MX2013007369A

MX2013007369A - Materiales y metodos para conjugar un derivado de acido graso soluble en agua a una proteina.

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Publication number: MX2013007369A
Application number: MX2013007369A
Authority: MX
Inventors: Juergen Siekmann; Richard Scheinecker
Original assignee: Baxter Healthcare Sa
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2013-09-26
Also published as: EP3673921A1; EP2654794A1; US8945897B2; TW201305090A; BR112013015898A2; AU2011349574B2; PT2654794T; EA201390940A1; AU2011349574A1; ES2800983T3; CA2822591C; EP2654794B8; AU2011349574B9; CN103269723A; MX345608B; JP2014501262A; KR20130129254A; AR084576A1; PL2654794T3; WO2012087838A1

Abstract

La invención se refiere a materiales y métodos para conjugar un derivado de ácido graso en agua a una proteína terapéutica, que comprenden poner en contacto la proteína terapéutica con un derivado de ácido graso soluble en agua activado bajo condiciones que permiten la conjugación.

Description

MATERIALES MÉTODOS PARA CONJUGAR UN DERIVADO DE ÁCIDO GRASO SOLUBLE EN AGUA A UNA PROTEÍNA Campo de la invención La presente invención se refiere a materiales y métodos para conjugar un derivado de ácido graso hidrosoluble a una Antecedentes de la invención Una variedad de moléculas compuestos se ha descripto para conjugar a las proteina terapéuticas a fin de aumentar la vida media de las proteínas terapéuticas conjugadas después de la administración a un paciente FM y Mero BioDrugs 2008 22 315 Gregoriadis G et Int J y Shechter Y et International Journal of Péptido Research and Therapeutics Vol 13 Los ácidos grasos se pueden conjugar a las proteínas terapéuticas para formar derivados de acción Este principio para la prolongación de vida media de la proteína o péptido se basa en el hecho de que FA puede unirse a la albúmina sérica bovina también denominada como sondas de unión a La asociación de los FA con albúmina sérica bovina en el torrente sanguíneo puede llevar a una sustancial prolongación de la vida media de la proteina terapéutica ya que se reciclará junto con la albúmina a través del receptor de Fe Los FA y sus derivados correspondientes ésteres presentan similares propiedades de unión a albúmina J Lipid Res Un ejemplo prominente para este principio de acción prolongada es insulina detemir de Novo Nordisk En la insulina el grupo carboxilo de un FA se acopla covalentemente al grupo de un residuo de lisina de la proteína de insulina por US US y US Otros grupos de investigación han descripto métodos similares Y et Bioconj Chem 2005 913 y Sasson K et J Control Reléase 2010 142 214 Por estos grupos describen un sistema de FMOC liberable que contiene un éster de NHS activo para acoplarse a los grupos amino de las La diferencia sin es que en este concepto el FA se une a la proteína por medio de un grupo funcional en la posición este modo produce el grupo carboxilo En se pueden preparar profármacos de acción que unidos a albúmina sérica bovina aún se disocian con tiempo a medida que el sistema FMOC experimenta la hidrólisis lenta en condiciones fisiológicas K et J Control Reléase Además de los ácidos la preparación de conjugados por la formación de una unión covalente entre el polímero hidrosoluble y la proteína terapéutica se puede llevar a cabo por una variedad de métodos La PEGilación de fármacos polipeptí los protege en circulación y mejoran sus perfiles farmacodinámicos y farmacocinéticos y Nat Rev Drug El proceso de PEGilación une unidades repetidas de etilenglicol a un fármaco polipeptí Las moléculas de PEG tienen un volumen hidrodinámicos grande veces el tamaño de las proteínas son muy hidrosolubles e no no inmunogénicas y se eliminan rápidamente del La PEGilación de las moléculas puede llevar al aumento de resistencia a la degradación aumento de la vida media in reducción de la frecuencia de disminución de la inmunogeni c idad aumento de la estabilidad física y aumento de la aumento de la estabilidad en líquido y reducción de la Los primeros fármacos PEGilados fueron aprobados por la FDA a principios de los Desde la FDA ha aprobado varios fármacos PEGilados para la administración inyectable y El ácido polisálico también denominada como ácido colominico es un polisacárido Es un homopolimero del ácido con unión cetosídica y contiene grupos diol vecinos en su extremo no Está cargado negativamente y es un constituyente natural del cuerpo Se puede producir fácilmente a partir de las bacterias en grandes cantidades y con características físicas predeterminadas US Debido a que el PSA producido en bacterias es química e idéntico a PSA producido en el cuerpo el PSA bacteriano no es inmunogénico incluso acoplado a las A diferencia de algunos el ácido PSA es biodegradable Se ha demostrado que el acoplamiento covalente del ácido colominico a catalasa y asparaginasa aumenta la estabilidad de la enzima en la presencia de enzimas proteolíticas o plasma Estudios comparativos in vivo con asparaginasa polisialilada y sin modificar revelaron que la polisialilación aumentó la vida media de la enzima y Int J El acoplamiento de los derivados de PEG a los péptidos o proteínas es revisado por oberts et Drug Deliv 5 Un método para acoplar los polímeros hidrosolubles a las proteínas terapéuticas es la conjugación de los polímeros por medio de los restos de carbohidrato de la Los grupos hidroxilo vecinos de los carbohidratos de las proteínas se pueden oxidar fácilmente con peryodato de sodio para formar grupos aldehidos activos y J Biol Chem van Lenten y J Biol Chem Posteriormente el polímero se puede acoplar a los grupos aldehidos del carbohidrato por el uso de reactivos que por un grupo hidrazida activo M y Bayer Methods Enzymol Una tecnología más reciente es el uso de reactivos que contienen grupos amionooxi que reaccionan con los aldehidos para formar las uniones oxima Los ejemplos adicionales que describen la conjugación de un polímero hidrosoluble a una proteína terapéutica se describen en WO que describe la oxidación de los restos carbohidrato en el factor de von y el posterior acoplamiento al PEG usando la química de la Publicación US que describe la oxidación del rFVIII y el posterior acoplamiento al PEG y otros polímeros hidrosolubles ejemplo usando la química de WO que describe la oxidación de diferentes factores de por ejemplo FVIIa y el posterior acoplamiento por usando química de aminooxi por la formación de una unión y la patente US que describe la oxidación de y el posterior acoplamiento al PEG usando la química de hidrazida No obstante los materiales y métodos anteriores para la conjugación de la se desean nuevos materiales y métodos por permitan la manipulación y preparación de conjugados de proteína Si bien los ácidos grasos pueden proporcionar el beneficio de la unión a los ácidos a menudo son difíciles de manipular en un ambiente acuoso y se pueden liberar o eliminar de su compañero de unión a la proteína con el Breve descripción de la invención La presente invención proporciona materiales y métodos para conjugar polímeros y derivados de ácidos grasos hidrosolubles a las lo que mejora las propiedades farmacodinámicas y cas de la proteína a la vez que se minimizan los costos asociados con diversos reactivos y los riesgos de salud para los receptores del paciente cuando la reacción de conjugación está catalizada por un catalizador nucí eo f 1 i co La presente invención proporciona materiales y métodos para conjugar derivados de ácidos grasos hidrosolubles a las proteínas en una solución de este modo se producen conjugados de proteina estables donde los derivados de ácidos grasos no se liberan con el En una forma de realización de la presente se proporciona un derivado de ácido graso hidrosoluble que comprende un ácido graso o éster de ácido graso unido a un ligador dicho derivado de ácido graso se une en forma estable a una proteína En otra forma de el derivado de ácido graso se une a albúmina sérica bovina in vitro o in En aún otra forma de el derivado de conjugado de ácido graso proteína terapéutica tiene vida media aumentada con respecto a una proteína terapéutica En otra forma de realización un derivado de ácido graso mencionado anteriormente comprende un ácido graso saturado o ácido graso En una forma de realización el ácido graso es un ácido graso En otra forma de realización el ácido graso es un ácido graso de cadena Se contemplan varias longitudes de ácidos grasos en los derivados de ácidos En una forma de se proporciona un derivado de ácido graso mencionado anteriormente donde el ácido graso comprende una longitud de cadena entre CIO y que incluyen los ácidos grasos sintéticos con números de carbono En una forma de se proporciona un derivado de ácido graso mencionado anteriormente donde el ácido graso comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste C22 y En otra forma de el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C16 y En otra forma de el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C15 y En aún otra forma de se proporciona un derivado de ácido graso mencionado anteriormente donde el ácido graso une al ligador hidrosoluble a un grupo del ácido graso seleccionado del grupo que consiste grupo carboxilo terminal y grupo En otra forma de el ácido graso se une al ligador hidrosoluble en el grupo En aún otra forma de el grupo ? se selecciona del grupo que consiste y En una forma de realización de la presente se proporciona un derivado de ácido graso mencionado anteriormente donde el ácido graso es ácido En otra forma de se proporciona un derivado de ácido graso donde el éster de ácido graso se selecciona del grupo que consiste éster metílico y éster En una forma de el éster de ácido graso es éster metílico del ácido Varios ligadores hidrosolubles están contemplados en la presente En una forma de se proporciona un derivado de ácido graso mencionado anteriormente donde el ligador hidrosoluble comprende un polímero hidrosoluble y al menos un grupo funcional unido a la proteína En una forma de el grupo funcional unido a la proteína terapéutica tiene la capacidad de impartir una carga negativa o de este modo se obtiene el ligador En aún otra forma de el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en un grupo grupo grupo grupo grupo grupo grupo amionooxi y grupo En una forma de el grupo funcional es un grupo Numerosos polímeros h dro s o 1 uble s están contemplados en la presente En una forma de se proporciona un derivado de ácido graso mencionado anteriormente donde el polímero hidrosoluble que es parte integral del se selecciona del grupo que consiste polietilenglicol PEG ácido polisiálico hidr ial qu i 1 almidón hidroxietil almidón ácido condroitin dermatan carboxime t il óxido de polialquileno polialquilen glicol po 1 i p i 1 eng 1 co 1 poliacriloilmorf alcohol polivinilico policarboxilato pol i fo s fa ceno anhídrido del ácido anhídrido del ácido po 1 ie s i r co poli hidroximetil formal y fosfato de me tacr i loi loxi t i 11 r ime t i lamonio En aún otra forma el polímero hidrosoluble es También se contemplan varias longitudes de polímeros hidrosoluble s En una forma de se proporciona un derivado de ácido graso donde el polímero hidrosoluble comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en 013 y En una forma de se proporciona un derivado de ácido graso donde el ligador hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste En otra forma de realización de la se proporciona un derivado de ácido graso donde el derivado de ácido graso se une en forma estable a la proteina terapéutica por una unión En otra forma de la unión oxima se forma entre el grupo oxima sobre el ligador hidrosoluble y un grupo aldehido de un carbohidrato oxidado en la proteina En otra forma de realización más de la se proporciona un derivado de ácido graso donde el derivado de ácido graso se une en forma estable a la proteína terapéutica por un grupo maleimido del ligador hidrosoluble a un grupo libre de la proteína En aún otra forma de el derivado de ácido graso se une en forma estable a la proteína terapéutica por un éster de hidroxi succinimida del ligador hidrosoluble a un grupo amino libre de la proteína En una forma de realización de la se proporciona un derivado de ácido graso donde el derivado de ácido graso se selecciona del grupo que consiste sal sódica de ácido 2 de la éster metílico del ácido 16 2 2 2 2 i Varias proteínas terapéuticas están contemplados en la presente En una forma de se proporciona un derivado de ácido graso mencionado anteriormente donde la proteína terapéutica es seleccionada del grupo que consiste Factor IX Factor VIII Factor Vlla factor de von Willebrand Factor FV Factor X Factor XI Factor XII trombina proteína proteína factor tisular ADAMTS 13 factor estimulante de colonial factor estimulante de colonia de granulocitos i n t e r fe r ón 1 fa interferón de trombopoye tina polipéptido tipo angiopoyetina 1 polipéptido tipo angiopoyetina 2 ANGPTL2 polipéptido tipo angiopoyetina 3 polipéptido tipo angiopoyetina 4 polipéptido tipo angiopoyetina 5 polipéptido tipo angiopoyetina 6 polipéptido tipo angiopoyetina 7 vitronectina factor de crecimiento endotelial vascular activina activina activina proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteina morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea receptor de la proteína morfogénica ósea receptor de la proteína morfogénica ósea receptor de la proteína morfogénica ósea factor neurotrófico derivado del cardiot rof ina 1 factor neurotrófico factor neurotrófico ciliar factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina ß factor de crecimiento celular endotelina factor de crecimiento atrayente de neutrófilos derivado factor de crecimiento fibroblást ico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblás tico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento f rob lá s t i co factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento fibroblás t ico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento f ibrobl á s t i co receptor del factor neurotrófico derivado de linea celular glial receptor del factor neurotrófico derivado de linea celular glial proteina relacionada con el proteina relacionada con el crecimiento proteina relacionada con el crecimiento proteina relacionada con el crecimiento factor de crecimiento epidérmico de unión a factor de crecimiento de receptor del factor de crecimiento de factor de crecimiento derivado de factor de crecimiento tipo insulina receptor del factor de crecimiento tipo factor de crecimiento tipo insulina proteina de unión al factor de crecimiento tipo factor de crecimiento de queratinocitos factor inhibidor de receptor del factor inhibidor de leucemia factor de crecimiento nervioso receptor del factor de crecimiento neurotrof ina neurotrofina oncostatina factor de crecimiento factor de crecimiento placentario factor de crecimiento celular endotelial derivado de factor de crecimiento derivado de factor de crecimiento derivado de plaqueta de cadena factor de crecimiento derivado de plaqueta factor de crecimiento derivado de plaqueta factor de crecimiento derivado de plaqueta de cadena factor de crecimiento derivado de plaqueta receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta factor estimulante del crecimiento de las células factor de células madre receptor del factor de células factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante latente proteina de unión al factor de crecimiento transformante ß proteina de unión al factor de crecimiento transformante ß proteina de unión al factor de crecimiento transformante ß linfopoyetina del estroma timico receptor del factor de necrosis tumoral receptor del factor de necrosis tumoral receptor del activador de plasminógeno tipo proteina activadora de fosfolipasa lectina gonadot ropina hormona estimulante hormona estimulante activador del plasminógeno y hormona luteini zante lipoproteinas fetoproteina trans fer r ina trombopoyetina Humira ada 1 Prolia Enbrel etane cept una proteina de la Tabla o un derivado biológicamente activo o variante de En otra forma de la proteina terapéutica es En otra forma de realización la proteína terapéutica es En aún otra forma de la proteína terapéutica es También se contemplan en la presente métodos de preparar derivados de ácidos En una forma de se proporciona un método de preparar un derivado de ácido graso que se describe en la presente que oxidar un grupo en un ácido graso para generar un grupo aldehido del ácido y acoplar un ligador hidrosoluble que comprende un grupo aminooxi activo al grupo aldehido para formar una unión oxima donde el derivado de ácido graso es hidrosoluble En una forma de se proporciona el método mencionado anteriormente donde el grupo se oxida con un reactivo de oxidación seleccionado del grupo que consiste reactivo peryodinano de Dess reactivo de oxidación Swern con cloruro de perrutenato de tetrapropilamonio reactivos de cromo VI tal como un reactivo de cloro cromato de piridinio y dicromato de En aún otra forma de el reactivo de oxidación es peryodinano de Dess En otra forma de se proporciona un método mencionado anteriormente donde el ácido graso es un ácido graso saturado o ácido graso En aún otra forma de el ácido graso es un ácido graso En otra forma de realización más de la se proporciona un método mencionado anteriormente donde el ácido graso es un ácido graso de cadena De acuerdo con otra forma de también se proporciona un método mencionado anteriormente donde el ácido graso comprende una longitud de cadena entre CIO y que incluyen ácidos grasos sintéticos con números de carbono En una forma de se proporciona un derivado de ácido graso mencionado anteriormente donde el ácido graso comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste C22 y En otra forma de el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C16 y En aún otra forma de el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C15 y En aún otra forma de se proporciona un método mencionado anteriormente donde el ligador hidrosoluble comprende un polímero hidrosoluble y al menos un grupo amionooxi Numerosos polímeros hidrosolubles están contemplados en la presente invención para usar en un método mencionado En una forma de se proporciona un método mencionado donde el polímero hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste polietilenglicol PEG ácido polisiálico hidroxialquil almidón hidroxietil almidón polisacáridos ácido condroitin dermatan carboxime t i 1 t r ano óxido de polialquileno polialquilen glicol polipropilenglicol pol ioxazol ina a 1 coho 1 polivinilico policarboxilato pol i f os f aceno anhídrido del ácido anhídrido del ácido poli y fosfato de e t i 11 t i 1 amon i o En una forma de el polímero hidrosoluble es PEG También se contemplan varias longitudes de polímeros hidrosolubles En una forma de se proporciona un método mencionado anteriormente donde el polímero hidrosoluble comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en 013 y En aún otra forma de se proporciona un método mencionado anteriormente donde el ligador hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste 1 de la de la fórmula 3 9 12 1 17 iamina de la fórmula 9 dioxiamina de la En otra forma de realización se proporciona un método mencionado anteriormente donde el ligador hidrosoluble es 3 de la En aún otra forma de se proporciona un método mencionado anteriormente donde el ligador hidrosoluble es 3 9 12 toxahept 1 dioxiamina de la En la presente se contemplan otros métodos más para obtener los derivados de ácidos En una forma de un método de preparar se proporciona un derivado de ácido graso mencionado anteriormente que esterificar un grupo carboxilo de un ácido graso para generar un éster del ácido activar un grupo de un ácido graso por la introducción de un grupo mesilo del ácido graso de la etapa y acoplar un ligador hidrosoluble que comprende un grupo aminooxi activo por la sustitución del grupo mesilo de la etapa de este modo se forma un enlace de metileno donde el derivado de ácido graso es hidrosoluble En una forma de se proporciona el método mencionado anteriormente donde el grupo carboxilo es esterifica con un agente e s te r i f i cant e seleccionada del grupo que consiste cloruro de metanol en presencia de etanol en presencia de y yoduro de En otra forma de el agente esteri ficante es cloruro de En aún otra forma de se proporciona el método mencionado anteriormente donde el grupo es activado por un agente de activación seleccionado del grupo que consiste cloruro de cloruro de tosilo y cloruro de En una forma de el agente de activación es cloruro de me Se contemplan varios ácidos grasos para usar en el método mencionado En una forma de se proporciona el método mencionado anteriormente donde el ácido graso es un ácido graso saturado o ácido graso En otra forma de el ácido graso es un ácido graso En otra forma de realización el ácido graso es un ácido graso de cadena En aún otra forma de se proporciona el método mencionado anteriormente donde el ácido graso comprende una longitud de cadena entre CIO y que incluye ácidos grasos sintéticos con números de carbono En una forma de se proporciona un derivado de ácido graso mencionado anteriormente donde el ácido graso comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste C22 y En otra forma de el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C16 y En otra forma de realización más el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C15 y También se contemplan varios polímeros hidrosolubles para usar en el método mencionado En una forma de se proporciona el método mencionado anteriormente donde el ligador hidrosoluble comprende un polímero hidrosoluble y al menos un grupo En otra forma de el polímero hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste 1 iet 1 co 1 PEG ácido polisiálico hidr oxialqui 1 almidón hidroxietil almidón pol i sacár idos ácido condroitin dermatan óxido de pol i a lqu i 1 eno polialquilen glicol polipropilenglicol alcohol policarboxilato pol i fo s f aceno anhídrido del ácido anhídrido del ácido po 1 ie s t i co 1 e i co po 1 i 1 i oxime t i 1 e t i 1 en y fosfato de En otra forma de el polímero hidrosoluble es En aún otra forma de realización de la se proporciona un método mencionado anteriormente donde el polímero hidrosoluble comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en 013 y En otra forma de el ligador hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste También se contemplan métodos de preparar proteínas conjugadas en la presente En una forma de se proporciona un método de preparar una proteína terapéutica conjugada que comprende poner en contacto un resto carbohidrato oxidado de la proteína terapéutica con el derivado de ácido graso mencionado anteriormente un polímero hidrosoluble como se describe en la en condiciones que permiten la el resto carbohidrato oxidado por la incubación con un buffer que comprende un agente oxidante seleccionado del grupo que consiste en peryodato de sodio tetraacetato de plomo perrutenato de potasio donde se forma una unión oxima entre el resto carbohidrato oxidado y el grupo aminooxi activo del derivado de ácido y donde la formación de la unión oxima está catalizada por un catalizador nucleofílico seleccionado del grupo que consiste en ácido ácido ácido ácido o zami da y En otra forma de se proporciona el método mencionado anteriormente donde la proteína terapéutica es seleccionada del grupo que consiste Factor IX Factor VIII Factor factor de von Factor FV Factor X Factor XI Factor XII trombina proteina proteína factor tisular F ADAMT S 13 factor estimulante de colonial factor estimulante de colonia de granulocitos interferón de trombopoyetina polipéptido tipo angiopoyetina 1 polipéptido tipo angiopoyetina 2 polipéptido tipo angiopoyetina 3 ANGPTL3 polipéptido tipo angiopoyetina 4 polipéptido tipo angiopoyetina 5 pol ipéptido angiopoyetina 6 po 1 tipo angiopoyetina 7 i t rone ct i na factor de crecimiento endotelial vascular activina activina activina proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea receptor de la proteína morfogénica ósea receptor de la proteína morfogénica ósea receptor de la proteína morfogénica ósea factor neurotrófico derivado del cardiotrof factor neurotrófico factor neurotrófico ciliar factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina ß factor de crecimiento celular endotelina factor de crecimiento atrayente de neutrófilos derivado factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento f ibrobl ás t i co factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico receptor del factor neurotrófico derivado de linea celular glial receptor del factor neurotrófico derivado de linea celular glial proteina relacionada con el proteina relacionada con el crecimiento proteina relacionada con el crecimiento proteina relacionada con el crecimiento factor de crecimiento epidérmico de unión a factor de crecimiento de receptor del factor de crecimiento de factor de crecimiento derivado de factor de crecimiento tipo insulina receptor del factor de crecimiento tipo factor de crecimiento tipo insulina proteina de unión al factor de crecimiento tipo factor de crecimiento de factor inhibidor de receptor del factor inhibidor de leucemia factor de crecimiento nervioso receptor del factor de crecimiento neuropoyetina neurotrofina neurotrofina oncostatina M factor de crecimiento factor de crecimiento placentario factor de crecimiento celular endotelial derivado de factor de crecimiento derivado de factor de crecimiento derivado de plaqueta de cadena factor de crecimiento derivado de plaqueta factor de crecimiento derivado de plaqueta factor de crecimiento derivado de plaqueta de cadena factor de crecimiento derivado de plaqueta receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta factor estimulante del crecimiento de las células factor de células madre receptor del factor de células factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante latente proteina de unión al factor de crecimiento transformante ß proteina de unión al factor de crecimiento transformante ß proteina de unión al factor de crecimiento transformante ß linfopoyetina del estroma timico receptor del factor de necrosis tumoral receptor del factor de necrosis tumoral receptor del activador de plasminógeno tipo proteína activadora de fosfolipasa lectina gonadotropina hormona estimulante hormona estimulante activador del plasminógeno y hormona luteini zante lipoproteínas fetopr ote í na trans ferr ina trombopoyetina ada 1 imumab Prolia Enbrel una proteína de la Tabla o un derivado biológicamente activo o variante de En otra forma de se proporciona el método mencionado anteriormente donde la proteína terapéutica es En otra forma de realización se proporciona el método mencionado anteriormente donde la proteína terapéutica es En otra forma de realización se proporciona el método mencionado anteriormente donde la proteína terapéutica es En aún otra forma de se proporciona el método mencionado anteriormente donde el agente oxidante es peryodato de sodio En otra forma de se proporciona el método mencionado anteriormente donde el catalizador nucleofílico es En otra forma de realización se proporciona el método mencionado anteriormente que también comprende purificar la proteina terapéutica En aún otra forma de se proporciona el método mencionado anteriormente donde el derivado de ácido graso se prepara por un método como se describe en la Otros métodos más de preparar los derivados de ácidos grasos están contemplados en la presente En una forma de se proporciona un método de preparar un derivado de ácido graso mencionado anteriormente que esterificar un grupo carboxilo de un ácido graso para generar un éster del ácido y acoplar un ligador hidrosoluble que comprende un grupo maleimido activo a un grupo sulfhidrilo de este modo se forma un enlace tioéter donde el derivado de ácido graso es En aún otra forma de se proporciona un método de preparar un derivado de ácido graso mencionado anteriormente que esterificar un grupo carboxilo de un ácido graso para generar el éster de ácido hacer reaccionar el ácido graso resultante de la etapa con un reactivo de este modo se produce una correspondiente azida del ácido hidrogenar la azida del ácido graso de la etapa para producir una correspondiente amina del ácido y acoplar un ligador idrosoluble que comprende un grupo NHS activo a un grupo amina de este modo se forma un enlace donde el derivado de ácido graso es Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra la síntesis del ligador hidrosoluble Descripción detallada de la invención Las propiedades farmacológicas e de la proteínas terapéuticas se pueden mejorar por la modificación y conjugación química con los compuestos tales como ácidos grasos y derivados de ácidos grasos de acuerdo con la presente La adición de un derivado de ácido graso hidrosoluble como se describe en la presente es un método para mejorar las propiedades de las proteínas terapéuticas tales como las proteínas de coagulación de la sagre del Factor IX Factor VIII Factor factor de von Willebrand Factor FV Factor X Factor XI Factor XII trombina proteína proteína factor tisular o proteasa ADAMTS así como otras proteínas conocidas o sus fragmentos biológica activos Proteínas terapéuticas En ciertas formas de realización de la los polipéptidos y polinucleótidos anteriormente mencionados se ejemplifican con las siguientes proteínas proteínas de coagulación factores de y En ciertas formas de la proteína terapéutica es una proteína de coagulación sanguínea tal como Factor IX Factor VIII Factor Vlla factor de von illebrand Factor FV Factor X Factor XI Factor XII trombina proteina proteína factor tisular o ADAMTS 13 En ciertas formas de la proteína terapéutica es inmunoglobulinas citoquinas tal como 1 factor estimulante de colonial factor estimulante de colonia de granulocitos ínter interferón de trombopoyetina por ejemplo the human polipéptido tipo angiopoyetinas ANGPTL1 a vitronectina factor de crecimiento endotelial vascular activina activina activina proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea proteína morfogénica ósea receptor de la proteína morfogénica ósea receptor de la proteína morfogénica ósea receptor de la proteína morfogénica ósea factor neurotrófico derivado del cardiotrof factor neurotrófico factor neurotrófico ciliar factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina ß factor de crecimiento celular endotelina factor de crecimiento atrayente de neutrófilos derivado factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblást ico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ib oblás t i co factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblá s t i co factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento fibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico factor de crecimiento f ibroblástico receptor del factor neurotrófico derivado de linea celular glial receptor del factor neurotrófico derivado de linea celular glial a2 proteina relacionada con el proteína relacionada con el crecimiento proteína relacionada con el crecimiento proteína relacionada con el crecimiento factor de crecimiento epidérmico de unión a factor de crecimiento de hepatocitos receptor del factor de crecimiento de factor de crecimiento derivado de factor de crecimiento tipo insulina receptor del factor de crecimiento tipo factor de crecimiento tipo insulina proteina de unión al factor de crecimiento tipo factor de crecimiento de factor inhibidor de receptor del factor inhibidor de leucemia factor de crecimiento nervioso receptor del factor de crecimiento neuropoyet ina neurotrof ina neurotrofina oncostatina M factor de crecimiento factor de crecimiento placentario factor de crecimiento celular endotelial derivado de factor de crecimiento derivado de factor de crecimiento derivado de plaqueta de cadena factor de crecimiento derivado de plaqueta factor de crecimiento derivado de plaqueta factor de crecimiento derivado de plaqueta de cadena factor de crecimiento derivado de plaqueta receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta factor estimulante del crecimiento de las células factor de células madre receptor del factor de células que incluye factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante factor de crecimiento factor de crecimiento transformante factor de crecimiento transformante latente proteina de unión al factor de crecimiento transformante ß proteina de unión al factor de crecimiento transformante ß proteina de unión al factor de crecimiento transformante ß linfopoyetina del estroma timico receptor del factor de necrosis tumoral receptor del factor de necrosis tumoral receptor del activador de plasminógeno tipo factor de crecimiento endotelial y proteínas quiméricas y sus fragmentos biológica o inmunol ógi camente En ciertas formas de la proteina terapéutica es interferones y factores estimulantes de colonia que incluyen factores estimulantes de colonia de granuloci tos factores de crecimiento f ibroblásticos factor de crecimiento derivado de proteina activadora de fosfolipasa proteínas de planta tal como lectinas y factores de necrosis tumoral y alelos formas solubles de receptores del factor de necrosis receptores de interleuquina y formas solubles de receptores de interleuquina factores de crecimiento tal como factores de crecimiento tal como o y factores de crecimiento somatomedinas hormonas factores liberadores hipotalámicos hormonas gonado ropina hormona estimulante hormona estimulante activador del plasminógeno y inmunoglobul inas tal como y una ga 1 ac t o s i idasa hormona luteinizante lipoproteinas fetoproteina trans ferrina trombopoyetina factores de crecimiento hematopoyético glucosidasas Humira adalimumab Prolia Enbrel etanercept y sus o cualquier proteina de fusión que comprende cualquiera de las proteínas o sus fragmentos mencionados Además de las proteínas mencionadas la siguiente Tabla 1 proporciona proteína terapéuticas contempladas por la presente o Tabla 1 o t í to o t o S O o o o o o o o o o Las proteínas terapéuticas provistas en la presente no deben considerar como Más tal como es evidente a partir de la descripción provista en la los métodos de la invención son aplicables a cualquier proteína en la que se desea la unión de un derivado de ácido graso hidrosoluble de acuerdo con la Por las proteínas terapéuticas se describen en la US incorporado en la presente por referencia en su Proteínas de coagulación sanguíneas En un el material de partida de la presente invención es una proteína de coagulación que se puede derivar de plasma o producido por técnicas de ingeniería recombinante como se describe en las patentes US Patente US Patente US Patente US Patente US Patente y EP 306 Los polipéptidos terapéuticos tales como proteínas de coagulación sanguínea que incluyen Factor IX Factor VIII Factor Vlla factor de von Willebrand Factor FV Factor X Factor XI Factor XII proteína proteína factor tisular y ADAMTS 13 proteasa se degradan rápidamente con las enzimas proteoliticas y neutralizadas con Esto reduce su vida media y tiempo de de este modo se limita su efectividad Se necesitan dosis relativamente altas y la administración frecuente para alcanzar y sostener el efecto terapéutico o profiláctico deseado de estas proteínas de Como la regulación de la dosis adecuada es difícil de obtener y la necesidad de administraciones intravenosas frecuentes impone restricciones en el modo de vida del Como se describe en la las proteínas de coagulación sanguínea que pero sin Factor IX Factor VIII Factor Vlla factor de von Willebrand Factor FV Factor X Factor Factor XII trombina proteína proteína factor tisular y ADAMTS 13 proteasa está contempladas por la Como se usa en la el término de coagulación se refiere a cualquier Factor IX Factor VIII Factor Vlla factor de Willebrand Factor FV Factor X Factor XII trombina proteína proteína factor tisular y ADAMTS 13 proteasa que exhibe actividad biológica que se asocia con la de la proteína de coagulación sanguínea nativa La cascada de coagulación de la sangre se divide en tres segmentos las vías extrínseca y comunes et Curr Opin Hematol La cascada involucra una serie de enzimas de serina proteasa y cofactores de Cuando se un precursor de zimógeno inactivo se convierte en la forma que en consecuencia se convierte en la próxima enzima en la La vía intrínseca requiere los factores de coagulación y La iniciación de la vía intrínseca se produce cuando la precalicreí na quininógeno de peso molecular factor XI y factor XII se exponen a una superficie cargado También se requieren iones de calcio y fosfolípidos secretados de las La vía extrínseca se inicia cuando se daña el lumen vascular de los vasos El factor tisular de gl i coprote ína de membrana y luego se une al factor VII circulante y a cantidad preexistentes pequeñas de su forma de FVIIa Esta unión facilita la conversión plena de FVII a FVIIa y en presencia de calcio y la conversión del factor IX al factor IXa y factor X al factor Xa La asociación del FVIIa con el factor tisular aumenta la actividad proteolitica al poner los sitios de unión de FBI para el sustrato y en proximidad cercana y por la inducción de un cambio que mejora la actividad enzimática de FVIIa La activación de la FX es el punto común de las dos Junto con el fosfolipido y los factores Va y Xa convierten la protrombina a trombina de prot rombinasa que luego escinde el fibrinógeno para formar monómeros de Los monómeros polimerizan para formar cadenas de El Factor une en forma covalente estas cadenas entre sí para formar una malla La conversión de FVII a FVIIa también es catalizada por numerosas que incluyen factor Xla y factor Para la inhibición de la fase temprana de la el inhibidor de la vía del factor tisular se dirige al complejo del producto de Factor Vlla FVII conocido como factor estable o proconvert ina es una glicoproteína de serina proteasa dependiente de vitamina con un papel crítico en hemostasia y coagulación Curr Protein Pept Sci 2002 FVII se sintetiza en el hígado y se secreta como una gl i copr ote i na de cadena simple de 48 El FVII comparte con todas las glicoproteí de serina proteasa dependiente de vitamina K una estructura del dominio de la proteína similar que consiste en un dominio terminal del ácido co con residuos responsables para la interacción de la proteína con membranas un dominio serina proteasa y dos dominios tipo factor de crecimiento epidérmico que contiene un sitio de unión del ion calcio que media la interacción con el factor La 1 carboxilasa cataliza la carboxilación de los residuos Gla en la porción terminal de la La carboxilasa es dependiente sobre la forma reducida de la vitamina K para su que se oxida a la forma La epóxido reductasa de la vitamina K se requiere para convertir la forma epóxido de la vitamina K de vuelta de la forma La principal proporción de FVII circula en el plasma en forma y la activación de esta forma produce la escisión del enlace entre la arginina 152 e isoleucina La FVIIa activada resultante consiste en una cadena liviana derivada de NH2 y una cadena pesada derivada de COOH terminal ligada por medio de un enlace disulfuro 135 a Cys La cadena liviana contiene el dominio de Gla de unión a mientras que la cadena pesada contiene el dominio La concentración plasmática de FVII determinada por los factores genéticos y ambientales es aproximadamente et Los diferentes genotipos de FVII pueden producir varias veces de diferencias en los niveles de FVII Los niveles de FBI plasmáticos se elevan durante el embarazo en mujeres sanas y también aumentan con la edad y son más altos en las mujeres y en personas con hipertriglice El FBI tiene la vida media más corta de todos los factores procoagulantes La concentración plasmática promedio del FVIIa es en individuos sanos y la vida media circulante del FVIIa es relativamente prolongada en comparación con otros factores de La deficiencia de FVII hereditaria es un trastorno hemorrágico recesivo autonómico raro con una prevalencia estimada en 1 caso por personas en la población general et J Thromb La deficiencia de FVII adquirida de los inhibidores es también muy También se han informado casos con la deficiencia que se produce en asociación con los fármacos tales como cefalosporinas y anti coagulantes se ha informado que la deficiencia de FVII adquirida se produce espontáneamente o con otras tal como anemia con terapia con y globulina antitimocito Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de referencia por Acceso GenBank J02933 para la secuencia M13232 para el ADNc et PNAS y P08709 para la secuencia de polipéptidos incorporadas en la presente en su Se ha descripto una variedad de polimorfismos de por ejemplo ver et Genet incorporadas en la presente en su Factor IX La FIX es una proteina plasmática dependiente de vitamina K que participa en la vía intrínseca de coagulación de sangre por la conversión de la FX a su forma activa en presencia de iones fosfolípidos y La capacidad catalítica predominante de FIX es como serina proteasa con especificidad para un enlace particular dentro de FX La activación del FIX se produce por FISA que causa la escisión del péptido de activación de FIX para producir una molécula de FIX activada que comprende dos cadenas mantenidas por uno o más enlaces Los defectos de FIX son la causa de la hemofilia B ligada a X recesivo La hemofilia A y B son enfermedades hereditarias caracterizadas por las deficiencias en FVIII y los polipéptidos de La causa subyacente de las deficiencias es con frecuencia el resultado de las mutaciones en los genes de FVI I I y los cuales se localizan en el cromosoma La terapia tradicional para las hemofilias a menudo involucra la administración intravenosa del plasma mezclado o proteínas de coagulación semi i f cada s de individuos Estas preparaciones se puede contaminar por agentes o virus tales como priones hepatitis y hepatitis En existe una necesidad urgente para agentes terapéuticos que no requieren el uso de suero humano El nivel de la disminución de la actividad de FIX es directamente proporcional a la gravedad de la hemofilia El tratamiento actual de la hemofilia B consiste en el reemplazo de la proteina faltante por derivado de plasma o recombinante sustitución de FIX o tratamiento o terapia de Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos del FIX se pueden hallar por ejemplo en el Acceso y patente US Factor VIH El factor de coagulación VIII circula en plasma en una concentración muy baja y está unido en forma no covalente al factor de von Willebrand Durante la FVIII se separa de VWF y actúa como un cofactor para la activación de FX mediada por el factor IX activado por el aumento de la tasa de activación en presencia de calcio y fosfolipidos o membranas El FVIII se sintetiza como un precursor de cadena único de aproximadamente con la estructura del dominio Al Cuando se purifica del plasma de o el FVIII está compuesto de una cadena pesada y una cadena liviana La masa molecular de la cadena liviana es 80 kD mientras debido a la proteólisis dentro del dominio la cadena pesada está en el rango de El FBI también se sintetiza como una proteina recombinante para el uso terapéutico en trastornos de Se han diseñado varios ensayos in vitro para determinar la potencial eficacia del recombinante como un medicamento Estos ensayos imitan los efectos in vivo del FBI El tratamiento con trombina in vitro del FBI produce un rápido aumento y posterior disminución de su actividad medida por ensayos in Esta activación y inactivación coincide con la proteólisis limitada específica tanto en las cadenas pesadas como que alteran la disponibilidad de diferentes epitopes de unión en por que permite al FVIII disociarse del y unirse a una superficie de fosfolípido o alterar la capacidad de unión a ciertos anticuerpos monoclonales La carencia o disfunción del FVIII se asocia con el trastorno hemorrágico más hemofilia El tratamiento de elección para el tratamiento de la hemofilia A es la terapia de reemplazo con derivados o concentrados de Los pacientes con hemofilia A severa con niveles de FVIII inferiores de son generalmente para la terapia profiláctica con el objetivo de mantener el FBI sobre entre las Tomando en cuenta las vidas media promedio de los diversos productos de FBI en la este resultado se puede obtener usualmente administrando dos a tres veces por Las secuencias de inucléot idos y polipéptidos por Un i t KB s s P o t P00451 Gitschier J et Characterization of the human Factor VIII Vehar GH et Structure of human Factor 312 2 Thompson AR Structure y Function of the Factor VIII gene y Semin Thromb 2003 29 11 Factor de von El factor de von Willebrand es una gl i coprote que circula en plasma como una serie de multimeros de un tamaño que varia de aproximadamente 500 a Las formas multiméricas del VWF se componen de subunidades de polipéptido de 250 kD unidos entre si por enlaces El VWF media la adhesión plaquetaria al de la pared de vaso Solo los multimeros más grandes exhiben actividad Se asume que las células endoteliales secretan formas poliméricas grandes del VWF y las formas del WMF que tienen un peso molecular bajo molecular bajo surgen de la escisión proteolitica Los multimeros que tienen grandes masas moleculares se almacenan en los cuerpos de Pallade de las células endoteliales y liberadas después de la VWF es sintetizada por las células endoteliales y megacariocitos como que consiste en gran cantidad de dominios Después de la escisión del péptido se dimeriza a través de la uniones disulfuro en su región Los dineros actúan como protómeros para la que está regido por las uniones disulfuro entre los extremos terminales El ensamblaje en multimeros es seguido por la eliminación proteolitica de las secuencias propéptidos et 274 El producto de traducción primario predicho a partir del ADNc clonado del VWF es un polipéptido precursor de 2813 residuos El consiste en un péptido señal de 22 aminoácidos y un propéptido de 741 con el VWF maduro que comprende 2050 aminoácidos y FAS EB Los defectos del VWF son causales para las enfermedades de von que se caracteriza por fenotipo de sangrado más o menos La VWD tipo 3 es la forma más severa en la que el VWF está completamente y el VWD tipo 1 se refiere a una pérdida cuantitativa de VWF y su fenotipo puede ser La VWD tipo 2 se refiere a los defectos cualitativos del VWF y puede ser tan severo como la VWD tipo La VWD tipo 2 tiene muchas algunas se asocian con la pérdida o la disminución de multimeros de peso molecular La enfermedad de Willebrand tipo 2a se caracteriza por una pérdida de multimeros intermedios y La se caracteriza por una pérdida de multimeros de peso molecular más Otras enfermedades y trastornos relacionados con VWF son conocidos en la Las secuencias de polinucleótidos y aminoácidos del están disponibles en el Acceso GenBank y Otras proteínas de coagulación sanguínea de acuerdo con la presente invención se describen en la por ejemplo Mann Thromb Polipéptidos En un el material de partida de la presente invención es una proteina o Como se describe en la el término proteina terapéutica se refiere a cualquier molécula de proteina terapéutica que exhibe actividad biológica que se asocia con la proteina En una forma de realización de la la molécula de proteina terapéutica es una proteina de longitud Las moléculas de la proteína terapéutica contempladas incluyen proteínas de longitud precursores de proteínas de longitud subunidades biológicamente activas o fragmentos de proteínas de longitud así como derivados biológicamente activos y variantes de algunas de estas formas de proteínas En la proteína terapéutica incluye los que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene más de aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente o aproximadamente o más identidad de secuencia de para una región de al menos aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente o más a un polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de referencia que se describen en la se unen específicamente a los por anticuerpos policlonales o monoclonales generados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de como se describe en la un fragmento inmunogénico de sus variantes modificadas en forma De acuerdo con la presente el término terapéutica recombinante incluye cualquier proteína terapéutica obtenida por medio de tecnología de ADN En ciertas formas de el término abarca proteínas como se describe en la presente se usa en la terapéutica incluye una proteína terapéutica que origina del mamífero destinado a recibir el El término también incluye la proteína terapéutica transcripta a partir de un transgén o cualquier otro ADN extraño presente en dicho Como se usa en la terapéutica incluye una proteína de coagulación sanguínea que no se origina del mamífero destinado a recibir el Como se usa en la de coagulación sanguínea derivada del o incluye todas las formas de la proteina hallada en sangre obtenida de un mamífero que tiene la propiedad de participar en la vía de se usa en la presente biológicamente o biológicamente incluye cualquier derivado o variante de una molécula que tiene sustancialmente las mismas propiedades funcionales biológicas de dicha tal como propiedades de la misma base tal como un esqueleto peptídico o una unidad Un o es un compuesto sustancialmente similar en estructura y tiene la misma actividad no obstante en ciertos casos en un grado que una molécula Por una variante de polipétido se refiere a un polipéptido que comparte una estructura sustancialmente similar y tiene la misma actividad biológica como un polipéptido de Las variantes o análogos difieren en la composición de sus secuencias de aminoácidos en comparación con el polipéptido natural del cual el deriva el sobre la base de una o más mutaciones que involucran supresión de uno o más residuos de aminoácidos en uno o más extremos terminales del polipéptido una o más regiones internas de la secuencia de polipéptidos natural inserción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más extremos terminales una o del polipéptido una o más regiones internas una de la secuencia de polipéptidos natural o sustitución de uno o más aminoácidos para otros aminoácidos para otros aminoácidos en la secuencia polipéptido A modo de un se refiere a un polipéptido que comparte la misma o sus a lmente similar estructura como un polipéptido de referencia que ha sido por En varias formas de se diseñan variantes o derivados para por conjugación de otra molécula al variante o derivado de la de este modo se forma una proteína conjugada de acuerdo con la presente invención Los polipéptidos variante o análogos incluyen variantes de donde uno o más residuos de aminoácidos se añaden a una secuencia de aminoácidos de la proteína terapéutica de la Las inserciones se pueden ubicar en uno o ambos extremos terminales de la proteína se puede ubicar dentro de regiones internas de la secuencia de aminoácidos de la proteína Las variantes de con residuos adicionales en uno o ambos extremos incluyen por proteínas de fusión y proteínas que incluyen marcas de aminoácidos u otras marcas de En un la molécula de proteína de coagulación sanguínea opcionalmente contiene un Met en especial cuando la molécula se expresa en forma recombinante en una célula tal como coli En las variantes por se eliminan uno o más de residuos de aminoácidos en un polipéptido de la proteína terapéutica como se describe en la Las supresiones se pueden efectuar en uno o ambos extremos terminales del polipéptido de la proteína con la eliminación de uno o más residuos dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína Las variantes por en incluyen fragmentos de un segmento de polipéptidos de una proteína En las variantes por se eliminan uno o más de residuos de aminoácidos en un polipéptido de la proteína terapéutica y se reemplazan con residuos En un las sustituciones son de naturaleza conservadora y las sustituciones conservadoras de este tipo son bien conocidas por los expertos en la De modo la invención abarca sustituciones que también son no Los ejemplos de sustituciones conservadoras se describen en Bi o chemi s t ry 2nd Worth New York y se exponen inmediatamente a Sustituciones conservadoras CARACTERÍSTICA DE LA AMINOÁCIDO CADENA LATERAL No polar hidro fóbi co Alifático A L I V P Aromático F W que contiene azufre Limite G Polar no Hidroxilo S T Y Amidas N Q Sulfhidrilo C Limite G Con carga positiva K R H Con carga negativa D E En forma los ejemplos de sustituciones conservadoras se exponen inmediatamente a Sustituciones conservadoras i RESIDUO ORIGINAL EJEMPLO DE SUSTITUCIÓN Ala Arg Asn Asn Arg Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp His Arg lie Leu Fe Lys Arg Gln Asn Met Leu Fe lie Fe Ala Pro Gli Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Y Ser Val Ala Polinucleótidos Los ácidos nucleicos que codifican una proteina terapéutica de la invención por ejemplo y sin variantes polimórf icas mutantes sintéticas y Los polinucleótidos que codifican una proteina terapéutica de la invención también sin los que se hibridan específicamente en condiciones de hibridación rigurosas con un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de referencia como se describe en la y sus variantes modificadas en forma tienen una secuencia de ácidos nucleicos que tiene más de aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente o identidad de la secuencia de nucleótidos mayor en una región de al menos aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente o más nucleótidos la longitud completa de 1218 nucleótidos de la proteina con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia como se describe en la Los ejemplos de condiciones de incluyen hibridación a en de 5X 20 de f y lavado en IX SSC a durante 30 Se entiende que la variación en estos ejemplos de condiciones se puede realizar sobre la base de la longitud y el contenido de nucleótidos de GC de las secuencias por Las fórmulas estándares en la técnica son apropiadas para determinar las condiciones de hibridación Ver et Molecular ? Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos es normalmente de un mamífero que pero sin por ser por o cualquier Los ácidos nucleicos y proteínas de la invención pueden ser moléculas recombinantes y que codifican la secuencia tipo salvaje o variante de o no Producción de las proteínas terapéuticas La producción de una proteína terapéutica incluye cualquier método conocido en la técnica para la producción del ADN por ingeniería introducir el ADN recombinante en células proca r i ca s o eucarióticas por ejemplo y sin trans fección o cultivar dichas células expresar la proteína por ejemplo en forma constitutiva o después de la y aislar dicha proteína de coagulación por ejemplo del medio de cultivo o por recolección de las células a fin de obtener la proteína terapéutica En otros la proteína terapéutica se produce por la expresión en un sistema huésped procariótico o eucarístico adecuado caracterizado por producir una molécula de proteína de coagulación sanguínea farmacológicamente Los ejemplos de células eucarióticas son células tales como HEK BHK y Una amplia variedad de vectores se usan para la preparación de la proteina terapéutica y se seleccionan de vectores de expresión eucarióticos y procarióticos Los ejemplos de vectores para la expresión procariótico incluyen plésmidos tales y sin y donde los promotores usados en los vectores de expresión procariótica incluyen uno o más y sin o Los ejemplos de los vectores para la expresión eucariótica para expresión en vectores tales y sin o usando promotores tales y sin o para la expresión en células de vectores tal como y sin o usando promotores tales como y sin limitación o y para la expresión en las células vectores tales como y sin limitación o y vectores derivados en un sistemas virales tales como y sin limitación virus virus virus o usando promotores tales como y sin limitación y En varias formas de reali de la las proteínas terapéuticas se modifican por la conjugación de un derivado de ácidos grasos hidrosolubles o ligadores hidrosolubles a uno o más carbohidratos de la proteína En en una forma de la proteína terapéutica es una glicoproteína y se purifica de una célula huésped que permite la gl icos i lación la proteína se glicosila in vivo y posteriormente se purifica como una En varias formas de la proteína terapéutica es o no es una glicoproteína y se glicosila in vitro después de la purificación de una célula En los métodos de glicosilación in vitro conocidos en la técnica por I y Combes Journal of Biotechnology Solá RJ y Griebenow BioDrugs los expertos en la técnica pueden purificar la proteína modificar la proteína terapéutica para permitir in opciona lmente específico de glicosilación deleciones inserci ones sus ti tuciones de y glicosilar en la proteína modificada in vitro de acuerdo con los procedimientos conocidos en la Administración En una forma de realización una proteina terapéutica conjugada de la presente invención se puede administrar por tal como inyección o intraperitoneal Para administrar las composiciones que comprende una proteina terapéutica conjugada de la presente invención a los seres humanos o animales de en un las composiciones comprenden uno o más portadores Los términos o se refieren a entidades moleculares que son inhiben la degradación de proteina tal como productos de agregación y u otras reacciones adversas cuando se administran usando rutas bien conocidas en la como se describe a farmacéuticamente incluyen alguno y todos los medios de agentes antibacterianos y anti fúngicos agentes isotónicos y retardadores de la absorción clínicamente útiles y que incluyen los agentes descriptos Como se usa en la incluye una dosis adecuada para tratar una enfermedad o trastorno o mejorar un síntoma de una enfermedad o En una forma de incluye una dosis adecuada para tratar un mamífero que tiene un trastorno hemorrágico como se describe en la Las composiciones se pueden administrar por vía transdérmica por spray o El término parenteral como se usa en la presente incluye inyecciones inyección intracisternal o técnicas de También está contemplada la administración por inyección intradérmica intramamar ia intrapulmonar e implantación quirúrgica en un sitio En las composiciones están esencialmente libres de así como otras impurezas que pueden ser perjudiciales para el Las administraciones únicas o múltiples de las composiciones se pueden llevar a cabo con los niveles de dosis y patrón seleccionadas por el médico Para la prevención o tratamiento de la la dosis apropiada dependerá del tipo de enfermedad como se describió la gravedad y tratamiento de la si el fármaco se administra para fines preventivos o terapia los antecedentes clínicos del paciente y respuesta al y la discreción del médico La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de una proteína terapéutica conjugada que se define en la La composición farmacéutica también puede comprender un o excipiente farmacéuticamente La composición farmacéutica se puede usar para tratar los trastornos hemorrágicos anteriormente La composición farmacéutica de la invención puede ser una solución o un producto Las soluciones de la composición farmacéutica se puede someter a cualquier proceso de liof ilización Como un aspecto la invención incluye kits que comprenden una composición de la invención envasada de una manera que facilita su uso para la administración a los En una forma de tal kit incluye un compuesto o composición descripta en la presente una composición que comprende una proteína terapéutica envasada en un recipiente tal como un frasco o recipiente con una marca fija al recipiente o se incluye en el envase que describe el uso del compuesto o composición para practicar el En una forma de el kit contiene un primer recipiente que tiene una composición que comprende una proteína terapéutica conjugada y un segundo recipiente que tiene una solución de reconstitución fisiológicamente aceptable para la composición en el primer En un el compuesto o la composición se envasa en una forma de dosis El kit también puede incluir un dispositivo adecuado para administrar la composición de acuerdo con una vía específica de Con el kit contiene una marca que describe el uso de la composición de proteína o péptido derivados de ácidos y conjugados de de ácido graso En un una molécula del derivado de la proteína terapéutica una proteína terapéutica provista en la presente se une a un derivado de ácido graso hidrosoluble Como se usa en la un de ácido graso comprende un ácido graso un ácido conjugado a un ligador hidrosoluble un ligador como se describe en la Tales derivados de ácidos de acuerdo con la son estables no se liberan de la y son capaces de unir a la albúmina sérica Ácidos grasos Los ácidos grasos FA o FAs incluyen pero sin ácidos grasos ácidos grasos ácidos grasos de cadena ramificada ukheriji et Prog Lipid Res 2003 y sus derivaodos que son capaces de unir la albúmina sérica bovina de acuerdo con la presente A modo de los ácidos grasos tiene la siguiente estructura FA estructura general éster metílico de FA saturado estructura general éster etílico de FA estructura general Los ácidos de acuerdo con varias formas de realización de la presente también comprenden estructuras alternativas ejemplo éster metílicos o u otras estructuras tales como las que contienen grupos terminales en posición ? grupos tio y En una forma de el ácido graso es un ácido graso En varias formas de el ácido graso es un ácido graso de cadena corta menos de seis un ácido graso de cadena media ácidos grasos de cadena larga más de 12 o un ácido graso de cadena muy larga más de 22 En otra forma de el ácido graso tiene entre 4 y 28 En una forma de el ácido graso está en la configuración En aún otra forma de el ácido graso está en la configuración En una forma de el ácido graso es un ácido graso saturado entre 12 y 20 carbonos de Tales ácidos grasos son conocidos en la por C12 ácido C14 ácido C16 hexadecanoico ácido C18 ácido y C20 ácido Los ejemplos de ácidos grasos insaturados son ácido miristoleico ácido ácido oleico ácido linolénico y ácido araquidónico La mayor parte de los ácidos grasos están disponibles en el comercio y se pueden preparar por diferentes métodos químicos Developments in the Synthesis of Synthesis of Fatty Acid Knothe G and Derksen JTB AOCS Press ISBN En varias formas de realización de la presente el ácido graso comprende o 50 Derivados de ácidos grasos La presente invención proporciona la preparación de una nueva clase de derivados de ácidos grasos activados de que se pueden unir a albúmina sérica Los derivados de FA contienen un espaciador o ligador hidrosoluble que permite el manejo y manipulación de los derivados de FA en solución acuosa los derivados de ácidos grasos de acuerdo con la presente invención son hidrosolubles a diferencia de los correspondientes ácidos grasos de los que En una forma de los derivados de FA contienen un grupo activo que permite el acoplamiento del derivado de FA a un resto de carbohidrato oxidado de las proteínas terapéuticas para formar uniones Como se usa en la una unión significa que se forma un enlace covalente que es o no La modificación química por medio de carbohidratos puede ser la opción preferida para las proteínas de coagulación como FIX y para formar conjugados con alta actividad A modo de ejemplo y sin la siguiente estrategia representa una forma de realización de acuerdo con la presente invención para preparar un derivado de FA hidrosoluble que contiene un grupo aminooxi Estrategia 1 El grupo de un derivado de FA ejemplo ácido se somete a oxidación con peryodinano de Dess Martin para generar un grupo En la próxima etapa un ligador diaminooxi que contiene una cadena de PEG hidrosoluble ejemplo 3 6 r 11 oxiamina se acopla a este grupo aldehido para formar una unión oxima El siguiente esquema representa un ejemplo de acuerdo con la Estrategia Etapa El ácido se oxidó selectivamente con reactivo de para producir oxoe s teár i co El producto bruto se purifica por cromatografía usando gel de sílice como agente de separación ácido ácido Etapa El resto de la sal sódica del ácido se hizo reaccionar con 11 amina El producto bruto se purifica por cromatografía usando gel de sílice como agente de 1 sal sódica del hexadecanoico acido En forma otra forma de se emplea la siguiente estrategia para preparar derivados de FA hidrosolubles que contienen un grupo aminooxi activo Estrategia 2 El grupo carboxilo del ácido graso ejemplo ácido se esterifica con cloruro de El grupo de este derivado de éster metílico se activa con cloruro de para introducir un grupo saliente Luego el grupo mesilo se hace reaccionar con un ligador diaminooxi que contiene una cadena de PEG hidrosoluble ejemplo 3 1 11 oxi amina para formar un enlace i t 1 eno Opcionalmente el éster metílico se puede hidrolizar en solución alcalina para generar un grupo carboxilo El siguiente esquema representa un ejemplo de acuerdo con la Estrategia 2 Etapa El resto de ácido carboxilico del ácido se protegió por la formación del éster metílico usando cloruro de acetilo como el reactivo de Cloruro de acetilo metil ester del ácido ácido Etapa el resto del éster metílico del ácido se activó por la sustitución del grupo hidroxilo con que es el mejor grupo meto ester del ácido Cloruro de mesilo metil éster del ácido exadecanoico Etapa el resto del éster metílico del ácido fonilhexadecanoico se sustituyó con un resto aminooxi del 3 6 1 r i a unde ca no 1 11 di i amina El producto bruto se purifica por cromatografía usando gel de sílice como agente de separación metil éster del ácido éster del ácido exadecanoico También se contemplan estrategias adicionales en la presente La presente por no está restringida a la química de aminooxi para acoplar los grupo aldehidos de los residuos de carbohidrato Como se describe en la también se contempla el uso de otras reacciones químicas que pero sin limitación hidrazidas para acoplarse a los grupos ésteres de NHS para acoplarse a los grupos amino y maleimidas para acoplarse a los grupos SH libres de las proteínas A modo de un éster metílico de ácido graso preparado como se describió antes se hace reaccionar con un disponible en el comercio 1 PEG 12 COOH IRIS Biotech como se describe en la A modo de otro ejemplo un éster de ácido graso con un gripo amino reactivo se hace reaccionar con un NHS disponible en el comercio IRIS Biotech como se describe en la Los ligadores hidrosolubles pero sin polímeros hidrosolubles ejemplo El ligador puede consistir en cualquier estructura química que contiene uno o más grupos que aumentan su solubilidad en Estos grupos funcionales pueden tener la capacidad de formar una carga negativa o de este modo se obtiene el ligador hidrosoluble En una forma de realización este grupo funcional pero sin limitación un grupo sulfo o Además se puede usar cualquier grupo funcional que hace al ligador más Los ejemplos para este son grupos aminooxi e hidrazida asi como ésteres de y éster sulfo NHS En varias formas de el polímero hidrosoluble pero sin polietilenglicol PEG ácido polisiálico hidrox ialqu 1 almidón hidroxietil almidón po 1 i s a cá r i s ácido condroitin dermatan óxido de polialquileno polialquilen glicol polipropilenglicol pol zol ina alcohol polivinílico i carboxi ato pol fo s faceno pol oxazol ina anhídrido del ácido pol i e t 1 1 e i co anhídrido del ácido poli hidroximetil formal fosfato de En una forma de el polímero hidrosoluble es PEG En varias formas de realización de la el polímero hidrosoluble comprende una longitud de cadena de entre 3 a 25 Por el polímero hidrosoluble comprende o 25 en varias formas de realización de acuerdo con la presente Conjugados de de ácido graso Los sistemas ligadores de aminooxi donde un derivado de ácido graso hidrosoluble comprende un ligador están contemplados por presente Por en una forma de realización de la la reacción de hidroxilamina o los derivados de hidroxilamina con aldehidos un resto carbohidrato después de la oxidación con peryodato de para formar un grupo se aplica para la preparación de los conjugados de Por una g 1 i coprote í na una proteína terapéutica de acuerdo con la presente se oxida primero con un agente oxidante tal como peryodato de sodio JA et J Biol Chem y Van Lenten L y Ashwell J Biol Chem La oxidación con peryodato de las glicoproteinas se basa en la reacción de Malaprade clásica que se describió en 1928 la oxidación de los dioles vecinos con peryodato para formar un grupo aldehido activo Analytical Bull Soc Chim 1928 Los ejemplos adicionales para tal agente oxidante son tetraacetato de plomo acetato de manganeso acetato de cobalto acetato de talio sulfato de cerio o perrutenato de potasio et J Am Chem Soc Por se entiende un compuesto oxidante leve que es capaz de oxidar dioles vecinos en de este modo se generan grupos aldehido activos en condiciones de reacción fisiológicas La segunda etapa es el acoplamiento del polímero derivado de ácido que contiene un grupo amionooxi al resto carbohidrato oxidado para formar una unión En una forma de realización de la esta etapa se puede realizar en presencia de cantidades catalíticas del catalizador nucleofílico anilina o derivados de anilina A et Dawson Bioconjugate Zeng Y et Nature ethods Los catalizadores de anilina aceleran drásticamente el ligamiento de la oxima lo que permite el uso de concentraciones muy bajas de los En otra forma de realización de la invención la unión oxima se estabiliza con la reducción con NaCNBH3 para formar una unión Los catalizadores adicionales se describen a En otra forma de esta etapa se realiza en presencia de En una forma de realización de la las etapas de reacción para conjugar un ligador hidrosoluble derivado de ácido a una proteina se realizan por separado y en forma sucesiva materiales iniciales proteina ligador reactivos agentes y productos de reacción carbohidrato oxidado sobre una proteina ligador hidrosoluble aminooxi se separan entre las etapas de reacción En otra forma de los materiales de partida y los reactivos necesarios para completar una reacción de conjugación de acuerdo con la presente invención se lleva a cabo en un solo En una forma de realización la proteina nativa se mezcla con el reactivo se añade el reactivo oxidante y se realiza la reacción de La información adicional de la tecnología aminoxi se puede hallar en las siguientes cada una de las cuales se incorpora en su EP 1681303A1 WO de un polímero y una proteína ligada por un grupo de unión ligadores que contienen aminooxi y su aplicación en los WO Peri F et Tetrahedron J y Pozsgay J Org Lees A et Vaccine y Heredia KL et Macromoléculas 2007 40 El acoplamiento del ligador hidrosoluble se puede realizar por acoplamiento directo a la por por medio de un grupo sulfhidrilo libre o grupo amino libre de la o por medio de una molécula ligadora que se describe en la Lae conjugación en un aspecto se realizar por el acoplamiento directo acoplamiento por medio de sistemas del ligador hidrosoluble a una proteína terapéutica para la formación de enlaces En en varias formas de realización de la los derivados de ácidos grasos descriptos en la presente se diseñan para permitir la conjugación a una proteina Por los derivados de ácidos grasos se diseñan para incluir varios grupos reactivos como se describe en la En ciertos las proteínas terapéuticas se conjugan a un derivado de ácidos grasos hidrosolubles por cualquiera de una variedad de métodos químicos oberts JM et Advan Drug Delivery Rev 2002 459 Por en una forma de realización una proteína terapéutica se modifica por la conjugación de derivados de ácidos grasos a los grupos libres de la proteína usando ésteres de succinimida En otra forma de realización el derivado de ácido graso hidrosoluble se acopla a grupos SH libres usando reacciones químicas de la En otra forma de realización el derivado de ácido graso hidrosoluble se acopla por el uso de reacciones químicas de hidrazida o aminooxi a los restos de carbohidrato de la proteína terapéutica después de la oxidación En una forma de realización de la una proteína terapéutica se modifica por medio de residuos de lisina por el uso de derivados de ácidos grasos hidrosolubles que contienen un active Ester de hidroxisuccinimida Este derivado reacciona con los residuos de lisina de la proteina terapéutica en condiciones moderadas por la formación de un enlace amida En otra forma de realización de la se contempla la ligadura a través de un enlace peptidico entre un grupo carboxilo en uno de proteina o derivado de ácido graso y un grupo amino de la proteina o derivado de ácido o una ligadura éster entre un grupo carboxilo de la proteina o derivado de ácido graso y un grupo hidroxilo de la proteina terapéutica o derivado de ácido Otra ligadura por la cual la proteina terapéutica se une en forma covalente al derivado de ácido graso es por medio de una base de por entre un grupo amino libre de la proteina que reacciona con un grupo aldehido formado en un extremo de un ácido La base de Schiff generada en un aspecto se estabiliza con la reducción especifica con Na CNBH 3 para formar una amina Un método alternativo es la generación del grupos amino libres terminales en el derivado de ácido graso por aminación reductora con NH4C1 antrs de la oxidación Se pueden usar reactivos bifuncionales para unir los dos gruspo amino o dos Por un derivado de ácido graso que contiene un grupo amino se acopla a los grupos amino de la proteina con reactivos como BS3 sul fosuccinimidil los reactivos de unión cruzada heterobi funcionales como Maleiitiidocaproi loxi éster sul f o s da se usan por para unir grupos amino y En otro se prepara un derivado de ácido graso con un grupo hidrazida activo y se acopla al resto de carbohidrato de la proteina después de la oxidación previa y la generación de las funciones Como se describió un grupo amino libre de la proteina terapéutica reacciona con el grupo de un derivado de ácido graso para formar un enlace peptidilo o se forma una ligadura éster entre el grupo y un grupo hidroxilo u otro grupo activo En varias formas de la proteina terapéutica se liga a o se asocia con el derivado de ácido graso en cantidades estequiométricas o En varias formas de o derivados de ácidos grasos se ligan a la En aún otras formas de 20 o más derivados de ácidos grasos se ligan a la En varias formas de la proteina terapéutica se modifica para introducir sitios de gl i lación sitios diferentes de los sitios de gli eos ilación Tal modificación se puede lograr por medio técnicas biológicas moleculares estándares conocidas en la Más la proteina antes de la conjugación a un ligador hidrosoluble por medio de uno o más restos de se puede glicosilar in vivo o in Estos sitios glicosilados pueden servir como blancos para la conjugación de las proteínas con ligadores hidrosolubles de patente US Solicitud de patente US Solicitud de patente US Solicitud de patente US Solicitud de patente US y DeFrees et Glicobiology En una forma de la proteína conjugada retiene la actividad funcional completa de los productos de la proteína terapéutica y proporciona una vida media extendida in en comparación con los productos de la proteína terapéutica En otra forma de la proteína conjugada retiene al menos 27 28 31 48 51 54 57 58 61 62 64 67 70 71 72 74 90 92 94 98 o 150 por ciento de actividad biológica con respecto a la proteina En un aspecto las actividades biológicas de la proteina conjugada y proteina de coagulación sanguínea nativa se determinan por las relaciones de actividad cromogénica al valor de antígeno del factor de coagulación sanguíneo de coagulación sanguíneo Chr factor de coagulación sanguíneo En aún otra forma de realización de la la vida media de la proteína conjugada se reduce o aumenta o 10 veces con respecto a la vida media in vivo de la proteína terapéutica Catalizadores nucleofí lieos Como se describe en la la conjugación de los derivados de ácidos hidrosolubles a las proteínas terapéuticas se pueden catalizar con La anilina cataliza fuertemente las reacciones acuosas de los aldehidos y cetonas con las aminas para formar estables tales como hidrazones y El siguiente diagrama compara una reacción de ligamiento de oxima no catalizada versus catalizada con anilina de Kohler ChemBioChem reacción catalizada con anilina reacció no cataliz de oxima Sin considerando los numerosos riesgos de salud asociados con la son convenientes catalizadores La presente invención proporciona derivados de anilina como catalizadores alternativos del ligamiento de la Tales derivados de anilina pero sin ácido ácido ácido ácido zamida y El siguiente diagrama compara reacción de ligamiento de oxima no catalizada versus catalizada con reacción catalizada con adaptada de En una forma de realización de la toluidina t i lan i ina metilanilina o 3 1 t i lbenceno se usa para catalizar las reacciones de conjugación descriptas en la y anilina tienen propiedades físicas similares y esencialmente el mismo valor de pKa Los nucleofílicos de la invención sn útiles para el ligamiento de la oxima mediante una ligadura o formación de hidrazona usando reacciones químicas de la En varias formas de realización de la el catalizador nucleofílico se proporciona en la reacción de conjugación en una concentración de 18 20 30 40 o 50 En una forma de el catalizador nucleofílico se proporciona entre 1 a 10 mM En varias formas de realización de la el rango de pH de la reacción de conjugación es entre y entre y entre y entre y En varias formas de el pH de la reacción de conjugación es pH y En una forma de el pH es entre a Purificación de proteínas conjugadas En varias formas de se desea la purificación de una proteina que se ha incubado con un agente oxidante una proteina terapéutica que se ha conjugado con un derivado de ácido graso hidrosoluble de acuerdo con la Numerosas técnicas de purificación son conocidas en la técnica e sin métodos croma ográ f i co s métodos de filtración y métodos de precipitación por Guide to Protein i f i cat i on Enzymology Vol 463 por Burgess RR y Deutscher 2nd Academic Press Los siguientes ejemplos no se consideran limitantes sino solo ejemplos de formas de realización especificas de la Ejemplos Ejemplo 1 Preparación del ligador homobi funcional NH2 OCH2CH2 El ligador homobifuncional NH2 OCH2CH2 1 que contiene dos grupos aminooxi activos se sintetizó de acuerdo con Boturyn et en una reacción orgánica de dos etapas que emplea una síntesis de Gabriel modificada de aminas primarias En la primera etapa una molécula de 2 2 clorodie i léter se hizo reaccionar con dos moléculas de en El producto homobi funcional deseado se preparó a partir del intermediario resultante por hidrazinolsis en Ejemplo 2 Preparación del ligador OCH2CH2 El ligador homobi funcional que contiene dos grupo aminooxi activos se sintetizó de acuerdo con Boturyn et en una reacción orgánica de dos etapas que emplea una síntesis de Gabriel modificada de aminas En la primera etapa una molécula de diclorhidrato de hexaetilen glicol se hizo reaccionar con dos moléculas de en El producto homobi funcional deseado se preparó a partir del intermediario resultante por hidrazinolsis en etanol 3 Preparación del ligador homobifuncional NH2 OCH2CH2 El ligador homobifuncional NH2 OCH2CH2 ONH2 t r i aoxaundecano 1 11 ox ami na que contiene dos grupos activos se sintetizó de acuerdo con Boturyn et 53 5485 92 en una reacción orgánica de dos etapas que emplea una síntesis de Gabriel modificada de aminas En la primera etapa una molécula bi s 2 cío r oe ti 1 ter se hizo reaccionar con dos moléculas en El producto homobifuncional deseado se preparó a partir del intermediario resultante por hidrazinolsis en 4 Preparación de sal sódica de ácido 16 2 2 2 2 El ligador ácido sal sódica de ácido ami noox i e t ox i hexadecanoico se sintetizó de acuerdo con Halligan y Nair 2006 y Hubbs y Heathcock Am en una reacción de dos etapas 1 Sal sódica de ácido oxohexadecanoico A una solución enfriada de ácido hidroxihexadecanoico en di clorometano y tetrahidrofurano se añadió peryodinano de a La mezcla se agitó durante horas a y horas a temperatura ambiente bajo atmósfera de Ar Luego se añadió una solución de tiosulfato de sodio en solución de bicarbonato de sodio la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante El intermediario 1 se extrajo con después de secar con sulfato de sodio la capa orgánica se evaporó a sequedad y se purifica por cromatografía en columna usando gel de sílice como agente de separación y una mezcla de solventes de tolueno acetato de Sal sódica de ácido 2 2 2 2 A una solución de 3 riaoxaundecano 1 11 dioxiamina en tetrahidrofurano anhidro se añadió el Intermediario 1 La mezcla se agitó durante horas a temperatura ambiente bajo atmósfera de Ar Luego la mezcla se evaporó a sequedad y se purifica por cromatografía en columna usando gel de sílice como agente de separación y una mezcla de solventes de diclorometano metanol base de Espectrometría de masa para Ejemplo 5 Preparación de éster metílico del ácido 2 2 El ligador de éster metílico de ácido aminooxi ligador éster del ácido 2 2 se sintetizó de acuerdo con Hang et Chem Soc en una reacción en tres Intermediario Éster metílico del ácido hidroxihexadecanoico A una solución enfriada de ácido hidroxihexadecanoico en metanol anhidro se añadió gota a gota cloruro de acetilo a dentro de 2 luego la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante horas bajo atmósfera de Ar Posteriormente la mezcla se evaporó a el residuo se disolvió en diclorometano se lavó con solución de bicarbonato de sodio saturado y Solución de salmuera Después de secar con sulfato de la fase orgánica recolectada se evaporó a sequedad y se secó al vacio a temperatura Intermediario Ester metílico del ácido me tilsulfonilhexadecanoico A una solución enfriada de intermediario 1 en diclorometano se añadió trietilamina luego a una solución preenfriada de cloruro de mesilo en diclorometano se añadió gota a gota dentro de 10 a La mezcla se agitó durante 30 min a y durante horas a temperatura Luego la mezcla se diluyó con diclorometano se lavó con agua solución de bicarbonato de sodio saturado y solución de salmuera Después de secar con sulfato de sodio la fase orgánica recolectada se evaporó a sequedad y se secó al vacio a temperatura amarillo pálido y Ester metílico del ácido 2 2 2 2 A una solución de 3 6 r aoxa unde cano 1 11 dioxiamina mg en anhidra una solución de intermediario 2 en formamida anhidra se añadió gota a gota durante 1 hora a temperatura ambiente bajo atmósfera de la mezcla se agitó durante 2 días a temperaturas diferentes para completar la Luego la mezcla se evaporó a el producto bruto se purifica por cromatografía en columna usando gel de sílice como agente de separación y a mezcla de solventes de diclorometano metanol blanco parcialmente solificado Espectrometría de masa para Ejemplo 6 Acoplamiento de éster metílico del ácido 2 2 2 al resto carbohidrato del factor de coagulación VIII se prepara por medio de un procedimiento de dos En la primera etapa rFVIII se oxida con NaI04 y se purifica por cromatografía de intercambio aniónico Posteriormente el rFVIII oxidado se modifica con el reactivo rFVIII mg material de se oxida con NaI04 final 200 Después de un tiempo de incubación de 30 minutos la reacción de oxidación se detiene por la adición de una 1 M solución acuosa de 10 El rFVIII oxidado se purifica por cromatografía de intercambio aniónico en EMD Luego se añadieron 25 µ? de una solución de éster metílico de ácido 2 2 2 2 i toxi toxi etoxiamino de acuerdo con el Ejemplo en D SO al eluato de proteina 2 y la reacción de acoplamiento se realiza durante 18 horas a el conjugado de se purifica adicionalmente por HIC en Fenil Sefarosa 4 Finalmente el eluaro se concentra por usando una membrana de 30 Ejemplo 7 Acoplamiento de éster metílico del ácido 2 2 2 2 al resto carbohidrato de factor de coagulación IX Se disuelven 10 mg de rFIX en buffer de reacción 5 mM de 150 mM de f para dar una concentración final de A esta solución se añadió una solución aciuosa de 5 para obtener una concentración final de 100 La mezcla de reacción se incubó durante lh a baoj agitación suave en la Luego la mezcla se carga en columnas de desalini zación equilibradas para extraer el exceso de A esta mezcla se añadieron 8 µ? de una solución de éster metílico del ácido etoxi de acuerdo con el Ejemplo en DMSO y la reacción de acoplamiento se realiza at pH durante 18 h a Luego el conjugado se purifica adicionalmente por IEX en Finalmente el eluato se concentra por usando dispositivos Ejemplo 8 Acoplamiento de éster metílico del ácido 2 2 2 2 al resto carbohidrato de factor de coagulación Vlla Se disuelven 10 mg de rFVIIa en buffer de reacción mM de 150 de cloruro de 5 mM de cloruro de pH para dar una concentración final de A esta solución se añade una solución acuosa 5 mM de para obtener una concentración final de 50 La mezcla de reacción se incuba durante 1 h a bajo agitación suave en la Luego la mezcla se carga en columnas de desalini zación para extraer el exceso de A esta mezcla se añaden 8 de una solución de éster metílico del ácido decanoico de acuerdo con el Ejemplo en DMSO y la reacción de acoplamiento se realiza a pH durante 18 h a Luego el conjugado se purifica adicionalmente por IEX on Finalmente el eluato se concentra por usando dispositivos Vi vaspin Ejemplo 9 Acoplamiento de éster metílico del ácido 2 2 2 2 al resto carbohidrato de factor de coagulación VIII se disuelven 10 rFVIII en buffer Hepes mM de 150 de 5 de cloruro de pH para dar una concentración de proteína de 2 Luego se añaden 10 µ? de una solución de éster metílico del ácido 2 2 2 2 i e i etoxi de acuerdo con el Ejemplo en DMSO a la solución de Posteriormente se prepara una solución acuosa del catalizador nucleofílico y se añade a la mezcla dentro de 15 minutos para obtener una concentración final de 10 m Finalmente se añade una solución acuosa de peryodato de sodio 40 para dar una concentración de 400 La mezcla de reacción se incuba durante 120 minutos en la oscuridad a una temperatura de 22 bajo agitación Luego la reacción se detiene por la adición de una solución acuosa de para dar una concentración final de 10 mM en la mezcla de reacción e incubación durante 60 Posteriormente la mezcla de reacción se carga en una columna IEX cargada con FF x 8 La columna se lava con 20 volúmenes de columna de buffer de equilibrio mM de 5 mM de pH y el Conjugado de se eluye con buffer B mM 5 mM de M de pH Finalmente el producto se somete a con dispositivos Vivaspin usando buffer de 150 mM de 5 mM de pH como buffer de diaf iltración 10 Acoplamiento de éster metílico del ácido 2 2 2 2 aminooxietoxi talresto carbohidrato de factor de coagulación IX Se disuelven 7 rFIX en mM de 150 mM de 5 mM de pH para dar una concentración de proteína de 2 Luego se añaden 7 µ? de una solución de éster metílico del ácido 16 e t iami no de acuerdo con el Ejemplo en DMSO a la solución de Luego se prepara una solución acuosa del catalizador nucleof ilico y se añade a la mezcla dentro de 15 minutos para obtener una concentración final de 10 Finalmente se añade una solución acuosa de peryodato de sodio 40 para dar una concentración de 250 La mezcla de reacción se incuba durante minutos en la oscuridad a una temperatura de 22 bajo agitación Posteriormente la reacción se inactiva por la adición de 5 durante 30 a temperatura El conjugado se purifica por cromatografía de intercambio La mezcla de reacción se diluye con 10 mi de buffer A mM de 5 mM de pH y se carga en una columna 5ml HiTrap Q FF equilibrada con buffer La columna se lava con 5 CV usando el mismo Luego la columna se eluye con buffer B mM de 1 M de 5 mM de pH Las fracciones que contienen el conjugado se concentra por usando una membrana de 10 kD hecha de celulosa La etapa de diaf iltración final se realiza contra buffer Hepes 20 pH que contiene 150 mM de NaCl y 5 mM de Ejemplo 11 Acoplamiento de éster metílico del ácido ico al resto carbohidrato de factor de coagulación Se disuelven 10 rFVIIa en buffer Hepes de 150 de cloruro de 5 de cloruro de pH Luego se añaden 10 µ? de una solución de éster metílico del ácido 2 2 de acuerdo con el Ejemplo en DMSO a la solución de Posteriormente se prepara una solución acuosa del catalizador nucleofilico y se añade a la mezcla dentro de 15 minutos para obtener una concentración final de 10 mM Finalmente se añade una solución acuosa de peryodato de sodio 40 para dar una concentración de 250 µ La mezcla de reacción se incuba durante 120 minutos en la oscuridad a una temperatura de 22 bajo agitación Posteriormente la reacción se inactiva por la adición de 5 durante 30 min a temperatura El conjugado se purifica por cromatografía de intercambio La mezcla de reacción se diluye con 10 mi de buffer A de pH y se carga en una columna 5 mi HiTrap Q FF equilibrada con buffer La columna se lava con 5 CV usando el mismo Luego la columna se eluye con buffer B mM de 1 M de 5 mM de pH Las fracciones que contienen el conjugado se concentran por usando una membrana de 10 hecha de celulosa La etapa de diafiltración final se realiza contra buffer Hepes 20 pH que contiene 150 de NaCl y 5 mM de Ejemplo 12 Acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxi activo a un resto carbohidrato oxidado en presencia de un catalizador nucleofilico También se proporciona el acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxi activo a una proteina terapéutica oxidada como las proteínas expuestas en la Tabla 1 de la Para el acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo los restos carbohidrato de una proteina terapéutica o ver Tabla 3 se oxidan primero con NaI0 200 Luego la reacción se detiene por la adiciión de 5 y los reactivos se separan por Después de la se añade el FA aminooxi reactivo el derivado de usando un exceso de 25 M y la reacción de acoplamiento se realiza a pH durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación suave en presencia del catalizador nucleofilico toluidina 10 Posteriormente la mezcla de reacción se carga en una columna de intercambio iónico La columna se lava con 5 CV de buffer de lavado y el conjugado se eluye con un gradiente lineal de NaCl Finalmente las fracciones que contienen el conjugado se someten a Ejemplo 13 Acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxi activo a un resto carbohidrato oxidado en presencia de un catalizador nucleofilico Para el acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxi al resto carbohidrato de una proteina la proteina o ver Tabla 3 se incuba a pH con 300 durante 1 hora a temperatura ambiente en presencia del catalizador nucleofilico 10 Luego la reacción se detiene por la adición de 5 y la mezcla de reacción se carga en una columna de intercambio iónico La columna se lava con 5 CV buffer de lavado y el conjugado se eluye con se eluye con un gradiente lineal de NaCl Finalmente las fracciones que contienen el conjugado se someten a Ejemplo 14 Acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxi activo a una proteina de coagulación sanguínea oxidada en presencia de un catalizador nucleofílico El acoplamiento de un derivado de FA que contiene un grupo aminooxi activo a una proteína de coagulación sanguínea oxidada como y FVIIa como se describió en los ejemplos se puede realizar en presencia de un catalizador nucleofílico tal como toluidina en un rango concentración de 15 Preparación de un ligador de ácido graso MAL hidrosoluble Un ligador de ácido graso que contiene una cadena de PEG hidrosoluble en y un grupo MAL activo se prepara en una síntesis de dos Etapa Preparación del éster metílico del ácido El ácido disponible en el comercio se esterifica con cloruro de acetilo en metanol durante 5 horas a temperatura ambiente de acuerdo con el Ejemplo 3 para dar el correspondiente éster metílico et Chemical probes for the rapid detection of f proteins in mammalian JACS 2007 Etapa Preparación del ligador de ácido graso MAL El éster metílico del ácido se hace reaccionar con disponible en el comercio 12 IRIS Biotech Marktredwitz que emplea una reacción de Mitsunobu en THF a temperatura ambiente durante la noche et Synthesis of a New Heterobifunctional for Facile Access to a Bioconjugate Chem Ejemplo 16 Preparación de un ligador de ácido graso hidrosoluble NHS Se prepara un ligador de ácido graso que contiene una cadena de PEG hidrosoluble en y un éster de NHS activo terminal por el uso de una síntesis e cuatro etapas Etapa Preparación de éster metílico de ácido bromohexadecanoico El ácido disponible en el comercio se esterifica con metanol y cantidad catalítica de ácido sulfúrico concentrado durante la noche temperatura de reflujo para dar el correspondiente éster metílico et Positionally Organic Racemic versus Enantiomeric and Solvation Eur J Etapa Preparación de éster metílico del ácido El éster metílico del ácido se hace reaccionar con azida sódica en acetonitrilo durante cuatro días a temperatura de reflujo para dar la correspondiente azida et Positionally Isomeric Organic Racemic versus Enantiomeric and Solvation Etapa Preparación del éster metílico del ácido El éster metílico del ácido éster metílico se hidrogena catalíticamente con paladio carbono activado en a 3 bar durante tres horas para la correspondiente amina et Positionally Isomeric Organic Gelation Racemic versus Enantiomeric and Solvation Etapa Preparación del ligador de ácido graso NHS El éster metílico del ácido éster metílico se hace reaccionar con NHS IRIS Biotech Mar redwi t disponible en el comercio en a temperatura ambiente durante tres días para dar el Ligador de ácido graso NHS et The de Hidroxi succinimide A JACS Ejemplo 17 Caracterización analítica de los conjugados de proteína FA Las propiedades de unión de la albúmina de las muestras de rFIX o preparadas de acuerdo con los ejemplos de la presente se verifican in vitro por el uso de sistemas de ensayo inmunoadsorbente enzimático Una placa de 96 pocilios se cubre con un anticuerpo policlonal dirigido contra albúmina sérica bovina La próxima etapa es el bloqueo de la placa ELISA con un buffer de Luego se une HSA al anticuerpo seguido por la unión de la muestra que se diluye a concentraciones Finalmente la muestra se detecta por un anticuerpo o anti FVIIa marcado con La actividad de peroxidasa se detecta por el uso de t e t rame t i 1 d ina como La intensidad de color desarrollada se mide con un lector ELISA a 450 La unión de la muestra a HSA se evalúa por el gráficio de las diferentes concentraciones de muestra en el eje x y sus correspondientes valores de absorbancia en el eje 18 Preparación de un ligador de ácido graso hidrosoluble PEGilado que contiene un grupo amionooxi Un ligador de ácido graso que contiene una cadena de PEG hidrosoluble con un resto aminooxi en la conectada al grupo carboxilo del ácido graso se prepara de una síntesis de tres etapas usando dioxiamina como se describió en el Ejemplo Etapa Preparación de Se hizo reaccionar con de fluorenilmetilo en a temperatura ambiente durante 1 La solución se evaporó a presión reducida y el producto bruto se purificó empleando cromatografía en gel de sílice con diclorometano metanol como la mezcla de solventes para dar dioxiamina protegida con et Synthesis de Fluorescent Probes for the Detection of Abasic Sites in Tetrahedron 1997 Etapa Preparación de hexadecanoico amida Se hace reaccionar luorenilmetoxicarboni éster del ácido de disponible en el comercio en THF a temperatura ambiente durante la noche para dar el conjugado graso protegido con et Synthesis de ceramides using éster de hidroxi succinimidas Journal de Lipid Research Etapa Preparación de hexadecanoico etoxi amida El conjugado de graso protegido con se hace reaccionar con piperidina en di el a temperatura ambiente para dar el de ácido graso desprotegido como producto final et Synthesis of ceramides using Journal of Lipid Research Ejemplo 19 Acoplamiento de un ligador de ácido graso MAL con A1PI Un ligador de graso que contiene un grupo MAL se prepara como se describió en el Ejemplo 15 por la reacción de éster metílico del ácido hidroxihexadecanoico con 12 IRIS disponible en el comercio Biotech empleando una reacción de Este ligador se acopla con el grupo SH libre de Se disuelven 10 mg de A1PI purificado 1 en buffer de reacción de 5 mM de pH y se añaden 10 L de una solución del ligador de ácido graso MAL en DMSO a la solución de La reacción de modificación se realiza durante 2 horas a temperatura ambiente seguida por una etapa de inactivación usando 10 Después de la adición de la mezcla de reacción se incuba bajo agitación suave durante una hora adicional a la misma El A1PI modificado se diluye con buffer de equilibrio de pH para corregir la conductividad de las soluciones a y se carga en una columna HiTrap Q FF con un volumen de columna de 5 Luego la columna se equilibra con 10 CV de buffer de equilibrio de 2 Finalmente el se eluye con un gradiente lineal con buffer de elución mM de 1 M d pH Ejemplo 20 Acoplamiento de un ligador de ácido graso NHS con el factor de coagulación VIII Un ligador de ácido graso que contiene un grupo NHS se prepara como se describió en el Ejemplo 16 por la reacción del éster metílico del ácido hidroxihexadecanoico con HS disponible en el comercio Biotech Marktredwitz Este ligador se acopla añ grupo libre de los residuos de lisina del factor de coagulación Se disuelven 10 mg de rFVIII en buffer Hepes mM de 150 mM de 5 mM de cloruro de pH para dar una concentración de proteína de 2 Luego se añaden 10 de una solución de ligador de ácido graso NHS en DMSO a la solución de La mezcla de reacción se incuba durante 120 minutos en la oscuridad a una temperatura de 22 bajo agitación Luego la reacción se detiene por la adición de una solución de glicina acuosa para dar una concentración final de 20 m en la mezcla de La mezcla se incuba durante 15 a temperatura ambiente bajo agitación suave y posteriormente se carga en una columna IEX llena con Sefarosa FF x 8 La columna se lava con 20 volúmenes de columna buffer de equilibrio mM de 5 mM de pH y el conjugado de rFVIII se eluye con buffer B mM de 5 mM de M de pH Finalmente el producto se somete a con dispositivos vivaspin usando buffer mM de 150 mM de 5 mM de pH como buffer de diaf insufficientOCRQuality

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un derivado de ácido graso hidrosoluble que comprende un ácido graso o éster de ácido graso unido a un ligador hidrosoluble, dicho derivado de ácido graso se une a forma estable a una proteina terapéutica. 2. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 1 que se une a albúmina sérica bovina (HSA) in vitro o in vivo. 3. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que tiene vida media aumentada con respecto a una proteina terapéutica nativa . 4. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 donde el ácido graso es un ácido graso saturado o ácido graso insaturado . 5. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 4 donde el ácido graso es un ácido graso saturado. 6. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 4 donde el ácido graso es un ácido graso de cadena ramificada. 7. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 donde el ácido graso comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en CIO, C12, C14, C16, C18, C20, C22, y C24. 8. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 7 donde el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C14, C16 y C18. 9. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 donde el ácido graso se une al ligador hidrosoluble en un grupo en el ácido graso seleccionado del grupo que consiste en: grupo carboxilo terminal y grupo ?. 10. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 9 donde el ácido graso se une al ligador hidrosoluble al grupo ?. 11. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 10 donde el grupo ? se selecciona del grupo que consiste en: hidroxilo, amino, tio, y carboxilo . 12. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 donde el ácido graso es ácido 16-hidroxihexadecanoi co . 13. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 donde el éster de ácido graso se selecciona del grupo que consiste en: éster metílico y éster etílico. 14. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 13 donde el éster de ácido graso es éster metílico del ácido 16-hidroxihexadecanoico . 15. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 donde el ligador hidrosoluble comprende un polímero hidrosoluble y al menos un grupo funcional unido a la proteína terapéutica . 16. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 15 donde el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en un grupo sulfo, grupo carboxilo, grupo hidroxilo, grupo amino, grupo amido, grupo maleimido, grupo aminooxi y grupo hidrazida . 17. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 16 donde el grupo funcional es un grupo amionooxi . 18. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-17 donde el polímero hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste en: polietilenglicol (PEG) , PEG ramificado, ácido polisiálico (PSA) , hidroxialquil almidón (HAS) , hidroxietil almidón (HES), carbohidrato, polisacáridos , pululano, chitosano, ácido hialurónico, condroitin sulfato, dermatan sulfato, almidón, dextrano, carbox ime t i 1 -dext rano , óxido de o 1 i a 1 qui 1 eno (PAO) , polialquilen glicol (PAG) , polipropilenglicol (PPG) , polioxa zol ina , poliacriloilmorfolina, alcohol polivinilico (PVA) , pol icarbox i lato , polivinilpirrolidona, pol i fos faceno , pol i oxazo 1 ina , anhídrido del ácido pol i e t i 1 en - co -ma 1 e i co , anhídrido del ácido poliestiren-co-maleico , poli ( 1-hidroximetiletilen hidroximetil formal ) (FF) , y fosfato de 2-metacriloiloxi-2' -etil trimetilamonio (MPC) . 19. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 18 donde el polímero hidrosoluble es PEG . 20. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15-17 y 19 donde el polímero hidrosoluble comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en 03, 05, 07, 09, 011, 013 y 015. 21. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 17 donde el ligador hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste en: a) 3-oxapentano-l , 5-dioxiamina de la fórmula: H2 0 NH2 b) 3,6,9-triaoxaundecano-l,ll-dioxiamina de la fórmula c) 3 , 6 , 9 , 12 , 15-penat oxaheptadecano- 1 , 17 -diox iamina de la fórmula : d) 3,6,9,12,15,18,21-heptaoxatricosano-l,23-dioxiamina de la fórmula: 22. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 21 donde el ligador hidrosoluble es 3 , 6 , 9-t r iaoxaundecano- 1 , 11 -diox iamina de la fórmula: 23. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 21 donde el ligador hidrosoluble es 3 , 6 , 9 , 12 , 15-penatoxaheptadecano- 1 , 17 -di oxiamina de la fórmula : derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 donde el derivado de ácido graso se une en forma estable a la proteina terapéutica por una unión oxima. 25. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 24 donde la unión oxima se forma entre un grupo oxima sobre el ligador hidrosoluble y un grupo aldehido de un carbohidrato oxidado sobre la proteina terapéutica . 26. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 donde el derivado de ácido graso une en forma estable la proteina terapéutica con un grupo maleimido sobre el ligador hidrosoluble a un grupo sulfhidrilo libre sobre la proteina terapéutica. 27. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 donde el derivado de ácido graso se une en forma estable a la proteina terapéutica por un éster de N-hidroxisuccinimida sobre el ligador hidrosoluble a un grupo araino libre sobre la proteina terapéutica. 28. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 donde el derivado de ácido graso se selecciona del grupo que consiste en: a) sal sódica del ácido 16- ( 2 - ( 2 - ( 2- (2 -aminooxietoxi) -etoxi) -etoxi) -etoxiimino) -hexadecanoico de la fórmula : b) éster metílico del ácido 16- ( 2 - ( 2- ( 2- (2-aminooxietoxi) -etoxi) -etoxi) -etoxiamino) -hexadecanoico, 29. El derivado de ácido graso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-28 donde la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en: Factor IX (FIX) , Factor VIII (FVIII) , Factor Vlla (FVIIa) , factor de von Willebrand (VWF) , Factor FV (FV) , Factor X (FX), Factor XI (FXI) , Factor XII (FXII) , trombina (FII) , proteína C, proteína S, tPA, PAI-1, factor tisular (TF) , ADAMTS 13 proteasa, IL-1 alfha, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, factor estimulante de colonia 1 (CSF-1) , M-CSF, SCF, GM-CSF, factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) , EPO, inter f erón-al fa (IFN-alfa) , interferón de consenso, IFN-beta, IFN-gamma, IFN-omega, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, I'L-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 alfa, IL-33, trombopoyetina (TPO) , Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, polipéptido tipo angiopoyetina 1 (ANGPTL1) , polipéptido tipo angiopoyetina 2 (ANGPTL2) , polipéptido tipo angiopoyetina 3 (ANGPTL3) , polipéptido tipo angiopoyetina 4 (ANGPTL4) , polipéptido tipo angiopoyetina 5 (ANGPTL5), polipéptido tipo angiopoyetina 6 (ANGPTL6), polipéptido tipo angiopoyetina 7 (ANGPTL7) , vitronectina , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , angiogenina, activina A, activina B, activina C, proteina morfogénica ósea 1, proteina morfogénica ósea 2, proteina morfogénica ósea 3, proteina morfogénica ósea 4, proteina morfogénica ósea 5, proteina morfogénica ósea 6, proteina morfogénica ósea 7, proteina morfogénica ósea 8, proteina morfogénica ósea 9, proteina morfogénica ósea 10, proteina morfogénica ósea 11, proteina morfogénica ósea 12, proteina morfogénica ósea 13, proteina morfogénica ósea 14, proteina morfogénica ósea 15, receptor de la proteina morfogénica ósea IA, receptor de la proteina morfogénica ósea IB, receptor de la proteina morfogénica ósea II, factor neurotrófico derivado del cerebro, cardiot rde ina - 1 , factor neurotrófico ciliar, factor neurotrófico ciliar receptor, cripto, críptico, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina 1, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina 2a, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina 2ß, ß factor de crecimiento celular endotelial, endotelina 1, factor de crecimiento epidérmico, epigen, epiregulina, atrayente de neutrófilos derivado epitelial, factor de crecimiento f ibroblástico 4, factor de crecimiento f ibroblástico 5, factor de crecimiento f ibroblástico 6, factor de crecimiento f ibroblástico 7, factor de crecimiento fibroblástico 8, factor de crecimiento f ibroblástico 8b, factor de crecimiento f ibrobl á s t i co 8c, factor de crecimiento f ibroblástico 9, factor de crecimiento f ibroblástico 10, factor de crecimiento f ibroblástico 11, factor de crecimiento f ibrob 1 á s t i co 12, factor de crecimiento f ibroblástico 13, factor de crecimiento fibroblástico 16, factor de crecimiento f ibroblásti co 17, factor de crecimiento f ibr oblá s t i co 19, factor de crecimiento f ibroblástico 20, factor de crecimiento fibroblástico 21, factor de crecimiento f ibroblástico ácido, factor de crecimiento f ibroblástico básico, receptor del factor neurotrófico derivado de linea celular glial al, receptor del factor neurotrófico derivado de linea celular glial OÍ2, proteina relacionada con el crecimiento, proteina relacionada con el crecimiento , proteina relacionada con el crecimiento ß, proteina relacionada con el crecimiento ?, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento derivado de hepatoma, factor de crecimiento tipo insulina I, receptor del factor de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento tipo insulina II, proteina de unión al factor de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor inhibidor de leucemia, receptor del factor inhibidor de leucemia a, factor de crecimiento nervioso, receptor del factor de crecimiento nervioso, neuropoyetina, neurotrdeina 3, neurotrdeina 4, oncostatina M (OSM) , factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento placentario 2, factor de crecimiento celular endotelial derivado de plaqueta, factor de crecimiento derivado de plaqueta, factor de crecimiento derivado de plaqueta de cadena A, factor de crecimiento derivado de plaqueta AA, factor de crecimiento derivado de plaqueta AB, factor de crecimiento derivado de plaqueta de cadena B, factor de crecimiento derivado de plaqueta BB, receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta a, receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta ß, factor estimulante del crecimiento de las células pre-B, factor de células madre (SCF) , receptor del factor de células madre, TNF, TNFO, TNF1, TNF2, factor de crecimiento transformante a, factor de crecimiento transformante ß, factor de crecimiento transformante ß?, factor de crecimiento transformante (31,2, factor de crecimiento transformante ß2, factor de crecimiento transformante ß3, factor de crecimiento transformante ß5, factor de crecimiento transformante latente ß?, proteina de unión al factor de crecimiento transformante ß I, proteina de unión al factor de crecimiento transformante ß II, proteína de unión al factor de crecimiento transformante ß III, linfopoyetina del estroma tímico (TSLP) , receptor del factor de necrosis tumoral I, receptor del factor de necrosis tumoral II, receptor del activador de plasminógeno tipo uroquinasa, proteína activadora de fosfolipasa (PUP) , insulina, lectinas, ricina, prolactina, gonadotropina coriónica, hormona estimulante folicular, hormona estimulante tiroideo, activador del plasminógeno tisular, IgG, IgE, IgM, IgA, y IgD, -galactosidasa, ß-galactosidasa , DNAsa, fetuina, hormona luteini zante , estrógeno, insulina, albúmina, lipoproteí ñas , fetoproteí na , trans ferrina , trombopoye tina , uroquinasa, integrina, trombina, leptina, Humira ( ada 1 imumab ) , Prolia ( denosuma ) , Enbrel (etanercept) , una proteína de la Tabla 1, o un fragmento, derivado biológicamente activo o variante de esta . 30. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 29 donde la proteina terapéutica es FVIIa . 31. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 29 donde la proteina terapéutica es FVIII . 32. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 29 donde la proteina terapéutica es Fix . 33. Un método de preparar un derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende: a) oxidar un grupo ?-hidroxi en un ácido graso para generar un grupo aldehido sobre el ácido graso; y b) acoplar un ligador hidrosoluble que comprende un grupo aminooxi activo al grupo aldehido para formar una unión oxima estable; donde dicho derivado de ácido graso es hidrosoluble . 34. El método de acuerdo con la reivindicación 33 donde el grupo ?-hidroxi está oxidado por un reactivo de oxidación seleccionado del grupo que consiste en: reactivo peryodinano de Dess Martin, reactivo de Tempo, cloruro de oxalilo/DMSO, perrutenato de tetrapropi lamonio (TPAP) y reactivos de cromo VI (reactivo de Collins, clorocromato de piridinio (PCC) y dicromato de piridinio) . 35. El método de acuerdo con la reivindicación 34 donde el reactivo de oxidación es peryodinano de Dess Martin. 36. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-35 donde el ácido graso es un ácido graso saturado o ácido graso insaturado. 37. El método de acuerdo con la reivindicación 36 donde el ácido graso es un ácido graso saturado. 38. El método de acuerdo con la reivindicación 36 donde el ácido graso es un ácido graso de cadena rami f icada . 39. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-37 donde el ácido graso comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en CIO, C12, C14, C16, C18, C20, C22, y C24. 40. El método de acuerdo con la reivindicación 39 donde el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en C14, C16 y C18. 41. El método de acuerdo con la reivindicación 40 donde el ácido graso es ácido 16-hidroxihexadecanoico. 42. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-41 donde el ligador hidrosoluble comprende un polímero hidrosoluble y al menos un grupo amionooxi . 43. El método de acuerdo con la reivindicación 42 donde el polímero hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste en: polietilenglicol (PEG) , PEG ramificado, ácido polisiálico (PSA) , hidroxialquil almidón (HAS), hidroxietil almidón (HES) , carbohidrato, pol i sacár idos , pululano, chitosano, ácido hialurónico, condroitin sulfato, dermatan sulfato, almidón, dextrano, carboximetil-dextrano, óxido de polialquileno (PAO) , polialquilen glicol (PAG) , polipropilenglicol (PPG) , po 1 i oxa zol ina , poliacriloilmorfolina, alcohol polivinílico (PVA) , po 1 i ca rbox i 1 a o , polivinilpirrolidona, pol i fos faceno , pol ioxazol ina , anhídrido del ácido polietilen-co-maleico, anhídrido del ácido pol ie s ti ren-co-ma le i co , poli ( 1-hidroximetiletilen hidroximetilformal) (FF) , y fosfato de 2 -me t a cr i lo i 1 o i -2' -etiltrimetilamonio (MPC) . 44. El método de acuerdo con la reivindicación 43 donde el polímero hidrosoluble es PEG. 45. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 42 o 44 donde el polímero hidrosoluble comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en 05, 07, 09, 011, 013 y 015. 46. El método de acuerdo con la reivindicación 45 donde el ligador hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste en: a) 3-oxapentano-l , 5-dioxiamina de la fórmula: H2N O NH b) 3 , 6 , 9- t i aoxaunde cano- 1 , 11 -diox i ami na de la fórmula : 3, 6, 9, 12, 15-penatoxaheptadecano-l, 17-dioxiamina de la fórmula d) 3,6,9,12,15,18,21-heptaoxatricosano-l,23-dioxiamina de la fórmula: NH, H2N 47. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 46 donde el ligador hidrosoluble es 3 , 6 , 9- triaoxaundecano- 1 , 11 -dioxiamina de la fórmula: ,0, ,0, .NH- O' O' 48. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 46 donde el ligador hidrosoluble 3, 6, 9 , 12, 15-pentaoxaheptadecano-l, 17-dioxiamina de fórmula : 49. Un método de preparar a derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende: a) esterificar un grupo carboxilo en un ácido graso para generar un éster en el ácido graso; b) activar un grupo ?-hidroxi en un ácido graso para generar un grupo mesilo en el ácido graso de la etapa a ) ; y c) acoplar un ligador hidrosoluble que comprende un grupo aminooxi activo por la sustitución del grupo mesilo de la etapa b) de. este modo se forma un enlace de oxiimina-metileno estable; donde dicho derivado de ácido graso es hidrosoluble . 50. El método de acuerdo con la reivindicación 49 donde el grupo carboxilo se esterifica con un agente es ter i f i cante seleccionado del grupo que consiste en: cloruro de acetilo, metanol en presencia de ácido, etanol en presencia de ácido, diazometano, y yoduro de metilo . 51. El método de acuerdo con la reivindicación 50 donde el agente e s te i f i cante es cloruro de acetilo. 52. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 49-51 donde el grupo ?-hidroxi se activa con un agente de activación seleccionado del grupo que consiste en: cloruro de mesilo, cloruro de tosilo y cloruro de nosilo. 53. El método de acuerdo con la reivindicación 52 donde el agente de activación es cloruro de mesilo. 54. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 49-53 donde el ácido graso es un ácido graso saturado o ácido graso insaturado. 55. El método de acuerdo con la reivindicación 54 donde el ácido graso es un ácido graso saturado. 56. El método de acuerdo con la reivindicación 54 donde el ácido graso es un ácido graso de cadena rami f i cada . 57. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 49-54 donde el ácido graso comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en CIO, C12, C14, C16, C18, C20, C22, y C24. 58. El método de acuerdo con la reivindicación 57 donde el ácido graso tiene una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en: C14, C16 y C18. 59. El método de acuerdo con la reivindicación 58 donde el ácido graso es ácido 16-hidroxihexadecanoico. 60. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 49-59 donde el ligador hidrosoluble comprende un polímero hidrosoluble y al menos un grupo amionooxi . 61. El método de acuerdo con la reivindicación 60 donde el polímero hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste en: po 1 ie t i lengl i col (PEG) , PEG ramificado, ácido polisiálico (PSA) , hidroxialquil almidón (HAS) , hidroxietil almidón (HES) , carbohidrato, pol i sacár idos , pululano, chitosano, ácido hialurónico, condroitin sulfato, dermatan sulfato, almidón, dextrano, carboximet il -dextrano , óxido de po 1 ial qui leño (PAO) , polialquilen glicol (PAG) , polipropilenglicol (PPG) , pol ioxa zol ina , pol iacr i 1 oilmor f ol i na , alcohol polivinílico ¦ (PVA) , po 1 i ca rboxi la t o , polivinilpirrolidona , pol i fos fa ceno , pol ioxa zo 1 ina , anhídrido del ácido poli et i len-co-ma le i co , anhídrido del ácido polies tiren-co-maleico , pol i ( 1 - hidrox ime t i 1 e t i 1 en hidrox imet i 1 forma 1 ) (FF) , y fosfato de 2 -metacr i loi loxi -2 ' -etiltrimetilamonio (MPC) . 62. El método de acuerdo con la reivindicación 61 donde el polímero hidrosoluble es PEG. 63. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 60 o 62 donde el polímero hidrosoluble comprende una longitud de cadena seleccionada del grupo que consiste en 03, 05, 07, 09, 011, 013 y 015. 64. El método de acuerdo con la reivindicación 63 donde el ligador hidrosoluble se selecciona del grupo que consiste en: a) 3-oxapentano-l , 5-dioxiamina de la fórmula: H2N O r b) 3 , 6 , 9-t r iaoxaunde cano- 1 , 11 -dioxiamina de la fórmula : c) 3,6,9,12,15-penatoxaheptadecano-l,17-dioxiamina de la fórmula: d) 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21-heptaoxatricosano-l, 23 dioxiamina de la fórmula: 65. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 64 donde el ligador hidrosoluble es 3 , 6 , 9- r iaoxaunde cano- 1 , 11 -dioxiamina de la fórmula: 66. El derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 64 donde el ligador hidrosoluble es 3 , 6 , 9 , 12 , 15-pena t oxahept ade cano - 1 , 17 -di oxi amina de la fórmula : 67. Un método de preparar una proteina terapéutica conjugada que comprende poner en contacto un resto carbohidrato oxidado de la proteina terapéutica con un derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 1 en condiciones que permiten la conjugación; dicho resto carbohidrato oxidado por la incubación con un buffer que comprende un agente oxidante seleccionado del grupo que consiste en peryodato de sodio (NaI04) , tetraacetato de plomo (Pb(0Ac)4 ) y perrutenato de potasio (KRu04) ; donde se forma una unión oxima entre el resto carbohidrato oxidado y el grupo aminooxi activo on el derivado de ácido graso; y donde dicha formación de la unión oxima está catalizada por un catalizador nucleofilico seleccionado del grupo que consiste en anilina, ácido o-amino benzoico, ácido m-amino benzoico, ácido p-amino benzoico, ácido sulfanilico, o-aminobenzamida , o-toluidina, m-toluidina, p-toluidina, o-anisidina, m-anisidina, y p-anisidina. 68. El método de acuerdo con la reivindicación 67 donde la proteina terapéutica es seleccionada del grupo que consiste en: Factor IX (FIX) , Factor VIII (FVIII) , Factor Vlla (FVIIa) , factor de von Willebrand (VWF) , Factor FV (FV) , Factor X ( F ) , Factor XI (FXI) , Factor XII (FXII) , trombina (FII) , proteina C, proteina S, tPA, PAI-1, factor tisular ( TF) , ADAMTS 13 proteasa, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, factor estimulante de colonia 1 (CSF-1) , M-CSF, SCF, GM-CSF, factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) , EPO, inter ferón-alfa (IFN-alfa) , interferón de consenso, IFN-beta, IFN-gamma, IFN-omega, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 alfa, IL-33, trombopoyetina (TPO) , Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, polipéptido tipo angiopoyetina 1 (ANGPTL1) , polipéptido tipo angiopoyetina 2 (ANGPTL2) , polipéptido tipo angiopoyetina 3 (ANGPTL3) , polipéptido tipo angiopoyetina 4 ( ANGPTL4 ) , polipéptido tipo angiopoyetina 5 (ANGPTL5), polipéptido tipo angiopoyetina 6 (ANGPTL6), polipéptido tipo angiopoyetina 7 (ANGPTL7) , vitronectina , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , angiogenina, activina A, activina B, activina C, proteína morfogénica ósea 1, proteína morfogénica ósea 2, proteína morfogénica ósea 3, proteína morfogénica ósea 4, proteína morfogénica ósea 5, proteína morfogénica ósea 6, proteína morfogénica ósea 7, proteína morfogénica ósea 8, proteína morfogénica ósea 9, proteína morfogénica ósea 10, proteína morfogénica ósea 11, proteína morfogénica ósea 12, proteína morfogénica ósea 13, proteína morfogénica ósea 14, proteína morfogénica ósea 15, receptor de la proteína morfogénica ósea IA, receptor de la proteína morfogénica ósea IB, receptor de la proteína morfogénica ósea II, factor neurotrófico derivado del cerebro, cardiotrdeina-1 , factor neurotrófico ciliar, factor neurotrófico ciliar receptor, cripto, críptico, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina 1, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina 2o¡, factor quimiotáctico de neutrófilos inducido por citoquina 2ß, ß factor de crecimiento celular endotelial, endotelina 1, factor de crecimiento epidérmico, epigen, epiregulina, atrayente de neutróf ilos derivado epitelial, factor de crecimiento fibroblástico 4, factor de crecimiento f ibroblást ico 5, factor de crecimiento f ibroblástico 6, factor de crecimiento f ibroblástico 7, factor de crecimiento fibroblástico 8, factor de crecimiento f ibroblástico 8b, factor de crecimiento f ibroblástico 8c, factor de crecimiento f ibroblástico 9, factor de crecimiento fibroblástico 10, factor de crecimiento f i r obl ás t i co 11, factor de crecimiento f ibroblástico 12, factor de crecimiento f ibroblástico 13, factor de crecimiento fibroblástico 16, factor de crecimiento f ibroblástico 17, factor de crecimiento f ibroblástico 19, factor de crecimiento f ibroblástico 20, factor de crecimiento fibroblástico 21, factor de crecimiento f ibroblás ti co ácido, factor de crecimiento f ibroblástico básico, receptor del factor neurotrófico derivado de linea celular glial al, receptor del factor neurotrófico derivado de linea celular glial a2, proteína relacionada con el crecimiento, proteína relacionada con el crecimiento a, proteína relacionada con el crecimiento ß, proteína relacionada con el crecimiento ?, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento derivado de hepatoma, factor de crecimiento tipo insulina I, receptor del factor de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento tipo insulina II, proteina de unión al factor de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento de queratinocitos , factor inhibidor de leucemia, receptor del factor inhibidor de leucemia , factor de crecimiento nervioso receptor del factor de crecimiento nervioso, neuropoye t ina , neuro t rde i na 3, neurotrdeina 4, oncostatina M (OS ) , factor de crecimiento placentario, factor de crecimiento placentario 2, factor de crecimiento celular endotelial derivado de plaqueta, factor de crecimiento derivado de plaqueta, factor de crecimiento derivado de plaqueta de cadena A, factor de crecimiento derivado de plaqueta AA, factor de crecimiento derivado de plaqueta AB, factor de crecimiento derivado de plaqueta de cadena B, factor de crecimiento derivado de plaqueta BB, receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta , receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta ß, factor estimulante del crecimiento de las células pre-B, factor de células madre (SCF) , receptor del factor de células madre, TNF, TNFO, TNF1 , TNF2, factor de crecimiento transformante a, factor de crecimiento transformante ß, factor de crecimiento transformante ß?, factor de crecimiento transformante ß1,2, factor de crecimiento transformante ß2, factor de crecimiento transformante ß3, factor de crecimiento transformante ß5, factor de crecimiento transformante latente ß?, proteina de unión al factor de crecimiento transformante ß I, proteína de unión al factor de crecimiento transformante ß II, proteína de unión al factor de crecimiento transformante ß III, linfopoyetina del estroma tímico (TSLP) , receptor del factor de necrosis tumoral I, receptor del factor de necrosis tumoral II, receptor del activador de plasminógeno tipo uroquinasa, proteína activadora de fosfolipasa (PUP) , insulina, lectina ricina, prolactina, gonadotropina coriónica, hormona estimulante folicular, hormona estimulante tiroideo, activador del plasminógeno tisular, IgG, IgE, IgM, igA, y IgD, a-galactos idasa , ß-galactosidasa, ADNasa, fetuin, hormona luteinizante , estrógeno, insulina, albúmina, lipoproteí ñas , fetoproteí na , t rans fer r ina , trombopoyetina , uroquinasa, integrina, trombina, leptina, Humira ( ada 1 imuma ) , Prolia (denosumab), Enbrel ( etanercept ) , una proteína de la Tabla 1, o un fragmento, derivado biológicamente activo o variante de esta. 69. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 67-68'. 70. El método de acuerdo con cualquiera de las rei indicaciones 67-69 donde la proteína terapéutica es FVIIa . 71. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 67-69 donde la proteina terapéutica es FVIII. 72. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 67-69 donde la proteína terapéutica es FIX . 73. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 67-72 donde el agente oxidante es peryodato de sodio (NaI04) . 74. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 67-73 donde el catalizador nucleofilico es m-toluidina. 75. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 67-74 que además comprende purificar la proteína terapéutica conjugada. 76. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 67-75 donde el derivado de ácido graso se prepara por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-47. 77. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 67-75 donde el derivado de ácido graso se prepara por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 49-66. 78. Un método de preparar a derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende: a) esterificar un grupo carboxilo de un ácido graso para generar un éster en el ácido graso; y b) acoplar un ligador hidrosoluble que comprende un grupo maleimido activo a un grupo sulfhidrilo (SH) libre, de este modo se forma un enlace tioéter estable; donde dicho derivado de ácido graso es hidrosoluble . 79. Un método de preparar a derivado de ácido graso de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende: a) esterificar un grupo carboxilo en un ácido graso para generar el éster de ácido graso; b) hacer reaccionar el ácido graso resultante de la etapa a) con un reactivo azida de este modo se produce una correspondiente azida del ácido graso; c) hidrogenar la azida del ácido graso de la etapa b) para producir una correspondiente amina del ácido graso; y d) acoplar un ligador hidrosoluble que comprende un grupo NHS activo a un grupo amina libre de este modo se forma un enlace estable; donde dicho derivado de ácido graso es hidrosoluble.