CN112375747B - 一种鸭病毒性肝炎病毒疫苗株、疫苗及疫苗制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗、预防、减缓或控制鸭病毒性肝炎的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株，包括微生物保藏号为CGMCC No.19696的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株和微生物保藏号为CGMCC No.19695的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株，该疫苗株免疫原性良好。本发明还公开了以前述疫苗株为免疫原的灭活疫苗组合物及其制备方法。该疫苗组合物特异性好，安全有效。

Description

一种鸭病毒性肝炎病毒疫苗株、疫苗及疫苗制备方法
技术领域
本发明属于生物制品领域，涉及一种鸭病毒性肝炎病毒疫苗株、疫苗及疫苗制备方法，特别涉及Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒单苗和二价灭活疫苗及制备方法。
背景技术
我国鸭存栏量每年约40亿只。鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)引起的雏鸭的急性、致死性传染病，以发病急、肝肿大、出血和高度致死率为特征。主要感染21日龄以内的雏鸭，引起典型的肝炎症状，雏鸭死亡率高达80％以上，传播迅速，呈广泛性分布。DHV系小RNA病毒，属无囊膜的单股正链RNA病毒。DHV有3个血清型，Ⅰ型(1型)、Ⅱ型(2型)和Ⅲ型(3型)，Ⅰ型(古典型)鸭病毒性肝炎病毒最早于1950年由Levine等从美国分离到，并分布于世界各养鸭国家；Ⅱ型鸭病毒性肝炎病毒最早于1956年从英国分离到，并且主要发生于英国，Ⅱ型病毒与Ⅰ型病毒无抗原相关性；Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒于1969年发现于美国纽约市长岛地区，并一直局限于该地区，Ⅱ型和Ⅲ型病毒与Ⅰ型病毒无抗原关系。1963年我国黄均建等报道该病在上海地区的发生与流行情况，随后许多省市陆续有该病的报道。
2008年，DHV被重新命名为鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)。DHAV分为A、B、C三个基因型，分别对应DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3，具OIE报道亚洲主要流行鸭肝炎Ⅰ型及其变异株，即鸭甲肝病毒，该病主要危害3周龄以内雏鸭，发病急，死亡率高，尤其是1～2周龄的雏鸭发病率和死亡率较高，死亡率可达30％以上，是危害养鸭业重要传染病之一。
该病全年任何季节都能够发生，我国南方多在2-5月和9-10月间，北方多在4-8月间，其中主要发生于孵化季节，且只要发生就会在雏鸭群中快速传播，发病率能够达到100％。临床上以发病急、传播快、死亡率高，剖检肝脏有明显出血点和出血斑为特征。
在疫苗研究方面，研究人员就卵黄抗体和全病毒灭活疫苗以及致弱活疫苗进行了大量的研究工作。目前资料表明，研究人员或疫苗生产企业主要利用鸭胚、鸡胚、鸭胚成纤维细胞等细胞增殖病毒。
发明内容
本发明提供了一种鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗制备的方法及其疫苗，病毒接种所用细胞系为DF-1细胞系(鸡胚成纤维细胞系)，病毒培养采用生物反应器以全悬浮方式培养；并经过1)毒种选育；2)建立毒种种子批；3)制备细胞毒液；4)灭活病毒；5)乳化等步骤完成疫苗的制备。
研究结果表明，利用鸭胚或鸡胚进行培养的鸭病毒性肝炎病毒的病毒含量低，原辅料稳定性差，工艺复杂。
针对现有技术存在的问题，本研究的目的在于提供一种生产细胞源鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗(Ⅰ型LSE株+Ⅲ型QZE株)的方法及其产品，该方法具有生产工艺稳定、批间差异小、质量可控、可显著提高疫苗产量和质量的优点，利用本发明提供的方法生产出的疫苗具有较高品质，并降低生产成本。
本发明第一方面提供了一种用于治疗、预防、减缓或控制鸭病毒性肝炎的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株，所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗株为Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株和/或Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株；
所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19696的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株；
所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19695的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株。
本发明第二方面提供了一种用于治疗、预防、减缓或控制鸭病毒性肝炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物以本发明第一方面所述的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株为免疫原。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物的原料包括所述免疫原和辅料。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物包括所述免疫原的用量和所述辅料的用量比为1500-4500×107.0ELD50:165-450g(比如，1700×107.0ELD50、1900×107.0ELD50、2100×107.0ELD50、2300×107.0ELD50、2500×107.0ELD50、2700×107.0ELD50、2900×107.0ELD50、3100×107.0ELD50、3300×107.0ELD50、3500×107.0ELD50、3700×107.0ELD50、3900×107.0ELD50、4100×107.0ELD50、4300×107.0ELD50)。
在一些实施方式中，所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的ELD50是基于鸭胚培养根据Reed-Muench法计算得到的。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物为灭活疫苗组合物。
在一些实施方式中，所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗株为灭活的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株，所述灭活的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株为灭活的所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株和/或灭活的所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株。
在一些实施方式中，所述灭活的所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的制备方法为：将所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液与灭活剂混合，得到所述灭活的所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液；和/或
所述灭活的所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的制备方法为：将所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液与灭活剂混合，得到所述灭活的所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液。
在一些实施方式中，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液中所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的含量为106.0-7.5ELD50/0.2ml(比如，106.2ELD50/0.2ml、106.4ELD50/0.2ml、106.6ELD50/0.2ml、106.8ELD50/0.2ml、107.0ELD50/0.2ml、107.2ELD50/0.2ml、107.4ELD50/0.2ml)；和/或
所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液中所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的含量为106.0-7.5ELD50/0.2ml(比如，106.2ELD50/0.2ml、106.4ELD50/0.2ml、106.6ELD50/0.2ml、106.8ELD50/0.2ml、107.0ELD50/0.2ml、107.2ELD50/0.2ml、107.4ELD50/0.2ml)。
在一些实施方式中，所述灭活剂选自甲醛水溶液、β-丙内酯中的一种或两种的组合。
在一些实施方式中，所述灭活剂为浓度为35-40％(比如，36％、37％、38％、39％)的甲醛水溶液。
在一些实施方式中，所述灭活剂的用量为所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液和/或所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液的0.10-0.20v/v％(比如，0.12v/v％、0.14v/v％、0.16v/v％、0.18v/v％)。
在一些实施方式中，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液是所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液经破碎得到的；和/或
所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液是所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液经破碎得到的。
在一些实施方式中，所述破碎选自冻融、超声波处理或高压细胞破碎机破碎。
在一些实施方式中，所述冻融的次数为1-5次。
在一些实施方式中，所述破碎之后对所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液进行除细胞处理；和/或
所述破碎之后对所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液进行除细胞处理。
在一些实施方式中，所述除细胞处理选自或离心除细胞或过滤除细胞。
在一些实施方式中，采用多层无菌纱布进行所述过滤除细胞。
在一些实施方式中，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液和/或所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液的制备方法为：
以细胞系悬浮培养Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批和/或Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批。
在一些实施方式中，所述细胞系为鸡胚成纤维细胞系。
在一些实施方式中，所述鸡胚成纤维细胞系为DF-1细胞系。
在一些实施方式中，所述悬浮培养的培养基为：无血清DMEM-F12培养基。在一些实施方式中，所述悬浮培养的温度为35～37℃。
在一些实施方式中，所述悬浮培养的pH为7.0～7.5。
在一些实施方式中，所述悬浮培养的转数为90-150rpm。
在一些实施方式中，所述细胞系的密度为3×106.0-7×106.0/L(比如，4×106.0/L、5×106.0/L、6×106.0/L)时，接种所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批和/或Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批。
在一些实施方式中，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批和/或所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批的接种密度为：按病毒与细胞培养基体积比为1/10000-5/1000之间(比如，1/9000、1/8000、1/7000、1/6000、1/5000、1/4000、1/3000、1/2000、1/1000)接种。
在一些实施方式中，接种所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批和/或所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批96-144h(比如，100h、110h、120h、130h、140h)后和/或细胞活力下降到40％以下，收获所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液和/或所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液。
在一些实施方式中，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液中，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的含量为107.0-8.0ELD50/0.2ml(比如，107.1ELD50/0.2ml、107.2ELD50/0.2ml、107.3ELD50/0.2ml、107.4ELD50/0.2ml、107.5ELD50/0.2ml、107.6ELD50/0.2ml、107.7ELD50/0.2ml、107.8ELD50/0.2ml、107.9ELD50/0.2ml)；和/或
所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液中，所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的含量为107.0-8.0ELD50/0.2ml(比如，107.1ELD50/0.2ml、107.2ELD50/0.2ml、107.3ELD50/0.2ml、107.4ELD50/0.2ml、107.5ELD50/0.2ml、107.6ELD50/0.2ml、107.7ELD50/0.2ml、107.8ELD50/0.2ml、107.9ELD50/0.2ml)。
在一些实施方式中，所述疫苗株的ELD50是基于鸭胚培养根据Reed-Muench法计算得到的。
在一些实施方式中，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批和/或所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批的制备方法为：
将所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系适应株以细胞系悬浮培养到F8～F10代，形成所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批；和/或
将所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系适应株以细胞系悬浮培养到F13～F15代，形成所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批。
在一些实施方式中，将所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系在DF-1细胞系中连续传代，得到所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系适应株；和/或
将所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系在DF-1细胞系中连续传代，得到所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系适应株。
在一些实施方式中，以无血清DMEM-F12培养基为培养液，将所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系在DF-1细胞系中连续传1-15代，得到所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系适应株；和/或
以无血清DMEM-F12培养基为培养液，将所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系在DF-1细胞系中连续传1-15代，得到所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系适应株。
在一些实施方式中，所述辅料包括油脂类佐剂、第一种乳化剂和第二种乳化剂。
在一些实施方式中，所述油脂类佐剂选自白油。
在一些实施方式中，所述第一种乳化剂选自司本-80。
在一些实施方式中，所述第二种乳化剂选自吐温-80。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物的成分按照用量比包括：
Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：油脂类佐剂：第一种乳化剂：第二种乳化剂＝750-2250×107.0ELD50:750-2250×107.0ELD50:150-400g:10-30g:5-20g(比如，800×107.0ELD50、900×107.0ELD50、1000×107.0ELD50、1100×107.0ELD50、1200×107.0ELD50、1300×107.0ELD50、1400×107.0ELD50、1500×107.0ELD50、1600×107.0ELD50、1700×107.0ELD50、1800×107.0ELD50、1900×107.0ELD50、2000×107.0ELD50、2100×107.0ELD50、2200×107.0ELD50：800×107.0ELD50、900×107.0ELD50、1000×107.0ELD50、1100×107.0ELD50、1200×107.0ELD50、1300×107.0ELD50、1400×107.0ELD50、1500×107.0ELD50、1600×107.0ELD50、1700×107.0ELD50、1800×107.0ELD50、1900×107.0ELD50、2000×107.0ELD50、2100×107.0ELD50、2200×107.0ELD50：160g、180g、200g、220g、240g、260g、280g、300g、320g、340g、360g、380g：12g、14g、16g、18g、20g、22g、24g、26g、28g：6g、8g、10g、12g、14g、16g、18g)。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物的成分按照用量比包括：
Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：油脂类佐剂：第一种乳化剂：第二种乳化剂＝1500-4500×107.0ELD50:150-400g:10-30g:5-20g(比如，1700×107.0ELD50、1900×107.0ELD50、2100×107.0ELD50、2300×107.0ELD50、2500×107.0ELD50、2700×107.0ELD50、2900×107.0ELD50、3100×107.0ELD50、3300×107.0ELD50、3500×107.0ELD50、3700×107.0ELD50、3900×107.0ELD50、4100×107.0ELD50、4300×107.0ELD50：160g、180g、200g、220g、240g、260g、280g、300g、320g、340g、360g、380g：12g、14g、16g、18g、20g、22g、24g、26g、28g：6g、8g、10g、12g、14g、16g、18g)。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物的成分按照用量比包括：
Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：油脂类佐剂：第一种乳化剂：第二种乳化剂＝1500-4500×107.0ELD50:150-400g:10-30g:5-20g(比如，1700×107.0ELD50、1900×107.0ELD50、2100×107.0ELD50、2300×107.0ELD50、2500×107.0ELD50、2700×107.0ELD50、2900×107.0ELD50、3100×107.0ELD50、3300×107.0ELD50、3500×107.0ELD50、3700×107.0ELD50、3900×107.0ELD50、4100×107.0ELD50、4300×107.0ELD50：160g、180g、200g、220g、240g、260g、280g、300g、320g、340g、360g、380g：12g、14g、16g、18g、20g、22g、24g、26g、28g：6g、8g、10g、12g、14g、16g、18g)。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物的成分按照用量比包括：
Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：油脂类佐剂：第一种乳化剂：第二种乳化剂＝1410×107.0ELD50:1410×107.0ELD50:285g:15g:12g。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物的成分按照用量比包括：
Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：油脂类佐剂：第一种乳化剂：第二种乳化剂＝2820×107.0ELD50:285g:15g:12g。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物的成分按照用量比包括：
Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：油脂类佐剂：第一种乳化剂：第二种乳化剂＝2820×107.0ELD50:285g:15g:12g。
本发明第三方面提供了本发明第二方面所述疫苗组合物的制备方法，所述制备方法为：以所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗株为免疫原，制备所述疫苗组合物。
在一些实施方式中，所述制备方法为：将所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗株与所述辅料混合，制备所述疫苗组合物。
在一些实施方式中，所述制备方法为：将灭活的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株与所述辅料混合，制备所述疫苗组合物。
在一些实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：
(a)油相佐剂的制备：
将所述油脂类佐剂与第一种乳化剂混合，得到油相佐剂；
(b)水相的制备：
将灭活的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株与第二种乳化剂混合，得到水相；
(c)混合：
将所述油相佐剂与所述水相混合，得到所述疫苗组合物。
在一些实施方式中，在步骤(a)中，在20-25℃(比如，21℃、22℃、23℃、24℃)条件下，将所述油脂类佐剂与所述乳化剂混合，得到所述油相佐剂。
在一些实施方式中，在步骤(a)中，将所述油脂类佐剂与所述乳化剂混合，搅拌，得到所述油相佐剂。
在一些实施方式中，在步骤(a)中，将所述油脂类佐剂与所述乳化剂混合，灭菌，得到所述油相佐剂。
在一些实施方式中，在步骤(b)中，将所述灭活的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株与第二种乳化剂混合，搅拌，得到所述水相。
在一些实施方式中，在步骤(c)中，将所述油相佐剂与所述水相混合，搅拌，得到所述疫苗组合物。
在一些实施方式中，在步骤(c)中，将所述疫苗组合物与防腐剂混合，得到防腐的疫苗组合物。
在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述防腐剂选自硫柳汞。
在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述防腐剂在所述疫苗组合物中的终浓度为0.005-0.015w/v％(比如，0.007w/v％、0.009w/v％、0.011w/v％、0.013w/v％)。
本发明第四方面提供了一种本发明第一方面所述的疫苗株、本发明第二方面所述的疫苗组合物或本发明第三方面所述的制备方法在制备用于单独使用，用于与其他免疫制剂和/或药物联合使用，或用作与其他免疫制剂和/或药物组成的复方制剂的组分以治疗、预防、减缓和/或控制Ⅰ型鸭病毒性肝炎和/或Ⅲ型鸭病毒性肝炎的制剂中的用途。
制备疫苗免疫鸭的结果表明，经DF-1细胞培养的病毒，其抗原性和免疫原性无明显的改变。利用DF-1细胞悬浮培养工艺克服了利用鸭胚生产存在的工艺复杂问题，达到了工艺简单稳定、易放大、节省人力和疫苗批次差异小的目的。利用反应器全悬浮DF-1细胞工艺培养的鸭肝炎病毒，制备成的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗质量高、价格低，是一种“物美价廉”的防疫用品。
与现有技术相比，本发明方法具有制备的细胞毒液病毒含量高、生产工艺稳定、智能化控制、可大规模悬浮培养、易操作和成本低等特点，制备的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗(Ⅰ型LSE株+Ⅲ型QZE株)具有安全、副反应低、免疫效力高、批间差异小、检验次数少和成本低等优点，为水禽产业预防鸭病毒性肝炎病发生和流行的理想疫苗，本发明具有如下显著的有益效果：
(1)鸭病毒性肝炎病毒用本发明确定的鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞培养，病毒适应性好和病毒含量高；
(2)用反应器培养鸭病毒性肝炎病毒，显著降低了病毒的扩散风险，具有更好的安全性；
(3)不采用鸭胚培养病毒工艺，不需要孵化器孵化和避免了挑选易感鸭胚的繁琐；
(4)培养的病毒液中仅含有病毒和细胞碎片，与鸭胚增殖病毒方法相比，不需要无害化处理鸭胚组织物，对环境影响小；
(5)利用鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞全悬浮培养的病毒液，其病毒含量高于鸭胚。
(6)全悬浮工艺培养的病毒液成本不到鸭胚工艺的三分之一。
(7)由于不需要鸭胚孵化车间、逐枚接种、逐枚收获等优点，该方法占用空间小，制备流程简单。
(8)用鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞生产的鸭病毒性肝炎病毒病灭活疫苗，安全，副反应小，免疫效力更高，疫苗批间质量差异小。该生产工艺简单稳定、易操作、产量大、培养的半成品病毒含量高、成本低和外源病原污染几率小等特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。
附图说明
图1为本发明Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒二价灭活疫苗制备的技术路线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
定义
临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株：
针对本发明所请求保护的病毒株，很明显，没有突变的传代病毒株属于实质上相同的病毒株，其临床致病性与免疫原性没有变化是指没有实质性变化，由于检测操作条件，动物品种、年龄、性别、健康状况等体现的差别以及可预期的系统误差属于没有实质性变化，属于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株。另外，病毒株传代多次后不可避免引入微小的突变，当突变发生在非编码序列区或者编码区的同义突变或者不影响病毒株致病性和免疫原性的突变(比如，可能是两个结构域之间的连接氨基酸残基，或者位于蛋白质高级结构内部因不与免疫细胞接触而不影响致病性或免疫原性的微小突变的残基)，这些微小的突变仍属于非实质性突变，应当视为临床致病性与免疫原性没有变化的突变病毒株。比如，本发明保藏的病毒株(比如，生物保藏号为CGMCC No.19695或CGMCC No.19696的病毒株)的禽胚(如，鸭胚)传代病毒株(或适应性病毒株)、细胞(比如DF-1细胞系)传代病毒株(或适应性病毒株)、不分顺序地经过禽胚和细胞传代的子代病毒株，以及交叉经历禽胚和细胞多次传代的子代病毒株，其临床致病性与免疫原性没有实质性变化，则属于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株。
本发明所指现行《中国兽药典》为《中华人民共和国兽药典》2015版三部，中国农业出版社出版。
易感鸭：鸭场未使用过鸭病毒性肝炎疫苗，且未发生过鸭病毒性肝炎；蛋黄中鸭病毒性肝炎中和抗体效价<1:4的种蛋所孵化的雏鸭及其不同日龄的鸭。
材料
DF-1细胞系，是一株鸡胚成纤维细胞系，购自ATCC公司(ATCC细胞系编号为：CRL-12203))。
检验用强毒为鸭病毒性肝炎病毒肝组织毒Ⅰ型LS株和III型QZ株，均由辽宁益康生物股份有限公司分离、鉴定、保管和供应。
白油：美国索诺邦白油。
吐温-80：由沈阳三瑞试剂有限公司供应。
司本-80：由上海丹众医药化工有限公司供应。
乳化设备：弗鲁克高剪切分散乳化机。
图1示出了本发明Ⅰ型鸭病毒性肝炎和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗制备的技术路线。
实施例1.Ⅰ型鸭病毒性肝炎疫苗毒株的获取
(1)病例
辽宁省一家鸭养殖场的鸭群发病，症状为：全身抽搐、两腿痉挛、头向后仰等神经症状，死后呈现典型的角弓反张、剖检主要典型的病变为肝脏肿大和出血。经病死鸭子尸体剖检，剖检肝脏肿大、有出血斑点，基本诊断为鸭病毒性肝炎。
(2)病原分离
将患病鸭肝组织用灭菌生理盐水冲洗3次，按1g组织：10ml生理盐水的比例将肝组织加入灭菌冷生理盐水，放入组织搅拌机中，以10000～12000r/min，充分捣碎肝组织，反复在-15℃以下冻融3次后，收集滤液，并以12000r/min 4℃下离心30分钟，收集上清，得到肝组织液。
取0.2ml肝组织液，经尿囊腔接种14日龄易感鸭胚，37℃条件下孵育96小时，然后无菌收集尿囊液，以12000r/min 4℃下离心30分钟，收集上清，得到含有疑似鸭病毒性肝炎病毒的病毒液a。
(3)特异性测试
将病毒液a用生理盐水作10倍系列稀释，每个稀释度尿囊腔内接种8～10日龄易感鸭胚5枚，每胚0.2ml，置37℃继续孵育，24小时以前死亡鸭胚弃去，48～168小时死亡鸭胚随时取出，根据Reed-Muench法计算ELD50。然后用生理盐水将病毒液a稀释成200ELD50/0.1ml。本发明后续所有ELD50测定均采用了与此相同的ELD50测定方法。
将稀释后的病毒液a与等体积Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒特异性血清(由辽宁益康生物股份有限公司针对已经鉴定的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒所制备的鸭来源的阳性血清)混合，经37℃孵育60分钟后，将混合物经尿囊腔接种8～10日龄易感鸭胚5枚，每胚0.2ml；37℃培养观察168小时。孵育组鸭胚全部健活。
在平行条件下，用稀释后的病毒液a与等体积生理盐水混合物接种鸭胚，作为对照，对照组鸭胚全部死亡。死亡胚胎后肢和腹部水肿，全身和皮下出血，肝脏有针尖大小的出血点和坏死灶，胚胎发育迟缓。
由此可以确信，病毒液a中含有Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒。
(4)分子诊断
根据GenBank上公布的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的基因序列在5’UTR保守区序列附近设计一对引物，引物序列为：
F1：5’-AGCACGAGAGACCCTTACG-3’
R1：5’-CCCACAGGCTCTCACTAAAG-3’
使用引物F1和R1对病毒液a中的核酸进行RT-PCR扩增，将PCR产物送至吉林库美生物工程有限公司进行测序，并将结果用DNAStar软件进行序列分析，与NCBI中基因序列进行比较，该序列与Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒VP1基因同源性最高的序列达到95.6％同源性，由此可以确信，病毒液a中含有Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒。
将病毒液a中含有的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒命名为Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株(简称LSE株)。
(5)Ⅰ型鸭病毒性肝炎毒株的生物保藏
本发明将所分离得到的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.19696的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病LSE株；分类命名为：Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒；保藏时间是：2020年04月22日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该病毒株称作Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株、DHAV-1LSE株、LSE株、LSE。
实施例2.Ⅲ型鸭病毒性肝炎疫苗毒株的获取
(1)病例
辽宁省一家鸭养殖场的鸭群发病，症状为：精神萎靡，共济失调，翅膀下垂。根据症状判断，疑似患有鸭病毒性肝炎。经病死鸭子尸体剖检，剖检肝脏肿大，胆囊肿大，胆汁颜色变淡，基本诊断为鸭病毒性肝炎。
(2)病原分离
与实施例1步骤(2)相同的方法，得到含有疑似鸭病毒性肝炎病毒的病毒液b。
(3)特异性测试
以与实施例1步骤(3)相同的方法，将病毒液b稀释成200ELD50/0.1ml。将稀释后的病毒液b与等体积Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒特异性血清(由辽宁益康生物股份有限公司针对已经鉴定的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒所制备的鸭来源的阳性血清)混合，经37℃孵育60分钟后，将混合物经尿囊腔接种8～10日龄易感鸭胚5枚，每胚0.2ml；37℃培养观察168小时。孵育组鸭胚全部健活。
在平行条件下，用稀释后的病毒液b与等体积生理盐水混合物接种鸭胚，作为对照，对照组鸭胚全部死亡。死亡胚胎后肢和腹部水肿，全身和皮下出血，肝呈红黄色。
由此可以确信，病毒液b中含有Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒。
(4)分子诊断
根据GenBank上公布的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒的基因序列在5’UTR保守区序列附近设计一对引物，引物序列为：
F3：5’-TGGGCTAATGGTCTTCGT-3’
R3：5’-TTGGGTCTGGTATTGTCTGT-3’
使用引物F3和R3对病毒液b中的核酸进行RT-PCR扩增，将PCR产物送至吉林库美生物工程有限公司进行测序，并将结果用DNAStar软件进行序列分析与NCBI中基因序列进行比较，该序列与Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒VP1基因同源性最高的序列达到96％同源性，由此可以确信，病毒液b中含有Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒。
将病毒液b中含有的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒命名为Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株(简称QZE株)。
(5)Ⅲ型鸭病毒性肝炎毒株的生物保藏
本发明将所分离得到的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.19695的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病QZE株；分类命名为：Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒；保藏时间是：2020年04月22日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该病毒株称作Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株、DHAV-3QZE株、QZE株、QZE。
实施例3.Ⅰ型鸭病毒性肝炎疫苗毒株的细胞培养
(1)Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒细胞适应株的培养
采用有限稀释法纯化技术进行选育，将实施例1所得到的病毒液a接种在DF-1细胞系中连续传代，培养液为无血清DMEM-F12培养基，选择病毒半数致死量高的子代，培养了1-10代，获得Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒DF-1细胞系适应株。
经测定，不同代次病毒含量为107.0-8.5ELD50/0.2ml。
(2)建立Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的毒种种子批
将步骤1)所得Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒DF-1细胞系适应株接种DF-1细胞，培养液为：无血清DMEM-F12培养基，用细胞培养三角摇瓶传代培养至第10代，对细胞培养液中病毒含量进行测定，选择各代次毒种的病毒含量≥107.5ELD50/0.2ml时进行传代或保存。应用5％蔗糖脱脂奶冻干保护剂(溶剂为水，蔗糖浓度为5w/v％，脱脂奶粉浓度为10w/v％)与每一代病毒培养液以1：1体积比例分装、冻干，-70℃保存。确定无菌检验合格(方法与合格标准参照现行《中国兽药典》，TG和TSB培养基检测合格)、特异性检验合格(方法与合格标准和实施例1步骤(3)相同)、病毒含量检验合格(≥107.5ELD50/0.2ml)和外源病毒检验合格(方法与合格标准参照现行《中国兽药典》)的F2～F4代病毒作为原始毒种，其中F5～F7代病毒为基础毒种，F8～F10代病毒为生产毒种；确定病毒针对DF-1细胞的感染复数(MOI)：具体为，测定F8～F10代生成毒种的病毒含量，通过1个ELD50接种10000、1000、100、10、1个细胞后增殖的病毒含量，按照≥107.5ELD50/0.2ml的标准，确定F8～F10代毒种接种DF-1细胞的MOI为0.001～0.1。使用鸭胚测定F8～F10代病毒生产种毒的病毒含量(ELD50，鸭胚半数致死量)，按照≥107.5ELD50/0.2ml的标准，确定了F8～F10代毒种接种DF-1细胞，每次传代均按病毒液与细胞培养液体积比为1/1000～5/1000之间接种。
(3)制备Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的细胞毒液
在体积为14L的生物反应器中利用培养基全悬浮培养DF-1细胞，培养基的组成为：无血清DMEM-F12培养基，培养条件为温度35～36℃，pH7.2～7.5；转速为130-150rpm，当反应器中DF-1细胞数量达到400～500万时，接种前述种子批培养的第F8～F10代毒种，毒种含量为107.5ELD50/0.2ml，接种量为1ml，35～37℃继续培养，96-144小时后，当细胞活力下降到40％以下时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量为107.4ELD50/0.2ml。
实施例4.Ⅲ型鸭病毒性肝炎疫苗毒株的细胞培养
(1)Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒细胞适应株的培养
采用实施例3步骤(1)相同的方法和判断标准，培养实施例2所得到的病毒液b，培养了1-10代，获得Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒DF-1细胞系适应株。
经测定，不同代次病毒含量为107.1-8.7ELD50/0.2ml。
(2)建立Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒的毒种种子批
将步骤1)所得Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒DF-1细胞系适应株接种DF-1细胞，培养液为：无血清DMEM-F12培养基，用细胞培养三角摇瓶传代培养至第15代，对细胞培养液中病毒含量进行测定，选择各代次毒种的病毒含量≥107.5ELD50/0.2ml时进行传代或保存。应用蔗糖脱脂奶冻干保护剂与第每一代病毒培养液以1：1体积比例分装、冻干，-70℃保存。确定无菌检验合格(方法与合格标准参照现行《中国兽药典》，TG和TSB培养基检测合格)、特异性检验合格(方法与合格标准和实施例2步骤(3)相同)、病毒含量检验合格(≥107.5ELD50/0.2ml)和外源病毒检验合格(方法与合格标准参照现行《中国兽药典》)的F7～F15代病毒作为原始毒种，其中F7～F9代病毒为基础毒种，F10～F12代病毒为生产毒种；确定病毒针对DF-1细胞的感染复数(MOI)：具体为，获得F13～F15代3型QZE株为生产毒种后，确定其病毒感染复数，测定F13～F15代生成毒种的病毒含量，通过1个ELD50接种10000、1000、100、10、1个细胞后增殖的病毒含量，按照≥107.5ELD50/0.2ml的标准，确定F13～F15代毒种接种DF-1细胞的MOI为0.001～0.1。使用鸭胚测定F13～F15代病毒生产种毒的病毒含量(ELD50，鸭胚半数致死量)，按照≥107.5ELD50/0.2ml的标准，确定了F13～F15代毒种接种DF-1细胞，每次传代均按病毒液与细胞培养液体积比为1/1000～5/1000之间接种。
(3)制备Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒的细胞毒液
在体积为14L的生物反应器中利用培养基全悬浮培养DF-1细胞，培养基的组成为：无血清DMEM-F12培养基，培养条件为温度35～36℃，pH7.2～7.5；转速为130-150rpm，当反应器中的DF-1细胞数量达到400～1000万时，接种前述种子批培养的第F13～F15代毒种，毒种含量为107.5ELD50/0.2ml，接种量为1ml，35～37℃继续培养，96-144小时后，当细胞活力下降到40％以下时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量为107.7ELD50/0.2ml。
实施例5.鸭病毒性肝炎疫苗的制备
(1)病毒的灭活
(i)灭活Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒：
取实施例3所得LSE株细胞毒液反复冻融3次处理，采用多层无菌纱布过滤除菌后，加入细胞毒液总量(V/V)0.2％的灭活剂(浓度为37％的甲醛水溶液)，36℃条件下振荡灭活24小时，得到LSE株灭活病毒液。
灭活病毒的成品检验：取所得LSE株灭活病毒液，以0.2ml/胚的剂量经CAM(绒毛尿囊膜)途径接种10枚易感鸭胚，观察168小时，无鸭病毒性肝炎特异性病变或死亡的鸭胚，判定毒液灭活完全；同时，取LSE株灭活病毒液，分别接种细菌检验用TG和TSB培养基，观察10日，均无细菌生长，判定灭活毒液无细菌污染。
(ii)灭活Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒：
取实施例4所得QZE株细胞毒液采用实施例5步骤(1)之(i)相同的方法，得到QZE株灭活病毒液。
灭活病毒的成品检验：取所得QZE株灭活病毒液，采用实施例5步骤(1)之(i)相同的方法，判定灭活毒液无细菌污染。
(2)油相佐剂制备：
将95体积份的白油和5体积份的司本-80混合，100℃下搅拌混匀，116℃下高压灭菌，冷却后得到油相佐剂，备用。
(3)水相制备：
(i)Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒水相的制备：
94体积份前述LSE株灭活病毒液与6体积份灭菌好的吐温-80，充分振摇混合均匀，得到LSE株水相。
(ii)Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒水相的制备：
94体积份前述QZE株灭活病毒液与6体积份灭菌好的吐温-80，充分振摇混合均匀，得到QZE株水相。
(4)疫苗的制备：
(i)Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗的制备：
将前述油相佐剂3体积份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入前述LSE株水相2份，进行充分搅拌乳化。在终止乳化前加入灭菌1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01w/v％。得到Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株疫苗(简称LSE株疫苗)。
(ii)Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗的制备：
将前述油相佐剂3体积份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入前述QZE株水相2份，进行充分搅拌乳化。在终止乳化前加入灭菌1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01w/v％。得到Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株疫苗(简称QZE株疫苗)。
(iii)二价鸭病毒性肝炎病毒疫苗的制备：
将前述油相佐剂3体积份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入前述LSE株水相1体积份和前述QZE株水相1体积份，进行充分搅拌乳化。在终止乳化前加入灭菌1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01w/v％。得到Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株和Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株的二价灭活疫苗(简称二价苗)。
实施例6.鸭病毒性肝炎二价疫苗的性能表征
使用实施例5的方法所制备的LSE株疫苗、QZE株疫苗和二价苗，分别进行如下方面的性能表征：
(1)外观：
经肉眼观察疫苗组合物，LSE株疫苗、QZE株疫苗和二价苗均为匀乳剂。
(2)剂型：
分别取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，液滴没有扩散。由此可知本发明的LSE株疫苗、QZE株疫苗和二价苗均为油包水型疫苗组合物。
(3)稳定性：
分别吸取三种疫苗10ml加入离心管，3000r/min离心15分钟，管底析出的水相均没有超过0.5ml，因此LSE株疫苗、QZE株疫苗和二价苗稳定性较好。
(4)黏度：
按现行《中国兽药典》附录的方法进行检验，黏度分别为：25-27cp，27-29cp，32-36cp，LSE株疫苗、QZE株疫苗和二价苗均符合规定。
(5)无菌检验：
按现行《中国兽药典》附录的方法进行检验，LSE株疫苗、QZE株疫苗和二价苗无菌生长。
(6)甲醛和汞类防腐剂残留量测定：
按现行《中国兽药典》附录的方法进行测定，甲醛含量和汞含量在LSE株疫苗、QZE株疫苗和二价苗中均符合规定。
实施例7：Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗的安全性测试
取1日龄健康易感鸭(樱桃谷鸭)10只，每只皮下注射实施例5所制备的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株疫苗1.0ml，连续观察14日，记录和观察试验鸭注射局部和全身不良反应。重复使用独立制备的3批疫苗进行前述测试。
结果显示，3批Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株灭活疫苗，均没有引起1日龄健康易感鸭全身不良反应和注射局部不良反应，剖检肾脏、器官，脾脏和注射局部均无明显病理变化，疫苗吸收良好。
实施例8：Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗的免疫效力测试
(1)血清学方法：用3月龄健康易感鸭(樱桃谷鸭)10只，5只各皮下或肌肉注射疫苗1.0ml，另5只作对照，同条件饲养。21日后分别采血分离血清，免疫组和对照组血清分别与倍比稀释的抗原等体积混合，以Ⅰ型LSE株(含量200ELD50/0.1ml)为抗原，测定中和抗体效价。重复使用独立制备的三批疫苗进行前述测试。
结果显示，3批Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒LSE株灭活苗，接种3月龄健康易感鸭后，血清中和抗体效价平均值分别为1:34.90、1:32.00、1:35.66。
(2)免疫攻毒法：用1日龄健康易感鸭(樱桃谷鸭)20只，10只各皮下注射疫苗0.5ml，另10只作对照，同条件饲养。21日后，取免疫鸭和对照鸭各10只，分别肌肉注射鸭病毒性肝炎病毒Ⅰ型LS株强毒0.5ml(含100LD50)。连续观察7日，记录对照组和免疫组鸭发病死亡情况。
结果显示，免疫组攻毒保护比例两个批次为9/10，一个批次为10/10，对照组全部发病死亡。
实施例9：Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗的安全性测试
取1日龄健康易感鸭(樱桃谷鸭)10只，每只皮下注射实施例5所制备的Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株疫苗1.0ml，连续观察14日，记录和观察试验鸭注射局部和全身不良反应。重复使用独立制备的3批疫苗进行前述测试。
结果显示，3批Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株灭活疫苗，均没有引起1日龄健康易感鸭全身不良反应和注射局部不良反应，剖检肾脏、器官，脾脏和注射局部均无明显病理变化，疫苗吸收良好。
实施例10：Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗的免疫效力测试
(1)血清学方法：用3月龄健康易感鸭(樱桃谷鸭)10只，5只各皮下或肌肉注射疫苗1.0ml，另5只作对照，同条件饲养。21日后分别采血分离血清，免疫组和对照组血清分别与倍比稀释的抗原等体积混合，以Ⅲ型QZE株(含量200ELD50/0.1ml)为抗原，测定中和抗体效价。重复使用独立制备的三批疫苗进行前述测试。
结果显示，制备的3批Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒QZE株灭活苗，接种3月龄健康易感鸭后，血清中和抗体效价平均值分别为1:25.81、1:28.74、1:22.63。
(2)免疫攻毒法：用1日龄健康易感鸭(樱桃谷鸭)20只，10只各皮下注射疫苗0.5ml，另10只作对照，同条件饲养。21日后，取免疫鸭和对照鸭各10只，分别肌肉注射鸭病毒性肝炎病毒Ⅲ型QZ株强毒0.5ml(含100LD50)。连续观察7日，记录对照组和免疫组鸭发病死亡情况。
结果显示，免疫组攻毒保护比例两个批次为10/10，一个批次为9/10，对照组全部发病死亡。
实施例11.二价苗的安全性测试
使用按照实施例5的方法制备的鸭病毒性肝炎二价灭活疫苗(免疫原为Ⅰ型LSE株和Ⅲ型QZE株，下文简称二价苗)，一共包括独立制备的3批二价苗。健康易感鸭：由辽宁益康生物股份有限公司提供。进行如下的安全性测试。
雏鸭参考健康检查标准：体重符合品种要求，群体整齐；脐部被腹绒毛覆盖，紧而干燥；腹部柔软，卵黄吸收良好，羽毛洁净而富有光泽；充满活力，精神好，反应灵敏；握在手中感触有弹性，挣扎有力，鸣声大。
种鸭参考健康检查标准：母鸭头中等大小，颈细长，眼亮有神，喙长而直，身长背阔，胸深腹圆，后躯宽大，耻骨开张，羽毛致密，两翼紧贴体躯，脚稍粗短，蹼大而厚，健康结实，体肥适中。
(1)一次单剂量接种试验
(i)雏鸭安全性试验：
取上述3批二价苗，每批任抽3瓶混合后使用，每批分别皮下和肌肉注射1日龄雏鸭(樱桃谷鸭)各10只，每只注射0.5ml。皮下和肌肉注射1日龄雏鸭各10只，每只注射0.5ml生理盐水，做为对照。连续观察14日，详细记录试验鸭的反应情况和解剖情况。
结果：在试验观察期内，所有雏鸭精神状态良好，行为活动未见异常，采食、饮水和粪便均正常，与对照组无明显差异。在试验期间，所有试验用雏鸭均健活，无任何不良反应，与对照组无明显差异，安全性良好。平均日增重与对照组差异不显著；平均体重与对照组差异不显著；注射雏鸭按压后无局部反应，所有雏鸭在注射疫苗后，均未出现红肿、硬结和其它局部反应；系统剖检观察肝脏、脾脏、肾脏、心脏和胆囊，与对照组雏鸭相比均无明显变化。
(ii)种鸭安全性试验：
取上述3批二价苗，每批任抽3瓶混合后使用，每批分别皮下和肌肉注射180日龄种鸭(樱桃谷鸭)各10只，每只注射1.0ml。皮下和肌肉注射1日龄雏鸭各10只，每只注射1.0ml生理盐水，做为对照。连续观察14日，详细记录试验鸭的反应情况。
结果：在试验观察期内，所有种鸭精神状态良好，行为活动未见异常，采食、饮水和粪便均正常，与对照组无明显差异。在试验期间，所有试验用雏鸭均健活，无任何不良反应，与对照组无明显差异，安全性良好。平均日增重与对照组差异不显著；平均体重与对照组差异不显著；注射雏鸭按压后无局部反应，所有雏鸭在注射疫苗后，均未出现红肿、硬结和其它局部反应；系统剖检观察肝脏、脾脏、肾脏、心脏和胆囊，与对照组雏鸭相比均无明显变化。
(2)单剂重复量接种试验
(i)雏鸭安全性试验：
分别用樱桃谷鸭和麻鸭做测试，操作上与一次单剂量接种试验的雏鸭安全性试验差别在于，注射2周后以相同剂量和方式重复接种1次，连续观察14日。
樱桃谷鸭和麻鸭做测试结果无明显差别，各组不同指标分别与一次单剂量接种试验的雏鸭安全性试验结果无明显差别。
(ii)种鸭安全性试验：
分别用樱桃谷鸭和麻鸭做测试，操作上与一次单剂量接种试验的种鸭安全性试验差别在于，注射2周后以相同剂量和方式重复接种1次，连续观察14日。
樱桃谷鸭和麻鸭做测试结果无明显差别，各组不同指标分别与一次单剂量接种试验种鸭安全性试验的结果无明显差别。
(3)一次超剂量接种试验
(i)雏鸭安全性试验：
分别用樱桃谷鸭和麻鸭做测试，操作上与一次单剂量接种试验的雏鸭安全性试验差别在于，注射剂量为1.0ml。
樱桃谷鸭和麻鸭做测试结果无明显差别，各组不同指标分别与一次单剂量接种试验的雏鸭安全性试验结果无明显差别。
(ii)种鸭安全性试验：
分别用樱桃谷鸭和麻鸭做测试，操作上分别用樱桃谷鸭和麻鸭做测试，与一次单剂量接种试验的种鸭安全性试验差别在于，注射剂量为2.0ml。
樱桃谷鸭和麻鸭做测试结果无明显差别，各组不同指标分别与一次单剂量接种试验种鸭安全性试验的结果无明显差别。
(4)种鸭安全性试验：
取上述3批二价苗，皮下和肌肉注射90日龄种鸭(樱桃谷鸭)各30只，每只注射1.0ml，接种后21日按同样剂量加强免疫一次，详细记录试验种鸭的反应情况和免后1-7周产蛋情况。
种鸭的反应情况与前述一次超剂量接种试验结果没有明显差别，对于产蛋量，试验种鸭在免疫后1周的免疫组产蛋率在5.24％-6.67％之间，对照组产蛋为6.19％；免后2周免疫组产蛋率在13.33％-15.24％之间，对照组产蛋为13.81％；免后3周免疫组产蛋率在24.29％-27.62％之间，对照组产蛋为25.24％；免后4周免疫组产蛋率在57.62％-64.76％之间，对照组产蛋为61.90％；免疫后5周免疫组产蛋率为68.10％-71.90％之间，对照组产蛋为70.00％；免疫后6周免疫组产蛋率在72.86％-78.10％之间，对照组产蛋率为76.19％；免疫后7周免疫组产蛋率为86.67％-88.57％，对照组产蛋率为80.10％。结果显示，免疫组和对照组无明显差异。
实施例12.二价苗的免疫效力测试
(1)对雏鸭免疫效力测试
免疫分组：取1日龄健康易感鸭(樱桃谷鸭)140只，随机分成7组，每组20只，其中3组分别应用3批次二价苗皮下注射疫苗0.5ml/只，另3组分别应用3批次二价苗肌肉注射疫苗0.5ml/只。剩余1组作对照，同条件饲养。
免疫攻毒试验：分别于免疫后21日进行攻毒试验，每组10只肌肉注射鸭病毒性肝炎病毒Ⅰ型LS株强毒0.5ml(含100LD50)，每组另外10只肌肉注射鸭病毒性肝炎病毒Ⅲ型QZ株强毒0.5ml(含100LD50)，攻毒后连续观察7日，记录免疫组和对照组死亡数量。
结果，三批疫苗，肌肉注射攻毒QZ组死亡1只，对照组两种攻毒模式各死亡10只，其他组别没有死亡鸭。
(2)对种鸭免疫效力测试
免疫分组：取3月龄种鸭(樱桃谷鸭)70只，随机分成7组，每组10只，其中3组分别应用3批次二价苗皮下注射疫苗1.0ml/只，另3组分别应用3批次二价苗肌肉注射疫苗1.0ml/只。剩余1组作对照，同条件饲养。
抗体测定：分别于免疫后21日对各组免疫鸭和对照鸭采血，分离血清，免疫组和对照组血清分别与倍比稀释的抗原等体积混合，每组分别以Ⅰ型LSE株(含量200ELD50/0.1ml)和Ⅲ型QZE株(含量200ELD50/0.1ml)为抗原，测定中和抗体效价。
结果：采用肌肉注射途径，接种3月龄种鸭，3批“二价苗”对Ⅰ型LSE株中和抗体效价平均值分别为1：35.66、1：25.81、1：35.66，对Ⅲ型QZE株中和抗体效价平均值分别为1：28.74、1：35.66、1：37.88。采用皮下注射途径，接种3月龄种鸭，3批“二价苗”对Ⅰ型LSE株中和抗体效价平均值分别为1：34.82、1：35.92、1：34.82，对Ⅲ型QZE株中和抗体效价平均值分别为1：35.92、1：28.74、1：32.00。
(3)子代攻毒保护测试
方法：取3月龄种鸭(樱桃谷鸭)100只，随机分成2组，其中1组分别应用前述3批二价苗中第2批皮下注射疫苗1.0ml/只，免疫后21日加强免疫1次，皮下注射疫苗1.0ml/只，另50只做空白对照，同条件饲养，分别在2免后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月收集1周的种鸭蛋，进行孵化，分别在雏鸭出壳后1日、7日、14日、21日采血，分别以Ⅰ型LSE株(含量200ELD50/0.1ml)和Ⅲ型QZE株(含量200ELD50/0.1ml)为抗原，测定中和抗体，并于出壳后14日、21日分别取20只，随机分为2组，第一组肌肉注射Ⅰ型LS株强毒(100LD50)，第二组肌肉注射Ⅲ型QZ株强毒(100LD50)，攻毒后观察7日，判定攻毒保护结果。空白对照不做接种，同条件下饲养。
结果：免前种鸭抗体均为阴性，一免后1个月，Ⅰ型LSE株抗体效价平均值为1:34.82，Ⅲ型QZE株抗体效价平均值为1:32.00，二免后1个月，Ⅰ型LSE株抗体效价平均值为1:39.29，Ⅲ型QZE株抗体效价平均值为1:28.00，空白对照检测结果为阴性。种蛋孵化雏鸭1～14日龄，Ⅰ型LSE株抗体效价在1:20.75～1:26.10之间，Ⅲ型QZE株抗体效价在1:19.84～1:28.74之间，攻毒保护率在80％以上。雏鸭21日龄，Ⅰ型LSE株抗体效价平均值1:13.45，Ⅲ型QZE株抗体效价平均值1:12.70，攻毒保护率在50％～70％。空白对照攻毒保护率为0。
(4)同类产品的对比试验
取3月龄种鸭(樱桃谷鸭)50只，随机分成4组，每组10只，其中4组应用3批本发明的二价苗和某公司二价苗(Ⅰ型鸭病毒性肝炎和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价苗)皮下注射疫苗1.0ml/只，另1组作空白对照，同条件饲养。在免后21日分别采血分离血清，分别以Ⅰ型LSE株(含量200ELD50/0.1ml)和Ⅲ型QZE株(含量200ELD50/0.1ml)为抗原，测定中和抗体。
结果：Ⅰ型LSE株血清中和抗体效价水平在1:34.90～1:40.32之间，Ⅲ型QZE株血清中和抗体效价在1:35.92～42.38之间。某公司二价苗，抗体测定为Ⅰ型LSE株血清中和抗体效价为1:33.6，Ⅲ型QZE株血清中和抗体效价为1:35.2，结果显示，本发明的二价苗和市场的同类产品免疫种鸭的抗体水平相当。
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

Claims (49)

1.一种用于预防鸭病毒性肝炎的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株组，所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗株组由Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株和Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株组成；
所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19696的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株；
所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19695的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株。
2.一种用于预防鸭病毒性肝炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括权利要求1所述的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株组，所述疫苗组合物以权利要求1所述的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株组为免疫原。
3.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物的原料包括所述免疫原和辅料。
4.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括所述免疫原的用量和所述辅料的用量比为1500-4500×107.0ELD50:165-450g。
5.如权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，基于鸭胚培养根据Reed-Muench法计算得到所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的ELD50和所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的ELD50。
6.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为灭活疫苗组合物。
7.如权利要求2-5中任一项所述的疫苗组合物，所述免疫原采用灭活的所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株和灭活的所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株。
8.如权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述灭活的所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的制备方法为：将Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液与灭活剂混合，得到所述灭活的所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液；
所述灭活的所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的制备方法为：将Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液与灭活剂混合，得到所述灭活的所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液。
9.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液中所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的含量为106.0-7.5ELD50/0.2ml；
所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液中所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的含量为106.0-7.5ELD50/0.2ml。
10.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述灭活剂选自甲醛水溶液、β-丙内酯中的一种或两种的组合。
11.如权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，所述灭活剂为浓度为35-40％的甲醛水溶液。
12.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述灭活剂的用量为所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液的0.10-0.20v/v％；所述灭活剂的用量为所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液的0.10-0.20v/v％。
13.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液是所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液经破碎得到的；
所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株溶液是所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液经破碎得到的。
14.如权利要求13所述的疫苗组合物，其特征在于，所述破碎选自冻融、超声波处理或高压细胞破碎机破碎。
15.如权利要求14所述的疫苗组合物，其特征在于，所述冻融的次数为1-5次。
16.如权利要求13所述的疫苗组合物，其特征在于，所述破碎之后对所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液进行除细胞处理；
所述破碎之后对所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液进行除细胞处理。
17.如权利要求16所述的疫苗组合物，其特征在于，所述除细胞处理选自离心除细胞或过滤除细胞。
18.如权利要求17所述的疫苗组合物，其特征在于，采用多层无菌纱布进行所述过滤除细胞。
19.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液的制备方法为：
以无血清DMEM-F12培养基为培养液，将所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株在DF-1细胞系中连续传1-15代，得到Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系适应株；
将所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系适应株以细胞系悬浮培养到F8～F10代，形成所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批；
以细胞系悬浮培养所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批，得到所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液；以及
所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液的制备方法为：
以无血清DMEM-F12培养基为培养液，将所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株在DF-1细胞系中连续传1-15代，得到Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系适应株；
将所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒细胞系适应株以细胞系悬浮培养到F13～F15代，形成所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批；
以细胞系悬浮培养所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批，得到所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液。
20.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，所述细胞系为鸡胚成纤维细胞系。
21.如权利要求20所述的疫苗组合物，其特征在于，所述鸡胚成纤维细胞系为DF-1细胞系。
22.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，所述悬浮培养的培养基为：无血清DMEM-F12培养基。
23.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，所述悬浮培养的温度为35～37℃。
24.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，所述悬浮培养的pH为7.0～7.5。
25.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，所述悬浮培养的转数为90-150rpm。
26.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，所述细胞系的密度为3×106.0-7×106.0/L时，接种所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批；所述细胞系的密度为3×106.0-7×106.0/L时，接种所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批。
27.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批和所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批的接种密度为：按病毒与细胞培养基体积比为1/10000-5/1000之间接种。
28.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，接种所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批96-144h后或细胞活力下降到40％以下，收获所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液；
接种所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株种子批96-144h后或细胞活力下降到40％以下，收获所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液。
29.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液中，所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的含量为107.0-8.0ELD50/0.2ml；
所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株细胞毒液中，所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的含量为107.0-8.0ELD50/0.2ml。
30.如权利要求29所述的疫苗组合物，其特征在于，基于鸭胚培养根据Reed-Muench法计算得到所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的ELD50和所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株的ELD50。
31.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述辅料包括油脂类佐剂、第一种乳化剂和第二种乳化剂。
32.如权利要求31所述的疫苗组合物，其特征在于，所述油脂类佐剂选自白油。
33.如权利要求31所述的疫苗组合物，其特征在于，所述第一种乳化剂选自司本-80。
34.如权利要求31所述的疫苗组合物，其特征在于，所述第二种乳化剂选自吐温-80。
35.如权利要求31所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物的成分按照用量比包括：
Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：油脂类佐剂：第一种乳化剂：第二种乳化剂＝750-2250×107.0ELD50:750-2250×107.0ELD50:150-400g:10-30g:5-20g。
36.如权利要求35所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物的成分按照用量比包括：
Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株：油脂类佐剂：第一种乳化剂：第二种乳化剂＝1410×107.0ELD50:1410×107.0ELD50:285g:15g:12g。
37.如权利要求2-36中任一项所述疫苗组合物的制备方法，所述制备方法为：以所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗株组为免疫原，制备所述疫苗组合物。
38.如权利要求37所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗株组与辅料混合，制备所述疫苗组合物。
39.如权利要求38所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将灭活的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株组与所述辅料混合，制备所述疫苗组合物，所述灭活的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株组包括灭活的所述Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株和灭活的所述Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒疫苗株。
40.如权利要求37所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(a)油相佐剂的制备：
将油脂类佐剂与第一种乳化剂混合，得到油相佐剂；
(b)水相的制备：
将灭活的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株组与第二种乳化剂混合，得到水相；
(c)混合：
将所述油相佐剂与所述水相混合，得到所述疫苗组合物。
41.如权利要求40所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)中，在20-25℃条件下，将所述油脂类佐剂与所述乳化剂混合，得到所述油相佐剂。
42.如权利要求41所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)中，将所述油脂类佐剂与所述乳化剂混合，搅拌，得到所述油相佐剂。
43.如权利要求41所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)中，将所述油脂类佐剂与所述乳化剂混合，灭菌，得到所述油相佐剂。
44.如权利要求41所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)中，将所述灭活的鸭病毒性肝炎病毒疫苗株组与第二种乳化剂混合，搅拌，得到所述水相。
45.如权利要求41所述的制备方法，其特征在于，在步骤(c)中，将所述油相佐剂与所述水相混合，搅拌，得到所述疫苗组合物。
46.如权利要求41所述的制备方法，其特征在于，在步骤(c)中，将所述疫苗组合物与防腐剂混合，得到防腐的疫苗组合物。
47.如权利要求46所述的制备方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述防腐剂选自硫柳汞。
48.如权利要求46所述的制备方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述防腐剂在所述疫苗组合物中的终浓度为0.005-0.015w/v％。
49.如权利要求1所述的疫苗株组、权利要求2-36中任一项所述的疫苗组合物或权利要求37-47中任一项所述的制备方法在制备用于预防Ⅰ型鸭病毒性肝炎和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的制剂中的用途。
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