CN102078609B - 一种鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，具体步骤为：(1)分离高免鸡蛋蛋黄；(2)提取卵黄抗体；(3)配制制剂及包装；所述鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，不仅易于操作，适合大规模生产，且制备的鸭病毒性肝炎卵黄抗体性质稳定、纯度高、效价高、特异性较强，无药残，温和环保，对预防鸭病毒性肝炎的预防及治疗极具应用价值，为鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及禽类用生物制品技术领域，尤其是一种鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHV)引起的雏鸭的一种高度致死且传播迅速的急性传染病，是养鸭业危害最严重的疾病之一，并常与病毒、细菌混合感染，给临床诊断与防制带来了很大的困难。DHV-I主要感染1月龄以下雏鸭，两周以内雏鸭尤其易感。雏鸭的发病率为100％，死亡率因雏鸭的周龄有所不同，小于一周龄的雏鸭死亡率可达95％，1-3周龄雏鸭的死亡率为50％或更低。而成年种鸭可带毒而不发病，且其产蛋率不受影响。鸭病毒性肝炎最先发现于美国，其后，在英国、法国、德国、意大利、加拿大、印度等国陆续地报道了有本病发生。1963年年我国首次报道了上海某鸭场于1958年秋至1962年春暴发本病的情况，此后，全国各地都相继报道了本病的爆发与流行。1980年至今，在我国多个地区已多次爆发该病，流行区域广，且发病严重，给我国的养鸭业带来了巨大的损失。
因为20日龄以内的雏鸭的免疫系统还未发育完全，所以对本病最有效的防制方法是用DHV-I疫苗免疫种鸭，使后代雏鸭获得高水平的母源抗体从而起到保护的目的。但对于母源抗体水平较低的情况，就需要对雏鸭注射卵黄抗体，以保护雏鸭不受鸭病毒性肝炎病毒的侵袭。
禽类卵黄中的抗体主要是卵黄免疫球蛋白，与血清抗体相比，卵黄抗体具有许多独特的优点：(1)无需采血，只需收集免疫种鸭产下的蛋即可纯化得到卵黄抗体；(2)有良好的稳定性，且耐热耐酸，常温下仍能保持一定的活性。(3)治疗效果明显，特异性强，且易大规模生产。(4)安全、无残留、温和环保。因此，开发一种安全有效的鸭病毒性肝炎精制卵黄抗体迫在眉睫。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，具体步骤为：
(1)分离高免鸡蛋蛋黄；
(2)提取卵黄抗体；
(3)配制制剂及包装。
优选的，上述鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，具体步骤为：
(1)分离高免鸡蛋蛋黄：收集高免鸡蛋用70％(V/V)的乙醇进行蛋壳表面消毒，晾干后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
(2)提取卵黄抗体：
A：将步骤(1)所收集的蛋黄与无菌水1∶1(V/V)混合后搅拌均匀，65℃密封灭活10分钟后迅速冷却至8℃-12℃，然后与无菌水以1∶4的比例混合(V/V)，1M的HCl调节pH至5.2，充分搅匀后4℃静置6小时，5000rpm离心20分钟，取上清；
B：将步骤A所得上清液与饱和硫酸铵溶液以1∶1(V/V)的比例混合，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀；按质量比为1∶3的比例将沉淀用无菌水溶解，所得溶液和饱和硫酸铵溶液以2∶1(V/V)的比例混合，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀，按质量比为1∶3的比例将沉淀用0.01M pH7.2的无菌PBS溶解；
C：将步骤B所得溶解液用截留量为100ku的超滤膜除盐浓缩；
D：将40％(V/V)的甲醛溶液与步骤C所得浓缩液混合，使甲醛的终浓度达到0.1％(V/V)；充分搅拌均匀后密封2小时；然后用0.45微米和0.22微米的微孔滤膜分别过滤，取滤液4℃保存备用；
(3)配制制剂及包装：将步骤(2)所得滤液进行鸭病毒性肝炎抗体效价测定，用0.01M pH7.2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1∶512；然后加入吐温80，至吐温80终浓度为0.01％(V/V)作为保护剂，搅拌均匀后无菌条件下分装成成品。
优选的，上述鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，所述步骤(1)中高免鸡蛋是由以下方法获得的：
(1)使用禽类专用抗菌肽饲料添加剂连续饲喂健康产蛋鸡；
(2)制备免疫用油乳剂抗原：
A：将冷冻保存的鸭肝炎病毒AV2111毒种稀释后接种10-11日龄SPF鸡胚并收集死亡鸡胚，收集胚体病变明显的鸡胚尿囊液；
B：将步骤A收集的尿囊液加入终浓度为0.1％的福尔马林密封灭活，取灭活后的尿囊液与无菌吐温-80以19∶1(W/W)的比例混合后制成水相；取白油、司本、硬脂酸铝以93∶5∶2(W/W/W)的比例混合，搅拌均匀后，高压灭菌20分钟制成油相；
C：将步骤B所制备的水相和油相以5∶2(V/V)的比例混合，乳化制成免疫用油乳剂抗原；
(3)免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋：将步骤(2)所制备的油乳剂抗原免疫步骤(1)处理过的产蛋鸡，免疫方式为皮下注射，剂量为1毫升/只，免疫次数为3次，第1次与第2次免疫间隔10天，第2次与第3次免疫间隔14天，将上述经过3次免疫后的产蛋鸡正常饲喂七天后收集鸡蛋，即为高免鸡蛋。
优选的，上述鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，所述步骤(1)中高免鸡蛋是由以下方法获得的：
(1)使用禽类专用抗菌肽饲料添加剂连续饲喂健康产蛋鸡3周，每日添加一次，日添加量为基础日粮的0.1％-0.3％。
(2)制备免疫用油乳剂抗原：
A：将冷冻保存的鸭肝炎病毒AV2111毒种稀释200倍后接种10-11日龄SPF鸡胚，接种量为100微升/只，置于37℃培养箱中孵育，48-96小时后收集死亡鸡胚，收集胚体病变明显的鸡胚尿囊液；
B：将A步骤收集的尿囊液加入终浓度为0.1％的福尔马林37℃密封灭活48小时，取灭活后的尿囊液与无菌吐温-80以19∶1(W/W)的比例混合后制成水相；取白油、司本、硬脂酸铝以93∶5∶2(W/W/W)的比例混合，搅拌均匀后，121℃高压灭菌20分钟制成油相；
C：将B步骤所制备的水相和油相以5∶2(V/V)的比例混合，乳化制成免疫用油乳剂抗原；
(3)免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋：将步骤(2)所制备的油乳剂抗原免疫步骤(1)处理过的产蛋鸡，免疫方式为皮下注射，剂量为1毫升/只，免疫次数为3次，第1次与第2次免疫间隔10天，第2次与第3次免疫间隔14天；3次免疫过后，每隔7周进行免疫一次，方式为皮下注射，剂量为1毫升/只，将上述经过3次免疫后的产蛋鸡正常饲喂七天后收集鸡蛋，即为高免鸡蛋。
优选的，上述鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，所述高免鸡蛋获得方法的步骤(1)中的禽类专用抗菌肽饲料添加剂为肽轻松B-001禽类专用制剂。
本发明的有益效果是：
上述鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，不仅易于操作，适合大规模生产，且制备的鸭病毒性肝炎卵黄抗体性质稳定、纯度高、效价高、特异性较强，无药残，温和环保，对预防鸭病毒性肝炎的预防及治疗极具应用价值，为鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备提供了新的思路。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
一种鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，具体步骤为：
(1)分离高免鸡蛋蛋黄：收集高免鸡蛋用70％(V/V)的乙醇进行蛋壳表面消毒，晾干后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
(2)提取卵黄抗体：
A：将步骤(1)所收集的蛋黄与无菌水1∶1(V/V)混合后搅拌均匀，65℃密封灭活10分钟后迅速冷却至10℃，然后与无菌水以1∶4的比例混合(V/V)，1M的HCl调节pH至5.2，充分搅匀后4℃静置6小时，5000rpm离心20分钟，取上清；
B：将步骤A所得上清液与饱和硫酸铵溶液以1∶1(V/V)的比例混合，混合方式为将饱和硫酸铵溶液逐渐加入步骤A所得的上清液，边加边搅拌，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀；按质量比为1∶3的比例将沉淀用无菌水溶解，所得溶液和饱和硫酸铵溶液以2∶1(V/V)的比例混合，混合方式为将饱和硫酸铵溶液逐渐加入步骤A所得的上清液，边加边搅拌，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀，按质量比为1∶3的比例将沉淀用0.01M pH7.2的无菌PBS溶解；
C：将步骤B所得溶解液用截留量为100ku的超滤膜除盐浓缩；
D：将商业售40％(V/V)的甲醛溶液(从商业途径获得)与步骤C所得浓缩液以1∶399的比例混合，混合方式将40％的甲醛逐滴加入步骤C所得浓缩液，并不断搅拌均匀，使甲醛的终浓度达到0.1％(V/V)；充分搅拌均匀后密封2小时；然后用0.45微米和0.22微米的微孔滤膜分别过滤，取滤液4℃保存备用；
(3)配制制剂及包装：将步骤(2)所得滤液进行鸭病毒性肝炎抗体效价测定，用0.01M pH7.2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1∶512；然后加入吐温80(从商业途径获得)，吐温80与稀释后的中和抗体的比例1∶9999，至吐温80终浓度为0.01％(V/V)作为保护剂，加入方式为逐滴加入，边加边搅拌，搅拌均匀后无菌条件下分装成成品。
实施例2
一种鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，具体步骤为：
(1)使用肽轻松B-001禽类专用制剂连续饲喂健康产蛋鸡3周，每日添加一次，日添加量为基础日粮的0.2％。
(2)制备免疫用油乳剂抗原：
A：将冷冻保存的鸭肝炎病毒AV2111毒种(购自中国兽药监察所)稀释200倍后接种10-11日龄SPF鸡胚(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，接种量为100微升/只，置于37℃培养箱中孵育，48-96小时后收集死亡鸡胚，收集胚体病变明显的鸡胚尿囊液；
B：将A步骤收集的尿囊液加入终浓度为0.1％的福尔马林37℃密封灭活48小时，取灭活后的尿囊液与无菌吐温-80以19∶1(W/W)的比例混合后制成水相；取白油、司本、硬脂酸铝以93∶5∶2(W/W/W)的比例混合，搅拌均匀后，121℃高压灭菌20分钟制成油相；
C：将B步骤所制备的水相和油相以5∶2(V/V)的比例混合，乳化制成免疫用油乳剂抗原；
(3)免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋：将步骤(2)所制备的油乳剂抗原免疫步骤(1)处理过的产蛋鸡，免疫方式为皮下注射，剂量为1毫升/只，免疫次数为3次，第1次与第2次免疫间隔10天，第2次与第3次免疫间隔14天；3次免疫过后，每隔7周进行免疫一次，方式为皮下注射，剂量为1毫升/只，将上述经过3次免疫后的产蛋鸡正常饲喂七天后收集鸡蛋，即为高免鸡蛋；
(4)分离高免鸡蛋蛋黄：收集上述方法获得的高免鸡蛋用70％(V/V)的乙醇进行蛋壳表面消毒，晾干后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
(5)提取卵黄抗体：
A：将步骤(4)所收集的蛋黄与无菌水1∶1(V/V)混合后搅拌均匀，65℃密封灭活10分钟后迅速冷却至10℃，然后与无菌水以1∶4的比例混合(V/V)，1M的HCl调节pH至5.2，充分搅匀后4℃静置6小时，5000rpm离心20分钟，取上清；
B：将步骤A所得上清液与饱和硫酸铵溶液以1∶1(V/V)的比例混合，混合方式为将饱和硫酸铵溶液逐渐加入步骤A所得的上清液，边加边搅拌，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀；按质量比为1∶3的比例将沉淀用无菌水溶解，所得溶液和饱和硫酸铵溶液以2∶1(V/V)的比例混合，混合方式为将饱和硫酸铵溶液逐渐加入步骤A所得的上清液，边加边搅拌，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀，按质量比为1∶3的比例将沉淀用0.01M pH7.2的无菌PBS溶解；
C：将步骤B所得溶解液用截留量为100ku的超滤膜除盐浓缩；
D：将商业售40％(V/V)的甲醛溶液(从商业途径获得)与步骤C所得浓缩液以1∶399的比例混合，混合方式将40％的甲醛逐滴加入步骤C所得浓缩液，并不断搅拌均匀，使甲醛的终浓度达到0.1％(V/V)；充分搅拌均匀后密封2小时；然后用0.45微米和0.22微米的微孔滤膜分别过滤，取滤液4℃保存备用；
(6)配制制剂及包装：将步骤(5)所得滤液进行鸭病毒性肝炎抗体效价测定，用0.01M pH7.2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1∶512；然后加入吐温80(从商业途径获得)，吐温80与稀释后的中和抗体的比例1∶9999，至吐温80终浓度为0.01％(V/V)作为保护剂，加入方式为逐滴加入，边加边搅拌，搅拌均匀后无菌条件下分装成成品。
实施例3
步骤(5)A中将步骤(4)所收集的蛋黄与无菌水1∶1(V/V)混合后搅拌均匀，65℃密封灭活10分钟后迅速冷却至8℃；其余步骤同实施例2。
实施例4
步骤(5)A中将步骤(4)所收集的蛋黄与无菌水1∶1(V/V)混合后搅拌均匀，65℃密封灭活10分钟后迅速冷却至12℃；其余步骤同实施例2。
本发明所述鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法采用了抗原性较好的鸭病毒性肝炎病毒AV21111-20毒种，系从中国兽药监察所购买的AV21111毒株在10日龄SPF鸡胚传代20代后获得，接种后鸡胚后，鸡胚一般稳定在48-96小时左右死亡；且
本发明所述鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法采用了水稀释硫酸铵两部沉淀法来沉淀分离卵黄抗体，然后用截留量为100ku的超滤膜除盐浓缩，该法易于大规模生产，且所得到的抗体纯度高、效价高、特异性强，为鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备提供了新的思路。
上述参照实施例对该一种鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
（1）分离高免鸡蛋蛋黄：收集高免鸡蛋用70%（V/V）的乙醇进行蛋壳表面消毒，晾干后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离，所述高免鸡蛋是由以下方法获得的：
①使用禽类专用抗菌肽饲料添加剂连续饲喂健康产蛋鸡；
②制备免疫用油乳剂抗原：
a：将冷冻保存的鸭肝炎病毒AV2111毒种稀释后接种10-11日龄SPF鸡胚并收集死亡鸡胚，收集胚体病变明显的鸡胚尿囊液；
b：将步骤a收集的尿囊液加入终浓度为0.1%的福尔马林密封灭活，取灭活后的尿囊液与无菌吐温-80以19：1（W/W）的比例混合后制成水相；取白油、司本、硬脂酸铝以93：5：2（W/W/W）的比例混合，搅拌均匀后，高压灭菌20分钟制成油相；
c：将步骤b所制备的水相和油相以5：2（V/V）的比例混合，乳化制成免疫用油乳剂抗原；
③免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋：将步骤②所制备的油乳剂抗原免疫步骤①处理过的产蛋鸡，免疫方式为皮下注射，剂量为1毫升/只，免疫次数为3次，第1次与第2次免疫间隔10天，第2次与第3次免疫间隔14天，将上述经过3次免疫后的产蛋鸡正常饲喂七天后收集鸡蛋，即为高免鸡蛋；
（2）提取卵黄抗体：
A：将步骤（1）所收集的蛋黄与无菌水1：1（V/V）混合后搅拌均匀，65℃密封灭活10分钟后迅速冷却至8℃-12℃，然后与无菌水以1：4的比例混合（V/V），1M的HCl调节pH至5.2，充分搅匀后4℃静置6小时，5000rpm离心20分钟，取上清；
B：将步骤A所得上清液与饱和硫酸铵溶液以1：1（V/V）的比例混合，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀；按质量比为1：3的比例将沉淀用无菌水溶解，所得溶液和饱和硫酸铵溶液以2：1（V/V）的比例混合，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀，按质量比为1：3的比例将沉淀用0.01M pH7.2的无菌PBS溶解；
C：将步骤B所得溶解液用截留量为100ku的超滤膜除盐浓缩；
D：将40%(V/V)的甲醛溶液与步骤C所得浓缩液混合,使甲醛的终浓度达到0.1%（V/V）；充分搅拌均匀后密封2小时；然后用0.45微米和0.22微米的微孔滤膜分别过滤，取滤液4℃保存备用；
（3）配制制剂及包装：将步骤（2）所得滤液进行鸭病毒性肝炎抗体效价测定，用0.01M pH7.2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1：512；然后加入吐温80，至吐温80终浓度为0.01%（V/V）作为保护剂，搅拌均匀后无菌条件下分装成成品。
2.根据权利要求1所述的鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中高免鸡蛋是由以下方法获得的：
①使用禽类专用抗菌肽饲料添加剂连续饲喂健康产蛋鸡3周，每日添加一次，日添加量为基础日粮的0.1%-0.3%。
②制备免疫用油乳剂抗原：
a：将冷冻保存的鸭肝炎病毒AV2111毒种稀释200倍后接种10-11日龄SPF鸡胚，接种量为100微升/只，置于37℃培养箱中孵育，48-96小时后收集死亡鸡胚，收集胚体病变明显的鸡胚尿囊液；
b：将a步骤收集的尿囊液加入终浓度为0.1%的福尔马林37℃密封灭活48小时，取灭活后的尿囊液与无菌吐温-80以19：1（W/W）的比例混合后制成水相；取白油、司本、硬脂酸铝以93：5：2（W/W/W）的比例混合，搅拌均匀后，121℃高压灭菌20分钟制成油相；
c：将b步骤所制备的水相和油相以5：2（V/V）的比例混合，乳化制成免疫用油乳剂抗原；
③免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋：将步骤②所制备的油乳剂抗原免疫步骤①处理过的产蛋鸡，免疫方式为皮下注射，剂量为1毫升/只，免疫次数为3次，第1次与第2次免疫间隔10天，第2次与第3次免疫间隔14天；3次免疫过后，每隔7周进行免疫一次，方式为皮下注射，剂量为1毫升/只，将上述经过3次免疫后的产蛋鸡正常饲喂七天后收集鸡蛋，即为高免鸡蛋。
3.根据权利要求2所述的鸭病毒性肝炎精制异源卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述高免鸡蛋获得方法的步骤（1）①中的禽类专用抗菌肽饲料添加剂为肽轻松B-001禽类专用制剂。
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| CN101704890A (zh) * | 2009-11-13 | 2010-05-12 | 烟台绿叶动物保健品有限公司 | 一种鸭肝炎抗体的制备方法 |
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2010
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| CN101704890A (zh) * | 2009-11-13 | 2010-05-12 | 烟台绿叶动物保健品有限公司 | 一种鸭肝炎抗体的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 杨晓梅等.鸡抗鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体的研制与应用.《四川畜牧兽医》.1994,9-10. * |
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