CN106589117A - 一种抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体及其制备方法，该方法包括如下步骤：(1)制备猪口蹄疫的高免鸡蛋；(2)利用高免鸡蛋制备精制蛋黄抗体；(a)分离高免鸡蛋蛋黄；(b)制备精制蛋黄抗体；(i)除脂；(ii)沉淀：采用‑20℃预冷的体积浓度95％乙醇处理；(iii)纯化：采用‑20℃预冷的体积浓度50％乙醇处理；(iv)浓缩；(v)灭活；(vi)除菌；(3)抗体效价的测定。本发明方法制备的抗猪口蹄疫蛋黄抗体，抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存，对猪口蹄疫的防治效果良好，特异性高，疗效确实，同时提供的制备方法安全、价格低廉，适于大规模生产，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及猪类用生物制品技术领域，尤其是一种抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体及其制备方法。
背景技术
猪口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的严重危害猪场的急性、热性、高度接触性传染病。瘦肉型猪较为易感。成年猪感染口蹄疫病毒的死亡率不超过5％，但新生仔猪往往因引发胸肌炎而死亡，死亡率可高达80％。由于口蹄疫传播速度快，发病率高，转播途径复杂，病原多型易变等特点，因而不易根除。该病流行性大、传染快、发病率高，在集约化猪场的发生无明显的季节性，常年均可发病，以冬春季节较常发生。病毒在外界环境中的抵抗力比较强，给养猪企业造成了巨大的损失，被国际兽疫局和国际粮农组织列为A类疫病中的第一号烈性传染病。各国也将该病列入法定传染病并积极防制和消灭。
目前主要用疫苗免疫母猪来预防该疾病的发生。由于还没有针对病毒性疾病的特效药物，因此临床治疗上主要采取对症治疗和抗生素类药物预防并发症的发生，其治疗效果不理想。因此，在生产中急需一种针对猪口蹄疫疾病具有特异性、治疗效果好且疗效迅速的治疗制剂。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种稳定性好、治疗效果明显、特异性强、制备安全方便的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体及其制备方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)制备猪口蹄疫的高免鸡蛋；
(2)利用高免鸡蛋制备精制蛋黄抗体：
(a)分离高免鸡蛋蛋黄；
(b)制备精制蛋黄抗体；
(i)除脂；
(ii)沉淀：采用-20℃预冷的体积浓度95％乙醇处理；
(iii)纯化：采用-20℃预冷的体积浓度50％乙醇处理；
(iv)浓缩；
(v)灭活：用二乙烯亚胺(BEI)做灭活剂，密封状态下室温静置；
(vi)除菌：用微孔滤膜设备进行除菌过滤；
(3)抗体效价的测定。
进一步，该方法包括如下步骤：
(1)制备猪口蹄疫的高免鸡蛋；
(2)利用高免鸡蛋制备精制蛋黄抗体：
(a)分离高免鸡蛋蛋黄：
将步骤(1)得到的高免鸡蛋清洗、消毒后(先用清水洗净，然后浸入体积浓度为1‰新洁尔灭水溶液中消毒，消毒1-3小时)，晾干，送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
(b)制备精制蛋黄抗体：
(i)除脂：
取步骤(a)分离的蛋黄，向其中加入蒸馏水稀释，并用盐酸调节PH，静置取上清液；
(ii)沉淀：
在步骤(i)得到的上清液中加入-20℃预冷的体积浓度95％乙醇，置4℃条件下搅拌、离心，用无菌PBS缓冲液溶解沉淀，得到沉淀溶解液；
(iii)纯化：
将步骤(ii)得到的沉淀溶解液加-20℃预冷的体积浓度50％乙醇，置4℃条件下搅拌、离心，用无菌PBS缓冲液溶解沉淀，得到沉淀溶解液；
(iv)浓缩：
将步骤(iii)得到的沉淀溶解液经(截留分子量为100KD)超滤浓缩仪过滤浓缩(至原体积的1/2)，得到浓缩液；
(v)灭活：
在步骤(iv)得到的浓缩液中加入灭活剂二乙烯亚胺(BEI)充分混匀，二乙烯亚胺(BEI)的终浓度为3mmol/L，在密封状态下室温静置12小时，得到灭活液；
(vi)除菌：
将步骤(v)得到的灭活液用(0.22微米)微孔滤膜设备进行除菌过滤，得最终的蛋黄抗体提取液；
(3)抗体效价的测定。
进一步，所述步骤(1)制备猪口蹄疫的高免鸡蛋的方法包括如下步骤：
(a)选择未经人工免疫的健康蛋鸡，经检测为猪口蹄疫病毒阴性；
(b)免疫：用市售猪O型口蹄疫灭活疫苗免疫步骤(a)处理过的(高产)蛋鸡；其中，免疫程序包括：基础免疫、加强免疫和维持免疫；
(c)高免鸡蛋的收集：
用所述步骤(b)中的疫苗免疫步骤(a)处理过的(高产)蛋鸡，进行免疫程序后，从基础免疫完成后(高免蛋中猪口蹄疫蛋黄抗体琼扩效价≥1:128)，开始收集鸡蛋，即为猪口蹄疫的高免鸡蛋。
进一步，所述步骤(a)中的蛋鸡满足以下条件：正值产蛋高峰、约200-400日龄的健康海蓝白产蛋鸡；将该蛋鸡隔离饲养，同时按照每公斤体重加喂8mg头孢曲松钠，以预防细菌感染。
进一步，所述基础免疫包括首免、二免和三免；所述首免为每只鸡腿肌或胸肌多点注射1.5ml疫苗；所述二免为在首免15天后，每只鸡腿肌或胸肌多点注射1.5ml疫苗；所述三免为在二免15天后，每只鸡腿肌或胸肌多点注射2ml所述疫苗；所述加强免疫为基础免疫完成后，隔一个月进行一次加强免疫，每只鸡腿肌或胸肌多点注射2ml所述疫苗，加强免疫共做2次；所述维持免疫为加强免疫后，每隔一个半月进行一次免疫，每只鸡腿肌或胸肌多点注射2ml所述疫苗，直至该产品停止生产。
进一步，所述步骤(i)除脂的方法为：
取分离的蛋黄，刺破蛋黄膜，收集无膜蛋黄并计量其体积；
然后将所得无膜蛋黄加入灭菌容器中，(缓慢)向其中加入蒸馏水稀释蛋黄液，并用磁力搅拌器(缓慢)搅拌(避免泡沫产生)，混匀后静置30min；
用盐酸调节pH至5.0-5.5，置4℃条件下静置过夜，次日，吸取上清液。
进一步，所述步骤(ii)沉淀的方法为：
在所述步骤(i)得到的上清液中加入-20℃预冷的体积浓度95％乙醇，使乙醇终浓度为溶液体积的50％，置4℃条件下(缓慢)搅拌1小时；22000g、20min、4℃条件下离心，弃掉上清液，用0.01M、pH为7.2的无菌PBS缓冲液溶解沉淀得沉淀溶解液。
进一步，所述步骤(iii)纯化的方法为：
将所述步骤(ii)所得沉淀溶解液加-20℃预冷的体积浓度50％乙醇，使乙醇终浓度为溶液体积的30％，置4℃条件下(缓慢)搅拌1小时；22000g、20min、4℃条件下离心，弃掉上清液，用0.01M、pH为7.2的无菌PBS缓冲液溶解沉淀得沉淀溶解液。
进一步，所述步骤(3)抗体效价的测定的方法为：
将所述步骤(2)所得蛋黄抗体提取液进行猪口蹄疫抗体效价测定，用0.01M、pH为7.2的无菌PBS缓冲液倍比稀释后加入琼脂凝胶周围孔中，中间孔中加入猪口蹄疫病毒抗原，置湿盒中37℃温箱反应24h，以出现沉淀带的最高稀释度的蛋黄液为该蛋黄液的猪口蹄疫病毒的抗体效价。
本发明还提供了一种由上述的制备方法制备得到的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体。
本发明还提供了上述抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体在防治猪口蹄疫疾病中的应用。
相对于现有技术，本发明所述的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体及其制备方法具有以下优势：
1、本发明制备的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体能针对猪口蹄疫进行有效的防治，提供了一种针对猪口蹄疫疾病具有特异性、治疗效果好且疗效迅速的治疗制剂。
2、本发明采用冰乙醇沉淀、纯化和BEI灭活方法处理所得抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体，纯度高、效价高、安全性好，性质稳定、易于保存，该法安全、价格低廉，适于大规模生产。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)制备猪口蹄疫的高免鸡蛋：
(a)选择正值产蛋高峰，未经人工免疫，约200-400日龄的健康海蓝白产蛋鸡，经检测为猪口蹄疫病毒阴性；将该蛋鸡隔离饲养，同时按照每公斤体重加喂8mg头孢曲松钠，以预防细菌感染。
(b)免疫：用市售猪O型口蹄疫灭活疫苗免疫步骤(a)处理过的高产蛋鸡；其中，免疫程序包括：基础免疫、加强免疫和维持免疫；
所述基础免疫包括首免、二免和三免；所述首免为每只鸡腿肌或胸肌多点注射1.5ml疫苗；所述二免为在首免15天后，每只鸡腿肌或胸肌多点注射1.5ml疫苗；所述三免为在二免15天后，每只鸡腿肌或胸肌多点注射2ml所述疫苗。
所述加强免疫为基础免疫完成后，隔一个月进行一次加强免疫，每只鸡腿肌或胸肌多点注射2ml所述疫苗，加强免疫共做2次。
所述维持免疫为加强免疫后，每隔一个半月进行一次免疫，每只鸡腿肌或胸肌多点注射2ml所述疫苗，直至该产品停止生产。
(c)高免鸡蛋的收集：
用所述步骤(b)中的疫苗免疫步骤(a)处理过的高产蛋鸡，进行免疫程序后，从基础免疫完成后，高免蛋中猪口蹄疫蛋黄抗体琼扩效价≥1:128，开始收集鸡蛋，即为猪口蹄疫的高免鸡蛋；
(2)利用高免鸡蛋制备精制蛋黄抗体：
(a)分离高免鸡蛋蛋黄：
将步骤(1)得到的高免鸡蛋先用清水洗净，然后浸入体积浓度为1‰新洁尔灭水溶液中消毒，消毒1-3小时，晾干，送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
(b)制备精制蛋黄抗体：
(i)除脂：
取步骤(a)中分离的蛋黄，刺破蛋黄膜，收集无膜蛋黄并计量其体积；
然后将所得无膜蛋黄加入灭菌容器中，缓慢向其中按8:1的体积比加入蒸馏水稀释蛋黄液，并用磁力搅拌器缓慢搅拌，避免泡沫产生，混匀后静置30min；
用盐酸调节pH至5.0-5.5，置4℃条件下静置过夜，次日，吸取上清液；
(ii)沉淀：
在步骤(i)得到的上清液中加入-20℃预冷的体积浓度95％乙醇，使乙醇终浓度为溶液体积的50％，置4℃条件下缓慢搅拌1小时；在22000g、20min、4℃条件下离心，弃掉上清液，用0.01M、pH为7.2的无菌PBS缓冲液溶解沉淀，得到沉淀溶解液；
(iii)纯化：
将步骤(ii)得到的沉淀溶解液加-20℃预冷的体积浓度50％乙醇，使乙醇终浓度为溶液体积的30％，置4℃条件下缓慢搅拌1小时；在22000g、20min、4℃条件下离心，弃掉上清液，用0.01M、pH为7.2的无菌PBS缓冲液溶解沉淀，得到沉淀溶解液；
(iv)浓缩：
将步骤(iii)得到的沉淀溶解液经截留分子量为100KD的超滤浓缩仪过滤浓缩至原体积的1/2，得到浓缩液；
(v)灭活：
在步骤(iv)得到的浓缩液中加入灭活剂二乙烯亚胺(BEI)充分混匀，二乙烯亚胺(BEI)的终浓度为3mmol/L，在密封状态下室温静置12小时，得到灭活液；
(vi)除菌：
将步骤(v)得到的灭活液用0.22微米的微孔滤膜设备进行除菌过滤，得最终的蛋黄抗体提取液；
(3)抗体效价的测定：
将所述步骤(2)所得蛋黄抗体提取液进行猪口蹄疫抗体效价测定，用0.01M、pH为7.2的无菌PBS缓冲液倍比稀释后加入琼脂凝胶周围孔中，中间孔中加入猪口蹄疫病毒抗原，置湿盒中37℃温箱反应24h，以出现沉淀带的最高稀释度的蛋黄液为该蛋黄液的猪口蹄疫病毒的抗体效价，其琼扩抗体效价为1:64。
将实施例1得到的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体进行猪口蹄疫疾病的临床疗效试验：
1、材料与方法
(1)试验材料
试验材料实施例1方法制备得到的抗体效价为1:64的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体。
实验动物某猪口蹄疫发病猪场，选取30日龄发病仔猪30头。
(2)试验方法
经PCR检测30头仔猪的猪口蹄疫病毒阳性且尚处于发病初期。
将试验猪随机分成两组，每组15头，第一组为对照组，不注射任何药品，第二组为治疗组，每头皮下注射2ml实施例1制备的琼扩效价为1:64的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体。隔离饲养，观察猪的发病和死亡情况至第21天。
2、试验结果与分析
抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体对猪口蹄疫疾病的临床疗效试验结果，详见表1。
表1抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体对猪口蹄疫疾病的临床疗效试验结果
| 编号 | 组别 | 发病率％ | 死亡率％ | 有效率％ |
| 第一组 | 对照组 | 100％ | 100％ | — |
| 第二组 | 治疗组 | 33％ | 6％ | 60％ |
试验结果表明：抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体对猪口蹄疫疾病具有良好的治疗效果，疗效显著。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改等同替换改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)制备猪口蹄疫的高免鸡蛋；
(2)利用高免鸡蛋制备精制蛋黄抗体：
(a)分离高免鸡蛋蛋黄；
(b)制备精制蛋黄抗体；
(i)除脂；
(ii)沉淀：采用-20℃预冷的体积浓度95％乙醇处理；
(iii)纯化：采用-20℃预冷的体积浓度50％乙醇处理；
(iv)浓缩；
(v)灭活：采用二乙烯亚胺(BEI)做灭活剂，密封状态下室温静置；
(vi)除菌：用微孔滤膜设备进行除菌过滤；
(3)抗体效价的测定。
2.根据权利要求1所述的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)制备猪口蹄疫的高免鸡蛋；
(2)利用高免鸡蛋制备精制蛋黄抗体：
(a)分离高免鸡蛋蛋黄：
将步骤(1)得到的高免鸡蛋清洗、消毒后，晾干，送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
(b)制备精制蛋黄抗体：
(i)除脂：
取步骤(a)分离的蛋黄，向其中加入蒸馏水稀释，并用盐酸调节PH，静置，取上清液；
(ii)沉淀：
在步骤(i)得到的上清液中加入-20℃预冷的体积浓度95％乙醇，置4℃条件下搅拌、离心，用无菌PBS缓冲液溶解沉淀，得到沉淀溶解液；
(iii)纯化：
将步骤(ii)得到的沉淀溶解液加-20℃预冷的体积浓度50％乙醇，置4℃条件下搅拌、离心，用无菌PBS缓冲液溶解沉淀，得到沉淀溶解液；
(iv)浓缩：
将步骤(iii)得到的沉淀溶解液经超滤浓缩仪过滤浓缩，得到浓缩液；
(v)灭活：
在步骤(iv)得到的浓缩液中加入灭活剂二乙烯亚胺(BEI)充分混匀，二乙烯亚胺(BEI)的终浓度为3mmol/L，在密封状态下室温静置12小时，得到灭活液；
(vi)除菌：
将步骤(v)得到的灭活液用微孔滤膜设备进行除菌过滤，得最终的蛋黄抗体提取液；
(3)抗体效价的测定。
3.根据权利要求1或2所述的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)制备猪口蹄疫的高免鸡蛋的方法包括如下步骤：
(a)选择未经人工免疫的健康蛋鸡，经检测为猪口蹄疫病毒阴性；
(b)免疫：用市售猪O型口蹄疫灭活疫苗免疫步骤(a)处理过的蛋鸡；其中，免疫程序包括：基础免疫、加强免疫和维持免疫；
(c)高免鸡蛋的收集：
用所述步骤(b)中的疫苗免疫步骤(a)处理过的蛋鸡，进行免疫程序后，从基础免疫完成后，开始收集鸡蛋，即为猪口蹄疫的高免鸡蛋。
4.根据权利要求3所述的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)中的蛋鸡满足以下条件：正值产蛋高峰、约200-400日龄的健康海蓝白产蛋鸡；将该蛋鸡隔离饲养，同时按照每公斤体重加喂8mg头孢曲松钠，以预防细菌感染。
5.根据权利要求3所述的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：所述基础免疫包括首免、二免和三免；所述首免为每只鸡腿肌或胸肌多点注射1.5ml疫苗；所述二免为在首免15天后，每只鸡腿肌或胸肌多点注射1.5ml疫苗；所述三免为在二免15天后，每只鸡腿肌或胸肌多点注射2ml所述疫苗；所述加强免疫为基础免疫完成后，隔一个月进行一次加强免疫，每只鸡腿肌或胸肌多点注射2ml所述疫苗，加强免疫共做2次；所述维持免疫为加强免疫后，每隔一个半月进行一次免疫，每只鸡腿肌或胸肌多点注射2ml所述疫苗，直至该产品停止生产。
6.根据权利要求1或2所述的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(i)除脂的方法为：
取分离的蛋黄，刺破蛋黄膜，收集无膜蛋黄并计量其体积；
然后将所得无膜蛋黄加入灭菌容器中，向其中加入蒸馏水稀释蛋黄液，并用磁力搅拌器搅拌，混匀后静置30min；
用盐酸调节pH至5.0-5.5，置4℃条件下静置过夜，次日，吸取上清液。
7.根据权利要求1或2所述的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(ii)沉淀的方法为：
在所述步骤(i)得到的上清液中加入-20℃预冷的体积浓度95％乙醇，使乙醇终浓度为溶液体积的50％，置4℃条件下搅拌1小时；22000g、20min、4℃条件下离心，弃掉上清液，用0.01M、pH为7.2的无菌PBS缓冲液溶解沉淀得沉淀溶解液。
8.根据权利要求1或2所述的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(iii)纯化的方法为：
将所述步骤(ii)所得沉淀溶解液加-20℃预冷的体积浓度50％乙醇，使乙醇终浓度为溶液体积的30％，置4℃条件下搅拌1小时；22000g、20min、4℃条件下离心，弃掉上清液，用0.01M、pH为7.2的无菌PBS缓冲液溶解沉淀得沉淀溶解液。
9.根据权利要求1或2所述的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)抗体效价的测定的方法为：
将所述步骤(2)所得蛋黄抗体提取液进行猪口蹄疫抗体效价测定，用0.01M、pH为7.2的无菌PBS缓冲液倍比稀释后加入琼脂凝胶周围孔中，中间孔中加入猪口蹄疫病毒抗原，置湿盒中37℃温箱反应24h，以出现沉淀带的最高稀释度的蛋黄液为该蛋黄液的猪口蹄疫病毒的抗体效价。
10.一种由权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到的抗猪口蹄疫精制蛋黄抗体。
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