HU217213B - Eljárás lóherpeszvírus-4 TK- vakcina előállítására - Google Patents

Eljárás lóherpeszvírus-4 TK- vakcina előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU217213B
HU217213B HU9300010A HU1093A HU217213B HU 217213 B HU217213 B HU 217213B HU 9300010 A HU9300010 A HU 9300010A HU 1093 A HU1093 A HU 1093A HU 217213 B HU217213 B HU 217213B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ehv
mutant
gene
nucleic acid
deletion
Prior art date
Application number
HU9300010A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT67778A (en
HU9300010D0 (en
Inventor
Lesley Nicolson
David Edward Onions
Original Assignee
Equine Virology Research Foundation
The University Court Of The University Of Glasgow
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Equine Virology Research Foundation, The University Court Of The University Of Glasgow filed Critical Equine Virology Research Foundation
Publication of HU9300010D0 publication Critical patent/HU9300010D0/hu
Publication of HUT67778A publication Critical patent/HUT67778A/hu
Publication of HU217213B publication Critical patent/HU217213B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A61K39/27—Equine rhinopneumonitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C12N9/1211—Thymidine kinase (2.7.1.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16741—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16743—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

A találmány egy EHV–4 műtáns – amely nem termel fűnkciőnális timidinkinázt –, egy vektőrmőlekűlát és az EHV–4 timidin kináz génszakaszlegalább egy részét tartalmazó rekőmbináns DNS-mőlekűla, az ezttartalmazó gazdasejt, valamint az EHV– 4 műtánst tartalmazó vakcinákelőállítási eljárására vőnatkőzik. ŕ

Description

A leírás terjedelme 12 oldal (ezen belül 4 lap ábra)
A találmány egy lóherpeszvírus-4 mutáns (EHV-4), egy EHV-4 DNS-t tartalmazó rekombináns DNS-molekula és a rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejt előállítási eljárására, továbbá az EHV-4 mutánssal fertőzött sejttenyészet, és az EHV-4 mutánsból származtatott vakcinák előállítási eljárására vonatkozik.
A lóherpeszvírus-4 (a továbbiakban EHV-4 vagy lóherpeszvírus-4) hasonlóan a lóherpeszvírus-1-hez egy alfa-herpeszvírus, amely igen jelentős gazdasági veszteségekért felelős a lótenyésztésben. Az EHV-4 elsősorban légzőszervi megbetegedésekkel kapcsolatos, bár az EHV-4 által okozott vetélésekről is beszámolnak esetenként.
Az EHV-4 genomját kétszálú DNS-ként jellemezték, amely két kovalens módon kötődő szegmenst tartalmaz (L, 109 kbp, S, 35 kbp), ez utóbbi invertált ismétlődő egységekkel végződik.
Régóta fennáll az igény az EHV-4 fertőzések elleni vakcinák iránt.
A jelenlegi vakcinák kémiailag inaktivált vírusvakcinákat és módosított élő vírusvakcinákat tartalmaznak. Az inaktivált vakcinák azonban általában csak alacsony szintű immunitást indukálnak, ezáltal további immunizálás szükséges, előnytelenül további adalékokat kell alkalmazni, és költséges az előállításuk. Továbbá bizonyos fertőző vírusrészecskék az inaktiválási folyamatot túlélhetik, és így az adagolás után betegséget válthatnak ki az állatnál. Általában a gyengített vírusvakcinák az előnyösek, ezek sokkal hosszabban tartó immunválaszt váltanak ki (mind humorálist, mind cellulárist), és a gyártásuk is egyszerűbb. Mostanáig csupán élő gyengített EHV-4 vakcinák voltak hozzáférhetők, amelyek élő EHV-4 vírusait szövettenyészetben virulens törzsek sorozatpasszálásával gyöngítették. Ezen kezelés következtében azonban ellenőrizhetetlen mutációk kerülnek be a virális genomba, ami a virulenciában és immunizálótulajdonságokban heterogén vírusrészecskéket eredményez. Ismert továbbá, hogy ilyen tradicionális módon gyengített élő vírusvakcinák virulenssé visszaváltozhatnak, ami a kezelt állatok megbetegedését és a kórokozók más állatokra való esetleges átterjedését válthatja ki. Továbbá a meglévő élő, gyengített EHV-4 vakcinák pozitív szerológiai tesztet mutatnak az EHV-4 fertőzésekre. így a meglévő EHV-4 vakcinák esetén nem lehetséges (szerológiai) teszttel, például Elisával meghatározni, hogy egy adott állat (latens) virulens vírushordozó-e vagy vakcinával kezelt.
A találmány célja EHV-4 mutáns biztosítása, amely alkalmazható EHV-4 fertőzések elleni vakcinákban, amely mutáns vírus szabályozott módon gyengített úgy, hogy az újbóli virulencia ki van zárva, de a gazdaállatban mégis erős immunválaszt vált ki.
A találmány értelmében az ilyen mutáns EHV-4 azzal jellemezhető, hogy nem termel funkcionális timidin kinázt (TK-) a timidin kinázt kódoló génben való deléció és/vagy inszerció eredményeképpen.
A genetikai anyagok szabályozott manipulációjára vonatkozó módszerek kifejlesztésével lehetővé vált olyan gyengített vírusvakcinák előállítása, amelyek nem rendelkeznek a klasszikus gyengített vírusvakcinák hátrányaival. Mostanáig azonban nem volt elegendő információ az EHV-4 virulenciát tartalmazó szakasz pontos elhelyezkedésére vonatkozóan az EHV-4 genomban, és így a gyengített EHV-4 vírusok genetikai úton történő előállítása nem volt lehetséges.
A timidin kinázt kódoló gént az EHV-4 genom BamHI C ffagmensén belül térképeztük, továbbá annak körülbelül 2 kbp EcoRV/XhoI fragmenséhez lokalizáltuk körülbelül 0,48 térképpozíciónál (1. ábra). Meghatároztuk a TK-gén nukleinsavszekvenciáját, ezt a SEQ ID NO: 1 ábrán mutatjuk be, ebből származtatható az a gén genetikai manipulációjához alkalmazandó restrikciós enzim hasítási hely.
A TK-gén 1056 nukleotidot tartalmaz, ez 352 aminosavenzimet kódol, és becsült molekulatömege 38 000 D. A TK expressziójának hatásosságát egy expressziós kontrollszekvencia szabályozza. Például promoter szekvenciák vesznek részt az RNSpolimeráznak a DNS-templáthoz való kötésében, és szabályozzák az mRNS helyét és belépését. Az ilyen szekvenciák gyakran találhatók a 100 bp nagyságú szakaszon belül a transzkripciós iniciációs hely előtt. A transzkripciós kontrollszignáltól downstream van többek között a transzkripciós terminációs kodon és a poliadenilezési szignál. A 21-25 bázispámál elhelyezkedő TATA box az EHV-4 TK-gén feltételezett promoter TATA box-a. A potenciális RNS-polimeráz iniciációs hely a 22 bp-nál található a TATA boxtól downstream. A poli A szignál a terminációs kodontól downstream a 42 bp-nál helyezkedik el (SEQ ID NO:1).
Nyilvánvaló, hogy az EHV-4 TK-gén DNS-szekvenciáinak természetes változatai fordulhatnak elő az egyes EHV-4 vírusokban. Ezek a változatok a TK-gén egy vagy több nukleotídjának megváltozását eredményezhetik, amely azonban még mindig kódolja a funkcionális TK-t. Ráadásul megvan a lehetősége annak, hogy géntechnológiai módszerekkel létrehozzuk ezen változatokat, amelyek a SEQ ID NO: 1 szekvenciával rokon DNS-szekvenciát eredményeznek. Nyilvánvaló, hogy azok az EHV-4 mutánsok, amelyek az ilyen rokon nukleinsavszekvenciában deléciót és/vagy inszerciót tartalmaznak, szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.
A találmány szerinti EHV-4 deléciós mutánsok olyan TK-gént tartalmaznak, amelyből egy DNS-fragmens törölve van oly módon, hogy a vírus replikációjának hatására funkcionális TK-enzim nem termelődik, például a megváltozott TK-protein tercier szerkezetének megváltozása eredményeképpen, vagy a leolvasási fázis eltolódása eredményeképpen.
A deléció mellett az EHV-4 mutáns genomja tartalmazhatja a komplett TK-gént is.
A találmány szerinti EHV-4 mutánst előállíthatjuk úgy is, hogy egy nukleinsavszekvenciát inszertálunk a TK-kódoló szakaszba, és így megakadályozzuk a funkcionális TK-enzim expresszióját. Ilyen nukleinsavszekvencia lehet többek között egy oligonukleotid, például egy 10-60 bp nagyságú, amely előnyösen tartalmaz még egy vagy több transzlációs kodont vagy egy, a polipeptidet kódoló gént. Ez a nukleinsavszekvencia bármilyen forrásból származhat, így például lehet szintetikus, virális, prokarióta vagy eukarióta.
A találmány egy másik megvalósítási formájánál az EHV-4 mutáns tartalmazhatja a fenti nukleinsavszekvenciát a törölt EHV-4 DNS helyén is.
A találmány további célja olyan EHV-4 mutáns biztosítása, amely nem csak EHV-4 fertőzések elleni vakcinák, hanem más fertőző lóbetegségek ellen is alkalmazható. Az ilyen biztos, élő, gyengített EHV-4 bázisú vektorvakcinák lehetőséget biztosítanak más patogének elleni immunizációra is azáltal, hogy az említett patogének antigénjeit expresszálják az immunizált gazda fertőzött sejtjein belül, és ezeket úgy állítjuk elő, hogy egy, az EHV-4-re heterológ polipeptidet kódoló nukleinsavszekvenciát inszertálunk az EHV-4 genom inszerciós szakaszába.
Azonban egy hasznos EHV-4 vektorhoz előfeltétel, hogy a heterológ nukleinsavszekvencia a genomiális EHV-4 szekvencia alkalmas (megengedő) szakaszába vagy helyzetébe legyen beépítve, azaz olyan szakaszba vagy helyzetbe, amely alkalmazható a heterológ szekvencia beépítésére anélkül, hogy zavarná az EHV-4 lényegi funkcióit, mint olyanokat, amelyek a fertőzéshez vagy replikációhoz szükségesek. Az ilyen szakaszokat inszertációs szakaszoknak nevezzük. A jelen találmányt megelőzően az EHV-4 genommal kapcsolatban ilyen inszertációs szakaszt még nem ismertettek.
A jelen találmány olyan EHV-4 mutánst biztosít, amely alkalmazható virális vektorként, és jellemzője, hogy e mutánsban nem termelődik funkcionális TK a TK-t kódoló génbe történő, egy polipeptidet kódoló heterológ nukleinsav inszertálása eredményeképpen.
A fentiek szerinti EHV-4 inszerciós mutáns, amely a törölt TK DNS-helyén tartalmaz inszertálva egy heterológ nukleinsavszekvenciát, szintén a találmány oltalmi körébe tartozik.
Az „EHV-4 inszerciós mutáns” többek között tartalmaz egy nem hatásos vírust, amely genetikailag módosítva lett egy heterológ nukleinsavszekvenciának a vírusgenomba való beépítésével, azaz egy gén beépítésével, amely egy proteint vagy annak egy részét kódolja, és amely gén eltérő az EHV-4-ben természetesen jelen lévő géntől.
Egy sejt említett EHV-4 inszerciós mutánssal való fertőzésekor az expresszálja a heterológ gént egy heterológ polipeptid formájában.
A „polipeptid” kifejezés egy biológiai aktivitású aminosavmolekula-láncra utal, de nem utal a termék specifikus hosszára, és kívánt esetben in vivő vagy in vitro módosítható is, például glikozilálással, amidálással, karboxilezéssel vagy foszforilezéssel, így például a polipeptid-meghatározásba beletartoznak többek között peptidek, oligopeptidek vagy proteinek.
Az EHV-4 genomba inszertálandó, találmány szerinti heterológ nukleinsavszekvencia bármilyen forrásból származhat, így például lehet vírus, prokarióta, eukarióta vagy szintetikus eredetű. A nukleinsavszekvencia származhat egy patogénből, előnyösen egy lópatogénből, amely az EHV-4 genomba való inszertálás után alkalmazható betegségek elleni immunitás indukálására. Előnyösen a következőkből származtatott nukleinsavszekvenciák alkalmazhatók az EHV-4 genom inszertációs szakaszába való beépítésre: EHV-1 lóinfluenza-vírus, -rotavírus, fertőzőanémiavírus, -arteritis-vírus, -enkefalitis-vírus, lovak Bomabetegség-vírusa, lovak Berue-vírusa, E. coli vagy Streptococcus equi.
Továbbá gyógyszerészeti vagy diagnosztikai célú polipeptideket kódoló nukleinsavszekvenciák, különösen immunmodulátorok, így például limfokinek, interferonok vagy citokinek is beépíthetők az említett inszertációs szakaszba.
A heterológ nukleinsavszekvencia EHV-4 mutánsban való expressziójához igen fontos követelmény egy megfelelő, a heterológ nukleinsavszekvenciához működőképesen kapcsolódó promoter. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy ez a promoter lehet bármilyen eukarióta, prokarióta vagy virális promoter, amely képes az EHV-4 mutánssal fertőzött sejtben a géntranszkripciót irányítani, így például lehet az SV-40 promoter (Science 222, 524-527, 1983) vagy a metallotionenin promoter (Natúré 296, 39-42) vagy egy hősokkpromoter (Voellmy és munkatársai, Proc. Natl. Sci. USA 82, 4949-53, 1985), vagy a humán citomegalovírus IE-promoter vagy az EHV-4-ben jelen lévő promoterek, így például a TK-promoter.
A DNS-szekvenciák klónozóvektorokba való beépítésére ismert eljárásokat és in vivő homológ rekombinációt alkalmazhatunk a delécióra és/vagy az EHV-4 genomba való inszertációra [Maniatis T. és munkatársai, (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 74808 számú európai szabadalmi bejelentés; Roizman B. és Jenkins F. J. (1985), Science 229, 1208; Higuchi R. és munkatársai (1988), Nucleic AcidsRes. 16, 7351],
Röviden, ezt az EHV-4 DNS rekombinációjához szükséges rekombináns DNS-molekula megalkotásával végezhetjük. Az ilyen rekombináns DNS-molekulát származtathatjuk bármilyen alkalmas plazmidból, kozmidból, vírusból vagy fágból, előnyösen plazmidból, amelyek tartalmaznak EHV-4 DNS-t, amely esetleg rendelkezik egy inszertált nukleinsavszekvenciával működőképesen kapcsolódva egy promoterhez. Ilyen klónozóvektorok előnyösen például a plazmidvektorok, így például a pBR322, a különböző pUC-k és Bluescript plazmidok, bakteriofágok, például a X-gt-WES-λ B, karon 28 és M13mp fágok vagy virális vektorok, így például SV40, Bovin papillomavírus, polyoma- és adenovírusok. A találmány értelmében alkalmazható vektorokat ismertetnek továbbá még a következő irodalmi helyen: Rodriguez, R. L. és D. T. Denhardt, kiadó: Vectors, A Survey of Molecular Cloning Vectors and theirUses, Butterworths, 1988.
Először, az inszertációs szakaszt, így például a TKgént tartalmazó EHV-4 DNS-fragmenst inszertáljuk a klónozóvektorba a recDNS-eljárás szerint. Ez a DNSffagmens tartalmazhatja a TK-gén egy részét vagy lényegében a teljes TK-gént, és kívánt esetben annak határolószekvenciáit. Másodszor, ha egy EHV-4 TK deléciós mutánst kívánunk előállítani, a TK-gén legalább egy részét töröljük az első lépésben nyert rekombináns DNS-molekulából. Ezt például elérhetjük a megfelelő exonukleáz III enzimmel végzett emésztéssel, vagy az első lépésben nyert rekombináns DNS-molekula restrikciós enzimmel végzett emésztésével. EHV-4 inszerciós mutáns esetén a nukleinsavszekvenciát az első lépés szerint nyert rekombináns DNSmolekulában lévő TK-génbe vagy az említett rekombináns DNS-molekulából törölt TK-DNS-helyére inszertáljuk. Az EHV-4 DNS-szekvencia, amelyet a törölt TK-DNS határol, vagy az inszertált nukleinsavszekvencia megfelelő hosszúságú kell, hogy legyen, hogy lehetővé tegye a virális EHV-4 genommal való homológ rekombinációt.
Kívánt esetben olyan konstrukciót is készíthetünk, amely két vagy több különböző inszertált (heterológ) nukleinsavszekvenciát tartalmaz, amelyek például az említett szekvencia ugyanazon vagy más patogénjéből származnak, és a definiált EHV-4 inszerciós szakaszával végződnek. Az ilyen rekombináns DNS-molekulát alkalmazhatjuk például olyan EHV-4 mutánsok előállításához, amelyek két vagy több különböző antigénhatású polipeptidet expresszálnak, és így többértékű vakcinákat alkotnak.
Ezután sejteket, így például nyúlsejteket, TK+ vagy TK fenotípust vagy lósejteket, így például dermális lósejteket transzfektálunk az EHV-4 DNS-sel a rekombináns DNS-molekula jelenlétében, amely a (heterológ) nukleinsavszekvencia-deléciót és/vagy -inszerciót tartalmazza és a megfelelő EHV-4 szekvenciák határolják, amikor is rekombináció megy végbe a rekombináns DNS-molekulában és az EHV-4 genomban lévő megfelelő szakaszok között. A rekombináció úgy is végezhető, hogy a gazdasejtet tartalmazó EHV-4 genomiális DNS-t transzfektáljuk egy DNS-sel, amely a megfelelő határoló inszerciósszakasz-szekvenciákkal van határolva, vektor DNS-szekvenciák nélkül. Ezután egy rekombináns virális utódot állítunk elő sejttenyészetben, és ezeket például genotípusosan vagy fenotípusosan elválasztjuk, így például hibridizációval, detektáló enzimaktivitással, amelyet egy kointegrált gén kódol egy (heterológ) nukleinsavszekvenciával együtt, és EHV-4 mutánsra teszteljük, amely nem termel funkcionális TK-t (lásd Roizman és Jenkins, F. J. fenti hivatkozása, 1985), vagy detektáljuk immunológiásan az antigénhatású, az EHV-4 mutánssal expresszált heterológ polipeptidet. Az elválasztott EHV-4 mutánst nagyipari méretekben tenyészthetjük sejtkultúrában, majd az EHV-4 mutánst tartalmazó anyagot vagy ezen EHV-4 által expresszált heterológ polipeptidet a tenyészetből kinyerjük.
Más módszer szerint az EHV-4 mutánst különböző kozmidok kotranszfekciójával nyerjük, amelyek valamelyike tartalmazza a teljes EHV-4 genomot, és egy inszerciót és/vagy deléciót viszünk be az EHV-4 TK DNS-t tartalmazó kozmidba.
A találmány értelmében az élő, gyengített EHV-4 mutánst, amely nem termel funkcionális TK-t, és ha szükséges, expresszálja specifikus patogének egy vagy több különböző heterológ polipeptidjét, alkalmazhatjuk
EHV-4-re vagy ilyen patogénekre érzékeny lovak vakcinálására.
Az ilyen élő vakcinákkal végzett vakcinálást előnyösen a kezelt gazdasejten belüli EHV-4 mutáns replikációja követi, amely in vivő EHV-4 polipeptideket és kívánt esetben heterológ polipeptideket expresszál. Ez az EHV-4-gyel és a polipeptidekkel szembeni immunválaszt vált ki. Ilyen EHV-4 mutánssal vakcináit állat immúnis lesz bizonyos időn át egy következő EHV-4 vagy más, fentiekben említett patogén által okozott fertőzésre.
A találmány szerinti EHV-4 mutáns, amely adott esetben tartalmaz vagy expresszál egy vagy több különböző polipeptidet, egy vagy többértékű vakcinaként szolgálhat.
A találmány szerinti EHV-4 mutáns alkalmazható inaktivált vakcinák előállításához is.
A találmány szerinti EHV-4 mutánst állatoknak adagolhatjuk többek között aeroszol, spray, ivóvíz formájában, orálisan, intradermálisan, szubkután vagy intramuszkulárisan. A vírus stabilizálására adalékokat, így például fölözött tejet vagy glicerint alkalmazhatunk, a lovak vakcinálását előnyösen intranazálisan végezzük. Általában az ajánlott dózis 103 és 108 TCID50 EHV-4 mutáns lovanként.
A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá az alegységvakcinák, gyógyszerkészítmények és diagnosztikai készítmények előállítási eljárása is, amelyek egy találmány szerinti EHV-4 mutáns által expresszált heterológ polipeptidet tartalmaznak. Ezt úgy végezzük, hogy az említett EHV-4 mutánssal fertőzött sejtet tenyésztünk olyan körülmények között, amelyek elősegítik a heterológ polipeptid expresszióját. A kapott heterológ polipeptidet ezután ismert eljárásokkal tisztítjuk a kívánt felhasználástól függő mértékben, majd immunizáló hatású vagy diagnosztikai célú készítménnyé alakítjuk.
A fentiek szerinti aktív immunizálást egészséges állatoknál alkalmazzuk specifikus patogének elleni védelemként. Nyilvánvaló, hogy a specifikus patogénnel már megfertőzött állatok kezelhetők olyan antiszérummal, amelyek a találmány szerinti EHV-4 mutáns által kiváltott antitesteket tartalmazzák. A találmány szerinti EHV-4 mutánsok elleni antiszérum előállítható az állatok hatásos mennyiségű mutánssal végzett immunizálásával, amikor is megfelelő immunválaszt váltunk ki, majd az állatoktól vért veszünk, és az antiszérumot előállítjuk.
1. példa
EHV-4 inszertációs szakasz izolálása és jellemzése
1. EHV-4 vírus tenyésztése
Hengeres fiolákban dermális lósejtek (NBL-6; ATCC CCL-57) enyhén összefolyó monorétegeit, amelyeket kiegészített (0,2% nátrium-hidrogén-karbonát, 1% nem esszenciális aminosav, 1% glutamin, 100 egység/ml penicillin, 100 mg/ml sztreptomicin és 10% magzati borjúszérum) Earle-féle Minimum Essential Médium (Flow) közegben tenyésztettünk, EHV-4 1942 törzshöz [Cullinane, A. A. és munkatársai: J. Gén. Virol. 69, 1575 (1988)] tartozó vírussal 0,003 m. o. i. mennyiségben megfertőzünk, és hagyjuk adszorbeálódni 60 percig 37 °C-on, majd 31 °C-on inkubáljuk, amíg extenzív c. p. e. evidenssé válik, és a sejtek túlnyomó többsége a lombik aljától elválik (2-6 nap). A fertőzött sejtközeget ezután 5000 f/perc mellett centrifugáljuk, a felülúszót 1200 f/perc mellett centrifugáljuk 2 órán át Sorvall GSA 6 x 200 ml-es rotorban. A pelleteket ezután 5 ml PBSben reszuszpendáljuk, ultrahanggal kezeljük, majd Sorvall SS34 rotorban 11 000 f/perc mellett centrifugáljuk 5 percen át a sejttörmelék elválasztására. A vímst ezután 18 000 f/perces centrifugálással pelletezzük Sorvall SS34 rotorban 1 órán át. A vírusrészecskék és plakk-képző egységek közötti arány körülbelül 1000 az 5000-hez.
2. EHV-4 DNS készítése
A pelletezett vírust 10 ml NTE-ben (NaCl/Tris/ /EDTA) reszuszpendáljuk, és rövid ideig ultrahanggal kezeljük. A szennyező celluláris DNS-t 10 pg/ml DNáz adagolásával megbontjuk, és 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Ezután 2% végső koncentrációban SDS-t adagolunk, majd a készítményt körülbelül 3-szor fenollal kiegyensúlyozott NTE-vel extraháljuk, amíg tiszta interfázisokat nyerünk.
A kloroformos extrakciót követően a fentiek szerinti DNS-t etanollal kicsapjuk, a DNS-t pelletezzük, 70%-os etanollal mossuk, 10 ml 100 mmólos NaCl-oldatban reszuszpendáljuk, és 10 pg/ml RNáz jelenlétében egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután egy további tisztítást végzünk 1 mg/ml proteináz K-val való kezeléssel (2 óra, 31 °C). A DNS-t egyszer fenol: kloroform (1:1 térfogat) eleggyel, majd egyszer kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, jól leszívatjuk és 0,1 X SSC-ben reszuszpendáljuk.
3. EHV-4 DNS klónozása
EHV-4 BamHI DNS-ffagmenseket pUC9 vektorba ligáljuk, ami egy olyan plazmid, amely tartalmazza a pBR322 ampicillinrezisztencia-génjét és az M13mp9 polilinkerszakaszát [Vieira J. és Messing J. (1982), Gene 19, 259], Külön 5 pg EHV-4 DNS-t és 5 pg pUC9 DNS-t emésztünk BamHI enzimmel.
A teljes emésztést a reakciókeverék alikvot részén végzett gélelektroforézissel igazoljuk, majd a DNS-t azonos térfogatú fenol: kloroform eleggyel kétszer extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. A ligálást lényegében Tanaka és Weisblum módszerével végezzük (J. Bact. 121, 354, 1975). Kb. 0,1 pg BamHI enzimmel emésztett pUC9 plazmidot elkeverünk 1 pg BamHIemésztett DNS-sel 50 mmol trisz-HCl-t, pH 7,5, 8 mmol MgCl2-t, 10 mmol ditiotreitolt 1 mmol ATP-t 40 pl végtérfogatban tartalmazó elegyben, majd hozzáadunk 2 egység T4 DNS-ligázt (0,5 pl), és a reakciókeveréket 4 °C-on 16 órán át inkubáljuk.
Kalciumsokkolt E. coli DHI-sejteket (Hanahan D. (1983), J. Mól. Bioi. 166, 557) a rekombináns plazmidokkal transzformáljuk (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110, 1972). További kiónokat származtatunk a BamHI C fragmenst tartalmazó rekombináns plazmid restrikciós emésztésével (lásd 1. ábra), majd a specifikus EHV-4 restrikciós fragmensek kinyerésével és szubklónozásával (lásd Maniatis és munkatársai fenti hivatkozása) a Bluescript Ml3+ plazmidvektor (Stratagene) többszörös klónozóhelyére.
pg-ot mindegyik konstrukcióból monorétegű BHK TK~-sejtekbe [European Collection of Cell Cultures (ECACC) nyilvántartási szám: 88011423] transzfektáljuk Graham és van dér Eb módosított eljárásával (Virology 52, 456, 1973; Cell. Phect Transfection Kit, a gyártó utasítása szerint), a TK+-kolóniákat elválasztjuk HAT kiegészített tápközegbe (10 4 mól hipoxantin, 4x 10~5 mól aminopterin, l,6x 10 5móltimidin).
A TK-transzformáló aktivitást így a 2 kbp EcoRV/XhoI-fragmenshez (RX2) lokalizáltuk, pBSRX2-konstrukcióba klónoztuk a kb 0,48 térképhellyel (lásd 1. ábra).
Az RX2-fragmens mindkét szálának nukleotidszekvenciáját meghatároztuk templátként egyszálú plazmid DNS és primerként Bluescript eredetű, szokásosan készített oligonukleotidot alkalmazva, Sanger didezoxi szekvenáló eljárással (Sanfer és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463, 1977) (lásd le. ábra). A pontos lokalizációt és a TK-gén nukleinsavszekvenciáját és a megfelelő aminosav-szekvenciát a SEQ ID NO: 1 ábrán mutatjuk be.
2. példa
TK-deléciós plazmid készítése
Az EHV-4 TK-gén DNS-ének restrikciós térképezése és szekvenciaanalízise azt mutatja, hogy az RS3 ffagmensen belül egyedülálló Smal és BstXI helyek vannak (1. és 2. ábrák), és az RX2-n belül pedig egyedülálló Smal és BstEII helyek, amelyek mindegyike a TK-kódoló szakaszon belül van. A TK-génen belüli 0,73 kbp deléciót a pUC 8 plazmidba (a Smal és Sáli helyeknél a többszörös klónozási helyen belül) RS3 klónozásával érjük el, majd a konstrukciót Smal és BstXI enzimekkel emésztjük. A vektorfragmenst plusz a deléciót határoló EHV-4 DNS-t izoláljuk, és a BstXI enzimmel nyert túlnyúló részt T4 pol alkalmazásával betöltjük. A lineáris plazmidot magát ezután ligáljuk, és így nyerjük az Smal-BstXI helyről törölt RS3 ffagmenst tartalmazó plazmidot (2. ábra).
A TK-génen belül a 0,52 kbp deléciót úgy nyeljük, hogy a Bluescript vektorba (a Smal és Xhol helyeknél a többszörös klónozási helyen belül) EHV-4 RX2-t klónozunk, és a TK-génen belül az Smal-BstEII helyről töröljük ezen enzimekkel végzett restrikciós emésztéssel. A nagyobb vektorfragmenst elválasztjuk a 0,52 kbp EHV-4 fragmenstől, a túlnyúló részt betöltjük, és a plazmidot újra ligáljuk. A kapott plazmid tartalmazza az EHV-4 TK-gén 5’- és 3’-kódolószakaszait, de törölve van a Smal-BstEII helyekről (lásd 2c. ábra).
3. példa
Rekombináns PCR alkalmazása TK~-konstrukciók előállításához
A 2. példa szerinti két plazmidkonstrukció EHV-4 DNS-t tartalmaz két meghatározott delécióval a TK-génen belül. Ezen deléciók helyét a TK-génen belüli restrikciós helyek hozzáférhetősége határozza meg, ami felhasználható a deléciós stratégiában. Mindkét deléció átfogja a TK-gén N-terminális kódolószakaszát. Feltételezve, hogy ez a szakasz valószínűleg tartalmazza a szomszédos UL24 típusú gén promoterét, ezen DNS-ek beépítése az EHV-genomba valószínűleg eredményezheti a mind az UL24 típusú gén, mind a TK-gén megváltozott expresszióját. A DNS-eket ezért úgy alkotjuk meg, hogy a TK-gén C-terminális kódolószakaszán belül tartalmazza a deléciót annak érdekében, hogy végül is olyan EHV-rekombinánsokat nyerjünk, amelyek csupán a TKexpresszióban vannak érintve. Ezen DNS-ek előállításához rekombináns polimeráz láncreakciót (PCR) alkalmazunk, mivel ez a módszer teszi lehetővé, hogy a deléció valamely helyen a génen belül lokalizálva legyen. Mint az a 2. és 3. ábrán látható, két primer készletet szintetizáltunk (1,2 és 3,4 primerek), amelyeket egymástól függetlenül alkalmaztunk a deléciótól jobbra és balra elhelyezkedő DNS-fragmensek előállításához (1. lépés). Ezután a külső primereket (1,4 primerek) alkalmaztuk a PCRreakciók első menetében nyert termékek bővítésére (primer 2,3, komplementer kapcsolható végekkel rendelkező szakaszokkal) a TK-konstrukciók előállítása céljából (2. és 3. lépések). Ezen módszernek az a további előnye, hogy a restrikciósendonukleáz-helyeket a végeknél és a deléciós helyeknél lehet inszertálni a primereken belüli beépítéssel. Ezek a helyek alkalmazhatók a TK-DNS PCR-termék alkalmas plazmidvektorba való klónozásának könnyítésére (4. lépés) és a deléció helyére történő klónozás végbevitelére.
Primerek
Az alábbi primerek 3’-terminális szekvenciáit az EHV-1 és EHV-4 TK-génjeinek publikált szekvenciáiból származtattuk (lásd az aláhúzott szekvenciákat). Az 5’-szekvenciák tartalmaznak egy „GC” kapcsot (az intra15 primer restrikciósenzimmel végzett hasítás hatásosságának fokozására) és 3 restrikciósenzim-helyet. A 2 és 3 primerek esetén a primerek 5’-szakaszai komplementerek annak érdekében, hogy megkönnyítsék a denaturált első amplifikált termékek kapcsolását a 2. lépésben.
EMU (Primer 1)
5’-GCGGATCGATAGATCTGCGGCCGCTGCGTTAGTGGTGTTC1 a I Bg111 No tI
LIL (Primer 2)
5’-GAGCTCGATATCTCTAGAGTAGGGCGTGGTAAAGC- 3’
Ss tI EcoRV Xbal
RIU (Primer 3)
5’-TCTAGAGATATCGAGCTCATATTGGAAGTTCACGC- 3’
Xbal EcoRV SstI
RML (Primer 4)
5’-CCGGGATCCAGATCTGCGGCCGCTCAGAAGATGTGTACGA- 3’ BamHI Bg 1 11 No t I
A PCR-technikát a következőképpen végezzük.
Az első 1 és 2 primereket az egyszálú EHVgenomhoz hibridizáljuk. Ezután a másik szálat a primer 1-től kezdődően az első szál mentén megszintetizáljuk egy DNS-polimeráz alkalmazásával addig, amíg a 2 primerrel kerül szembe, amikor is a DNS-szintézist leállítjuk. Hasonlóképpen egy második oligonukleotidszálat szintetizálunk a 3 primertől a 4 primerig. A szálakat ezután dehibridizáljuk egyetlen DNS-szállá, melegítéssel. Ha szükséges, a műveletet megismételjük további adag primerek alkalmazásával a PCR-termék mennyiségének növelése érdekében.
Az 1. ábrán bemutatjuk az EHV-4 timidin kináz génlokalizációs és -szekvenálási eljárását.
a) a TK-gént a 0,43 és 0,53 helyek közötti BamHI C fragmensnél lokalizáljuk;
b) az EHV-4 BamHI C szubfragmenst teszteljük azon képességére vonatkozóan, hogy biokémiailag transzformálja a BHK TK sejteket TK+ fenotípussá. A TK- transzformáló aktivitás a 2 kbp EcoRV/XhoIfragmens RX2 helyhez van lokalizálva;
c) az RX2 szubklónozása és az átlapolófragmensek szekvenálása a TK-gén pontos lokalizációját és nukleotid-szekvenciáját eredményezi.
A 2. ábrán látható:
a) a TK-gént tartalmazó RS3-ffagmens restrikciósenzim-formája;
b) 0,73 kbp deléció TK-génben (Smal-BstXI), 35 RS3-ból törölve;
c) 0,52 kbp deléció TK-génben (Smal-BstXI), RX2-ből törölve.
A 3. ábrán látható a TK-gén szakaszának deléciója polimeráz láncreakcióval (PCR), a 4. példa 1-3. lépése szerint; és a 4. ábrán látható a 4. példa szerint nyert TK-DNS PCR-termék klónozása alkalmas plazmidvektorba (4. lépés).
Szekvenciafelsorolás
45 SEQ ID NO: Szekvencia típusa: Szekvencia hosszúsága: DNS-típus: 1, nukleotid a megfelelő proteinnel, 1260 bázispár; 352 aminosav, egyszálú,
50 Topológia: lineáris,
Molekula típusa: Eredeti forrás- genomi DNS,
organizmus : Közvetlen kísérleti lóherpeszvírus-4,
55 forrás: genomi BamHI könyvtár,
Jellemzők: 21-25 bp között feltételezett TATA szignál, 47 bp feltételezett polimeráz iniciációs hely, 109-114 bp között poli A szignál,
60 Tulajdonságok: timidin kináz gén.
CCAAATCTTG AACCATTGCG TTATAGAAGC GGTTGTGGCA CCGTATACCC GCTCTGAGTC 60 TGCTTCTAGC GGTGAGACGC TGTTTACGTT TCATCTCCAC AGGCAGTA ATG GCT GCT 1 1 7
Me t Ala Ala 3
TGC GTA ccc CCG GGA GAA GCT CCA CGA AGC GCC AGC GGA ACG CCC ACC 165
Cy s Va 1 Pro Pro Gly Glu Al a Pro Arg Ser Al a Ser Gly Thr Pro Thr 19
CGG CGG CAA GTA ACA ATA GTT AGA ATT TAC CTC GAT GGA GTT TAT GGC 213
Arg Arg Gin Va 1 Thr I le Val Arg I 1 e Tyr Leu As p Gly Va 1 Tyr Gly 35
ATC GGT AAG AGC ACG ACG GGA CGA GTT ATG GCA TCG GCT GCT AGC GGA 261
I 1 e Gly Ly s Ser Thr Thr Gly Arg Va 1 Me t Al a Ser Al a Al a Ser Gly 5 1
GGA AGT CCA ACT CTA TAC TTT CCA GAG CCT ATG GCG TAC TGG CGG ACT 309
Gly Ser Pro Thr Leu Tyr Phe Pro Glu Pro Me t Al a Tyr Trp Arg Thr 67
CTT TTT GAA ACG GAC GTA ATT AGT GGT ATT TAC GAC ACC CAA AAC CGG 357
Leu Phe Glu Thr As p Va 1 11 e Ser Gly I 1 e Tyr As p Thr Gin Asn Arg 83
AAA CAG CAG GGA AAT TTG GCC GTT GAT GAC GCG GCA TTA ATA ACT GCG 405
Ly s Gin Gin Gly As n Leu Al a Val As p As p Al a Al a Leu 11 e Thr Al a 99
CAT TAC CAA AGC CGC TTT ACC ACG CCC TAC CTG ATA CTC CAC GAT CAC 453
Hi s Tyr Gin Ser Arg Phe Thr Thr Pro Tyr Leu I le Leu Hi s As p Hi s 115
ACT TGT ACG TTG TTT GGG GGA AAC AGC CTA CAG CGT GGA ACA CAA CCG 501
Thr Cy s Thr Leu Phe G1 y Gly Asn Ser Leu G1 n Arg Gly Thr Gin Pro 131
GAC CTG ACC CTT GTG TTT GAC CGC CAC CCG GTC GCC TCT ACC GTA TGC 549
As p Leu Thr Leu Va 1 Phe As p Arg Hi s Pro Va 1 Al a Ser Thr Va 1 Cy s 147
TTT CCA GCA GCC CGC TAC CTA CTC GGT GAC ATG TCA ATG TGC GCG CTA 597
Phe Pro Al a Al a Arg Tyr Leu Leu Gly As p Me t Ser Me t Cy s Al a Leu 163
ATG GCT ATG GTT GCT ACT CTA CCA AGA GAA CCC CAG GGT GGT AAC ATT 645
Me t Al a Me t Va 1 Al a Thr Leu Pro Arg Glu Pro Gin Gly Gly Asn 11 e 179
GTG GTT ACC ACC CTA AAT GTA GAG GAG CAT ATA CGG AGA CTG CGT ACG 693
Va 1 Va 1 Thr Thr Leu Asn Val Glu G1 u Hi s I le Arg Arg Leu Arg Thr 195
CGG GCT AGA ATA GGA GAA CAA ATT GAC ATT ACG CTG ATT GCT ACA TTG 741
Arg Al a Arg I le Gly Glu Gin I le As p I le Thr Leu I le Al a Thr Leu 211
CGA AAT GTG TAC TTT ATG CTA GTT AAT ACA TGT CAC TTT TTG CGC TCT 789
Arg Asn Va 1 Tyr Phe Me t Leu Va 1 As n Thr Cy s Hi s Phe Leu Arg Ser 227
GGG CGA GTT TGG CGC GAC GGT TGG GGT GAG CTA CCC ACT TCC TGT GGG 837
Gly Arg Va 1 Trp Arg As p Gly Trp Gly Glu Leu Pro Thr Ser Cy s Gly 243
GCT TAT AAG CAT CGC GCC ACA CAG ATG GAC GCC TTC CAA GAG CGC GTT 885
Al a Tyr Ly s Hi s Arg Al a Thr Gin Me t As p Al a Phe Gin Glu Arg Va 1 259
TCA CCG GAG CTG GGC GAC ACT CTG TTT GCC CTG TTT AAA ACT CAA GAA 933
Ser Pro Glu Leu Gly As p Thr Leu Phe Al a Leu Phe Ly s Thr Gin Glu 275
CTG CTA GAC GAT CGC GGT GTA ATA TTG GAA GTT CAC GCT TGG GCG TTG 981
Leu Leu As p As p Arg Gly Val I le Leu Glu Va 1 Hi s Al a Trp Al a Leu 291
GAC GCG CTT ATG CTA AAA CTG CGT AAC CTG AAT GTT TTC AGT GCC GAT 1029
As p Al a Leu Me t Leu Ly s Leu Arg As n Leu Asn Va 1 Phe Ser Al a As p 307
TTA AGT GGT ACA CCG CGA CAA TGT GCA GCT GTT GTA GAG TCT TTG CTG 1077
Leu Ser Gly Thr Pro Arg Gin Cy s Al a Al a Va 1 Va 1 Glu Ser Leu Leu 323
CCA CTT ATG AGC AGC ACC TTA TCA GAT TTT GAT TCC GCC TCT GCT TTA 1 125
Pro Leu Me t Ser Ser Thr Leu Ser As p Phe As p Ser Al a Ser Al a Leu 339
GAG CGG GCG GCA CGC ACC TTT AAC GCG GAG ATG GGC GTC TGA AGCTATATGT 1 177
Glu Arg Al a Al a Arg Thr Phe Asn Al a Glu Me t Gly Va 1 352
AATGTTTGTT GTGCCAATGC CAAAATTGTG AAATAAAGATT CATTTGCCAA TATCCATCAT 1237 AGCGCCTTGT GTGTTTCGTG TGT 1260

Claims (15)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás funkcionális timidin kinázt nem termelő EHV-4 mutáns előállítására, azzal jellemezve, hogy a vírus timidin kinázt kódoló génjében - az UL24 gén expresszióját lényegesen nem befolyásoló pozícióban - deléciót és/vagy inszerciót hozunk létre.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a deléciót vagy inszerciót úgy hozzuk létre, hogy a deléciós vagy inszerciós szakaszok végei nem egyeznek meg a timidin kináz génben található restrikciós endonukleáz hasítóhelyekkel.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a deléciót vagy inszerciót a timidin kináz gén
    60 C-terminális kódolószakaszában hozzuk létre.
    HU217213 Β
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inszerciót legalább egy, polipeptidet kódoló heterológ nukleinsavszekvencia beépítésével hozzuk létre.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterológ nukleinsavszekvenciaként egy - a nukleinsavszekvencia expresszióját az EHV-4 mutánssal fertőzött sejtben vezérelni képes - promoter szabályozása alatt álló heterológ szekvenciát építünk be.
  6. 6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterológ nukleinsavszekvenciaként egy lópatogén antigénjét kódoló szekvenciát építünk be.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy heterológ nukleinsavszekvenciaként EHV-1 vagy lóinfluenza-antigént kódoló szekvenciát építünk be.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inszerciót és/vagy deléciót a SEQ ID NO: 1 szerinti szekvenciával lényegében megegyező szekvenciájú timidin kináz génben hajtjuk végre.
  9. 9. Eljárás vektormolekulát és az EHV-4 timidin kináz génszakasz egy felismerhető részét tartalmazó rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy egy vektormolekulát összekapcsolunk egy - az UL24 gén expresszióját lényegesen nem befolyásoló pozícióban - deléciót és/vagy inszerciót tartalmazó EHV-4 timidin kináz génszakasszal.
  10. 10. Eljárás a 9. igénypont szerint előállított rekombináns DNS-molekulát tartalmazó gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 9. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekulát gazdasejtbe juttatunk.
  11. 11. Eljárás az 1-8. igénypontok bármelyike szerint előállítható EHV-4 mutáns előállítására, azzal jellemezve, hogy egy sejtkultúrát EHV-4 DNS-sel és egy 9. igénypont szerinti rekombináns DNS-sel kontraszfektálunk.
  12. 12. Eljárás az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti EHV-4 mutánssal fertőzött sejtkultúra előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1-8. igénypontok bármelyike szerinti EHV-4 mutánssal sejtkultúrát fertőzünk.
  13. 13. Eljárás az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti EHV-4 mutánsból származó vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1-8. igénypontok bármelyike szerinti EHV-4 mutánsból származó hatóanyagot gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal elegyítünk.
  14. 14. Eljárás az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti EHV-4 mutánst tartalmazó vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1-8. igénypontok bármelyike szerinti EHV-4 mutánst gyógyászatilag elfogadható hordozóval elegyítünk.
  15. 15. Eljárás EHV-4 vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 12. igénypont szerinti sejtkultúrából EHV-4 tartalmú anyagot választunk el, és azt immunizáló hatású készítménnyé alakítjuk.
HU9300010A 1990-07-06 1991-07-05 Eljárás lóherpeszvírus-4 TK- vakcina előállítására HU217213B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB909014951A GB9014951D0 (en) 1990-07-06 1990-07-06 Equine herpesvirus-4 tk vaccine

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9300010D0 HU9300010D0 (en) 1993-04-28
HUT67778A HUT67778A (en) 1995-04-28
HU217213B true HU217213B (hu) 1999-12-28

Family

ID=10678730

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9300010A HU217213B (hu) 1990-07-06 1991-07-05 Eljárás lóherpeszvírus-4 TK- vakcina előállítására

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0538299A1 (hu)
JP (1) JPH05508538A (hu)
AU (1) AU8212891A (hu)
CA (1) CA2086740A1 (hu)
GB (1) GB9014951D0 (hu)
HU (1) HU217213B (hu)
NZ (1) NZ238834A (hu)
WO (1) WO1992001045A1 (hu)
ZA (1) ZA915231B (hu)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731188A (en) * 1986-11-20 1998-03-24 Syntro Corporation Recombinant equine herpesviruses
DE4110962A1 (de) * 1991-04-05 1992-10-08 Bayer Ag Equine herpesviren (ehv), die fremd-dna enthalten, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in impfstoffen
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
US5620896A (en) * 1992-03-23 1997-04-15 University Of Massachusetts Medical Center DNA vaccines against rotavirus infections
US6165993A (en) * 1992-03-23 2000-12-26 University Of Massachusetts Medical Center DNA vaccines against rotavirus infections
GB9213882D0 (en) * 1992-06-30 1992-08-12 Univ Court Of The University O Live modified equine herpesvirus-4 vaccine
PT654089E (pt) * 1992-08-07 2003-11-28 Syntro Corp Herpesvirus equino recombinante
US6225111B1 (en) 1992-08-07 2001-05-01 Schering Plough Veterinary Corp. Recombinant equine herpesviruses
US5741696A (en) * 1992-08-07 1998-04-21 Syntro Corporation Recombinant equine herpesviruses
ES2132330T3 (es) * 1993-12-20 1999-08-16 Akzo Nobel Nv Vacuna para la proteccion de caballos frente a la infeccion por el virus del herpes equino.
EP0668355B1 (en) * 1993-12-20 1999-04-07 Akzo Nobel N.V. Vaccine for the protection of horses against equine herpesvirus infection
US5629348A (en) * 1994-11-14 1997-05-13 Nzym, Inc. Methods and compositions for treating septoria infections
US5637621A (en) * 1994-11-14 1997-06-10 Nzym, Inc. Methods and compositions for treating Botrytis infections
GB9626029D0 (en) * 1996-12-14 1997-01-29 Univ Leeds EVH-1 vectors
ATE316139T1 (de) 1998-07-31 2006-02-15 Akzo Nobel Nv Attenuierte pferdeherpesvirus
ATE298245T1 (de) * 1999-04-20 2005-07-15 Univ Paris Curie Verwendung von equiner-herpes-virus-typ-4- thymidin-kinase und einen nucleosidanalog ausgewählt von ganciclovir und acyclovir zur tötung von proliferativen humanzellen

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990001547A1 (en) * 1988-08-08 1990-02-22 The Upjohn Company Methods for isolating herpes virus thymidine kinase-encoding dna

Also Published As

Publication number Publication date
AU8212891A (en) 1992-02-04
JPH05508538A (ja) 1993-12-02
ZA915231B (en) 1992-04-29
CA2086740A1 (en) 1992-01-07
EP0538299A1 (en) 1993-04-28
HUT67778A (en) 1995-04-28
WO1992001045A1 (en) 1992-01-23
HU9300010D0 (en) 1993-04-28
NZ238834A (en) 1992-05-26
GB9014951D0 (en) 1990-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU633663B2 (en) Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
AU725846B2 (en) Recombinant live vaccine containing feline herpes virus type 1, particularly for treating feline infectious peritonitis
HU217213B (hu) Eljárás lóherpeszvírus-4 TK- vakcina előállítására
WO1994017810A1 (en) Recombinant cytomegalovirus vaccine
US8114409B2 (en) Structural proteins of fish pancreatic disease virus and uses thereof
JP2008143900A (ja) ウマの予防用ポリヌクレオチドワクチン製剤
JP2000512844A (ja) ベクターとして鳥類の感染性喉頭気管炎ウイルスを用いた鳥類用組換え生ワクチン
EP0510773B1 (en) Canine coronavirus subunit vaccine
EP0538341B1 (en) Ehv-4 glycoprotein vaccine
CA3027196A1 (en) Multivalent recombinant spv
HU219312B (en) Recombinant feline herpesvirus vaccine
JP3710838B2 (ja) ウマヘルペスウイルス感染からウマを防御するためのワクチン
JP3529134B2 (ja) 組換えネコヘルペスウイルスのベクターワクチン
US5279965A (en) Recombinant infectious laryngotracheitis virus
EP0668355B1 (en) Vaccine for the protection of horses against equine herpesvirus infection
GB2282601A (en) Coronavirus vaccines
WO2000012677A2 (en) Generation of recombinant infectious bursal disease viruses by reverse genetics technology and the use of the recombinant viruses as attenuated vaccines
US6225111B1 (en) Recombinant equine herpesviruses
JP3675569B2 (ja) 組み換えウイルス及びそれよりなるワクチン
US6025181A (en) Equine herpesvirus-4TK mutant
WO1994000587A2 (en) Attenuated equine herpesvirus-4 as live vaccine or recombinant vector
JPH09508005A (ja) 潜伏と腫瘍細胞発生の阻害によるマレク病の抑制
WO1997020036A1 (es) Adenovirus recombinantes que expresan antigenos del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (vgpt) y su empleo en la formulacion de vacunas
JP2002541815A (ja) ウシアデノウイルス１型から誘導された組換えアデノウイルスおよび変異アデノウイルス
JPH06253852A (ja) Ｃｃｖワクチン

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee