HU219377B - Recombinant virus of marek-disease - Google Patents
Recombinant virus of marek-disease Download PDFInfo
- Publication number
- HU219377B HU219377B HU526/91A HU252691A HU219377B HU 219377 B HU219377 B HU 219377B HU 526/91 A HU526/91 A HU 526/91A HU 252691 A HU252691 A HU 252691A HU 219377 B HU219377 B HU 219377B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- mdv
- dna
- plasmid
- bamhi
- foreign gene
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
A találmány tárgya Marek-féle betegség I. szerotípusú vírus, amelyetrekombináns technikával alkalmassá tesznek arra, hogy idegen géntfejezzen ki. Az idegen gén előnyösen valamely más baromfibetegséggénje. A találmány kiterjed a Marek-féle betegségvírus DNS-genomjánaknem esszenciális beiktatási területére, az ezt a területet tartalmazóplazmidokra, az ezeket a plazmidokat tartalmazó gazdasejtekre és azígy kialakított rekombináns vírusokat tartalmazó vakcinákra, amelyektöbb baromfibetegség ellen alkalmazhatók. ŕ
Description
A találmány tárgya olyan vírusvektor, amely képes idegen géneket kifejezni, különösen csirkékben. A találmány azon a felismerésen alapszik, hogy a Marek-féle betegségvírus („MDV”) 1. szerotípusának DNS-genomjába egy olyan heterológ nukleinsavszekvencia iktatható be, amely tartalmaz egy, az említett beiktatott terület által közrefogott idegen gént. A találmány tárgya továbbá az ezt a nukleinsavszekvenciát tartalmazó plazmid, a rekombináns MDV-t tartalmazó vakcina, valamint az anti-rekombináns MDV antitesteket tartalmazó antiszérum.
A Marek-féle betegség a csirkék rosszindulatú, limfómás rendellenessége, amelyet egy herpeszvírus, a Marek-féle betegségvírus okoz. A vírus megfertőzi a csirkéket, és a fertőzést követő hetekben különböző szövetekben T-sejt limfómák fejlődnek ki, ami végül a fertőzött csirkék pusztulását okozza, illetve feldolgozáskor a fertőzött csirkék kiselejtezését teszi szükségessé. Ez a betegség egyedi a herpeszvírusok által indukált rendellenességek között, amennyiben ezen betegség ellen a baromfiiparban a világ nagy részén már húsz éve vakcinálják a kereskedelmi célú csirketenyészeteket.
Az MDV olyan DNS-vírus, amely a Herpesviridae családra jellemző burokkal rendelkezik. A vírus az alábbi három szerotípusba sorolható:
I. típus: az MDV virulens törzsei, amely csirkékre nézve patogén és tumorkeltő, és legyengített nem patogén törzsek származnak belőle;
II. típus: az MDV természetben előforduló nem patogén törzsei;
III. típus: pulyka herpeszvírus (HVT) törzsek, amelyek csirkére nézve nem patogének.
Az MDV-t a fertőzés patogenezise és a klasszikus virológia szempontjából az egész huszadik századon át tanulmányozták. Az MDV molekuláris elemzésében az elmúlt évtized hozott fejlődést. Jelentős eredmények a vírus-DNS-molekula klónozása [Fukuchi és munkatársai : J. Virol. 51, 102-109 (1984)]; az MDV elleni monoklonális antitestek kialakítása; a viruspolipeptidek azonosítása; a transzkripciós térkép meghatározása [Schat és munkatársai: Int. J. Cancer 44, 101-109 (1989)]; és az MDV genomon levő gének azonosítása [Buckmaster és munkatársai: J. Gén. Virol. 69, 2033-2042 (1988)]. A vírust genetikailag eddig még gyakorlatilag nem elemezték, bár a HVT-nek egy foszfono-acetát-rezisztens mutánsáról már beszámoltak.
A Marek-féle betegségnek óriási a gazdasági jelentősége, és a Marek-féle betegség vírus elleni hatékony vakcinák kritikusan fontosak a baromfiipar fenntartása szempontjából. A legszélesebb körben alkalmazott vakcina a HVT, bár jelenleg a csirkéket már több helyen MDV vakcina törzsek kombinációjával vakcinálják. Nem valószínű, hogy a jelenleg létező Marek-féle betegség elleni vakcinák a jövőben megfelelőek maradnak, és a rekombináns Marek-féle betegség elleni vakcinák kifejlesztése továbbra is fontos feladat a kutatók számára. Mivel a jelenlegi Marek-féle betegség elleni vakcinákat már húsz éve élő herpeszvírus-vakcinaként használják a baromfiiparban, ezeken most mint a baromfiakhoz esetlegesen alkalmas herpeszvírusvektorokon jelentős kutatásokat folytatnak.
Vírus vektorként például Vacciniát, Papillomavírust, Baculovírust, Parvovírust és dohány mozaikvírust alkalmaznak. Ezeket klónozóvektorként vagy idegen gének kifejező vektoraként ismertetik. Ishikawa és munkatársai a 0 334 530 számú európai szabadalmi bejelentésben az MDV-t szintén mint idegen gén kifejező vektorát ismertetik. A leírás szerint egy idegen gént, például a Newcastle vírus (NDV) hemagglutininjét és neuraminidázát kódoló gént a HVT A antigén helyét (gp 57-65 gén) kódoló génbe iktatják be. A rekombináns HVT-t olyan vakcina előállítására alkalmazzák, amely mind az NDV, mind az MDV ellen hatásos.
A WO 88/07088 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentésben Martin S. és munkatársai egy idegen génnek a HVT egyik nem esszenciális területébe történő beiktatását és a madarak ezzel a vírusvektorral történő fertőzését ismertetik, ami azután mind az idegen géntermékre, mind a HVT-re immunogén reakciót vált ki. Feltételezik, hogy a HVT az egyetlen madár herpeszvírus, amely vírusvektorként alkalmazható, és az alkalmazott nem-esszenciális területek a timidinkinázt és az Ι-β-D-arabinofiiranozil-timin-rezisztenciát kódolják.
A WO 89/0140 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentésben Cochran és munkatársai egy idegen DNS-nek legyengített herpeszvírus vektorokba történő beiktatását ismertetik. Olyan rekombináns fúziós fehérjét ismertetnek, amely egy antigén jellegű aminosavszekvenciát és egy ahhoz fuzionált álveszettség (pseudorabies) vírusból származó gpX glikoprotein egy részét tartalmazza. A fertőző burzális betegségvírus (IBDV) RNS-e nagy szegmensének egyik cDNSmásolatát, amely három polipeptidet kódol, nevezetesen a VP2-t, VP4-et és VP3-at, valamint az E. coli Bgalaktozidázgént a HVT genom egy egyedi hosszú területén belül levő nem esszenciális helynél iktatják be. Ezt a rekombináns vírust vakcinaként használják IBDV ellen. MDV elleni javított tulajdonságú vakcina előállítására az MDV A antigén génjét (gp 57-65) a HVT azonos helyébe iktatják be.
Bár néhány herpeszvírus, például a Herpes simplex vírus és az álveszettségvírus genetikai elemzését már elvégezték, az MDV 1. szerotipus („MDV-1”) DNSgenomjának genetikai szerkezete még nem eléggé ismert.
A különböző baromfibetegségek ellen jelenleg gyakran élő, legyengített patogének felhasználásával készítenek vakcinákat, ami magában hordja azt a kockázatot, hogy az állatokat esetleg nem kellőképpen legyengített patogén mikroorganizmusokkal inokulálják.
Az inaktivált vakcinák általában csak alacsony szintű immunitást indukálnak, és így további immunizálások szükségesek. Ezenkívül a vírusok közömbösítést indukáló antigén-determinánsai az inaktiváló kezelés révén megváltozhatnak, csökkentve a vakcina védőpotenciálját.
Ha egy vakcinában egynél több legyengített élő patogént kombinálnak, további gondok vetődhetnek fel. Az
HU 219 377 Β antigén komponensek kölcsönös egymásra hatása csökkentheti egy vagy több alkotó antigén immunogenitását.
Abból a célból, hogy Marek-féle betegség és még legalább egy másik madárbetegség ellen hatékony vakcinát készítsünk egy MDV-vektor alkalmazásával - ahol az MDV DNS-genomja olyan idegen gént tartalmaz, amely egy másik madárbetegséget okozó ágensből való antigént kódol -, meg kell találni az MDVgenomnak egy nem esszenciális területét, és ezt beiktatási területként kell használni. Ha az idegen gén be van iktatva a beiktatási területbe, a megfelelő génterméket ki kell fejezni. Az MDV-vektor csirkéknek beadva immunválaszt fog kiváltani mind MDV, mind az idegen géntermék, például egy fehérje ellen, és ez az immunválasz előnyösen nagyobb hatásfokú, mint az a válasz, amely kombinált vakcina hatására alakulna ki.
Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.
Az 1. ábra az MDV-1 DNS-genomjának egyedi rövid területében levő BamHI-Α terminális, 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alfragmentumában található nyitott leolvasókeret restrikciós térképét mutatja.
A 2. ábra az MDV-1 beiktatási területének DNSszekvenciáját mutatja.
A 3. ábra a pMDIOO plazmidot ábrázolja, amely a BamHI-Α pUC19 plazmid vektorba klónozott terminális, 4,3 kb-s EcoRIBamHI alfragmentumát tartalmazza.
A 4. ábra az SV40 korai promotorról kifejezett, a β-galaktozidázt kódoló lacZ-gént ábrázolja.
Az 5. ábra az SV40 korai promotorról kifejezett, a BamHI-A 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alffagmentumán belül elhelyezkedő BglII helyre beiktatott lacZ-gént tartalmazó pMTIA és pMTIB plazmidokat mutatja be.
A 6. ábra a GA szülő és GAlac rekombináns MDV-1 izolátumokból való DNS Southem-folt elemzését mutatja be, jelezve, hogy a rekombinációs esemény helyspecifikus.
A 7. ábra a szülő és a rekombináns MDV-1 izolátumok 37 °C-on történő növekedésének a görbéit mutatja.
A 8. ábra a szülő és a rekombináns MDV-1 izolátumok 41 °C-on történő növekedésének a görbéit mutatja.
A találmány az MDV-1 DNS-genomján levő, eddig ismeretlen, nem esszenciális beiktatási terület felfedezésén alapul. Ez a terület egy nyitott leolvasókeretet tartalmaz a genom egyedi rövid területében levő BamHI-Α terminális 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alffagmentumában. A BamHI-Α a legnagyobb a 29 BamHI fragmentumok közül, amelyeket az MDV-1 genom BamHI-gyel végzett teljes emésztésével kapunk, és ez a BamHI-Α magában foglalja a genom egyedi rövid területét. Ezt a területet az 1. ábrán bemutatott restrikciós térképpel lehet szemléltetni. Ez a terület lényegében véve a 2. ábrán bemutatott, 238-1050 nukleotidhelyek DNS-szekvenciáját tartalmazza. A találmány kiterjed az ezt a beiktatási területet tartalmazó plazmidra is.
A találmány tárgya továbbá olyan rekombináns MDV-1, amely egy idegen gént tartalmaz, előnyösen olyan gént, amely egy másik baromfibetegséget előidéző ágens immunogénjét kódolja. Ezt a rekombináns vírust vakcinaként alkalmazhatjuk állatok egészségének védelmére, mivel mind az MDV-re, mind arra a betegségokozó ágensre immunválaszt vált ki, amelynek idegen génjét az MDV-1 genomba iktattuk be.
Ismeretes, hogy egy adott patogénnel már fertőzött állatok az illető patogén elleni antiszérummal kezelhetők. A találmány értelmében az antitesteket olyan rekombináns MDV-1 segítségével váltjuk ki, amely egy, az adott patogénből származó antigén polipeptidet kódoló heterológ gént tartalmaz. Egy rekombináns MDV-1 elleni antiszérumot a találmány értelmében úgy állítunk elő, hogy a kellő immunválasz kiváltására állatokat, például baromfiakat immunizálunk az említett rekombináns MDV-1 hatékony mennyiségével. Ezután az állatokat elvéreztetjük, és az antiszérumot önmagában ismert módon készítjük.
A találmány értelmében az alkalmazható rekombináns MDV-1-et úgy készítjük, hogy a heterológ nukleinsavszekvenciát az MDV-1 genomjának nem esszenciális helyére vagy területébe iktatjuk be, vagyis egy olyan helyre vagy területbe, amelyet ilyen beiktatáshoz alkalmazhatunk anélkül, hogy a vírus esszenciális funkcióit, például azokat, amelyek a fertőzéshez és a replikálódáshoz szükségesek, lerontanánk. Az ilyen területet beiktatási területnek nevezzük. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott beiktatási területet heterológ DNS beépítéséhez még nem ismertették. Ezenkívül nem volt ismeretes az MDV-1 genomja azon területének restrikciós enzim térképe, amelyet az itt ismertetett, heterológ DNS-szekvencia beépítéséhez használunk.
A találmány értelmében a rekombináns MDV előállítása érdekében a heterológ DNS-szekvencia beépítéséhez használt előnyös beépítési terület, a 2. ábrán megadott 238-tól 1050-ig terjedő DNS-szekvencia, a genom egyedi rövid területében helyezkedik el. A beiktatási terület a BamHI-A 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alfragmentumán belül helyezkedik el, amint ezt a nyitott leolvasókeretet tartalmazó genomterület restrikciós enzimes térképében az 1. ábrán bemutatjuk. Közelebbről a beiktatási terület egy BglII helyet tartalmaz a BamHI-A 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alfragmentumán belül.
A fenti nem esszenciális beiktatási területnek megfelelő DNS-szekvenciák alkalmazhatók olyan célra, hogy géneket iktassunk be az MDV-1 genomba.
Nyilvánvaló, hogy az MDV-1 genom DNS-szekvenciájának különböző természetes variációi léteznek az egyes törzsek esetén. Ezek a variációk egy vagy több nukleotid kiiktatását, helyettesítését, beiktatását, inverzióját vagy hozzátételét eredményezhetik, ami esetleg befolyásolhat egy vagy több restrikciós helyet, így olyan restrikciós enzim térképek alakulhatnak ki, amelyek az 1. ábrán bemutatott térképpel nem teljesen azonosak, de azzal rokonok.
HU 219 377 Β
Ezenkívül fennáll az a lehetőség is, hogy genetikai manipulációs technikát alkalmazva hozzuk létre a fentebb említett variációkat, így alakítva ki az 1. ábrán bemutatott térképpel nem teljesen azonos, de rokon DNS-szekvenciát. A rekombináns MDV-1, amely az MDV-1 genom területében - amelyet bármely ilyen rokon restrikciós enzim térképjellemez - elhelyezkedő beiktatási területében egy beiktatott heterológ gént tartalmaz, szintén a találmány tárgykörébe tartozik. Továbbá mivel az említett beiktatási terület nem fejt ki esszenciális szerepet, ez a terület részben vagy teljesen törölhető, és azután a területre a heterológ gén beiktatható. Nyilvánvaló, hogy az olyan rekombináns MDV-1, amely egy, a találmány szerinti beiktatási területnek vagy ezen beiktatási terület egy részének megfelelő MDV-1 genomterületbe beépített heterológ gént tartalmaz, szintén a találmány tárgykörébe tartozik.
Összefoglalva: a fenti beiktatási terület megszabja annak a területnek az elhelyezkedését az MDV genomon belül, amelyet egy heterológ nukleinsavszekvencia beiktatásához alkalmazhatunk.
A beiktatási terület DNS-szekvenciáját a 2. ábra mutatja, amint egy, a 238. és a 1050. nukleotidhely közti DNS-szekvenciából áll. A találmány szerinti beiktatási terület jellemzésénél fontos megemlíteni, hogy az MDV-1 vírusok közt természetes variációk lehetnek, amelyek egy vagy több nukleotid kiiktatását, helyettesítését, inverzióját stb. idézhetik elő. Ezek a variációk genetikai manipulációk segítségével szintén létrehozhatók. Az olyan rekombináns MDV-1 törzsek, amelyek heterológ gént ilyen nem teljesen azonos, de rokon MDV-1 genomterületbe beiktatva tartalmaznak, szintén a találmány tárgykörébe tartoznak. így például egy heterológ gént be lehet iktatni egy olyan MDV-1 törzsbe, amelyben a 2. ábrán bemutatott MDV-1 genom nukleotidszekvenciájához viszonyítva egy nukleotid ki van iktatva. A 2. ábrán bemutatott DNS-szekvenciával jellemzett MDV-1 beiktatási terület megszabja annak a területnek az elhelyezkedését az MDV-1 genomon belül, amelyet egy heterológ nukleinsavszekvencia beiktatásához alkalmazhatunk.
A találmány értelmében az MDV-1 genomba beiktatandó heterológ nukleinsavszekvencia bármely forrásból származhat, így például lehet vírus, prokarióta, eukarióta vagy szintetikus eredetű. Az említett nukleinsavszekvencia származhat valamely patogénből, előnyösen madárpatogénből, amelyet az MDV-1 genomba történt beiktatás után az adott betegség elleni immunitás indukálására alkalmazhatunk. Az MDV-1 genom beiktatási területébe való beépítéshez alkalmasak például a következő organizmusokból származó nukleinsavszekvenciák: fertőző bronchitis vírus (IBV), MDV, NDV, IBDV, csirkevérszegénységet okozó ágens (CAA), reovírus, madár retrovírus, szárnyas adenovírus, pulyka rinotracheitiszvírus, fertőző laringotracheitiszvírus, Eimeria fajok, Salmonella fajok, Escherichia coli és Mycoplasma gallisepticum. Az említett beiktatási területbe ezenkívül gyógyszer vagy diagnosztikai alkalmazásra szánt polipeptideket, különösen immunmodulátorokat, például limfokineket, interferonokat vagy citokineket kódoló nukleinsavszekvenciák is beépíthetők.
Az ilyen heterológ nukleinsavszekvenciák kifejezéséhez az szükséges, hogy a szekvencia megfelelő és működőképes promotorhoz legyen kapcsolva. Promotorként bármely olyan prokarióta, eukarióta, vírus eredetű vagy szintetikus promotor alkalmazható, amely az MDV-1-gyel fertőzött sejtekben irányítani tudja a gén kifejeződését.
A rekombináns MDV-l-et az alábbi lépéseket tartalmazó eljárással állíthatjuk elő:
- előállítunk egy első vektort, amely alkalmas hordozóba klónozva az MDV-1 genom BamHI-A restrikciós fragmentumának 4,3 kb-s BamHI-EcoRI alfragmentumát tartalmazza;
- az első vektor MDV-1 DNS-fragmentumába legalább egy idegen génszekvenciát iktatunk be, így egy második vektort kapunk;
- a sejteket együtt átfertőzzük a második vektorból való DNS-sel és az MDV-l-ből való DNS-sel;
- az együtt átfertőzött sejteket annyi ideig inkubáljuk, amely elegendő ahhoz, hogy homológ rekombináció alakuljon ki a második vektor DNS-fragmentuma és a legyengített MDV-1 genomiális DNS-e között, ahol a második vektor az idegen gén által megszakított MDV-1 DNS-t tartalmaz, míg a legyengített MDV-1 genomiális DNS-ének a nukleotidszekvenciája homológ vagy hasonló a második vektor MDV-1 DNS-fragmentumához;
- az átfertőzött sejtekből rekombináns vírust izolálunk, amely tartalmaz egy legyengített MDV-l-et és egy ebbe beiktatott idegen gént.
Az első lépésben az MDV-1 genom BamHI-A restrikciós fragmentumának 4,3 kb-s BamHI-EcoRI alfragmentumát egy megfelelő vektorhoz ligáljuk, így megkapjuk az első vektort. A vektor származhat bármely alkalmas plazmidból, kozmidból vagy bakteriofágból, amelyek közül a plazmidok az előnyösek. A legelőnyösebb plazmid a pMDIOO plazmid. A BamHI-A restrikciós fragmentum 4,3 kb-s BamHI-EcoRI alfragmentumát úgy izoláljuk, hogy az MDV-1 23 kb-s BamHI-A fragmentumát tartalmazó kiónt BamHI-gyel és EcoRI-gyel emésztjük.
Az MDV-1 23 kb-s BamHI-A fragmentumát tartalmazó kiónt szükség esetén az MDV-1 genomiális könyvtárából izolálhatjuk. A vírus genomiális könyvtárát úgy állíthatjuk elő, hogy az MDV-l-et gazdasejt-, például madársejttenyészetben szokásos módon tenyésztjük, majd az MDV-1-gyel fertőzött gazdasejttenyészetből szokásos módon vírus-DNS-t izolálunk. Az eljárást például úgy végezzük, hogy MDV-l-et inokulálunk csirkeembrió-fibroblasztsejtekbe, és tenyésztjük, így vírussal fertőzött sejteket kapunk. A vírussal fertőzött sejteket kinyeijük, pufferral mossuk, centrifugáljuk, és trisz-HCl és EDTA elegyében 1-5-108 sejt/ml sejtsűrűségben újra szuszpendáljuk. 0,5% végső koncentrációig nátrium-dodecil-szulfátot (SDS), továbbá 200 pg/ml végső koncentrációig K-proteinázt adunk hozzá. Inkubálás után további K-proteinázt adunk hozzá, és az inkubálást további 1 órán át folytatjuk. Az ol4
HU 219 377 Β datot fenol és kloroform 1:1 térfogatarányú elegyével kétszer extraháljuk, és a nukleinsavakat szokásos módon etanollal kicsapjuk. A fertőzött sejtekből az összes DNS-t centrifugálással kinyerjük, és 10 mmol/1 triszHCl-t (pH=7,5) és 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó oldatban (TE) feloldjuk. A DNS-t valamely restrikciós enzimmel, például Sau3A-val inkubáljuk az enzimet forgalmazó cég által javasolt körülmények között. A reakciótermékeket agarózgélen elkülönítjük, és a 16 és 20 kb közti méretű frakciókat izoláljuk. Ezekből a DNS-ffagmentumokból 100 ng-ot megfelelő enzimekkel a forgalmazó cég által javasolt körülmények között emésztett megfelelő DNS-vektorhoz ligálunk. Megfelelő vektor lehet például a BamHI-gyel és EcoRI-gyel emésztett lambda-EMBL3-DNS. Ligálás után a reakciókeveréket kereskedelmi forgalomban levő extraktumokkal in vitro „csomagoljuk”. A rekombináns bakteriofágokat megfelelő E. coli gazdatörzsre, például LE392-re vagy K802-re szélesztjük mintegy 100 tarfoltképző egység (PFU)/lemez sűrűséggel. A lemezekről nitrocellulóz szűrőkre szokásos módon két példányban replikákat készítünk. Az első sorozat szűrőt nem fertőzött sejtekből való, radioaktívan jelzett DNS-sel, míg a második sorozat szűrőt MDV-l-gyel fertőzött sejtekből való, radioaktívan jelzett DNS-sel szokásos módon hibridizáljuk. Mosás és röntgenfílmen végzett exponálás után a két példányban készült szűrők képét korrekt orientációban egymásra illesztjük, és néhány olyan tarfoltot izolálunk, amelyek az MDV-l-gyel fertőzött sejtekről készített mintával fajlagosan jelet adnak, és az ezekből származó bakteriofágokat sokszorozzuk. Ezeket a bakteriofág kiónokat a beiktatás restrikciós térképezésével részletesen elemezve megkeressük azt a kiónt, amelynek a restrikciós enzimes felismerési mintája azt jelzi, hogy az MDV-1 genom BamFII-A fragmentumát tartalmazza.
Amint fentebb ismertettük, az MDV-1 genom BamHI-A 4,3 kb-s BamHI-EcoRI alffagmentumát úgy izoláljuk, hogy egy BamHI-A-t tartalmazó genomiális kiónt BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel szokásos módon emésztünk. Az emésztéssel kapott fragmentumokat alacsony olvadáspontú agarózgélen végzett elektroforézissel elkülönítjük, és a 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alfragmentumot izoláljuk, és szokásos módon, például fenolos extrahálással és etanolos kicsapással tisztítjuk. A tisztított 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alfragmentumot szokásos módon DNS-ligáz segítségével megfelelő vektorba ligáljuk, így az első vektort kapjuk. Előnyös megfelelő vektor a pUC18 vagy pUC19 plazmid [hozzáférhető a Life Technologies, Inc. intézetnél (postafiók 6009, Gaithersburg, Maryland 20877, Amerikai Egyesült Államok)]. A ligálási termékeket megfelelő gazdasejtekbe transzformáljuk. A transzformánsokból DNS-t tisztítunk, és szokásos módon elemezzük annak ellenőrzésére, hogy a korrekt első vektort kaptuk-e. Az első vektor egy BglII restrikciós enzim felismerési helyet tartalmaz a 4,3 kb-s EcoRIBamHI alffagmentumon belül. Első vektorként előnyösen a 3. ábrán bemutatott pMDIOO plazmidot alkalmazzuk.
A következő lépésben az első vektor MDV-1
DNS-ffagmentumába legalább egy idegengén-szekvenciát iktatunk be, így egy második vektorhoz jutunk.
Az első vektor BglII helyébe történő beiktatásához bármilyen idegen gént alkalmazhatunk. Az első vektorba történő beiktatáshoz alkalmazott idegen gént valamely, az MDV -1 -hez viszonyítva heterológ organizmusból állíthatjuk elő. Ha az idegen genom RNS-ból áll, szokásos módon el kell készítenünk a genom komplementer DNS-ét kereskedelmi forgalomban kapható reverz transzkriptáz segítségével. Ahhoz, hogy az idegen gént megfelelő módon iktathassuk be az első vektorba, előnyös, ha elkészítjük az idegen gén restrikciós térképét, és meghatározzuk a nukleotidszekvenciáját. A restrikciós térkép elkészítését és a nukleotidszekvencia meghatározását szokásos eljárásokkal végezzük.
Az idegen gén kifejezéséhez szükség van arra, hogy megfelelő és működőképes promotor kapcsolódjék az idegen génhez. A promotor lehet bármilyen eukarióta, prokarióta vagy vírus eredetű promotor, amely képes a rekombináns MDV-l-gyel fertőzött sejtekben a génátírást irányítani. Ilyen promotorok például a retrovírus hosszú terminális ismétlődésből származó promotorok, az SV40 promotorok vagy az MDV, illetve a HVT genomjaiban jelen levő promotorok.
Az első vektorba az idegen gén beiktatását szokásos módszerekkel végezhetjük. Az első vektort az MDV-1 genom BamHI-A restrikciós fragmentumának 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alfragmentumán belül elhelyezkedő BglII helynél hasítjuk. Az idegen gént a BglII helyre szokásos módon DNS-ligáz segítségével ligáljuk, így a második vektort kapjuk. A ligálási termékeket megfelelő gazdasejtekbe transzformáljuk. A transzformánsokat szokásos eljárásokkal tisztítjuk, és arra nézve elemezzük, hogy a korrekt második vektort kaptuk-e. A második vektorból plazmid DNS-t állítunk elő, és szokásos módon cézium-kloridos egyensúlyi centrifugálással kétszer centrifugáljuk.
A harmadik lépésben a második vektorból a fenti módon kapott DNS-sel és az MDV-1 törzsből kapott DNS-sel együtt fertőzünk sejteket. Eljárhatunk úgy is, hogy MDV-l-gyel fertőzött sejteket a második vektorból származó DNS-sel fertőzünk.
Az MDV- 1-ből úgy nyerhetünk DNS-t, hogy másodlagos csirkeembrió-fíbroblaszttenyészeteket megfelelő legyengített MDV-l-gyel fertőzünk, és a tenyészeteket szokásos módon addig inkubáljuk, amíg kiterjedt citopatikus hatás nem válik nyilvánvalóvá. A teljes sejt DNS-t tisztítjuk olyan módon, hogy az MDV-l-gyel fertőzött sejteket 4 órán át emésztőoldatban [0,2 mg/ml K-proteináz, 0,5% SDS, 100 mmol/1 nátrium-klorid, 10 mmol/1 trisz-HCl(pH=8) és 1 mmol/1 EDTA] inkubáljuk. Az oldatot egyszer fenollal és kétszer kloroform és izoamil-alkohol 24:1 térfogatarányú elegyével extraháljuk. A DNS-t kétszeres térfogatú abszolút etanol hozzáadásával kicsapjuk, centrifugáljuk, TE-ben feloldjuk, és mennyiségét 260 nm-nél mért extinkció alapján meghatározzuk. Az ilyen módon kapott DNS-t a továbbiakban „MDV DNS”-ként említjük. Az MDV DNS-t
HU 219 377 Β bármely alkalmas MDV-l-gyel fertőzött tenyészetből előállíthatjuk.
A második vektorból kapott DNS és az MDV-DNS együttfertőzését a kalcium-foszfáttal közvetített átfertőzésnek megfelelő szokásos módszerrel végezzük [Graham F. L. és munkatársai: Virology 52, 456-467 (1977); Stow N. D. és munkatársai: J. Gén. Virol. 33, 447-458 (1976)], de a következő módosításokkal: primer csirkeembrió-fibroblasztokat készítünk specifikus patogénmentes tojásokból kapott tíznapos csirkeembriókból. Egy nap múlva a primer tenyészetekből másodlagos csirkeembrió-fibroblasztokat készítünk. A másodlagos csirkeembrió-fibroblasztok készítése közben kalcium-foszfátos DNS-csapadékokat készítünk, a csöveket állni hagyjuk, amíg finom csapadék nem válik láthatóvá, majd a csövek tartalmát egyenlő arányban elosztjuk két, frissen szélesztett sejteket tartalmazó lemez között. Inkubálás után a tenyészeteket szérumot nem tartalmazó fenntartó tápközeggel öblítjük, 3 percig 15% glicerint tartalmazó 1 χ HBSP-oldattal [0,75 mmol/1 Na2HPO4.7H2O, 5 mmol/1 KC1, 140 mmol/1 NaCl, 6 mmol/1 glükóz, 25 mmol/1 HEPES (pH=7)] kezeljük, öblítjük, és komplett fenntartó tápközeget adunk hozzá.
A negyedik lépésben az együttfertózött sejteket annyi ideig inkubáljuk, amely elegendő ahhoz, hogy homológ rekombináció történjék az MDV-1 genom DNS-fragmentumát az idegen génnel együtt tartalmazó második vektor DNS-e és a legyengített MDV-1 DNS-ének részlete között, amely legyengített MDV-1 nukleotidszekvenciája homológ vagy hasonló a második vektorban levő MDV-1 DNS-fragmentumával.
Végül a legyengített MDV-l-et és benne egy idegen gént tartalmazó rekombináns vírust a tenyésztett, átfertőzött sejtekből izoláljuk, majd a más idegen géneket tartalmazó rekombinánsokat különböző eljárással, például megfelelő vizsgálómintával végzett hibridizálással, fajlagos antitestekkel való reaktivitás alapján vagy egy releváns enzimaktivitás elvesztése vagy kialakulása alapján azonosíthatjuk.
így például egy rekombináns vírus hibridizálással végzett azonosítását úgy végezzük, hogy a tenyészetekről a fenntartó tápközeget elöntjük, és agarózt is tartalmazó friss fenntartó tápközeget rétegzünk a sejtekre. A tenyészeteket 1-3 napig inkubáljuk, amíg a tarfoltok el nem kezdenek kialakulni. A tarfoltok egy részletét egy kis rész agarózgéllel együtt kiemeljük, és kereskedelmi forgalomban kapható membránszűrőre visszük át. A szűrőt denaturálásnak és közömbösítésnek vetjük alá, és az egyes tarfoltokból származó DNS-t a szűrőn szokásos módon rögzítjük. Az így kapott szűrőt szokásos módon az idegen gént tartalmazó, radioaktívan jelzett vizsgálóminta alkalmazásával tarfolt-hibridizálásnak vetjük alá. Azokat a tarfoltokat, amelyek a vizsgálómintával hibridizálnak, pozitívnak tekintjük. A pozitív hibridizációs szignáloknak megfelelő rekombináns tarfoltokat a szövettenyésztő lemezen levő agaróz felülrétegzésből izoláljuk, és az MDV-1 esetén szokásos eljárással szaporítjuk.
Az idegen gén transzfektánsokban való jelenlétének kimutatására más eljárásokat is alkalmazhatunk. így például eljárhatunk úgy, hogy a rekombináns MDV-1 tarfoltokat tartalmazó szövettenyésztő lemezeket az idegen géntermékre fajlagos antitesteket alkalmazva „megfesthetjük”. Azokat a tarfoltokat, amelyek idegen gént termelő rekombináns MDV-1-t tartalmaznak, az antitestek fajlagosan felismerik.
A rekombináns MDV-l-et a fenti módon tenyésztett sejtekben szaporítjuk. A rekombináns MDV-l-gyel fertőzött sejtekből a teljes DNS-t izoláljuk, és szokásos módon Southem-folt elemzésnek vetjük alá annak ellenőrzésére, hogy az idegen gén a célzott helyre, nevezetesen a BamHI-A 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alffagmentumába épült-e be.
Az élő, egy vagy több különböző madár patogén eredetű heterológ polipeptidet kifejező rekombináns MDV-1 állatok, elsősorban olyan madárfajok, például csirkék és pulykák vakcinálására alkalmazható, amelyek ezekre a patogénekre fogékonyak. A rekombináns MDV-1-ből készített élő vektorvakcinával végzett vakcinálást követően a rekombináns MDV-1 előnyösen replikálódik, és az inokulált gazdaszervezetben mind a heterológ polipeptidet, mind az MDV-1 polipeptideket in vivő kifejezi. Ha a védő immunválasz kifejlődik, az így inokulált állatokat megvédhetjük az ezekkel a patogénekkel történő későbbi fertőzésektől.
A találmány szerinti eljárással előállított, egy vagy több heterológ polipeptidet tartalmazó és kifejező rekombináns MDV-1 monovalens vagy multivalens vakcinaként alkalmazható. Az ilyen MDV-1 inaktivált vakcina előállításához is használható. A vakcinák önmagukban ismert szokásos eljárásokkal állíthatók elő.
A találmány szerinti megoldást az alábbi példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.
1. példa
Anyagok
Az MDV-1 GA törzs a Showa Research Institute fór Biomedicine intézettől, M. Nonoyamától szerezhető be (St. Petersburg, Florida, Amerikai Egyesült Államok). A törzsből állítjuk elő az MDV-1 BamHI plazmidkönyvtárat (Fukuchi és munkatársai, 1984). A törzset másodlagos csirkeembrió-fibroblasztokon (CEF) 75-ször passzáljuk.
2. példa
A plazmid megalkotása
A klónozást szokásos eljárásokkal végezzük. A restrikciós enzimes emésztést az enzim forgalmazója által javasolt körülmények között végezzük. A pMDIOO plazmid - amint a 3. ábrán látható - tartalmazza a BamHI-A 4,3 kb-s terminális EcoRI-BamHI alfragmentumát a pUC19 plazmidvektorba klónozva. A 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alffagmentum teljes egészében a genom egyedi rövid területén belül helyezkedik el. A lacZ-kazetta az Intervet International intézettől (Boxmeer, Hollandia) szerezhető be. A kazettát úgy alkotjuk meg, hogy a pCHno eukarióta vizsgálóvektorból (Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey, Amerikai Egyesült Államok) a lacZ-gént eltávolítjuk, és az alábbiak szerint módosítjuk: az SV40 replikációs origó
HU 219 377 Β közelében levő 72 bázispáros Sphl fragmentumot az alábbi kettős szálú szintetikus oligonukleotiddal helyettesítjük:
'-GGATCCGTCGACCATG-3 ’ '-GTACCCTAGGCAGCTG-5 ’
A kapcsoló beiktatása a pCHj 10 két Sphl restrikciós helye közé nem állítja helyre az Sphl felismerőszekvenciát egyik helyen sem, és létrehoz egy BamHI és egy Sáli helyet az SV40 korai promotortól fölfelé. Ennek a konstrukciónak azután a BamHI-gyel végzett emésztése egy 4,0 kb-s kifejezőkazettát alakít ki. A lacZ-gén 4056 bp hosszúságú, és az SV40 korai promotor szabályozása alatt áll, amint ez a 4. ábrán látható.
A lacZ-kazettának a pMDIOO-ba történő beépítéséhez 1 pg pMDIOO-at BglII-vel emésztünk [Bethesda Research Laboratories (BRL), Gaithersburg, Maryland, Amerikai Egyesült Államok]. Mintegy 1 egység borjúbél alkálikus foszfatázt (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana, Amerikai Egyesült Államok) adunk hozzá, és az inkubálást további 30 percen át folytatjuk. A reakcióelegy összetétele a következő: 20 mmol/1 trisz-HCl (pH=7,4), 5 mmol/1 EDTA, 0,5% nátriumdodecil-szulfát (SDS), 100 pg/ml K-proteináz (BRL), és az inkubálást további 1 órán át folytatjuk. A reakcióelegyet egyszer extraháljuk fenollal, majd 0,1 mol/1 végső koncentrációig nátrium-acetátot, és végül 2 térfogat abszolút etanolt adunk hozzá. A DNS-t 15 percen át a mikrocentrifuga csúcssebességén végzett centrifugálással összegyűjtjük. A DNS-üledéket 20 pl 10 mmol/1 trisz-HCl-t (pH=7,4) és 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó (TE) oldatban feloldjuk.
A módosított lacZ-gént a pMDIOO BglII helyébe iktatjuk be a következő ligálási reakció segítségével. 50 ng BglII-vel emésztett pMDIOO-at és 10 ng lacZ-kazettát inkubálunk egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten 2 egység T4 DNS-ligázzal (BRL) 10 pl teljes térfogatban olyan ligálási pufferban, amely 66 mmol/1 trisz-HCl-t (pH=7,6), 6 mmol/1 MgCl2-t és 1 mmol/1 ATP-t tartalmaz. A ligálási reakciókeveréket TE-vel hígítjuk 1 ng vektor/pl koncentrációig, és a hígított reakciókeverékből 2 pl-t használunk kompetens DH5a sejtek transzformálására. Az egyes telepekből plazmidDNS-t tisztítunk, és elemezzük lacZ-szekvenciák jelenlétére. A lacZ-t tartalmazó pMDIOO-at pMTIA-nak nevezzük, amint ezt az 5. ábrán bemutatjuk. Egy másik plazmidot, a pMTIB-t is megalkotjuk, amely a pMTIA-tól a lacZ-kazetta orientációjában különbözik; ez is látható az 5. ábrán. Plazmid-DNS-t szokásos módszerekkel állítunk elő, és cézium-kloridos egyensúlyi centrifugálással elválasztjuk.
3. példa
MDV DNS-elöállitása
MDV-vel fertőzött CEF-ből teljes DNS-t állítunk elő a fenti módon. Röviden ismertetve: 75 cm2-es lombikban növesztett másodlagos CEF-et (1,6-107 szélesztett sejt/lombik) sejttel társult vírussal (105 PFU/lombik) fertőzünk, és 6 napon át inkubáljuk. DNS-t tisztítunk olyan módon, hogy a sejteket emésztőoldatban [0,2 mg/ml K-proteináz (BRL), 0,5% SDS, 100 mmol/1
NaCl, 10 mmol/1 trisz-HCl (pH=8), és 1 mmol/1 EDTA] inkubáljuk 4 órán át. Az oldatot egyszer fenollal és kétszer kloroform és izoamil-alkohol 24:1 térfogatarányú elegyével extraháljuk. A DNS-t 2 térfogat abszolút etanol hozzáadásával kicsapjuk, centrifugálással kinyeqük, TE-ben feloldjuk, és mennyiségét 260 nm-nél mért extinkció alapján meghatározzuk. Az ilyen módon készített DNS-t MDV DNS-nek nevezzük.
4. példa
Atfertőzés
Minden egyes MDV DNS-készítménynél meghatározzuk az MDV DNS-sel történő tarfoltképzés dózisválaszát, és az együtt átfertőzéshez olyan mennyiségű MDV DNS-t alkalmazunk, amely maximális tarfoltkitermelést ad. Az átfertózés előtt 4-8 pg MDV DNS-t és 0,5 pg plazmid-DNS-t etanollal kicsapunk, centrifugálással kinyerünk, és feloldunk 50 pl TE-ben.
Primer csirkeembrió-fíbroblasztokat állítunk elő specifikus patogénmentes tojásokból kapott 10 napos csirkeembriókból. A sejteket 8-105 sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk, és 75 cm2-es lombikban 1,6 · 107 sejtet szélesztünk (20 ml/lombik). 1 nap múlva a primer tenyészeteket szérumot nem tartalmazó fenntartó tápközeggel egyszer mossuk, és a lombikokból 0,05%-os tripszinnel eltávolítjuk. A tripszint mintegy 0,5 ml boíjúszérum hozzáadásával inaktiváljuk, és a sejteket 2500 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugáljuk, majd újraszuszpendáljuk az eredeti térfogat másfélszeresére, és primer tenyészetként szaporítjuk 8· 105 sejt/ml koncentrációig, majd kétszer átszűqük tüllvásznon. A sejteket közvetlenül a kalcium-foszfát/DNS csapadék hozzáadása előtt 60 mm-es, rácsos szövettenyésztő lemezekre szélesztjük 4· 107 sejt/lemez (5 ml/lemez) sűrűséggel.
Miközben a másodlagos csirkeembrió fibroblasztokat készítjük, 15 ml-es polisztirolcsőben kalciumfoszfát/DNS csapadékot készítünk a következő reagensek egymás utáni adagolásával: 388 pl víz, 50 pl DNS TE-ben és 62 pl 2 mol/l-es kalcium-klorid. Ehhez az elegyhez lassan hozzáadunk pontosan 500 pl 2xHBSP-t [2xHBSP: 1,5 mmol/1 Na2HPO4.7H2O, 10 mmol/1 KC1, 280 mmol/1 NaCl, 12 mmol/1 glükóz, 50 mmol/1 HEPES (pH=7)], és a cső tartalmát óvatosan összekeverjük olyan módon, hogy egy, az oldatba mártott pipettán át 5-6 buborékot fújunk keresztül az oldaton. A csöveket szobahőmérsékleten 30 percen át hagyjuk ülepedni, amíg finom csapadék nem válik láthatóvá, ezután a cső tartalmát óvatosan összekeverjük, és két, frissen szélesztett sejteket tartalmazó lemezen egyenlően elosztjuk. Miután 37 °C hőmérsékleten 4 órán át inkubáltuk, a tenyészeteket óvatosan átöblítjük szérummentes fenntartó tápközeggel, 3 percig kezeljük 15% glicerint tartalmazó lxHBSP-vel (1,5 ml/lemez), öblítjük, majd komplett fenntartó tápközeget adunk hozzá.
A tarfoltokat 6 nap múlva számoljuk meg. Az együttfertőzési kísérleteknél a tarfoltképzés gyakorisága változik az alkalmazott MDV DNS-készítménytől függően, amint ez az 1. táblázatban látható.
HU 219 377 Β
1. táblázat
A stabil GAlac rekombinánsok kialakítására végzett együtt-transzformálási kísérletek összefoglalása
| MDV DNS3 (Mg) | Plazmidb | Tarfolt- esapadékc | Összes kapott tarfolt | β-gaN pozitív tarfoltok | β-gal pozitívak gyakorisága (%) | Stabil β-gal pozitívak (jel)3 | Stabil β-gal pozitívak gyakorisága (%) |
| 4,5 | pMTIB | 323 | 712 | 7 | 1 | 1 | 0,1 |
| 4,5 | pMTIB | 389 | (GAlacl) | ||||
| 6 | pMTIB | 159 | |||||
| 6 | pMTIB | 116 | 498 | 3 | 0,6 | 1 | 0,2 |
| (GAlac2) | |||||||
| 6 | pMTIB | 223 | |||||
| 8 | pMTIB | 306 | |||||
| 8 | pMTIB | 411 | 1450 | 9 | 0,6 | 1 | 0,07 |
| 8 | pMTIB | 360 | (GAlac3) | ||||
| 8 | pMTIB | 373 | |||||
| 8 | pMTIA | 600 | 915 | 3 | 0,3 | 1 | 0,1 |
| 8 | pMTIA | 315 | (GAlac4) |
“Teljes DNS az MDV-vel fertőzött CEF-ból.
b500 ng plazmid-DNS-t MDV DNS-sel együtt átfertőztünk másodlagos CEF-be.
A pMTIA és a pMTIB plazmid a lacZ-kazetta orientációjában különbözik egymástól.
CA kalcium-foszfát/DNS csapadékot egyenletesen elosztottuk két 60 mm-es szövettenyésztő tálban. A tarfoltokat megszámoltuk, és 6 nap múlva megfestettük.
«β-gal=B-galaktozidáz.
eA kezdeti β-galaktozidáz pozitív tarfoltok száma, amelyeket sikeresen tisztítottunk.
A három átfertőzési kísérlet után kapott tarfoltok száma átlagosan 296±96, csapadékonként 116 és 411 tarfolt közötti. így az optimális együttfertőzéshez minden egyes MDV DNS-készítményt átfertőzési hatásfokával kell jellemezni.
5. példa
Stabil GAlac rekombinánsok kimutatása és izolálása
Az E. coli lacZ génjét tartalmazó rekombinánsokat az alábbi módon azonosítjuk. Az átfertőzés után 7 nappal a szövettenyésztő tápközeg térfogatát 2 ml-re csökkentjük, és a lemezekhez 20 μΐ Bluo-gal (BRL) oldatot (20 mg/ml, frissen elkészítve dimetil-szulfoxidban) adunk, így 0,2 mg/ml Bluo-gal-koncentrációt érünk el. A lemezeket a szövettenyésztő inkubátorban 1-2 órán inkubáljuk. A kék tarfoltokat, amint megjelennek, felszedjük, és 0,05%-os tripszinoldatban szuszpendálva dezaggregáljuk a sejteket. 5 perc múlva a tripszint 1-2 csepp boíjúszérum hozzáadásával inaktiváljuk, és az izolált tarfoltokat frissen szélesztett másodlagos CEF-en titráljuk. 7 nap múlva a lemezeket megfestjük, és a kék tarfoltokat felszedjük és újra szélesztjük.
Festés után a megszámolt tarfoltok 0,3- 1,0%-a pozitív β-galaktozidáz-aktivitásra, amint ez az 1. táblázatból látható. Az egyes pozitív tarfoltokat körülbelül négy ciklusban szedjük fel és festjük abból a célból, hogy stabil, tarfolttisztított izolátumot kapjunk. Az eredetileg felszedett kék tarfoltok 18%-ánál kapunk stabil, tarfolttisztított izolátumokat, így stabil rekombináns izolátumok az átfertőzött lemezeken jelen levő eredeti tarfoltok mintegy 0,1%-ából származik. Amikor egy stabil rekombinánst izoláltunk, az ebből származó tarfoltok 100%-ig B-galaktozidáz pozitívak maradnak, akár a vírus sejttenyészeten történő passzálása, akár a vírus DNS másodlagos CEF-be történő újra átfertózése után. Összesen négy, lacZ-t kifejező rekombináns vírust izolálunk. Ezeket az izolátumokat GAlacl, GAlac2, GAlac3 és GAlac4 jellel jelöljük. Három izolátum (GAlacl, GAlac2, GAlac3) pMTIB felhasználásával, egy pedig (GAlac4) pMTIA felhasználásával készül.
6. példa
GAlac rekombináns DNS elemzése cm2-es lombikokban nőtt másodlagos CEF-et fertőzünk tisztított GAlac rekombinánsokkal, és így lombikonként mintegy 10 000 tarfoltot alakítunk ki. A rekombináns vírussal fertőzött tenyészetekből teljes DNS-t tisztítunk a fenti módon. Ismert módon Southern-foltokat készítünk, és a pMDl 00-ból való 4,3 kb-s beiktatással, a pCH110 lacZ-génje 5’-végét tartalmazó 2,5 kb-s PvuII fragmentumával, illetve pBR322-vel átvizsgáljuk, amint ezt a 6. ábra szemlélteti. A vizsgálómintákat radioaktív jelzéssel látjuk el 32P-dezoxinuk8
HU 219 377 Β leotidok segítségével, egy véletlenszerű beindító DNSszintézis-készlet alkalmazásával (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana, Amerikai Egyesült Államok). A DNS-DNS hibridizálást 42 °C hőmérsékleten 16 órán át olyan oldatban végezzük, amely 50% formamidot, 10 mmol/1 trisz-HCl-t (pH=7,5), 0,1% SDS-t, 100 pg/ml denaturált lazacsperma-DNS-t, 5xDenhardt-oldatot, amely 0,1% Ficoll 400-at (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok) is tartalmaz, 0,1% poli(vinil-pirrolidon)-t és 6xSSC-t tartalmaz [lxSSC: 0,15 mol/1 nátrium-klorid és 0,015 mol/1 nátrium-citrát (pH=7)]. A hibridizált nitrocellulóz szűrőket négyszer 30 percig 65 °C hőmérsékleten mossuk olyan mosóoldatban, amely 0,1 x SSC-t és 0,1% SDS-t tartalmaz.
Az RNS-mentes plazmidok DNS-szekvencia elemzését a didezoxi szekvenciaelemzési eljárással, Sequenase I segítségével (United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio, Amerikai Egyesült Államok) végezzük. A szekvenciákat a szokásos „Microgenie” szoftvercsomag (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) segítségével elemezzük.
7. példa
A GAlac rekombinánsok Southern-folt elemzése
Annak ellenőrzésére, hogy a rekombináció helyspecifikus módon történt-e a BamHI-A 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alffagmentumán belül, a rekombináns vírusokból kapott DNS-t Southern-folt elemzésnek vetjük alá, amint ez a 6. ábrán látható. Az A panelban a foltokat a BamHI-A 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alffagmentumával vizsgáljuk, amelyet pMDIOO-ból nyerünk. A B panelban az alkalmazott vizsgálóminta a lacZ-génen belül elhelyezkedő 2,5 kb-s PvuII fragmentum. Az egyes minták esetén 10 pg DNS-t emésztünk BamHIgyel vagy BamHI és EcoRI kombinációjával. Az ábrán az 1, 6, 13 vonalak: CEF DNS BamHI-gyel hasítva; 2, 7, 14 vonalak: a szülő GA törzzsel fertőzött CEF-ből kapott DNS BamHI-gyel hasítva; 3, 8, 15 vonalak: a szülő GA törzzsel fertőzött CEF-ből kapott DNS BamHI-gyel és EcoRI-gyel hasítva; 4, 9, 11, 16 vonalak: GAlacl, 2, 3, illetve 4-gyel fertőzött CEF-ből kapott DNS BamHI-gyel és EcoRI-gyel hasítva. A rekombináció minden esetben a célzott helyen történt. A pMD100 4,3 kb-s beiktatása hibridizál a GAlacl, GAlac2 és GAlac3 4,6 kb-s és 3,8 kb-s EcoRI-BamHI csíkjához, jelezve, hogy a szülő 4,3 kb-s csík módosult az egy EcoRI helyet tartalmazó 4 kb-s DNS hozzáadásával. A lacZ vizsgálóminta ezekben a rekombinánsokban egy 4,6 kb-s csíkhoz hibridizál, jelezve, hogy a 4,6 kb-s csík tartalmaz lacZ-szekvenciákat. A lacZ vizsgálómintával a 3,8 kb-s csík nem mutatható ki, mivel az alkalmazott 2,5 kb-s PvuII vizsgálóminta homológ a lacZ-gén 5’-végével, és nem teljed a lacZ-génen belül levő EcoRI helyen túl. Ugyanezeknek a vizsgálómintáknak a hibridizálása GAlac4-hez azt jelzi, hogy a rekombináció hasonlóképpen megy végbe; a lacZ-gén azonban a vírusban ellenkező orientációban helyezkedik el (6. ábra).
A lacZ rekombinációja az MDV genomba kétféle úton valósulhatna meg. Egy kettős keresztezést (double crossover) esemény, amely a pMD 100-ban a lacZ-gén mindkét szegélyét érinti azt eredményezné, hogy a BamHI-A 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alfragmentumát a lacZ-t tartalmazó származék helyettesítené. Egy egyszeri keresztezést esemény (single crossover), amely a lacZ-gén valamelyik szegélyét érinti, olyan vírusszármazékot eredményezne, amely tartalmazná az összes szülőszekvenciát és a pMTIA-t vagy pMTIB-t teljes egészében, beleértve a pUC19 szekvenciákat is.
A Southern-folt elemzés eredményei azt jelzik, hogy a rekombináció „double crossover” esemény formájában megy végbe. Először: ha a pUC19 szekvenciák az MDV-be „single crossover” esemény formájában lennének beiktatva, az lenne várható, hogy a pMDIOO 4,3 kb-s beiktatása hibridizál GAlacl, 2 és 3 esetében mind a három (4,6; 4,3; és 3,8 kb méretű) fragmentumhoz, és GAlac4 esetében szintén mind a három (6,9; 4,3; és 1,5 kb méretű) fragmentumhoz. Az a tény, hogy a pMDIOO eredetű vizsgálóminta nem mutatja ki a 4,3 kb-s csíkot, annak bizonyítéka, hogy a pUC19 szekvenciák nem rekombinálódnak az MDV rekombinánsokba. Másodszor: a pBR322, amely DNS-szekvenciáit tekintve részben megegyezik a pUC19-cel, nem hibridizál a rekombinánsok egyikével sem, jelezve, hogy a pUC19 szekvenciák nem rekombinálódnak a vírusba.
8. példa
A beiktatási hely szekvenciája
A lacZ beiktatása a BamHI-A 4,3 kb-s EcoRIBamHI alfragmentumának BglII helyébe azt jelzi, hogy ez a hely nem esszenciális a vírus sejttenyészetben történő replikációjához. A releváns BglII helyet mindkét irányból körülvevő szekvenciaadatokat felvesszük, hogy azonosítsunk minden olyan gént, amely esetleg megszakadt (2. ábra). A BglII helybe történő beiktatás megszakíthat egy attól balra elhelyezkedő 810 bázispár hosszúságú nyitott leolvasókeretet, és egy attól jobbra levő 462 bázispár hosszúságú nyitott leolvasókeretet.
9. példa
A szülő és a rekombináns MDV izolátumok növekedési görbéi
Primer CEF-et készítünk és szélesztünk 75 cm2-es lombikokban. A primer tenyészeteket kinyerjük, és a 0., 1., 2., 4. és 6. napon szükség szerint, másodlagos tenyészetként újraszélesztjük. A 0. napon a másodlagos CEF 12 db 60 mm-es lemezét inokuláljuk a szülőtörzs mintegy 300 PFU mennyiségével, és 12 lemezt inokulálunk a GAlacl rekombináns mintegy 300 PFU menynyiségével. Az egyes törzsek esetén 6 nappal az inokulálás után megszámoljuk a mindkét lemezen jelen levő tarfoltokat, így meghatározzuk a tényleges szélesztett PFU számot. A 0., 1., 2., 4. és 6. napon két-két inokulált lemezről kinyerjük a vírusokat, és ezek számát frissen készített másodlagos CEF-en titráljuk meg. Hat nappal a titrálás után a tarfoltokat megszámláljuk, és az ere9
HU 219 377 Β deti inokulált lemezeken jelen levő PFU számot meghatározzuk.
napos periódus után nincs kimutatható különbség a két törzs másodlagos CEF-en 37 °C, illetve 41 °C hőmérsékleten történő növekedési tulajdonságaiban, amint ez a 7. és 8. ábrán látható. Mindkét törzs gyorsabban nő 41 °C-on, mint 37 °C-on, a lemezenként kapott vírus végső kitermelése azonban mindkét hőmérsékletnél azonos.
10. példa
A szülő és a rekombináns MDV izolátumok in vivő elemzése napos specifikus patogénmentes, egytarajú fehér leghom csirkék szárnyát lekötözzük, és a csirkéket hasüregen keresztül inokuláljuk szülő MDV törzzsel fertőzött sejtekkel, GAlacl rekombinánssal fertőzött sejtekkel, illetve nem fertőzött sejtekkel. 1 héttel az inokulálás után (Pl) az egyes csirkékből plazmamintákat veszünk. Az egyes csoportokból lépmintákat izolá5 lünk, megszámoljuk, és azonos számú élő sejtet (5 · 107 és 5 106) együtt tenyésztünk frissen készített CEF-en. Limfocitákat „Histopaque 1077”-en (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok) keresztül történő centrifugálással tisztítunk, megszám10 láljuk, és azonos számú élő sejtet (1107 és 1 · 106) együtt tenyésztünk frissen készített CEF-en. 6 nappal később az együtt-tenyésztő lemezeken a tarfoltokat megszámoljuk. Ezeknek a titrálásoknak az eredményét a lépsejtekre vonatkozóan a 2. táblázatban, a limfocitákra vonatkozóan a 3. táblázatban foglaltuk össze.
2. táblázat
Vírusok újraizolálása lépekből
| Törzs | Dózis (PFU) | Szélesztett sejtekből kapott tarfoltok száma | Szélesztett sejtekből kapott tarfoltok átlagos száma | ||
| 5-107 | 5 106 | 5-107 | 5-106 | ||
| Szülő | 216 | 54, 60 | 12, 19 | 57 | 16 |
| 390 | 17, 18 | 2, 5 | 18 | 4 | |
| 682 | 4, 3 | 1, o | 4 | 1 | |
| GAlacl | 526 | 30, 20 | 1, 6 | 25 | 4 |
| 914 | 32, 47 | 6, 2 | 40 | 4 | |
| 1554 | 62, 68 | 4, 7 | 65 | 5 | |
| - | 0, 0 | 0, 0 | 0 | 0 |
3. táblázat
Vírusok újraizolálása limfocitákból
| Törzs | Dózis (PFU) | Szélesztett sejtekből kapott tartfoltok száma | Szélesztett sejtekből kapott tarfoltok átlagosszáma | ||
| 1 · 107 | 1106 | 1 107 | 1106 | ||
| 216 | 9, 9 | 1, 1 | 9 | 1 | |
| Szülő | 390 | 9, 4 | 0, 0 | 7 | 0 |
| 682 | 1, 4 | 1, 0 | 3 | 1 | |
| 526 | 19, 35 | 2, 7 | 27 | 5 | |
| GAlacl | 914 | 79, 93 | 9, 16 | 86 | 13 |
| 1554 | 128, 142 | 11, 18 | 135 | 15 | |
| - | 0, 0 | 0, 0 | 0 | 0 | |
| Ezek az | eredmények azt | mutatják, hogy a | tán azokat csirkéken át passzáltuk. A GAlac titrálások- |
BamHI-A 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alfragmentumának BglII helyére beiktatott β-galaktozidáz gént tartalmazó rekombináns MDV lépsejtekből visszaizolálható, és hasonló módon képes virémiát indukálni csirkékben, mint a szülő MDV törzs. A titrálólemezek közül néhányat βgalaktozidáz-aktivitásra nézve szubsztrátként Bluogalt alkalmazva megfestettünk abból a célból, hogy meghatározzuk a GAlac rekombináns stabilitását, miu55 ból megfestett 473 tarfolt közül mind pozitívnak mutatkozott β-galaktozidáz-aktivitásra. Az inokulálás után 3 és 6 héttel ismét plazmamintákat vettünk, limfocitákat tisztítottunk belőlük, és megvizsgáljuk MDV jelenlétére abból a célból, hogy meghatározzuk a virémia időtartamát az egyes törzsek esetén. A két vírus a limfocitákban legalább 6 hétig fennmaradt az inokulálás után, bár a 3. hét után a virémia jelentősen csökkent.
HU 219 377 Β
Az inokulálás után az 1., 2. és 6. héten minden egyes plazmamintában megméijük az MDV-re adott antitestválaszt közvetett immunfluoreszcenciás méréssel. Akár a szülővírussal, akár a GAlac rekombinánssal injektált összes csoportban megfigyelhető az anti-MDV-antitestválasz. Az antitestválasz a 3. héten jelent meg, és erősödött a 6. hétig.
Ezekből a kísérletekből arra lehet következtetni, hogy a BamHI-A 4,3 kb-s EcoRI-BamHI alfragmentumán belül elhelyezkedő BglII helyet idegen szekvenciák stabil integrálásához alkalmazhatjuk anélkül, hogy jelentősen befolyásolnánk a fertőzéshez vagy replikációhoz szükséges esszenciális MDV funkciókat. Ezenkívül arra is lehet következtetni, hogy a vírusnak az a képessége, hogy anti-MDV immunválaszt tud kiváltani, nem károsodik az idegen szekvenciáknak a beiktatási helybe való integrálásával.
Claims (16)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Marek-féle betegség I. szerotípusú vírus (MDV-1) DNS-genomjának beiktatási területe, azzal jellemezve, hogy ez egy nyitott leolvasókeret, amely a genom egyedi rövid területén belül, a BamHI-A 4,3 kb hosszúságú terminális EcoRI-BamHI alfragmentumában helyezkedik el, és amelynek restrikciós enzim térképe lényegében az 1. ábrán bemutatott térképnek felel meg.
- 2. Az 1. igénypont szerinti beiktatási terület, azzal jellemezve, hogy a 2. ábrán bemutatott szekvencia 238. és 1050. nukleotidhelyei közti DNS-szekvenciát tartalmazza.
- 3. A 2. igénypont szerinti beiktatási terület, azzal jellemezve, hogy az említett terület egy olyan beiktatási helyet foglal magában, amely a BglII restrikciós enzim felismerőszekvenciáját tartalmazza.
- 4. Plazmid, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti beiktatási területet tartalmazza.
- 5. A 4. igénypont szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy ez a pMDIOO plazmid.
- 6. A 4. igénypont szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy az említett beiktatási területbe beiktatva valamely baromfibetegséget előidéző ágensből származó idegen gént tartalmaz.
- 7. A 6. igénypont szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy idegen génként Marek-féle betegség vírus, fertőző bronchitis vírus, Newcastle betegség vírus, fertőző burzális betegség vírus, csirkevérszegénységet okozó ágens, reovírus, madár retrovírus, szárnyas adenovírus, pulyka rinotracheitisz, fertőző laringotracheitisz vírus, Eimeria, Salmonella, E. coli vagy Mycoplasma gallisepticum valamely génje, ahol az említett idegen gén olyan promotor szabályozása alatt áll, amely képes az említett szekvencia kifejezésének elősegítésére.
- 8. A 6. igénypont szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy az említett idegen gén olyan promotor szabályozása alatt áll, amely képes az említett szekvencia kifejezésének elősegítésére.
- 9. A 8. igénypont szerinti plazmid, azzal jellemezve, hogy promotorként az SV40 korai promotort tartalmaz.
- 10. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy valamely, a 4. igénypont szerinti plazmidot tartalmaz.
- 11. Rekombináns MDV-1, azzal jellemezve, hogy MDV-1 genomiális DNS-t és ebben, az 1. igénypont szerinti beiktatási területben beiktatva legalább egy, valamely baromfibetegséget előidéző ágensből származó idegen gént tartalmaz.
- 12. A 11. igénypont szerinti rekombináns MDV-1, azzal jellemezve, hogy a beiktatási területhez egy olyan promotort tartalmaz, amely egy gazdasejtben az említett idegen gén kifejezéséhez működőképes.
- 13. A 11. igénypont szerinti rekombináns MDV-1, azzal jellemezve, hogy az idegen gént a BamHI-A 4,3 kb hosszúságú EcoRI-BamHI alffagmentumának BglII restrikciós helyébe beiktatva tartalmazza.
- 14. A 12. igénypont szerinti rekombináns MDV-1, azzal jellemezve, hogy legalább egy, az idegen gén által kódolt polipeptidet és legalább egy, az MDV-1 genomiális DNS-e által kódolt polipeptidet fejez ki.
- 15. Vakcina, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti rekombináns MDV-l-et tartalmazza.
- 16. A 15. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy legalább egy, az MDV-1 által kifejezett polipeptidet tartalmaz.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55973590A | 1990-07-30 | 1990-07-30 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU912526D0 HU912526D0 (en) | 1992-01-28 |
| HUT58371A HUT58371A (en) | 1992-02-28 |
| HU219377B true HU219377B (en) | 2001-03-28 |
Family
ID=24234797
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU526/91A HU219377B (en) | 1990-07-30 | 1991-07-29 | Recombinant virus of marek-disease |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0473210B1 (hu) |
| JP (1) | JP3159476B2 (hu) |
| KR (1) | KR0153005B1 (hu) |
| CN (1) | CN1056879C (hu) |
| AU (1) | AU645333B2 (hu) |
| CA (1) | CA2047290C (hu) |
| DE (1) | DE69101683T2 (hu) |
| ES (1) | ES2056565T3 (hu) |
| HU (1) | HU219377B (hu) |
| NZ (1) | NZ239146A (hu) |
| ZA (1) | ZA915563B (hu) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5965138A (en) * | 1985-09-06 | 1999-10-12 | Syntro Corporation | Recombinant chimeric virus and uses thereof |
| US5928648A (en) * | 1985-09-06 | 1999-07-27 | Syntro Corporation | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof |
| US6087127A (en) * | 1990-08-24 | 2000-07-11 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Marek's disease herpesvirus DNA segment encoding glycoproteins, gD, gI and gE |
| FR2666589B1 (fr) * | 1990-09-07 | 1994-08-05 | Rhone Merieux | Nouveaux virus herpes recombinants, vaccin a base de ces recombinants, leur procede de preparation, genes, vecteurs et plasmides utilises dans ce procede. |
| US6913751B2 (en) | 1992-06-12 | 2005-07-05 | Schering-Plough Veterinary Corporation | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production |
| US5853733A (en) * | 1993-02-26 | 1998-12-29 | Syntro Corporation | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof |
| US6875856B2 (en) | 1993-09-24 | 2005-04-05 | Syntro Corporation | Recombinant infectious laryngotracheitis virus and uses thereof |
| EP0750670A1 (en) * | 1994-02-07 | 1997-01-02 | Cornell Research Foundation, Inc. | Compositions useful in controlling marek's disease |
| FR2728795B1 (fr) * | 1994-12-30 | 1997-03-21 | Rhone Merieux | Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire |
| CA2216139C (en) * | 1995-03-23 | 2013-01-08 | Syntro Corporation | Recombinant infectious laryngotracheitis virus and uses thereof |
| CA2221570A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Aesculaap B.V. | Neutralizing conformation epitopes of chicken anemia virus |
| FR2767335B1 (fr) * | 1997-08-14 | 2001-09-28 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Adenovirus aviaire celo recombinant comme vecteur vaccinant |
| ATE330013T1 (de) | 2000-12-20 | 2006-07-15 | Intervet Int Bv | Lawsonia intracellularis impfstoff |
| US7314715B2 (en) | 2001-06-14 | 2008-01-01 | Schering-Plough Animal Health Corporation | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production |
| CA2494197C (en) | 2002-08-12 | 2012-10-09 | Akzo Nobel N.V. | Streptococcus uberis protein, nucleic acid sequence encoding the same and its use in a mastitis vaccine |
| CN100334217C (zh) * | 2005-08-15 | 2007-08-29 | 北京市农林科学院 | 重组鸡马立克氏病病毒转移载体及应用 |
| EP2412382A1 (en) | 2010-07-29 | 2012-02-01 | University Court of the University of Edinburgh | Recombinant Trypanosoma theileri parasite |
| US9139824B2 (en) | 2011-04-21 | 2015-09-22 | The University Court Of The University Of Aberdeen | Sapolegina protein in for use as a medicament |
| US10105424B2 (en) | 2012-10-09 | 2018-10-23 | Universiteit Gent | Cooperia vaccine |
| EP2845904A1 (en) * | 2013-09-06 | 2015-03-11 | Ceva Sante Animale | Recombinant Marek's disease viruses and uses thereof |
| EP3050572A1 (en) | 2015-01-29 | 2016-08-03 | Ceva Sante Animale | Recombinant MDV1 and the uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2779447B2 (ja) * | 1988-03-20 | 1998-07-23 | 財団法人阪大微生物病研究会 | 弱毒マレック病ウイルス・ベクターを用いる組換え遺伝子作成法、及び該ウイルスの組換え体 |
| EP0431668B1 (en) * | 1989-12-04 | 1995-02-15 | Akzo Nobel N.V. | Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof |
| US6087127A (en) * | 1990-08-24 | 2000-07-11 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Marek's disease herpesvirus DNA segment encoding glycoproteins, gD, gI and gE |
-
1991
- 1991-07-10 DE DE69101683T patent/DE69101683T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-10 ES ES91201796T patent/ES2056565T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-10 EP EP91201796A patent/EP0473210B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-16 ZA ZA915563A patent/ZA915563B/xx unknown
- 1991-07-17 CA CA002047290A patent/CA2047290C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-26 NZ NZ239146A patent/NZ239146A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-07-29 CN CN91105196A patent/CN1056879C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-29 AU AU81437/91A patent/AU645333B2/en not_active Expired
- 1991-07-29 KR KR1019910012990A patent/KR0153005B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-07-29 HU HU526/91A patent/HU219377B/hu unknown
- 1991-07-30 JP JP19033291A patent/JP3159476B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA915563B (en) | 1992-07-29 |
| ES2056565T3 (es) | 1994-10-01 |
| CA2047290A1 (en) | 1992-01-31 |
| HU912526D0 (en) | 1992-01-28 |
| EP0473210A2 (en) | 1992-03-04 |
| KR920002782A (ko) | 1992-02-28 |
| DE69101683D1 (de) | 1994-05-19 |
| JPH06233682A (ja) | 1994-08-23 |
| JP3159476B2 (ja) | 2001-04-23 |
| AU645333B2 (en) | 1994-01-13 |
| KR0153005B1 (ko) | 1998-10-15 |
| CN1056879C (zh) | 2000-09-27 |
| EP0473210A3 (en) | 1992-06-10 |
| AU8143791A (en) | 1992-02-06 |
| EP0473210B1 (en) | 1994-04-13 |
| CA2047290C (en) | 2002-12-10 |
| NZ239146A (en) | 1992-12-23 |
| HUT58371A (en) | 1992-02-28 |
| DE69101683T2 (de) | 1994-07-21 |
| CN1060680A (zh) | 1992-04-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU219377B (en) | Recombinant virus of marek-disease | |
| EP0431668B1 (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof | |
| JP3339854B2 (ja) | ウイルスワクチン | |
| Sonoda et al. | Development of an effective polyvalent vaccine against both Marek's and Newcastle diseases based on recombinant Marek's disease virus type 1 in commercial chickens with maternal antibodies | |
| Sakaguchi et al. | Protection of chickens with or without maternal antibodies against both Marek's and Newcastle diseases by one-time vaccination with recombinant vaccine of Marek's disease virus type 1 | |
| JP3587065B2 (ja) | 鳥類感染型ヘルペス属ウイルスの組み換え体、およびこれを利用した組み換えワクチン | |
| JPH08500969A (ja) | 七面鳥の組換えヘルペスウイルス及びそれらの使用 | |
| US6866852B2 (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and use thereof | |
| US6913751B2 (en) | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production | |
| US20100008948A1 (en) | Recombinant herpesvirus useful in vaccine production | |
| US5231023A (en) | Recombinant Marek's disease virus | |
| EP0520753B1 (en) | Recombinant fowlpox vaccine for protection against Marek's disease | |
| JP3334077B2 (ja) | ウイルスワクチン | |
| JP3720843B2 (ja) | 試験管内でｇＤ遺伝子を発現するように形質転換されたヘルペスウィルス | |
| US5279965A (en) | Recombinant infectious laryngotracheitis virus | |
| JPH06141853A (ja) | 組換え鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス及びその製法 | |
| JP3924328B2 (ja) | 新規ｄｎａベクター、及び組み換え新規ｄｎａベクターを有効成分とするワクチン | |
| JPH09271383A (ja) | 組み換えウイルス、その作製法およびその利用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: INTERVET INTERNATIONAL B.V., NL Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO N.V., NL |