CN110381994A - 用于诱导针对寨卡病毒的免疫应答的核苷修饰的rna - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在受试者中诱导针对寨卡病毒(ZIKV)的适应性免疫应答的组合物和方法。在某些实施方式中，本发明提供了包含编码ZIKV抗原、佐剂或其组合的核苷修饰的核酸分子的组合物。例如，在某些实施方式中，组合物包含疫苗，其包含编码ZIKV抗原、佐剂或其组合的核苷修饰的核酸分子。

Description

用于诱导针对寨卡病毒的免疫应答的核苷修饰的RNA
相关申请的引用
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2017年1月11日提交的美国临时专利申请号62/444,931的优先权权益，其内容通过引用以其整体并入本文。
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的A1050484、A1084860、AI058607和AI100645的政府支持下完成的。政府享有本发明中的某些权利。
背景技术
寨卡病毒(ZIKV)，于1947年首次识别(Dick等人,1952,Trans R Soc Trop MedHyg,46:509-520)，是一种黄病毒，最近与新生儿的小头畸形和其他出生缺陷以及成年人的格林-巴利综合征有关(Pierson和Graham,2016,Cell,625-631)。有效的疫苗已被批准用于其他密切相关的黄病毒，包括黄热病、日本脑炎和登革热病毒(Beck和Barrett,2015,Expert Rev Vaccines,14:1479-1492；Jarmer等人,2014,J Virol,88:13845-13857；Guy和Jackson,2016,Nat Rev,Microbiol,14:45-54)，但ZIKV的疫苗候选物最近才被开发出来(Larocca等人,2016,Nature,536:474-478；Abbink等人,2016,Science,353,1129-1132；Dowd等人,2016,Science,354,237-240)。Larocca及其同事生产了一种纯化的灭活病毒疫苗和一种质粒DNA疫苗，其可诱导ZIKV感染小鼠的完全保护(Larocca等人,2016,Nature,536:474-478)。同一实验室还证明，这些疫苗平台和恒河猴腺病毒血清型52载体(RhAd52)在非人灵长类动物(NHP)中引发针对ZIKV的完全保护(Abbink等人,2016,Science,353,1129-1132)。最近，Dowd及其同事描述了两种质粒DNA疫苗，其在两次免疫后诱导有效的免疫应答，其保护小鼠和NHP免受ZIKV感染(Dowd等人,2016,Science,354,237-240)。理想的疫苗是安全的，并且在单次免疫后诱导保护性免疫，无论先前的血清学史如何。在迄今描述的候选寨卡病毒疫苗中，已证实在NHP中单次免疫后只有RhAd52平台能提供保护；然而，这种恒河猴腺病毒载体在人体中的功效目前尚未确定。此外，对腺病毒血清型预先存在的免疫力可能会限制此类载体的功效(Ledgerwood等人,2010,Vaccine,29:304-313；Sumida等人,2004,J Virol,78:2666-2673)，并且在人类中检测到恒河猴腺病毒(包括RhAd52)的低中和效价(Abbink等人,2015,J Virol,89:1512-1522)。
因此，本领域需要治疗和预防ZIKV感染的改进的组合物和方法。本发明满足了这种未被满足的需求。
发明内容
一方面，本发明提供了一种用于在受试者中诱导针对寨卡病毒(ZIKV)的免疫应答的组合物，该组合物包含至少一种编码至少一种ZIKV抗原的分离的核苷修饰的RNA。
在一个实施方式中，至少一种分离的核苷修饰的RNA包含假尿苷。在一个实施方式中，至少一种分离的核苷修饰的RNA包含1-甲基-假尿苷。在一个实施方式中，至少一种分离的核苷修饰的RNA是纯化的核苷修饰的RNA。
在一个实施方式中，至少一种ZIKV抗原包含选自由以下各项组成的组的至少一种ZIKV抗原：包膜(E)蛋白、膜前(prM)蛋白、膜(M)蛋白和衣壳(C)蛋白。在一个实施方式中，权利要求5所述的组合物，其中至少一种ZIKV抗原包含prM和E蛋白。在一个实施方式中，至少一种ZIKV抗原包含来自MHC II类的信号肽。
在一个实施方式中，至少一种ZIKV抗原包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一个实施方式中，至少一种核苷修饰的RNA包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在一个实施方式中，组合物是疫苗。在一个实施方式中，组合物还包含佐剂。在一个实施方式中，至少一种核苷修饰的RNA进一步编码至少一种佐剂。
在一个实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)。在一个实施方式中，至少一种核苷修饰的RNA包封在LNP内。在一个实施方式中，LNP包含具有式(I)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或碳-碳双键；
R1a和R1b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基、或(b)R1a是H或C1-C12烷基，并且R1b与其键合的碳原子一起与相邻的R1b连接并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基、或(b)R2a是H或C1-C12烷基，并且R2b与其键合的碳原子一起与相邻的R2b连接并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基、或(b)R3a是H或C1-C12烷基，并且R3b与其键合的碳原子一起与相邻的R3b连接并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基、或(b)R4a是H或C1-C12烷基，并且R4b与其键合的碳原子一起与相邻的R4b连接并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R5和R6各自独立地为甲基或环烷基；
R7在每次出现时独立地为H或C1-C12烷基；
R8和R9各自独立地为未取代的C1-C12烷基；或R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成包含一个氮原子的5、6或7元杂环；
a和d各自独立地为0至24的整数；
b和c各自独立地为1至24的整数；且
e为1或2。
在一个实施方式中，LNP包含具有式(II)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa、
-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-或直接键(直接结合，direct bond)；
G1是C1-C2亚烷基、–(C＝O)-、-O(C＝O)-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-或直接键；
G2是–C(＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-、-C(＝O)NRa或直接键；
G3是C1-C6亚烷基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1a和R1b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R1a是H或C1-C12烷基，并且R1b与其键合的碳原子一起与相邻的R1b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R2a是H或C1-C12烷基，并且R2b与其键合的碳原子一起与相邻的R2b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R3a是H或C1-C12烷基，并且R3b与其键合的碳原子一起与相邻的R3b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R4a是H或C1-C12烷基，并且R4b与其键合的碳原子一起与相邻的R4b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R5和R6各自独立地为H或甲基；
R7为C4-C20烷基；
R8和R9各自独立地为C1-C12烷基；或R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7元杂环；
a、b、c和d各自独立地为1至24的整数；且
x为0、1或2。
在一个实施方式中，LNP包含具有式(III)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2中的一个是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2中的另一个是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1和G2各自独立地为未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3为C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3为H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或–NR5C(＝O)R4；
R4为C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；和
x为0、1或2。
在一个实施方式中，LNP包含具有以下结构之一的化合物：
在一个实施方式中，LNP包含具有以下结构(IV)的聚乙二醇化脂质：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R10和R11各自独立地为含有10至30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链，其中烷基链可选被一个或多个酯键中断；且
z的平均值范围为30至60。
在一个实施方式中，聚乙二醇化脂质具有以下结构(IVa)：
其中n是选择的整数，使得聚乙二醇化脂质的平均分子量为约2500g/mol。
在一个方面，本发明提供了在受试者中诱导针对寨卡病毒(ZIKV)的适应性免疫应答的方法。该方法包括向受试者施用有效量的组合物，该组合物包含至少一种编码至少一种ZIKV抗原的核苷修饰的RNA。
在一个实施方式中，组合物是通过选自皮内、皮下、吸入、鼻内和肌内的递送途径施用的。
在一个实施方式中，该方法包括单次施用组合物。在一个实施方式中，该方法包括多于一次施用(即，至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种，或更多种)的组合物。
在一个实施方式中，该方法治疗或预防受试者中的与ZIKV相关的感染、疾病或病症。在一个实施方式中，该方法治疗或预防受试者的未出生婴儿中的与ZIKV相关的感染、疾病或病症。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的实施方式的以下详细描述。应该理解，本发明不限于附图中所示的实施方式的精确布置和手段。
图1，包括图1A至图1G，描绘了证明核苷修饰的ZIKV mRNA-LNP免疫引发ZIKV特异性T辅助细胞和中和抗体应答的实验结果。图1A-图1D，用30μg的核苷修饰的ZIKV prM-EmRNA-LNPs(n＝8)或对照聚(C)RNA-LNP(n＝4)免疫C57BL/6小鼠。(图1A)在第2周，通过细胞内细胞因子染色检测抗原特异性CD4+T细胞。通过使用ZIKV MR-766的(图1B)ELISA，(图1C)PRNT和使用ZIKV H/PF/2013的(图1D)RVP监测抗体应答。图1E-图1G，BALB/c小鼠类似地用ZIKV mRNA-LNP(n＝10)或聚(C)RNA-LNP(n＝5)免疫，并通过使用MR-766的(图1E)ELISA、(图1F)PRNT和使用H/PF/2013的(图1G)RVP监测。点代表个体小鼠；水平线显示平均值；虚线表示检测限。图1D和图1G中的对照来自第8周的时间点。图1A中的*P<0.05(非配对t检验)；通过曼-惠特尼检验在每个时间点比较疫苗组和对照组中的抗体应答，对于所有比较，P<0.01(图1B-图1G)。
图2，包括图2A和图2B，描绘了实验结果，证明核苷修饰的ZIKV prM-E mRNA-LNP的单次免疫提供了对小鼠中的ZIKV激发(challenge)的快速且持久的保护。用30μg的ZIKVprM-E mRNA-LNP或对照聚(C)RNA-LNP免疫的BALB/c小鼠静脉内激发200PFU ZIKVPRVABC59在疫苗接种后2周(图2A)(每组n＝9)或在疫苗接种后20周(图2B)(n＝5只对照小鼠；n＝10只ZIKV mRNA小鼠)，并通过qRT-PCR测量ZIKV衣壳RNA的血浆病毒载量。符号表示两条重叠曲线。虚线表示检测限(200拷贝/ml)，不可检测的曲线交错以显示个体小鼠。第3天，通过曼-惠特尼(Mann–Whitney)检验比较疫苗组和对照组中的病毒血症，对于两次激发，P<0.001。
图3，包括图3A至图3C，描绘了证明核苷修饰的ZIKV mRNA-LNP免疫在非人灵长类动物中引发有效的ZIKV特异性中和抗体应答的实验结果。用600μg(n＝4)、200μg(n＝3)或50μg(n＝3)的ZIKV prM-EmRNA-LNP免疫恒河猴，并通过使用ZIKV MEX I-44的(图3A)ELISA和(图3B)FRNT以及使用ZIKV H/PF/2013的(图3C)RVP定量抗体应答。仅显示预激发和未激发的动物数据。点代表个体猴；虚线表示检测限；水平线表示平均值。通过克鲁斯凯-沃利斯(Kruskal–Wallis)检验比较剂量组中的免疫应答，对于所有比较，P>0.05。
图4描绘了实验结果，证明核苷修饰的ZIKV prM-E mRNA-LNP的单次免疫在免疫后5周保护恒河猴免于ZIKV激发。在第5周使用104TCID50的ZIKV PRVABC59皮下激发在第0周接受50μg(n＝3)、200μg(n＝1)或600μg(n＝1)的ZIKV mRNA-LNP的6只未接种的对照猕猴和5只接种的猕猴。对于ZIKV衣壳RNA，通过qRT-PCR在血浆中测量病毒载量。虚线表示阈值以下的值低于检测限(50个拷贝/ml)，并且不可检测的值交错以显示单个动物。通过曼-惠特尼检验比较疫苗组和对照组中的第3天和第5天的病毒血症，P<0.001。
图5，包括图5A至图5C，描绘了ZIKV prM-E mRNA的设计和表征。(图5A)ZIKV mRNA编码来自MHC II类的信号肽(SP)和来自ZIKV H/PF/2013的prM和E糖蛋白。(图5B)将mRNA转染到293T细胞(n＝3)、人DC(n＝2)或鼠DC(n＝2)中。使用荧光素酶mRNA转染的细胞作为阴性对照，通过蛋白质印迹探测细胞裂解物和上清液中的E蛋白表达。(图5C)在存在和不存在0.5％的Triton X-100的情况下通过超速离心表征来自转染的293T细胞的ZIKV mRNA上清液(n＝3)，然后是输入(IN)、沉淀(P)和最终上清液(S)级分的蛋白质印迹。
图6描绘了实验结果，证明编码ZIKV prM-E的修饰mRNA被翻译并分泌亚病毒颗粒。
图7描绘了证明核苷修饰的ZIKV mRNA-LNP免疫引发多功能ZIKVE特异性CD4+T细胞应答的实验结果。用30μg的核苷修饰的ZIKVprM-E mRNA-LNP(n＝8)或对照聚(C)RNA-LNP(n＝4)免疫C57BL/6小鼠。在第2周，通过细胞内细胞因子染色检测抗原特异性CD4+T细胞。条形图显示由CD4+T细胞产生的细胞因子组合的平均频率。误差条表示SEM，星号表示学生t检验的显著差异(p<0.05)。
图8，包括图8A和图8B，描绘了测量小鼠中的ZIKV E-蛋白特异性IgG浓度的实验结果。通过ELISA测定来自免疫的(图8A)C57BL/6小鼠(n＝4对照；n＝8ZIKV mRNA-LNP)或(图8B)BALB/c小鼠(n＝5对照；n＝10ZIKV mRNA-LNP)的血清，并使用小鼠单克隆mAb NR-4747作为标准计算ZIKV E-蛋白特异性IgG浓度的估计。点代表个体小鼠；水平线表示平均值。通过曼-惠特尼检验在每个时间点比较疫苗组和对照组中的反应，对于所有比较，P<0.01。
图9描绘了中和mAb的人抗ZIKV的中和曲线。ZIKV MR-766被Ab3594，即人类ZIKV中和单克隆抗体中和，作为PRNT测定中的阳性对照。显示的是代表性曲线(n＝4)。EC50＝0.026±5.4μg ml-1(平均值±s.d.)。
图10，包括图10A和图10B，描绘了证实在用ZIKV prM–EmRNA–LNP免疫的猕猴中中和针对ZIKV MR-766的抗体应答的实验结果。在指定的时间点使用PRNT测定(图10A)或RVP测定(图10B)分析来自免疫猕猴的血清的ZIKV MR-766的中和。阴影区域表示低于检测限的值；水平条表示平均值；符号表示个体动物。通过克鲁斯凯-沃利斯检验比较剂量组中的免疫应答，对于所有比较，P>0.05。
具体实施方式
本发明涉及在受试者中诱导针对ZIKV的免疫应答的组合物和方法。在某些实施方式中，本发明提供了包含至少一种编码至少一种ZIKV抗原的核苷修饰的RNA的组合物。例如，在一个实施方式中，组合物是包含至少一种编码至少一种ZIKV抗原的核苷修饰的RNA的疫苗，其中疫苗在受试者中诱导针对至少一种ZIKV抗原的免疫应答，并因此诱导受试者中针对ZIKV病毒或与ZIKV相关的病理学的免疫应答。在某些实施方式中，至少一种核苷修饰的RNA编码ZIKV的膜前(prM)蛋白、ZIKV的包膜(E)蛋白，或其组合。在一个实施方式中，核苷修饰的RNA编码ZIKV的prM和E(prM-E)蛋白。在一个实施方式中，核苷修饰的RNA编码包含来自MHC II类的信号肽(SP)的蛋白质。在一个实施方式中，核苷修饰的RNA编码包含来自MHCII类的SP、ZKIV的prM和ZIKV的E的蛋白质。在某些实施方式中，将至少一种核苷修饰的RNA包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
定义
除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
如在本文中所使用的，以下术语中的每一个具有与本节中相关的含义。
本文使用的冠词“一个(A)”和“一种(an)”用于是指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)的语法对象。举例来说，“要素”表示一个要素或多于一个要素。
当提及诸如量、时间持续时间等的可测量值时，如本文所用的“约”意味着包括指定值的±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％的变化，因为这样的变化是适当的以进行公开的方法。
如在本文中所使用的，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是衍生自天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人，1999，In：使用抗体：实验室手册，纽约冷泉港实验室出版社；Harlow等人,1989,In：抗体：实验室手册，纽约冷泉港实验室出版社；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如在本文中所使用的，“抗体重链”是指在其天然存在的构象中存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大的一种。
如在本文中所使用的，“抗体轻链”是指在其天然存在的构象中存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小的一种。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如在本文中所使用的，术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如由噬菌体表达的抗体。该术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子并且该DNA分子表达抗体蛋白或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中DNA或氨基酸序列已经使用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。该术语还应解释为意指通过合成编码抗体的RNA分子产生的抗体。RNA分子表达抗体蛋白或指定抗体的氨基酸序列，其中RNA通过转录DNA(合成的或克隆的)或本领域可用和公知的其他技术获得。
如在本文中所使用的，术语“抗原”或“Ag”定义为引发适应性免疫应答的分子。该免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫原性感受态细胞的激活，或两者。技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA或RNA。本领域技术人员将理解，包含编码引发适应性免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA或RNA因此编码如本文所用的术语的“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫应答。此外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，可以合成产生抗原，或者可以从生物样品中获得抗原。这种生物样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
如在本文中所使用的，术语“佐剂”定义为增强抗原特异性适应性免疫应答的任何分子。
“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善则动物的健康继续恶化。相反，动物中的“病症”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但其中动物的健康状况不如没有病症时的健康状态。如果不治疗，病症不一定会导致动物的健康状况进一步下降。
如在本文中所使用的，“有效量”是指提供治疗或预防益处的量。
“编码”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列的固有特性，例如基因、cDNA或mRNA，以用作在具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)的生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。编码链，其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供，并且非编码链，用作基因或cDNA转录的模板，可以称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达对照序列。表达载体包含足够的顺式作用元件用于表达；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，例如粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)RNA，和掺入重组多核苷酸的病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列一致性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，那么分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共有的匹配或同源位置的数量除以比较位置的数量X 100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个匹配或同源，那么这两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。通常，当比对两个序列以产生最大同源性时进行比较。
“免疫原”是指引入到体内以产生免疫应答的任何物质。该物质可以是物理分子，例如蛋白质，或者可由载体编码，例如DNA、mRNA或病毒。
本文使用的术语“免疫应答”是指通过非限制性实例在T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和/或抗原呈递细胞(APC)中激活和/或诱导效应器功能的过程。因此，如本领域技术人员所理解的，免疫应答包括但不限于任何可检测的抗原特异性激活和/或辅助性T细胞或细胞毒性T细胞活性或反应的诱导、抗体的产生、抗原呈递细胞活性或浸润、巨噬细胞活性或浸润、中性粒细胞活性或浸润等。
“分离的”意指从自然状态改变或除去。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，诸如例如宿主细胞。
在本发明的上下文中，使用以下对常见核苷的缩写(通过N-糖苷键与核糖或脱氧核糖结合的核碱基)。“A”是指腺苷，“C”是指胞苷，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中可含有内含子。
如在本文中所使用的，术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的受试者中的反应水平相比和/或与其他相同但未经治疗的受试者的反应水平相比，介导受试者中的反应水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或响应，从而在受试者(例如，人)中介导有益的治疗反应。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可能包括内含子。另外，核苷酸序列可含有修饰的核苷，其能够通过细胞中的翻译机制进行翻译。例如，其中所有尿苷已被假尿苷、1-甲基假尿苷或另一种经修饰的核苷替换的mRNA。
术语“可操作地连接”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA或RNA序列是连续的，并且在必要时将两个蛋白质编码区连接在同一阅读框中。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指任何动物或其细胞，无论是体外还是原位，适合于本文所描述的方法。在某些非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是人。
如在本文中所使用的，术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员通常知道核酸是多核苷酸，其可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如在本文中所使用的，多核苷酸包括但不限于，通过本领域可获得的任何方法获得的所有核酸序列，本领域可获得的任何方法包括但不限于重组方法，即，从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，使用普通克隆技术和PCRTM等，并且通过合成方法。
在某些情况下，本发明的多核苷酸或核酸是“核苷修饰的核酸”，其是指包含至少一个修饰的核苷的核酸。“修饰的核苷”是指具有修饰的核苷。例如，已经在RNA中鉴定了超过100种不同的核苷修饰(Rozenski等人，1999，RNA修饰数据库1999更新.Nucl Acids Res27:196-197)。
在某些实施方式中，“假尿苷”在另一个实施方式中是指m1acp3Ψ(1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷。在另一个实施方式中，该术语是指m1Ψ(1-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指Ψm(2'-O-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指m5D(5-甲基二氢尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指m3Ψ(3-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指未进一步修饰的假尿苷部分。在另一个实施方式中，该术语是指任何上述假尿苷的单磷酸盐、二磷酸盐或三磷酸盐。在另一个实施方式中，该术语是指本领域已知的任何其他假尿苷。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
如在本文中所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括通过肽键彼此连接的任何肽或蛋白质，其包含两个或多个氨基酸。如在本文中所使用的，该术语是指短链，其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体，并且例如是指较长的链，其通常在本领域中称为蛋白质，其中存在有很多种类型的蛋白质。“多肽”包括，例如，生物活性片段，基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如在本文中所使用的，术语“启动子”定义为由启动多核苷酸序列的特异性转录所需的细胞合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。例如，由噬菌体RNA聚合酶识别的启动子用于通过体外转录产生mRNA。
如在本文中所使用的，关于抗体的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以与来自一种或多种其他物种的抗原结合。但是，这种跨物种反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不会将抗体的分类改变为特异性。在一些情况下，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异地结合(specifically binding)”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，以表示相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别并结合特定蛋白质结构而不是蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的，未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记A的量。
如在本文中所使用的，术语“治疗剂”是指治疗和/或预防。通过抑制、减少、缓解或根除疾病或病症的至少一种病征或症状来获得治疗效果。
术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在寻求的组织、系统或受试者的生物或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括化合物的量，当给药时，其足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种病征或症状的发展或在一定程度上缓解。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重程度和待治疗受试者的年龄、体重等而变化。
如本文使用的术语“治疗”疾病是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重性。
如在本文中所使用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源性核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试细胞及其后代。
如在本文中所使用的，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”是指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。
“载体”是物质组合物，其包含分离的核酸并且其可以用于将分离的核酸递送至细胞内部。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸，与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
范围：贯穿本公开内容，本发明的各个方面可以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应该被解释为对本发明范围的不可改变的限制。因此，应该认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，应当认为对诸如1至6的范围的描述具有特定公开的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在该范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
描述
本发明涉及在受试者中诱导针对ZIKV的免疫应答的组合物和方法。在某些实施方式中，本发明提供了包含编码ZIKV抗原的核酸分子的组合物，其中ZIKV抗原在受试者中诱导针对ZIKV的免疫应答。在一些实施方式中，诱导的免疫应答是适应性免疫应答。例如，在某些实施方式中，组合物包含疫苗，其包含编码ZIKV抗原的核酸分子。在某些实施方式中，ZIKV抗原诱导保护性抗体的表达。在某些实施方式中，ZIKV抗原提供佐剂功能。
在一个实施方式中，本发明的组合物包含体外转录的(IVT)RNA。例如，在某些实施方式中，本发明的组合物包含编码ZIKV抗原的IVTRNA，其中ZIKV抗原诱导适应性免疫应答。在某些实施方式中，ZIKV抗原是ZIKV包膜(E)蛋白、ZIKV前膜(prM)蛋白、ZIKV膜(M)蛋白、ZIKV衣壳(C)蛋白、ZIKV NS1、ZIKV NS2A、ZIKV NS2B、ZIKVNS3、ZIKV NS4A、ZIKV NS4B、ZIKVNS5中的至少一种，或其片段。
在某些实施方式中，本发明组合物的抗原编码核酸是核苷修饰的RNA。本发明部分基于以下发现：编码ZIKV抗原的核苷修饰的RNA诱导针对ZIKV的稳健且持久的免疫应答。此外，观察到编码ZIKV抗原的核苷修饰的RNA诱导抗原特异性抗体产生。核苷修饰的RNA被证明可诱导与现有ZIKV疫苗策略相当或更优的适应性免疫应答。
在某些实施方式中，本发明组合物的抗原编码核酸是纯化的核苷修饰的RNA。例如，在某些实施方式中，纯化组合物使得其不含双链污染物。
在某些实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)。例如，在一个实施方式中，组合物包含包封在LNP内的编码ZIKV抗原的核酸分子。在某些情况下，LNP增强核酸分子的细胞摄取。
在某些实施方式中，组合物包含佐剂。在某些实施方式中，组合物包含编码佐剂的核酸分子。例如，在一个实施方式中，组合物包含编码佐剂的核苷修饰的RNA。在一个实施方式中，组合物包含编码ZIKV抗原和佐剂的核苷修饰的RNA。在一个实施方式中，组合物包含编码ZIKV抗原的第一核苷修饰的RNA和编码佐剂的第二核苷修饰的RNA。在一个实施方式中，组合物包含编码佐剂的核苷修饰的RNA和LNP，其中LNP具有佐剂活性。
在一个实施方式中，本发明提供了在受试者中诱导针对ZIKV的免疫应答的方法。在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用包含一种或多种编码ZIKV抗原的核苷修饰的RNA、佐剂或其组合的组合物。
在一个实施方式中，该方法包括将组合物全身施用给受试者，包括例如皮内施用或皮内施用。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用多个剂量。在另一个实施方式中，该方法包括施用单剂量的组合物，其中单剂量有效诱导适应性免疫应答。在一个实施方式中，该方法提供持续或延长的免疫应答。
疫苗
在一个实施方式中，本发明提供了用于在受试者中诱导针对ZIKV的免疫应答的免疫原性组合物。例如，在一个实施方式中，免疫原性组合物是疫苗。对于可用作疫苗的组合物，该组合物必须在细胞、组织或哺乳动物(例如，人)中诱导对ZIKV抗原的免疫应答。在某些情况下，疫苗在哺乳动物中诱导保护性免疫应答。如在本文中所使用的，“免疫原性组合物”可包含抗原(例如，肽或多肽)、编码抗原的核酸、表达或呈递抗原或细胞组分的细胞，或其组合。在具体的实施方式中，组合物包含或编码本文所描述的任何肽抗原的全部或部分，或其免疫原性功能等同物。在其他实施方式中，组合物是包含另外的免疫刺激剂或编码这种药剂的核酸的混合物。免疫刺激剂包括但不限于另外的抗原、免疫调节剂、抗原呈递细胞、脂质纳米颗粒或佐剂。在其他实施方式中，一种或多种另外的药剂以任何组合共价键合至抗原或免疫刺激剂。
在本发明的上下文中，术语“疫苗”是指诱导接种到动物体内的免疫应答的组合物。在一些实施方式中，诱导的免疫应答提供保护性免疫。
本发明的疫苗可以改变其核酸和/或细胞组分的组成。在非限制性实例中，编码ZIKV抗原的核酸也可以与佐剂一起配制。当然，应理解本文所描述的各种组合物可进一步包含其他组分。例如，一种或多种疫苗组分可包含在脂质、脂质体或脂质纳米颗粒中。在另一个非限制性实例中，疫苗可包含一种或多种佐剂。根据本公开内容，本发明的疫苗及其各种组分可以通过本文公开的或者如本领域普通技术人员已知的任何方法制备和/或施用。
通过ZIKV抗原的表达诱导免疫可以通过体内或体外观察宿主中免疫系统的全部或任何部分对ZIKV抗原的反应来检测。
例如，用于检测细胞毒性T淋巴细胞诱导的方法是众所周知的。进入活体的外来物质通过APC的作用呈递给T细胞和B细胞。响应于APC以抗原特异性方式呈递的抗原的T细胞由于抗原的刺激而分化成细胞毒性T细胞(也称为细胞毒性T淋巴细胞或CTL)。然后这些抗原刺激的细胞增殖。该过程在本文中称为T细胞的“激活”。因此，通过APC将多肽或肽或其组合的表位呈递给T细胞，并检测CTL的诱导，可以评价通过多肽或肽或其组合的表位的CTL诱导。此外，APC具有激活B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和NK细胞的作用。
使用树突细胞(DC)作为APC评价CTL的诱导作用的方法是本领域熟知的。DC是代表性APC，其在APC中具有强大的CTL诱导作用。在本发明的方法中，多肽或肽或其组合的表位最初由DC表达，然后该DC与T细胞接触。在与DC接触后检测对目标细胞具有细胞毒作用的T细胞表明多肽或肽或其组合的表位具有诱导细胞毒性T细胞的活性。此外，还可以通过使用抗-IFN-γ抗体(例如ELISPOT)进行可视化，通过测量在存在携带固定化肽或肽组合的抗原呈递细胞存在下由CTL产生和释放的IFN-γ来检测诱导的免疫应答。
除DC外，外周血单核细胞(PBMC)也可用作APC。据报道，通过在GM-CSF和IL-4存在下培养PBMC，可以增强CTL的诱导。类似地，已显示CTL通过在匙孔戚血蓝蛋白(KLH)和IL-7存在下培养PBMC而被诱导。
通过这些方法证实具有CTL诱导活性的抗原是具有DC激活作用和随后的CTL诱导活性的抗原。此外，由于APC呈递抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作抗原相关病症的疫苗。
通过观察针对ZIKV抗原的抗体产生的诱导，可以进一步证实通过表达ZIKV抗原诱导免疫。例如，当在用编码抗原的组合物免疫的实验动物中诱导针对抗原的抗体时，并且当抗原相关病理被这些抗体抑制时，确定该组合物诱导免疫。
通过观察CD4+T细胞的诱导可以进一步证实通过表达ZIKV抗原的免疫诱导。CD4+T细胞也可裂解靶细胞，但主要供应有助于诱导其他类型的免疫应答，包括CTL和抗体生产。CD4+T细胞帮助的类型可以表征为Th1、Th2、Th9、Th17、T调控的或T滤泡辅助(Tfh)细胞。CD4+T细胞的每种亚型都有助于某些类型的免疫应答。在一个实施方式中，组合物选择性诱导T滤泡辅助细胞，其驱动有效的抗体应答。
本发明的治疗化合物或组合物可以预防性地(即，预防疾病或病症)或治疗性地(即，治疗疾病或病症)施用给患有或有风险(或易于)发展该疾病或病症的受试者。可以使用标准临床方法鉴定这些受试者。在本发明的上下文中，预防性施用发生在疾病的明显临床症状的表现之前，使得预防疾病或病症或者使其进展延迟。在医学领域的上下文中，术语“预防”包括减少疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防可以发生在一级、二级和三级预防水平。虽然一级预防避免了疾病的发展，但二级和三级水平的预防包括旨在预防疾病进展和症状出现的活动，以及通过恢复功能和减少疾病相关并发症来减少已经确立的疾病的负面影响。
抗原
本发明提供了在受试者中诱导免疫应答的组合物。在一个实施方式中，组合物包含ZIKV抗原。在一个实施方式中，组合物包含编码ZIKV抗原的核酸序列。例如，在某些实施方式中，组合物包含编码ZIKV抗原的核苷修饰的RNA。在某些实施方式中，组合物包含编码ZIKV抗原的纯化的核苷修饰的RNA。抗原可包括但不限于在受试者中诱导免疫应答的多肽、肽或蛋白质。
在一个实施方式中，抗原包含与ZIKV相关的多肽或肽，使得抗原诱导针对抗原的免疫应答，并因此诱导针对ZIKV的免疫应答。在一个实施方式中，抗原包含与ZIKV相关的多肽或肽的片段，使得抗原诱导针对ZIKV的免疫应答。
在某些实施方式中，ZIKV抗原是ZIKV包膜(E)蛋白、ZIKV前膜(prM)蛋白、ZIKV膜(M)蛋白、ZIKV衣壳(C)蛋白、ZIKV NS1、ZIKV NS2A、ZIKV NS2B、ZIKV NS3、ZIKV NS4A、ZIKVNS4B、ZIKVNS5中的至少一种，或其片段。
在一个实施方式中，抗原包含含有来自MHC II类的信号肽(SP)的蛋白质。在一个实施方式中，抗原包含来自MHC II类的SP、ZKIV的prM和ZIKV的E。
在一个实施方式中，组合物包含编码SP-prM-E的核酸序列，其中核酸序列包含：
ATGGCCATAAGTGGAGTCCCGGTGCTAGGATTCTTCATCATAGCCGTGCTGATGAGCGCGCAGGAATCATGGGCCGCCGAGGTGACGAGACGGGGGAGCGCATACTACATGTACTTGGACAGAAACGACGCCGGGGAGGCCATATCCTTCCCAACCACATTGGGGATGAACAAGTGTTACATACAGATCATGGACCTGGGACACATGTGCGACGCCACCATGAGCTACGAATGCCCTATGCTGGACGAGGGGGTGGAACCAGACGACGTCGACTGCTGGTGCAACACGACGTCAACTTGGGTGGTGTACGGAACCTGCCACCACAAAAAAGGCGAAGCACGGAGATCGAGACGGGCCGTGACGCTCCCCTCCCACTCCACGAGGAAGCTGCAAACGCGGTCGCAAACCTGGTTGGAATCAAGAGAATACACAAAGCACTTGATCAGAGTCGAAAACTGGATATTCAGGAACCCTGGCTTCGCGTTAGCAGCAGCCGCCATCGCTTGGCTGTTGGGAAGCTCAACGAGCCAAAAAGTCATATACTTGGTCATGATACTGCTGATCGCCCCGGCATACAGCATCAGGTGCATAGGAGTCAGCAACAGGGACTTCGTGGAAGGGATGTCAGGCGGGACCTGGGTGGACGTGGTCTTGGAACACGGAGGGTGCGTCACCGTAATGGCACAGGACAAACCGACGGTCGACATAGAGCTGGTTACAACAACAGTCAGCAACATGGCGGAGGTAAGATCCTACTGCTACGAGGCATCAATATCGGACATGGCGTCGGACAGCCGCTGCCCAACACAAGGCGAAGCCTACCTGGACAAGCAATCAGACACGCAATACGTCTGCAAAAGAACGTTAGTGGACAGAGGCTGGGGAAACGGATGCGGACTGTTCGGCAAAGGGAGCCTGGTGACATGCGCCAAGTTCGCATGCTCCAAGAAAATGACCGGGAAGAGCATCCAGCCAGAGAACCTGGAGTACCGGATAATGCTGTCAGTGCACGGCTCCCAGCACAGCGGGATGATCGTGAACGACACAGGACACGAAACGGACGAGAACAGAGCGAAGGTGGAGATAACGCCCAACTCACCAAGAGCCGAAGCCACCCTGGGGGGCTTCGGAAGCCTAGGACTGGACTGCGAACCGAGGACAGGCCTCGACTTCTCAGACTTGTACTACTTGACGATGAACAACAAGCACTGGTTGGTGCACAAGGAGTGGTTCCACGACATCCCATTACCTTGGCACGCCGGGGCAGACACCGGAACGCCACACTGGAACAACAAAGAAGCACTGGTAGAGTTCAAGGACGCACACGCCAAAAGGCAAACGGTCGTGGTCCTAGGGAGCCAAGAAGGAGCAGTGCACACGGCCCTGGCCGGAGCGCTGGAGGCCGAGATGGACGGGGCAAAGGGAAGGCTGTCCTCCGGCCACTTGAAATGCCGCCTGAAAATGGACAAACTGAGATTGAAGGGCGTGTCATACTCCTTGTGCACCGCAGCGTTCACATTCACCAAGATCCCGGCGGAAACACTGCACGGGACAGTCACAGTGGAGGTACAGTACGCAGGGACAGACGGACCGTGCAAGGTGCCAGCGCAGATGGCGGTGGACATGCAAACCCTGACCCCAGTCGGGAGGTTGATAACCGCGAACCCCGTAATCACGGAAAGCACCGAGAACTCGAAGATGATGCTGGAACTCGATCCACCATTCGGGGACTCGTACATCGTCATAGGAGTCGGGGAGAAGAAGATCACCCACCACTGGCACAGGAGCGGCAGCACCATCGGAAAAGCATTCGAAGCCACGGTGAGAGGGGCCAAGAGAATGGCAGTCTTGGGAGACACAGCCTGGGACTTCGGATCAGTCGGAGGCGCGCTCAACTCATTGGGCAAGGGCATCCACCAAATCTTCGGAGCAGCTTTCAAATCATTGTTCGGAGGAATGTCCTGGTTCTCACAAATCCTCATCGGAACGTTGCTGATGTGGTTGGGGCTGAACACAAAGAACGGATCGATCTCCCTGATGTGCTTGGCCTTAGGGGGAGTGTTGATCTTCTTATCCACAGCGGTCTCCGCGTAA(SEQ ID NO:1)。在一个实施方式中，组合物包含核苷修饰的SEQ ID NO:1，其中一个或多个残基被修饰的核苷替换，如本文其他地方所述。
在一个实施方式中，组合物包含编码SP-prM-E的核酸序列，其具有包含以下的氨基酸序列：
MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWAAEVTRRGSAYYMYLDRNDAGEAISFPTTLGMNKCYIQIMDLGHMCDATMSYECPMLDEGVEPDDVDCWCNTTSTWVVYGTCHHKKGEARRSRRAVTLPSHSTRKLQTRSQTWLESREYTKHLIRVENWIFRNPGFALAAAAIAWLLGSSTSQKVIYLVMILLIAPAYSIRCIGVSNRDFVEGMSGGTWVDVVLEHGGCVTVMAQDKPTVDIELVTTTVSNMAEVRSYCYEASISDMASDSRCPTQGEAYLDKQSDTQYVCKRTLVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFACSKKMTGKSIQPENLEYRIMLSVHGSQHSGMIVNDTGHETDENRAKVEITPNSPRAEATLGGFGSLGLDCEPRTGLDFSDLYYLTMNNKHWLVHKEWFHDIPLPWHAGADTGTPHWNNKEALVEFKDAHAKRQTVVVLGSQEGAVHTALAGALEAEMDGAKGRLSSGHLKCRLKMDKLRLKGVSYSLCTAAFTFTKIPAETLHGTVTVEVQYAGTDGPCKVPAQMAVDMQTLTPVGRLITANPVITESTENSKMMLELDPPFGDSYIVIGVGEKKITHHWHRSGSTIGKAFEATVRGAKRMAVLGDTAWDFGSVGGALNSLGKGIHQIFGAAFKSLFGGMSWFSQILIGTLLMWLGLNTKNGSISLMCLALGGVLIFLSTAVSA(SEQ ID NO:2)。
ZIKV抗原可以是ZIKV的任何类型或菌株。例如，在一个实施方式中，ZIKV抗原是ZIKV菌株的蛋白质或其片段，包括但不限于H/PF/2013(GenBank:KJ776791)、PRVABC59、MEXI-44、VEN/UF-2/2016、SZ01/2016/China、SEN/1984/41671-DAK、KHM/2010/FSS13025、SEN/1984/41662-DAK、SEN/1984/41525-DAK、PHL/2012/CPC-0740、THA/2014/SV0127-14、COL/UF-1/2016、CN/SZ02/2016、GZ02/2016、HND/2016/HU-ME167-PLA、USA/2016/FL-038-URI、USA/2016/FL-030-URI、USA/2016/FL-01-MOS、USA/2016/FL-02-MOS、USA/2016/FL-03-MOS和DOM/2016/BB-0115-SER。
在某些实施方式中，ZIKV抗原包含与本文所描述的ZIKV抗原的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列，并保留原始氨基酸序列的免疫原性功能。例如，在某些实施方式中，ZIKV抗原的氨基酸序列与原始氨基酸序列的一致性程度为至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％。
在一个实施方式中，ZIKV抗原由核酸分子的核酸序列编码。在某些实施方式中，核酸序列包含DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。在一个实施方式中，核酸序列包含修饰的核酸序列。例如，在一个实施方式中，编码ZIKV抗原的核酸序列包含核苷修饰的RNA，如本文其他地方详细描述的。在某些情况下，核酸序列包括编码通过肽键与抗原连接的接头或标签序列的其他序列。
佐剂
在一个实施方式中，组合物包含佐剂。在一个实施方式中，组合物包含编码佐剂的核酸分子。在一个实施方式中，编码佐剂的核酸分子是IVTRNA。在一个实施方式中，编码佐剂的核酸分子是核苷修饰的RNA。
示例性佐剂包括但不限于α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86。其他可能是有用佐剂的基因包括编码以下各项的那些：MCP-I、MIP-Ia、MIP-Ip、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、，CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-I、VLA-I、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-I、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6，胱天蛋白酶ICE，Fos、c-jun、Sp-I、Ap-I、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB，非活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP 1、TAP2、抗-CTLA4-sc、抗-LAG3-Ig、抗-TIM3-Ig及其功能片段。
在某些实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒，其中脂质纳米颗粒充当佐剂。
核酸
在一个实施方式中，本发明包括核苷修饰的核酸分子。在一个实施方式中，核苷修饰的核酸分子编码ZIKV抗原。在一个实施方式中，核苷修饰的核酸分子编码多种抗原，包括一种或多种ZIKV抗原。在某些实施方式中，核苷修饰的核酸分子编码ZIKV抗原，其诱导针对ZIKV抗原的适应性免疫应答。在一个实施方式中，本发明包括编码佐剂的核苷修饰的核酸分子。
如本文所描述的，编码ZIKV抗原或佐剂的核苷酸序列可替代地包含关于原始核苷酸序列的序列变异，例如，一个或多个核苷酸的取代、插入和/或缺失，条件是所得多核苷酸编码根据本发明的多肽。因此，本发明的范围包括与本文所描述的核苷酸序列基本同源并编码感兴趣的ZIKV抗原或佐剂的核苷酸序列。
如在本文中所使用的，当其核苷酸序列与核苷酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少65％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的一致性程度时，核苷酸序列与本文所描述的任何核苷酸序列“基本上同源”。例如，通过引入保守或非保守取代，基于核苷酸序列中包含的信息，通常可以从抗原的生物生产者有机体中分离出与编码抗原的核苷酸序列基本上同源的核苷酸序列。可能的修饰的其他实例包括在序列中插入一个或多个核苷酸，在序列的任何末端添加一个或多个核苷酸，或在序列的任何末端或内部缺失一个或多个核苷酸。使用本领域技术人员公知的计算机算法和方法确定两个多核苷酸之间的一致性程度。
此外，本发明的范围包括编码与本文所描述的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列并保留原始氨基酸序列的免疫原性功能的核苷酸序列。
如在本文中所使用的，当其氨基酸序列与氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少65％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的一致性程度时，氨基酸序列与本文所描述的任何氨基酸序列“基本上同源”。两个氨基酸序列之间的一致性可以通过使用BLASTN算法(BLAST Manual,Altschul,S.,et al.,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894,Altschul,S.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))来确定。
在一个实施方式中，本发明涉及构建体，其包含编码ZIKV抗原的核苷酸序列。在一个实施方式中，构建体包含编码多种ZIKV抗原的多个核苷酸序列。例如，在某些实施方式中，构建体编码1种或多种、2种或多种、5种或多种，或全部10种ZIKV抗原。在一个实施方式中，本发明涉及构建体，其包含编码佐剂的核苷酸序列。在一个实施方式中，构建体包含编码ZIKV抗原的第一核苷酸序列和编码佐剂的第二核苷酸序列。
在一个实施方式中，组合物包含多种构建体，每种构建体编码一种或多种ZIKV抗原。在某些实施方式中，组合物包含1种或多种、2种或多种、3种或多种、4种或多种、5种或多种、6种或多种、7种或多种、8种或多种、9种或多种、10种或多种、15种或多种、或20或多种构建体。在一个实施方式中，组合物包含第一构建体，其包含编码ZIKV抗原的核苷酸序列；和第二构建体，其包含编码佐剂的核苷酸序列。
在另一个特定的实施方式中，构建体可操作地与翻译控制元件结合。构建体可以掺入可操作地结合的调控序列，用于表达本发明的核苷酸序列，从而形成表达盒。
载体
编码ZIKV抗原或佐剂的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达该基因的细胞中筛选文库，通过从已知包含其的载体中衍生该基因，或者通过使用标准技术直接从包含其的细胞和组织中分离。或者，可以合成产生感兴趣的基因。
可以将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒、PCR生产的线性DNA序列和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生产载体、测序载体和针对体外转录优化的载体。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、碳水化合物、肽、阳离子聚合物和脂质体。用作体外和体内的递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在其中使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质结合。与脂质相关的核酸可以包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、通过与脂质体和寡核苷酸结合的连接分子附着于脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为脂质中的悬浮液被包含、含有或与胶束复合、或以其他方式与脂质结合。脂质、脂质/RNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以双层结构、以胶束形式或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物的化合物类，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡脂(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，包括通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质载体。脂质体可以表征为具有囊泡结构，其具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有通过水性介质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。在形成封闭结构之前，脂质成分经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染-核酸复合物。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞中还是以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了确认宿主细胞中的mRNA序列的存在，可以进行多种测定。此类测定包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Northern印迹和RT-PCR；“生物化学”测定，例如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫原性手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所描述的测定法以鉴定落入本发明范围内的试剂。
体外转录的RNA
在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码ZIKV抗原的体外转录(IVT)RNA。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码多种ZIKV抗原的IVT RNA。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码佐剂的IVT RNA。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码一种或多种ZIKV抗原和一种或多种佐剂的IVT RNA。
在一个实施方式中，可以将IVT RNA作为瞬时转染的形式引入细胞。使用合成产生的质粒DNA模板通过体外转录产生RNA。可以使用适当的引物和RNA聚合酶将来自任何来源的感兴趣的DNA通过PCR直接转化为用于体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。在一个实施方式中，用于体外转录的期望模板是能够诱导适应性免疫应答的ZIKV抗原。在一个实施方式中，用于体外转录的期望模板是能够增强适应性免疫应答的佐剂。
在一个实施方式中，用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方式中，DNA是基因的一部分的感兴趣的全长基因。该基因可包括5'和/或3'非翻译区(UTR)中的一些或全部。该基因可包括外显子和内含子。在一个实施方式中，用于PCR的DNA是人基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA是来自包括细菌、病毒、寄生虫和真菌的病原或共生生物体的基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA来自包括细菌、病毒、寄生虫和真菌的病原或共生生物体，包括5'和3'UTR。DNA可替代地是人工DNA序列，其通常不在天然存在的生物体中表达。示例性人工DNA序列是包含连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因部分的序列。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一种生物体。
可用作PCR的DNA来源的基因包括编码在生物体中诱导或增强适应性免疫应答的多肽的基因。在某些情况下，该基因可用于短期治疗。在某些情况下，基因对表达基因的剂量具有有限的安全性问题。
在各种实施方式中，质粒用于产生mRNA的体外转录模板，其用于转染。
也可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。在某些实施方式中，RNA具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度为0至3000个核苷酸。待添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同的方法改变，包括但不限于设计用于与UTR的不同区域退火的PCR的引物。使用该方法，本领域普通技术人员可以修饰在转录的RNA的转染后获得最佳翻译效率所需的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可以是感兴趣的基因的天然存在的内源5'和3'UTR。或者，可以通过将UTR序列掺入到正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰来添加对感兴趣的基因不是内源的UTR序列。使用对感兴趣的基因而言不是内源的UTR序列可用于修饰RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可降低mRNA的稳定性。因此，可以选择或设计3'UTR，以基于本领域熟知的UTR的性质来增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方式中，5'UTR可含有内源基因的Kozak序列。或者，当如上所述通过PCR添加对感兴趣的基因不是内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎并不需要所有RNA能够实现有效的翻译。对许多mRNA的Kozak序列的要求是本领域已知的。在其他实施方式中，5'UTR可以衍生自RNA病毒，其RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施方式中，各种核苷酸类似物可用于3'或5'UTR以阻止mRNA的核酸外切酶降解。
为了能够从DNA模板合成RNA而无需基因克隆，转录启动子应连接到待转录序列上游的DNA模板上。当将充当RNA聚合酶启动子的序列添加到正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子被掺入到待转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个实施方式中，启动子是T7RNA聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他有用的启动子包括但不限于，T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个实施方式中，mRNA在5'末端具有帽子和3'聚(A)尾，其确定细胞中核糖体结合、翻译起始和稳定性mRNA。例如，在环状DNA模板上，质粒DNA、RNA聚合酶产生长的尾尾相接产物，其不适于在真核细胞中表达。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，其在转录后被多聚腺苷酸化时在真核转染中有效。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以将转录物的3'末端延伸到模板的最后一个碱基之外(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
将聚A/T的整合延伸到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚A/T序列可引起质粒不稳定性，这可通过使用重组功能不全细菌细胞进行质粒增殖来改善。
在使用聚(A)聚合酶(例如，大肠杆菌聚A聚合酶(E-PAP)或酵母聚A聚合酶)进行体外转录后，可以进一步延长RNA的聚(A)尾。在一个实施方式中，将聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加至300至400个核苷酸使得RNA的翻译效率增加约2倍。另外，不同化学基团与3'末端的连接可以增加mRNA稳定性。这种附着可含有修饰的/人工核苷酸、核酸适配体和其他化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶将ATP类似物掺入聚(A)尾部。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
5’帽子也为mRNA分子提供稳定性。在一个实施方式中，通过该方法产生的RNA包括5'cap1(5’帽子1)结构。这种cap1结构可以使用牛痘加帽酶和2'-O-甲基转移酶(CellScript,Madison,WI)产生。或者，使用本领域已知的和本文描述的技术提供5'帽子(Cougot等人,Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
可以使用许多不同方法中的任何一种将RNA引入到靶细胞中，例如，可商购的方法，其包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或基因脉冲仪II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂质转染、聚合物包封、肽介导的转染或基因枪颗粒递送系统如“基因枪”的阳离子脂质体介导的转染(参见，例如，Nishikawa等人，Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。在某些实施方式中，使用包括使用-mRNA转染试剂盒(Mirus,Madison WI)的方法将本发明的RNA引入细胞，其在一些情况下，提供高效率、低毒性的转染。
核苷修饰的RNA
在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码如本文所描述的ZIKV抗原的核苷修饰的核酸。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码多种抗原的核苷修饰的核酸，包括一种或多种ZIKV抗原。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码如本文所描述的佐剂的核苷修饰的核酸。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码一种或多种ZIKV抗原和一种或多种佐剂的核苷修饰的核酸。
例如，在一个实施方式中，组合物包含核苷修饰的RNA。在一个实施方式中，组合物包含核苷修饰的mRNA。核苷酸修饰的mRNA相对于未修饰的mRNA具有特别的优势，包括例如稳定性增加、先天免疫原性低或不存在，以及增强的翻译。可用于本发明的核苷修饰的mRNA进一步描述于美国专利号8,278,036、8,691,966和8,835,108，其每一个都通过引用其全部内容并入本文。
在某些实施方式中，核苷修饰的mRNA不会激活任何病理生理途径，在递送后非常有效且几乎立即翻译，并且作为体内连续蛋白质产生的模板持续数天(Karikó等人,2008,Mol Ther 16:1833-1840；Karikó等人,2012,Mol Ther 20:948-953)。发挥生理作用所需的mRNA量很少，这使其适用于人类治疗。例如，如本文所描述的，编码ZIKV抗原的核苷修饰的mRNA已证明具有抗原特异性抗体产生的能力。例如，在某些情况下，与由未修饰的mRNA编码的抗原相比，由核苷修饰的mRNA编码的抗原诱导更多的抗原特异性抗体产生。
在某些情况下，通过递送编码mRNA表达蛋白质与使用蛋白质、质粒DNA或病毒载体的方法相比具有许多益处。在mRNA转染期间，所需蛋白质的编码序列是递送至细胞的唯一物质，因此避免了与质粒主链、病毒基因和病毒蛋白质相关的所有副作用。更重要的是，与基于DNA和病毒的载体不同，mRNA不具有掺入基因组中的风险，并且蛋白质产生在mRNA递送后立即开始。例如，在体内注射编码mRNA的15至30分钟内测量了高水平的循环蛋白。在某些实施方式中，使用mRNA而不是蛋白质也具有许多优点。循环中的蛋白质的半衰期通常很短，因此蛋白质处理需要频繁给药，而mRNA为几天的连续蛋白质生产提供模板。蛋白质的纯化是有问题的，并且它们可能含有聚集物和引起不利影响的其他杂质(Kromminga和Schellekens,2005,Ann NY Acad Sci 1050:257-265)。
在某些实施方式中，核苷修饰的RNA包含天然存在的修饰的核苷假尿苷。在某些实施方式中，包含假尿苷使得mRNA更稳定，非免疫原性和高度可翻译(Karikó等人,2008,MolTher 16:1833-1840；Anderson等人,2010,Nucleic Acids Res 38:5884-5892；Anderson等人,2011,Nucleic Acids Research 39:9329-9338；Karikó等人,2011,Nucleic AcidsResearch 39:e142；Karikó等人,2012,Mol Ther 20:948-953；Karikó等人,2005,Immunity23:165-175)。
已经证明，修饰的核苷(包括RNA中的假尿苷)的存在抑制了它们的先天免疫原性(Karikó等人,2005,Immunity 23:165-175)。此外，含有假尿苷的蛋白质编码的体外转录的RNA可比不含或含有其他修饰的核苷的RNA更有效地翻译(Karikó等人,2008,Mol Ther 16:1833-1840)。随后，证实了假尿苷的存在改善了RNA的稳定性(Anderson等人,2011,NucleicAcids Research 39:9329-9338)并且减少了PKR的激活和翻译的抑制(Anderson等人,2010,Nucleic Acids Res 38:5884-5892)。
在某些实施方式中，核苷修饰的核酸分子是纯化的核苷修饰的核酸分子。例如，在某些实施方式中，纯化组合物以除去双链污染物。在某些情况下，使用制备型高效液相色谱(HPLC)纯化程序来获得含有假尿苷的RNA，其具有优异的翻译潜力并且没有先天免疫原性(Karikó等人,2011,Nucleic Acids Research 39:e142)。将编码促红细胞生产素的HPLC纯化的含假尿苷的RNA施用于小鼠和猕猴导致血清EPO水平显著增加(Karikó等人,2012,MolTher 20:948-953)，从而证实含有假尿苷的mRNA适用于体内蛋白质治疗。在某些实施方式中，使用非HPLC方法纯化核苷修饰的核酸分子。在某些情况下，使用色谱方法纯化核苷修饰的核酸分子，包括但不限于HPLC和快速蛋白质液相色谱(FPLC)。示例性的基于FPLC的纯化程序描述于Weissman等人,2013,Methods Mol Biol,969:43-54中。示例性纯化程序也描述于美国专利申请公开号US2016/0032316中，其通过引用其全部内容并入本文。
本发明包括RNA、寡核糖核苷酸和包含假尿苷或修饰的核苷的多核糖核苷酸分子。在某些实施方式中，组合物包含编码抗原的分离的核酸，其中核酸包含假尿苷或修饰的核苷。在某些实施方式中，组合物包含载体，其包含编码抗原、佐剂或其组合的分离的核酸，其中核酸包含假尿苷或修饰的核苷。
在一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA是IVT RNA，如本文其他地方所述。例如，在某些实施方式中，核苷修饰的RNA通过T7噬菌体RNA聚合酶合成。在另一个实施方式中，核苷修饰的mRNA通过SP6噬菌体RNA聚合酶合成。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA通过T3噬菌体RNA聚合酶合成。
在一个实施方式中，修饰的核苷是m1acp3Ψ(1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m1Ψ(1-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是Ψm(2'-O-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m5D(5-甲基二氢尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m3Ψ(3-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是未进一步修饰的假尿苷部分。在另一个实施方式中，修饰的核苷是任何上述假尿苷的单磷酸盐、二磷酸盐或三磷酸盐。在另一个实施方式中，修饰的核苷是本领域已知的任何其他假尿苷样核苷。
在另一个实施方式中，在本发明的核苷修饰的RNA中修饰的核苷是尿苷(U)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是胞苷(C)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是腺苷(A)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是鸟苷(G)。
在另一个实施方式中，本发明的经修饰的核苷是m5C(5-甲基胞苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m5U(5-甲基尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是m6A(N6-甲基腺苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是s2U(2-硫代尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是Ψ(假尿苷)。在另一个实施方式中，修饰的核苷是Um(2'-O-甲基尿苷)。
在其他实施方式中，修饰的核苷是m1A(1-甲基腺苷)；m2A(2-甲基腺苷)；Am(2'-O-甲基腺苷)；ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)；i6A(N6-异戊烯基腺苷)；ms2i6A(2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷)；io6A(N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6A(2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨酸基氨基甲酰基腺苷)；t6A(N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；ms2t6A(2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；hn6A(N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷)；ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷)；Ar(p)(2'-O-核糖基腺苷(磷酸))；I(肌苷)；m1I(1-甲基肌苷)；m1Im(1,2'-O-二甲基肌苷)；m3C(3-甲基胞苷)；Cm(2'-O-甲基胞苷)；s2C(2-硫代胞苷)；ac4C(N4-乙酰基胞苷)；f5C(5-甲酰基胞苷)；m5Cm(5,2'-O-二甲基胞苷)；ac4Cm(N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷)；k2C(赖胞苷)；m1G(1-甲基鸟苷)；m2G(N2-甲基鸟苷)；m7G(7-甲基鸟苷)；Gm(2'-O-甲基鸟苷)；m2 2G(N2,N2-二甲基鸟苷)；m2Gm(N2,2’-O-二甲基鸟苷)；m2 2Gm(N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2'-O-核糖基鸟苷(磷酸))；yW(怀丁苷)；o2yW(过氧基怀丁苷)；OHyW(羟基怀丁苷)；OHyW*(未修饰的羟基怀丁苷)；imG(怀俄苷)；mimG(甲基怀俄苷)；Q(queuosine，辫苷)；oQ(环氧基辫苷)；galQ(半乳糖基-辫苷)；manQ(甘露糖基-辫苷)；preQ0(7-氰基-7-去氮鸟苷)；preQ1(7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷)；G+(古嘌苷)；D(二氢尿苷)；m5Um(5,2'-O-二甲基尿苷)；s4U(4-硫尿苷)；m5s2U(5-甲基-2-硫尿苷)；s2Um(2-硫代-2'-O-甲基尿苷)；acp3U(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷)；ho5U(5-羟基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；cmo5U(尿苷5-羟乙酸)；mcmo5U(尿苷5-羟乙酸甲酯)；chm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷))；mchm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯)；mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um(5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷)；nm5s2U(5-氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷)；ncm5U(5-氨基甲酰基甲基尿苷)；ncm5Um(5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5U(5-羧甲基氨基甲基尿苷)；cmnm5Um(5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5s2U(5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；m6 2A(N6,N6-二甲基腺苷)；Im(2'-O-甲基肌苷)；m4C(N4-甲基胞苷)；m4Cm(N4,2'-O-二甲基胞苷)；hm5C(5-羟甲基胞苷)；m3U(3-甲基尿苷)；cm5U(5-羧甲基尿苷)；m6Am(N6,2'-O-二甲基腺苷)；m6 2Am(N6,N6,O-2’-三甲基腺苷)；m2,7G(N2,7-二甲基鸟苷)；m2,2,7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)；m3Um(3,2'-O-二甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氢尿苷)；f5Cm(5-甲酰基2'-O-甲基胞苷)；m1Gm(1,2'-O-二甲基鸟苷)；m1Am(1,2'-O-二甲基腺苷)；τm5U(5-牛磺酸基甲基尿苷)；τm5s2U(5-牛磺酰基甲基-2-硫尿苷))；imG-14(4-去甲基怀俄苷)；imG2(异怀俄苷)；或ac6A(N6-乙酰基腺苷)。
在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA包含2种或多种上述修饰的组合。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA包含3种或多种上述修饰的组合。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA包含多于3种上述修饰的组合。
在各种实施方式中，本发明的核苷修饰的残基的0.1％-100％被修饰(例如，通过假尿苷或另一种修饰的核苷碱基的存在)。在一个实施方式中，修饰的残基的分数为0.1％。在另一个实施方式中，修饰的残基的分数为0.2％。在另一个实施方式中，该分数为0.3％。在另一个实施方式中，该分数为0.4％。在另一个实施方式中，该分数为0.5％。在另一个实施方式中，该分数为0.6％。在另一个实施方式中，该分数为0.7％。在另一个实施方式中，该分数为0.8％。在另一个实施方式中，该分数为0.9％。在另一个实施方式中，该分数为1％。在另一个实施方式中，该分数为1.5％。在另一个实施方式中，该分数为2％。在另一个实施方式中，该分数为2.5％。在另一个实施方式中，该分数为3％。在另一个实施方式中，该分数为4％。在另一个实施方式中，该分数为5％。在另一个实施方式中，该分数为6％。在另一个实施方式中，该分数为7％。在另一个实施方式中，该分数为8％。在另一个实施方式中，该分数为9％。在另一个实施方式中，该分数为10％。在另一个实施方式中，该分数为12％。在另一个实施方式中，该分数为14％。在另一个实施方式中，该分数为16％。在另一个实施方式中，该分数为18％。在另一个实施方式中，该分数为20％。在另一个实施方式中，该分数为25％。在另一个实施方式中，该分数为30％。在另一个实施方式中，该分数为35％。在另一个实施方式中，该分数为40％。在另一个实施方式中，该分数为45％。在另一个实施方式中，该分数为50％。在另一个实施方式中，该分数为55％。在另一个实施方式中，该分数为60％。在另一个实施方式中，该分数为65％。在另一个实施方式中，该分数为70％。在另一个实施方式中，该分数为75％。在另一个实施方式中，该分数为80％。在另一个实施方式中，该分数为85％。在另一个实施方式中，该分数为90％。在另一个实施方式中，该分数为91％。在另一个实施方式中，该分数为92％。在另一个实施方式中，该分数为93％。在另一个实施方式中，该分数为94％。在另一个实施方式中，该分数为95％。在另一个实施方式中，该分数为96％。在另一个实施方式中，该分数为97％。在另一个实施方式中，该分数为98％。在另一个实施方式中，该分数为99％。在另一个实施方式中，该分数为100％。
在另一个实施方式中，该分数小于5％。在另一个实施方式中，该分数小于3％。在另一个实施方式中，该分数小于1％。在另一个实施方式中，该分数小于2％。在另一个实施方式中，该分数小于4％。在另一个实施方式中，该分数小于6％。在另一个实施方式中，该分数小于8％。在另一个实施方式中，该分数小于10％。在另一个实施方式中，该分数小于12％。在另一个实施方式中，该分数小于15％。在另一个实施方式中，该分数小于20％。在另一个实施方式中，该分数小于30％。在另一个实施方式中，该分数小于40％。在另一个实施方式中，该分数小于50％。在另一个实施方式中，该分数小于60％。在另一个实施方式中，该分数小于70％。
在另一个实施方式中，给定的核苷(即尿苷、胞苷、鸟苷或腺苷)的0.1％的残基被修饰。在另一个实施方式中，修饰的残基的分数为0.2％。在另一个实施方式中，该分数为0.3％。在另一个实施方式中，该分数为0.4％。在另一个实施方式中，该分数为0.5％。在另一个实施方式中，该分数为0.6％。在另一个实施方式中，该分数为0.7％。在另一个实施方式中，该分数为0.8％。在另一个实施方式中，该分数为0.9％。在另一个实施方式中，该分数为1％。在另一个实施方式中，该分数为1.5％。在另一个实施方式中，该分数为2％。在另一个实施方式中，该分数为2.5％。在另一个实施方式中，该分数为3％。在另一个实施方式中，该分数为4％。在另一个实施方式中，该分数为5％。在另一个实施方式中，该分数为6％。在另一个实施方式中，该分数为7％。在另一个实施方式中，该分数为8％。在另一个实施方式中，该分数为9％。在另一个实施方式中，该分数为10％。在另一个实施方式中，该分数为12％。在另一个实施方式中，该分数为14％。在另一个实施方式中，该分数为16％。在另一个实施方式中，该分数为18％。在另一个实施方式中，该分数为20％。在另一个实施方式中，该分数为25％。在另一个实施方式中，该分数为30％。在另一个实施方式中，该分数为35％。在另一个实施方式中，该分数为40％。在另一个实施方式中，该分数为45％。在另一个实施方式中，该分数为50％。在另一个实施方式中，该分数为55％。在另一个实施方式中，该分数为60％。在另一个实施方式中，该分数为65％。在另一个实施方式中，该分数为70％。在另一个实施方式中，该分数为75％。在另一个实施方式中，该分数为80％。在另一个实施方式中，该分数为85％。在另一个实施方式中，该分数为90％。在另一个实施方式中，该分数为91％。在另一个实施方式中，该分数为92％。在另一个实施方式中，该分数为93％。在另一个实施方式中，该分数为94％。在另一个实施方式中，该分数为95％。在另一个实施方式中，该分数为96％。在另一个实施方式中，该分数为97％。在另一个实施方式中，该分数为98％。在另一个实施方式中，该分数为99％。在另一个实施方式中，该分数为100％。在另一个实施方式中，被修饰的给定的核苷的分数小于8％。在另一个实施方式中，该分数小于10％。在另一个实施方式中，该分数小于5％。在另一个实施方式中，该分数小于3％。在另一个实施方式中，该分数小于1％。在另一个实施方式中，该分数小于2％。在另一个实施方式中，该分数小于4％。在另一个实施方式中，该分数小于6％。在另一个实施方式中，该分数小于12％。在另一个实施方式中，该分数小于15％。在另一个实施方式中，该分数小于20％。在另一个实施方式中，该分数小于30％。在另一个实施方式中，该分数小于40％。在另一个实施方式中，该分数小于50％。在另一个实施方式中，该分数小于60％。在另一个实施方式中，该分数小于70％。
在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA比具有相同序列的未修饰的RNA分子在细胞中更有效地被翻译。在另一个实施方式中，核苷修饰的RNA表现出增强的被靶细胞翻译的能力。在另一个实施方式中，相对于其未修饰的对应物，翻译增强了2倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了3倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了4倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了5倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了6倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了7倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了8倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了9倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了10倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了15倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了20倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了50倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了100倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了200倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了500倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了1000倍因子。在另一个实施方式中，翻译增强了2000倍因子。在另一个实施方式中，该因子是10至1000倍。在另一个实施方式中，该因子是10至100倍。在另一个实施方式中，该因子是10至200倍。在另一个实施方式中，该因子是10至300倍。在另一个实施方式中，该因子是10至500倍。在另一个实施方式中，该因子是20至1000倍。在另一个实施方式中，该因子是30至1000倍。在另一个实施方式中，该因子是50至1000倍。在另一个实施方式中，该因子是100至1000倍。在另一个实施方式中，该因子是200至1000倍。在另一个实施方式中，翻译增强了任何其他显著量或量的范围。
在另一个实施方式中，与相同序列的未修饰的体外合成的RNA分子相比，本发明的核苷修饰的编码抗原的RNA诱导显著更强的适应性免疫应答。在另一个实施方式中，修饰的RNA分子诱导的适应性免疫应答比其未修饰的对应物高2倍。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加3倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加4倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加5倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加6倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加7倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加8倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加9倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加10倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加15倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加20倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加50倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加100倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加200倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加500倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加1000倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加2000倍因子。在另一个实施方式中，适应性免疫应答增加另一倍数差异。
在另一个实施方式中，“诱导显著更强的适应性免疫应答”是指适应性免疫应答的可检测的增加。在另一个实施方式中，该术语是指适应性免疫应答的倍数增加(例如，上文列举的倍数增加为1)。在另一个实施方式中，该术语是指增加使得核苷修饰的RNA可以比未修饰的RNA分子以更低的剂量或频率施用，同时仍然诱导类似的有效的适应性免疫应答。在另一个实施方式中，增加使得核苷修饰的RNA可以使用单剂量施用以诱导有效的适应性免疫应答。
在另一个实施方式中，本发明的核苷修饰的RNA显示出比相同序列的未修饰的体外合成的RNA分子显著更低的先天免疫原性。在另一个实施方式中，修饰的RNA分子表现出比其未修饰的对应物低2倍的先天免疫应答。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低3倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低4倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低5倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低6倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低7倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低8倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低9倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低10倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低15倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低20倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低50倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低100倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低200倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低500倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低1000倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低2000倍因子。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低另一种倍数差异。
在另一个实施方式中，“表现出显著较低的先天免疫原性”是指先天免疫原性的可检测的降低。在另一个实施方式中，该术语是指先天免疫原性的倍数降低(例如，上文列举的倍数降低为1)。在另一个实施方式中，该术语是指降低使得可以施用有效量的核苷修饰的RNA而不引发可检测的先天免疫应答。在另一个实施方式中，该术语是指降低使得核苷修饰的RNA可以重复施用而不引发足以可检测地减少由修饰的RNA编码的蛋白质的产生的先天免疫应答。在另一个实施方式中，所述降低使得核苷修饰的RNA可以重复施用而不引发足以消除由修饰的RNA编码的蛋白质的可检测产生的先天免疫应答。
脂质纳米颗粒
在一个实施方式中，核苷修饰的RNA的递送包括任何合适的递送方法，包括本文其他地方描述的示例性RNA转染方法。在某些实施方式中，将核苷修饰的RNA递送至受试者包括在接触步骤之前将核苷修饰的RNA与转染试剂混合。在另一个实施方式中，本发明的方法还包括将核苷修饰的RNA与转染试剂一起施用。在另一个实施方式中，转染试剂是阳离子脂质试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是阳离子聚合物试剂。
在另一个实施方式中，转染试剂是基于脂质的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于蛋白质的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于碳水化合物的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于阳离子脂质的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于阳离子聚合物的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是基于聚乙烯亚胺的转染试剂。在另一个实施方式中，转染试剂是磷酸钙。在另一个实施方式中，转染试剂是 或在另一个实施方式中，转染试剂是本领域已知的任何其他转染试剂。
在另一个实施方式中，转染试剂形成脂质体。在另一个实施方式中，脂质体增加细胞内稳定性，增加摄取效率并改善生物活性。在另一个实施方式中，脂质体是由脂质组成的中空球形囊泡，所述脂质以与构成细胞膜的那些脂质类似的方式排列。在另一个实施方式中，它们具有用于捕获水溶性化合物的内部含水空间，并且其直径的尺寸范围为0.05至数微米。在另一个实施方式中，脂质体可以生物活性形式将RNA递送至细胞。
在一个实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)和本文所描述的一种或多种核酸分子。例如，在一个实施方式中，组合物包含LNP和一种或多种核苷修饰的RNA分子，其编码一种或多种抗原、佐剂或其组合。
术语“脂质纳米颗粒”是指具有至少一个大约是纳米级(例如，1-1,000nm)的尺寸的颗粒，其包括一种或多种脂质，例如式(I)、(II)或(III)的脂质。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包含在包含如本文所描述的核苷修饰的RNA的制剂中。在一些实施方式中，这种脂质纳米颗粒包含阳离子脂质(例如，式(I)、(II)或(III)的脂质)和一种或多种选自中性脂质、带电脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质的赋形剂(例如，聚乙二醇化脂质，例如结构(IV)的聚乙二醇化脂质，例如化合物Iva)。在一些实施方式中，核苷修饰的RNA包封在脂质纳米颗粒的脂质部分或由脂质纳米颗粒的一些或全部脂质部分包封的水性空间中，从而保护其免受酶降解或由宿主生物或细胞的机制诱导的其他不良作用，例如，不良免疫反应。
在各种实施方式中，脂质纳米颗粒的平均直径为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm、或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm，并且基本上无毒。在某些实施方式中，核苷酸修饰的RNA，当存在于脂质纳米颗粒中时，在水溶液中对用核酸酶的降解具有抗性。
LNP可包含能够形成与一种或多种核酸分子连接的颗粒的任何脂质，或其中包封一种或多种核酸分子的任何脂质。术语“脂质”是指一组有机化合物，其是脂肪酸的衍生物(例如，酯)，并且其特征通常在于不溶于水但可溶于许多有机溶剂。脂质通常分为至少三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂；(3)“衍生脂质”，如类固醇。
在一个实施方式中，LNP包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和聚乙二醇化脂质。
在一个实施方式中，LNP包含阳离子脂质。如在本文中所使用的，术语“阳离子脂质”是指当pH降低至低于脂质的可电离基团的pK时是阳离子或变成阳离子(质子化)的脂质，但在较高pH值下逐渐变得更中性。在低于pK的pH值下，脂质然后能够与带负电的核酸结合。在某些实施方式中，阳离子脂质包含两性离子脂质，其在pH降低时呈现正电荷。
在某些实施方式中，阳离子脂质包含在选择性pH(例如生理pH)下带有净正电荷的许多脂质物质中的任何一种。这些脂质包括但不限于N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；3-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、双十八烷基酰胺基甘氨酰基羧基精胺(DOGS)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、N,N-二甲基-2,3-二油酰基氧基)丙胺(DODMA)和N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。另外，可获得许多可用于本发明的阳离子脂质的商业制剂。这些包括，例如，(商业上可获得的阳离子脂质体，其包含DOTMA和1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，来自GIBCO/BRL，Grand Island,N.Y.)；(商业上可获得的阳离子脂质体，其包含N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N,N-二甲基铵三氟乙酸盐(DOSPA)和(DOPE)，来自GIBCO/BRL)；和来自Promega Corp.,Madison,Wis.的商业上可获得的包含双十八烷基酰胺基甘氨酰基羧基精胺(DOGS)的阳离子脂质的乙醇溶液)。以下脂质是阳离子的并且在低于生理学pH的条件下具有正电荷。DODAP、DODMA、DMDMA、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)，1,2-二亚油醇氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)。
在一个实施方式中，阳离子脂质是氨基脂质。用于本发明的合适的氨基脂质包括在WO 2012/016184中描述的那些，其通过引用其全部内容并入本文。代表性的氨基脂质包括但不限于1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪子基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油氧基-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)和2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)。
合适的氨基脂质包括具有下式的那些：
其中R1和R2相同或不同并且独立地为可选取代的C10-C24烷基、可选取代的C10-C24烯基、可选取代的C10-C24炔基、或可选取代的C10-C24酰基；
R3和R4相同或不同并且独立地为可选取代的C1-C6烷基、可选取代的C2-C6烯基、或可选取代的C2-C6炔基或R3和R4可连接以形成4-6碳原子和1或2个选自氮和氧的杂原子的可选取代的杂环；
R5不存在或存在，并且当存在时为氢或C1-C6烷基；
m、n和p相同或不同，并且独立地为0或1，条件是m、n和p不同时为0；
q为0、1、2、3或4；和
Y和Z相同或不同，并且独立地为O、S或NH。
在一个实施方式中，R1和R2各自为亚油基，并且氨基脂质为二亚油基氨基脂质。在一个实施方式中，氨基脂质是二亚油基氨基脂质。
代表性的有用的二亚油基氨基脂质具有下式：
其中n为0、1、2、3或4。
在一个实施方式中，阳离子脂质是DLin-K-DMA。在一个实施方式中，阳离子脂质是DLin-KC2-DMA(上述DLin-K-DMA，其中n是2)。
在一个实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有式(I)的结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或碳-碳双键；
R1a和R1b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基、或(b)R1a是H或C1-C12烷基，并且R1b与其键合的碳原子一起与相邻的R1b连接并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基、或(b)R2a是H或C1-C12烷基，并且R2b与其键合的碳原子一起与相邻的R2b连接并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基、或(b)R3a是H或C1-C12烷基，并且R3b与其键合的碳原子一起与相邻的R3b连接并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基、或(b)R4a是H或C1-C12烷基，并且R4b与其键合的碳原子一起与相邻的R4b连接并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R5和R6各自独立地为甲基或环烷基；
R7在每次出现时独立地为H或C1-C12烷基；
R8和R9各自独立地为C1-C12烷基；或R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成包含一个氮原子的5、6或7元杂环；
a和d各自独立地为0至24的整数；
b和c各自独立地为1至24的整数；且
e为1或2。
在式(I)的某些实施方式中，R1a、R2a、R3a或R4a中的至少一个是C1-C12烷基，或者L1或L2中的至少一个是–O(C＝O)-或(C＝O)O-。在其他实施方式中，当a为6时，R1a和R1b不是异丙基，当a为8时，其不是正丁基。
在式(I)的又一些实施方式中，R1a、R2a、R3a或R4a中的至少一个是C1-C12烷基，或者L1或L2中的至少一个是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；和
当a为6时，R1a和R1b不是异丙基，当a为8时，其不是正丁基。
在式(I)的其他实施方式中，R8和R9各自独立地为未取代的C1-C12烷基；或R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成包含一个氮原子的5、6或7元杂环；
在式(I)的某些实施方式中，L1或L2中的任何一个可以是-O(C＝O)-或碳-碳双键。L1和L2各自可以是-O(C＝O)-或者各自可以是碳-碳双键。
在式(I)的一些实施方式中，L1或L2中的一个是-O(C＝O)-。在其他实施方式中，L1和L2都是-O(C＝O)-。
在式(I)的一些实施方式中，L1或L2中的一个是-(C＝O)O-。在其他实施方式中，L1和L2都是-(C＝O)O-。
在式(I)的一些其他实施方式中，L1或L2中的一个是碳-碳双键。在其他实施方式中，L1和L2都是碳-碳双键。
在式(I)的其他实施方式中，L1或L2中的一个是-O(C＝O)-，而L1或L2中的另一个是-(C＝O)O-。在更多实施方式中，L1或L2中的一个是-O(C＝O)-，而L1或L2中的另一个是碳-碳双键。在更多实施方式中，L1或L2中的一个是-(C＝O)O-，而L1或L2中的另一个是碳-碳双键。
应理解，在整个说明书中使用的“碳-碳”双键是指以下结构之一：
其中Ra和Rb在每次出现时独立地为H或取代基。例如，在一些实施方式中，Ra和Rb在每次出现时独立地为H、C1-C12烷基或环烷基，例如H或C1-C12烷基。
在其他实施方式中，式(I)的脂质化合物具有以下结构(Ia)：
在其他实施方式中，式(I)的脂质化合物具有以下结构(Ib)：
在其他实施方式中，式(I)的脂质化合物具有以下结构(Ic)：
在式(I)的脂质化合物的某些实施方式中，a、b、c和d各自独立地为2至12的整数或4至12的整数。在其他实施方式中，a、b、c和d各自独立地为8至12或5至9的整数。在一些某些实施方式中，a为0。在一些实施方式中，a为1。在其他实施方式中，a为2。在更多实施方式中，a为3。在其他实施方式中，a为4。在一些实施方式中，a为5。在其他实施方式中，a为6。在更多实施方式中，a为7。在其他实施方式中，a为8。在一些实施方式中，a为9。在其他实施方式中，a为10。在更多实施方式中，a为11。在其他实施方式中，a为12。在一些实施方式中，a为13。在其他实施方式中，a为14。在更多实施方式中，a为15。在其他实施方式中，a为16。
在式(I)的一些其他实施方式中，b为1。在其他实施方式中，b为2。在更多实施方式中，b为3。在其他实施方式中，b为4。在一些实施方式中，b为5。在其他实施方式中，b为6。在更多实施方式中，b为7。在其他实施方式中，b为8。在一些实施方式中，b为9。在其他实施方式中，b为10。在更多实施方式中，b为11。在其他实施方式中，b为12。在一些实施方式中，b为13。在其他实施方式中，b为14。在更多实施方式中，b为15。在其他实施方式中，b为16。
在式(I)的一些更多实施方式中，c为1。在其他实施方式中，c为2。在更多实施方式中，c为3。在其他实施方式中，c为4。在一些实施方式中，c为5。在其他实施方式中，c为6。在更多实施方式中，c为7。在其他实施方式中，c为8。在一些实施方式中，c为9。在其他实施方式中，c为10。在更多实施方式中，c为11。在其他实施方式中，c为12。在一些实施方式中，c为13。在其他实施方式中，c为14。在更多实施方式中，c为15。在其他实施方式中，c为16。
在式(I)的一些某些其他实施方式中，d为0。在一些实施方式中，d为1。在其他实施方式中，d为2。在更多实施方式中，d为3。在其他实施方式中，d为4。在一些实施方式中，d为5。在其他实施方式中，d为6。在更多实施方式中，d为7。在其他实施方式中，d为8。在一些实施方式中，d为9。在其他实施方式中，d为10。在更多实施方式中，d为11。在其他实施方式中，d为12。在一些实施方式中，d为13。在其他实施方式中，d为14。在更多实施方式中，d为15。在其他实施方式中，d为16。
在式(I)的一些其他各种实施方式中，a和d相同。在一些其他实施方式中，b和c相同。在一些其他具体实施方式中，a和d相同，并且b和c相同。
式(I)中的a和b的总和以及c和d的总和是可以改变的因子，以获得具有期望性质的式(I)的脂质。在一个实施方式中，选择a和b使得它们的总和为14至24的整数。在其他实施方式中，选择c和d使得它们的总和为14至24的整数。在进一步的实施方式中，a和b的总和以及c和d的总和是相同的。例如，在一些实施方式中，a和b的总和以及c和d的总和都是相同的整数，其可以在14至24的范围内。在更多实施方式中，选择a、b、c和d使得a和b的总和以及c和d的总和为12或更大。
在式(I)的一些实施方式中，e为1。在其他实施方式中，e是2。
式(I)的R1a、R2a、R3a和R4a的取代基没有特别限制。在某些实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a在每次出现时为H。在某些其他实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C12烷基。在某些其他实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C8烷基。在某些其他实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C6烷基。在一些前述实施方式中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(I)的某些实施方式中，R1a、R1b、R4a和R4b在每次出现时为C1-C12烷基。
在式(I)的进一步的实施方式中，R1b、R2b、R3b和R4b中的至少一个是H或R1b、R2b、R3b和R4b在每次出现时是H。
在式(I)的某些实施方式中，R1b与其键合的碳原子一起与相邻的R1b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键。在前述的其他实施方式中，R4b与其键合的碳原子一起与相邻的R4b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键。
式(I)的R5和R6处的取代基在前述实施方式中没有特别限制。在某些实施方式中，R5或R6中的一个或两个是甲基。在某些其他实施方式中，R5或R6中的一个或两个是环烷基，例如环己基。在这些实施方式中，环烷基可以是取代的或不是取代的。在某些其他实施方式中，环烷基被C1-C12烷基取代，例如叔丁基。
R7处的取代基在式(I)的前述实施方式中没有特别限制。在某些实施方式中，至少一个R7是H。在一些其他实施方式中，R7在每次出现时是H。在某些其他实施方式中，R7是C1-C12烷基。
在式(I)的前述实施方式的某些其他实施方式中，R8或R9之一是甲基。在其他实施方式中，R8和R9均为甲基。
在式(I)的一些不同实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7元杂环。在前述的一些实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，例如吡咯烷基环。
在各种不同的实施方式中，式(I)的脂质具有下表1中列出的结构之一。
表1
式(I)的代表性脂质
在一些实施方式中，LNP包含式(I)的脂质、核苷修饰的RNA和一种或多种选自中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质的赋形剂。在一些实施方式中，式(I)的脂质是化合物I-5。在一些实施方式中，式(I)的脂质是化合物I-6。
在一些其他实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有式(II)的结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa、-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1是C1-C2亚烷基、–(C＝O)-、-O(C＝O)-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-或直接键；
G2是–C(＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-、-C(＝O)NRa或直接键；
G3是C1-C6亚烷基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1a和R1b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R1a是H或C1-C12烷基，并且R1b与其键合的碳原子一起与相邻的R1b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R2a是H或C1-C12烷基，并且R2b与其键合的碳原子一起与相邻的R2b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R3a是H或C1-C12烷基，并且R3b与其键合的碳原子一起与相邻的R3b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R4a是H或C1-C12烷基，并且R4b与其键合的碳原子一起与相邻的R4b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键；
R5和R6各自独立地为H或甲基；
R7为C4-C20烷基；
R8和R9各自独立地为C1-C12烷基；或R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7元杂环；
a、b、c和d各自独立地为1至24的整数；且
x为0、1或2。
在式(II)的一些实施方式中，L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接键。在其他实施方式中，G1和G2各自独立地为-(C＝O)-或直接键。在一些不同的实施方式中，L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接键；且G1和G2各自独立地为-(C＝O)-或直接键。
在式(II)的一些不同实施方式中，L1和L2各自独立地为-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRa-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa、-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-、-NRaS(O)xNRa-、-NRaS(O)x-或-S(O)xNRa-。
在式(II)的前述实施方式的其他实施方式中，脂质化合物具有以下结构(IIA)或(IIB)之一：
在式(II)的一些实施方式中，脂质化合物具有结构(IIA)。在其他实施方式中，脂质化合物具有结构(IIB)。
在任何前述式(II)的实施方式中，L1或L2中的一个是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个是-O(C＝O)-。
在式(II)的一些不同实施方式中，L1或L2之一是-(C＝O)O-。例如，在某些实施方式中，L1和L2中的每一个是-(C＝O)O-。
在式(II)的不同实施方式中，L1或L2中的一个是直接键。如在本文中所使用的，“直接键”是指基团(例如，L1或L2)不存在。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个是直接键。
在式(II)的其他不同实施方式中，对于R1a和R1b的至少一次出现，R1a是H或C1-C12烷基、并且R1b与其键合的碳原子一起与相邻的R1b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键。
在式(II)的其他不同实施方式中，对于R4a和R4b的至少一次出现，R4a是H或C1-C12烷基、并且R4b与其键合的碳原子一起与相邻的R4b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键。
在式(II)的更多实施方式中，对于R2a和R2b的至少一次出现，R2a是H或C1-C12烷基、并且R2b与其键合的碳原子一起与相邻的R2b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键。
在式(II)的其他不同实施方式中，对于R3a和R3b的至少一次出现，R3a是H或C1-C12烷基、并且R3b与其键合的碳原子一起与相邻的R3b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键。
在式(II)的各种其他实施方式中，脂质化合物具有以下结构(IIC)或(IID)之一：
其中e、f、g和h各自独立地为1至12的整数。
在式(II)的一些实施方式中，脂质化合物具有结构(IIC)。在其他实施方式中，脂质化合物具有结构(IID)。
在结构(IIC)或(IID)的各种实施方式中，e、f、g和h各自独立地为4至10的整数。
在式(II)的某些实施方式中，a、b、c和d各自独立地为2至12的整数或4至12的整数。在其他实施方式中，a、b、c和d各自独立地为8至12或5至9的整数。在一些某些实施方式中，a为0。在一些实施方式中，a为1。在其他实施方式中，a为2。在更多实施方式中，a为3。在其他实施方式中，a为4。在一些实施方式中，a为5。在其他实施方式中，a为6。在更多实施方式中，a为7。在其他实施方式中，a为8。在一些实施方式中，a为9。在其他实施方式中，a为10。在更多实施方式中，a为11。在其他实施方式中，a为12。在一些实施方式中，a为13。在其他实施方式中，a为14。在更多实施方式中，a为15。在其他实施方式中，a为16。
在式(II)的一些实施方式中，b为1。在其他实施方式中，b为2。在更多实施方式中，b为3。在其他实施方式中，b为4。在一些实施方式中，b为5。在其他实施方式中，b为6。在更多实施方式中，b为7。在其他实施方式中，b为8。在一些实施方式中，b为9。在其他实施方式中，b为10。在更多实施方式中，b为11。在其他实施方式中，b为12。在一些实施方式中，b为13。在其他实施方式中，b为14。在更多实施方式中，b为15。在其他实施方式中，b为16。
在式(II)的一些实施方式中，c为1。在其他实施方式中，c为2。在更多实施方式中，c为3。在其他实施方式中，c为4。在一些实施方式中，c为5。在其他实施方式中，c为6。在更多实施方式中，c为7。在其他实施方式中，c为8。在一些实施方式中，c为9。在其他实施方式中，c为10。在更多实施方式中，c为11。在其他实施方式中，c为12。在一些实施方式中，c为13。在其他实施方式中，c为14。在更多实施方式中，c为15。在其他实施方式中，c为16。
在式(II)的一些某些实施方式中，d为0。在一些实施方式中，d为1。在其他实施方式中，d为2。在更多实施方式中，d为3。在其他实施方式中，d为4。在一些实施方式中，d为5。在其他实施方式中，d为6。在更多实施方式中，d为7。在其他实施方式中，d为8。在一些实施方式中，d为9。在其他实施方式中，d为10。在更多实施方式中，d为11。在其他实施方式中，d为12。在一些实施方式中，d为13。在其他实施方式中，d为14。在更多实施方式中，d为15。在其他实施方式中，d为16。
在式(II)的一些实施方式中，e为1。在其他实施方式中，e是2。在更多实施方式中，e为3。在其他实施方式中，e为4。在一些实施方式中，e为5。在其他实施方式中，e为6。在更多实施方式中，e为7。在其他实施方式中，e为8。在一些实施方式中，e为9。在其他实施方式中，e为10。在更多实施方式中，e为11。在其他实施方式中，e为12。
在式(II)的一些实施方式中，f为1。在其他实施方式中，f为2。在更多实施方式中，f为3。在其他实施方式中，f为4。在一些实施方式中，f为5。在其他实施方式中，f为6。在更多实施方式中，f为7。在其他实施方式中，f为8。在一些实施方式中，f为9。在其他实施方式中，f为10。在更多实施方式中，f为11。在其他实施方式中，f为12。
在式(II)的一些实施方式中，g为1。在其他实施方式中，g为2。在更多实施方式中，g为3。在其他实施方式中，g为4。在一些实施方式中，g为5。在其他实施方式中，g为6。在更多实施方式中，g为7。在其他实施方式中，g为8。在一些实施方式中，g为9。在其他实施方式中，g为10。在更多实施方式中，g为11。在其他实施方式中，g为12。
在式(II)的一些实施方式中，h为1。在其他实施方式中，e是2。在更多实施方式中，h为3。在其他实施方式中，h为4。在一些实施方式中，e为5。在其他实施方式中，h为6。在更多实施方式中，h为7。在其他实施方式中，h为8。在一些实施方式中，h为9。在其他实施方式中，h为10。在更多实施方式中，h为11。在其他实施方式中，h为12。
在式(II)的一些其他各种实施方式中，a和d相同。在一些其他实施方式中，b和c相同。在一些其他具体实施方式中，a和d相同，并且b和c相同。
式(II)中的a和b的总和以及c和d的总和是可以改变的因子，以获得具有期望性质的脂质。在一个实施方式中，选择a和b使得它们的总和为14至24的整数。在其他实施方式中，选择c和d使得它们的总和为14至24的整数。在进一步的实施方式中，a和b的总和以及c和d的总和是相同的。例如，在一些实施方式中，a和b的总和以及c和d的总和都是相同的整数，其可以在14至24的范围内。在更多实施方式中，选择a、b、c和d使得a和b的总和以及c和d的总和为12或更大。
式(II)的R1a、R2a、R3a和R4a的取代基没有特别限制。在一些实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是H。在某些实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a在每次出现时为H。在某些其他实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C12烷基。在某些其他实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C8烷基。在某些其他实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C6烷基。在一些前述实施方式中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(II)的某些实施方式中，R1a、R1b、R4a和R4b在每次出现时为C1-C12烷基。
在式(II)的进一步的实施方式中，R1b、R2b、R3b和R4b中的至少一个是H或R1b、R2b、R3b和R4b在每次出现时是H。
在式(II)的某些实施方式中，R1b与其键合的碳原子一起与相邻的R1b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键。在前述的其他实施方式中，R4b与其键合的碳原子一起与相邻的R4b一起并且与其键合的碳原子形成碳-碳双键。
式(II)的R5和R6处的取代基在前述实施方式中没有特别限制。在某些实施方式中，R5或R6中的一个是甲基。在其他实施方式中，R5或R6中的每一个是甲基。
式(II)的R7处的取代基在前述实施方式中没有特别限制。在某些实施方式中，R7是C6-C16烷基。在一些其他实施方式中，R7是C6-C9烷基。在这些实施方式的一些中，R7被-(C＝O)ORb、–O(C＝O)Rb、-C(＝O)Rb、-ORb、-S(O)xRb、-S-SRb、-C(＝O)SRb、-SC(＝O)Rb、-NRaRb、-NRaC(＝O)Rb、-C(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)NRaRb、-OC(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)ORb、-NRaS(O)xNRaRb、-NRaS(O)xRb或-S(O)xNRaRb取代，其中：Ra是H或C1-C12烷基；Rb是C1-C15烷基；并且x是0、1或2。例如，在一些实施方式中，R7被-(C＝O)ORb或-O(C＝O)Rb取代。
在式(II)的各种前述实施方式中，Rb是支链C1-C15烷基。例如，在一些实施方式中，Rb具有以下结构之一：
在式(II)的前述实施方式的某些其他实施方式中，R8或R9之一是甲基。在其他实施方式中，R8和R9均为甲基。
在式(II)的一些不同实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7元杂环。在前述的一些实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5-元杂环，例如吡咯烷基环。在前述的一些不同实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成6-元杂环，例如哌嗪基环。
在式(II)的前述脂质的其他实施方式中，G3是C2-C4亚烷基，例如C3亚烷基。
在各种不同的实施方式中，脂质化合物具有下表2中列出的结构之一。
表2
式(II)的代表性脂质
在一些实施方式中，LNP包含式(II)的脂质、核苷修饰的RNA和一种或多种选自中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质的赋形剂。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-9。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-10。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-11。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-12。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-32。
在一些其他实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有式(III)的结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2中的一个是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2中的另一个是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1和G2各自独立地为未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3为C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3为H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或–NR5C(＝O)R4；
R4为C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；和
x为0、1或2。
在式(III)的前述实施方式的一些中，脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)之一：
其中：
A是3至8元环烷基或亚环烷基环；
R6在每次出现时独立地为H、OH或C1-C24烷基；
n是1至15的整数。
在式(III)的前述实施方式的一些中，脂质具有结构(IIIA)，并且在其他实施方式中，脂质具有结构(IIIB)。
在式(III)的其他实施方式中，脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)之一：
其中y和z各自独立地为1至12的整数。
在任何式(II)的前述实施方式中，L1或L2中的一个是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个是-O(C＝O)-。在任何前述的一些不同实施方式中，L1和L2各自独立地为-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个是-(C＝O)O-。
在式(III)的一些不同实施方式中，脂质具有以下结构(IIIE)或(IIIF)之一：
在式(III)的前述实施方式的一些中，脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)之一：
在式(III)的前述实施方式的一些中，n是2至12的整数，例如2至8或2至4。例如，在一些实施方式中，n为3、4、5或6。在一些实施方式中，n为3。在一些实施方式中，n为4。在一些实施方式中，n为5。在一些实施方式中，n为6。
在式(III)前述实施方式的一些其他实施方式中，y和z各自独立地为2至10的整数。例如，在一些实施方式中，y和z各自独立地为4至9或4至6的整数。
在式(III)的前述实施方式的一些中，R6是H。在前述实施方式的其他实施方式中，R6是C1-C24烷基。在其他实施方式中，R6是OH。
在式(III)的一些实施方式中，G3是未取代的。在其他实施方式中，G3是取代的。在各种不同的实施方式中，G3是直链C1-C24亚烷基或直链C1-C24亚烯基。
在式(III)的一些其他前述实施方式中，R1或R2或两者是C6-C24烯基。例如，在一些实施方式中，R1和R2各自独立地具有以下结构：
其中：
R7a和R7b在每次出现时独立地为H或C1-C12烷基；和
a是2至12的整数，
其中各自选择R7a、R7b和a使得R1和R2各自独立地包含6-20个碳原子。例如，在一些实施方式中，a是5至9或8至12的整数。
在式(III)的前述实施方式的一些中，至少一次出现的R7a是H。例如，在一些实施方式中，R7a在每次出现时是H。在前述的其他不同实施方式中，至少一次出现的R7b是C1-C8烷基。例如，在一些实施方式中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(III)的不同实施方式中，R1或R2或两者具有以下结构之一：
在式(III)的前述实施方式的一些中，R3是OH、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NHC(＝O)R4。在一些实施方式中，R4是甲基或乙基。
在各种不同的实施方式中，式(III)的阳离子脂质具有下表3中列出的结构之一。
表3
式(III)的代表性化合物
在一些实施方式中，LNP包含式(III)的脂质、核苷修饰的RNA和一种或多种选自中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质的赋形剂。在一些实施方式中，式(III)的脂质是化合物III-3。在一些实施方式中，式(III)的脂质是化合物III-7。
在某些实施方式中，阳离子脂质以约30至约95mol％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约30至约70mol％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约40至约60mol％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约50mol％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，LNP仅包含阳离子脂质。
在某些实施方式中，LNP包含一种或多种另外的脂质，其在它们的形成期间稳定颗粒的形成。
合适的稳定脂质包括中性脂质和阴离子脂质。
术语“中性脂质”是指在生理学pH下以不带电或中性两性离子形式存在的许多脂质物质中的任何一种。代表性的中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
示例性的中性脂质包括，例如，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰卵磷脂(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一个实施方式中，中性脂质是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。
在一些实施方式中，LNP包含选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质。在各种实施方式中，阳离子脂质(例如，式(I)的脂质)与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1。
在各种实施方式中，LNP还包含类固醇或类固醇类似物。“类固醇”是包含以下碳骨架的化合物：
在某些实施方式中，类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在这些实施方式的一些中，阳离子脂质(例如，式(I)的脂质)与胆固醇的摩尔比为约2:1至1:1。
术语“阴离子脂质”是指在生理学pH下带负电的任何脂质。这些脂质包括磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)和与中性脂质连接的其他阴离子修饰基团。
在某些实施方式中，LNP包含糖脂(例如，单唾液酸神经节苷脂GM1)。在某些实施方式中，LNP包含甾醇，例如胆固醇。
在一些实施方式中，LNP包含聚合物缀合的脂质。术语“聚合物缀合的脂质”是指包含脂质部分和聚合物部分的分子。聚合物缀合的脂质的实例是聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化脂质是本领域已知的，并且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-s-DMG)等。
在某些实施方式中，LNP包含另外的稳定化脂质，其是聚乙二醇-脂质(聚乙二醇化脂质)。合适的聚乙二醇-脂质包括PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG-修饰的磷脂酸、PEG-修饰的神经酰胺(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG-修饰的二烷基胺、PEG-修饰的二酰基甘油、PEG-修饰的二烷基甘油。代表性的聚乙二醇-脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA和PEG-s-DMG。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是PEG-c-DOMG)。在其他实施方式中，LNP包含聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)，例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)例如4-O-(2’,3’-二(十四烷酰基氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯例如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。在各种实施方式中，阳离子脂质与聚乙二醇化脂质的摩尔比为约100:1至约25:1。
在一些实施方式中，LNP包含具有以下结构(IV)的聚乙二醇化脂质：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R10和R11各自独立地为含有10至30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链，其中烷基链可选被一个或多个酯键中断；且
z的平均值范围为30至60。
在聚乙二醇化脂质(IV)的一些前述实施方式中，当z为42时，R10和R11不都是正十八烷基。在一些其他实施方式中，R10和R11各自独立地为含有10至18个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方式中，R10和R11各自独立地为含有12至16个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方式中，R10和R11各自独立地为含有12个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方式中，R10和R11各自独立地为含有14个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在其他实施方式中，R10和R11各自独立地为含有16个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在更多的实施方式中，R10和R11各自独立地为含有18个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在另一些实施方式中，R10为含有12个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链，并且R11为含有14个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。
在各种实施方式中，z跨越选择的范围，使得(II)的PEG部分具有约400至约6000g/mol的平均分子量。在一些实施方式中，平均z为约45。
在其他实施方式中，聚乙二醇化脂质具有以下结构之一：
其中n是选择的整数，使得聚乙二醇化脂质的平均分子量为约2500g/mol。
在某些实施方式中，另外的脂质以约1至约10mol％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，另外的脂质以约1至约10mol％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，另外的脂质以约1mol％或约1.5mol％存在于LNP中。
在一些实施方式中，LNP包含式(I)的脂质、核苷修饰的RNA、中性脂质、星状和聚乙二醇化脂质。在一些实施方式中，式(I)的脂质是化合物I-6。在不同的实施方式中，中性脂质是DSPC。在其他实施方式中，类固醇是胆固醇。在其他实施方式中，聚乙二醇化脂质是化合物IVa。
在某些实施方式中，LNP包含一种或多种靶向部分，其能够将LNP靶向细胞或细胞群。例如，在一个实施方式中，靶向部分是配体，其将LNP引导至细胞表面上发现的受体。
在某些实施方式中，LNP包含一个或多个内化结构域。例如，在一个实施方式中，LNP包含一个或多个结构域，其结合细胞以诱导LNP的内化。例如，在一个实施方式中，一个或多个内化结构域与细胞表面上发现的受体结合，以诱导LNP的受体介导的摄取。在某些实施方式中，LNP能够在体内结合生物分子，其中LNP结合的生物分子然后可被细胞表面受体识别以诱导内化。例如，在一个实施方式中，LNP结合全身性ApoE，其导致LNP和相关货物的摄取。
其他示例性LNP及其制造在本领域中有所描述，例如在美国专利申请公开号US20120276209，Semple等人，2010，Nat Biotechnol.,28(2):172-176；Akinc等人,2010,Mol Ther.,18(7):1357-1364；Basha等人,2011,Mol Ther,19(12):2186-2200；Leung等人,2012,J Phys Chem C Nanomater Interfaces,116(34):18440-18450；Lee等人,2012,IntJ Cancer.,131(5):E781-90；Belliveau等人,2012,Mol Ther nucleic Acids,1:e37；Jayaraman等人,2012,Angew Chem Int Ed Engl.,51(34):8529-8533；Mui等人,2013,MolTher Nucleic Acids.2,e139；Maier等人,2013,Mol Ther.,21(8):1570-1578；和Tam等人,2013,Nanomedicine,9(5):665-74中所述，其中每一个都通过引用其全部内容并入。
以下反应方案说明制备式(I)、(II)或(III)的脂质的方法。
一般反应方案1
式(I)的脂质(例如，化合物A-5)的实施方式可根据一般反应方案1(“方法A”)制备，其中R为饱和的或不饱和的C1-C24烷基或饱和的或不饱和的环烷基，m为0或1，并且n为1至24的整数。参考一般反应方案1，结构A-1的化合物可以从商业来源购买或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。用DCC处理A-1、A-2和DMAP的混合物，得到溴化物A-3。溴化物A-3、碱(例如N,N-二异丙基乙胺)和N,N-二甲基二胺A-4的混合物在足以在任何必要的后处理和/或纯化后产生A-5的温度和时间下加热。
一般反应方案2
式(I)的化合物(例如，化合物B-5)的其他实施方式可根据一般反应方案2(“方法B”)制备，其中R为饱和的或不饱和的C1-C24烷基或饱和的或不饱和的环烷基，m为0或1，并且n为1至24的整数。如一般反应方案2所示，结构B-1的化合物可以从商业来源购买或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。用酰氯B-2(1当量)和碱(如，三乙胺)处理B-1(1当量)溶液。用氧化剂(例如氯铬酸吡啶)处理粗产物，回收中间产物B-3。然后，用还原剂(例如，三乙酰氧基硼氢化钠)处理粗B-3，酸(例如，乙酸)和N,N-二甲基氨基胺B-4的溶液，以在任何必要的后处理和/或纯化之后获得B-5。
应当注意，尽管起始材料A-1和B-1在上面描述为仅包括饱和亚甲基碳，但是包括碳-碳双键的起始材料也可用于制备包括碳-碳双键的化合物。
一般反应方案3
式(I)的脂质(例如，化合物C-7或C9)的不同实施方式可根据一般反应方案3(“方法C”)制备，其中R为饱和的或不饱和的C1-C24烷基或饱和的或不饱和的环烷基，m为0或1，并且n为1至24的整数。参考一般反应方案3，结构C-1的化合物可以从商业来源购买或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。
一般反应方案4
式(II)化合物(例如，化合物D-5和D-7)的实施方式可根据一般反应方案4(“方法D”)制备，其中R1a、R1b、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5、R6、R8、R9、L1、L2、G1、G2、G3、a、b、c和d如本文所定义，并且R7’代表R7R7或C3-C19烷基。参考一般反应方案1，结构D-1和D-2的化合物可以从商业来源购买或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。用还原剂(例如，三乙酰氧基硼氢化钠)处理D-1和D-2的溶液以在任何必要的后处理后得到D-3。在任何必要的后处理和/或纯化后，用酰氯D-4(或羧酸和DCC)处理D-3和碱(例如，三甲胺、DMAP)的溶液，得到D-5。在任何必要的后处理和/或纯化后，可以用LiAlH4D-6还原D-5以得到D-7。
一般反应方案5
式(II)的脂质(例如，化合物E-5)的实施方式可根据一般反应方案5(“方法E”)制备，其中R1a、R1b、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5、R6、R7、R8、R9、L1、L2、G3、a、b、c和d如本文所定义。参考一般反应方案2，结构E-1和E-2的化合物可以从商业来源购买或根据本领域普通技术人员熟悉的方法制备。在任何必要的后处理之后，加热E-1(过量)、E-2和碱(例如，碳酸钾)的混合物以获得E-3。在任何必要的后处理和/或纯化后，用酰氯E-4(或羧酸和DCC)处理E-3和碱(例如，三甲胺、DMAP)的溶液，得到E-5。
一般反应方案6
一般反应方案6提供了用于制备式(III)的脂质的示例性方法(方法F)。一般反应方案6中的G1、G3、R1和R3如本文对式(III)所定义，并且G1'是指G1的一个碳短同系物。根据本领域已知的方法购买或制备结构F-1的化合物。在适当的缩合条件(例如，DCC)下，F-1与二醇F-2反应得到酯/醇F-3，然后可将其(例如，PCC)氧化成醛F-4。在还原胺化条件下F-4与胺F-5的反应产生式(III)的脂质。
应注意，用于制备式(III)的脂质的各种替代策略可用于本领域普通技术人员。例如，其中L1和L2不是酯的式(III)的其他脂质可以使用适当的起始原料根据类似方法制备。此外，一般反应方案6描述了式(III)的脂质的制备，其中G1和G2相同；然而，这不是本发明的必需方面，并且对上述反应方案的修改可以产生其中G1和G2不同的化合物。
本领域技术人员应理解，在本文所描述的方法中，中间体化合物的官能团可能需要通过合适的保护基团保护。这些官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。合适的羟基保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。适用于氨基、脒基和胍基的保护基包括叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等。合适的巯基保护基包括-C(O)-R″(其中R”是烷基、芳基或芳基烷基)、p-甲氧基苄基、三苯甲基等。合适的羧酸保护基包括烷基、芳基或芳烷基酯。可以根据标准技术添加或去除保护基团，其是本领域技术人员已知的并且如本文所描述。保护基团的使用详细描述于Green,T.W.and P.G.M.Wutz,Protective Groups in OrganicSynthesis(1999),3rd Ed.,Wiley中。如本领域技术人员所理解的，保护基团也可以是聚合物树脂，例如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。
药物组合物
本文所描述的药物组合物的制剂可通过药理学领域已知或以后开发的任何方法制备。通常，这种制备方法包括将活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分结合的步骤，然后，如果必要或需要，将产品成型或包装成期望的单剂量或多剂量单位。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合于对人类进行伦理施用的药物组合物，但本领域技术人员将理解，这样的组合物通常适合施用于各种动物。适合于对人施用的药物组合物的改性以使组合物适于施用于各种动物是很好理解的，并且普通技术的兽医药理学家可以仅通过普通的(如果有的话)实验来设计和进行这种改性。预期对其施用本发明药物组合物的受试者包括但不限于人和其他灵长类动物、哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，例如非人灵长类动物、牛、猪、马、绵羊、猫和狗。
可用于本发明的方法的药物组合物可以适于眼用、口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺、鼻内、颊、静脉内、脑室内、皮内、肌内或另一种施用途径的制剂形式制备、包装或销售。其他预期的制剂包括预计纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫原性的制剂。
本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量大量制备、包装或销售。如在本文中所使用的，“单位剂量”是离散量的包含预定量的活性成分的药物组合物。活性成分的量通常等于活性成分的剂量，其将施用于受试者或这种剂量的方便部分，诸如例如这种剂量的一半或三分之一。
本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的载体和任何附加成分的相对量将根据所治疗的受试者的身份、体型和病症而变化，并且还取决于施用组合物的途径。举例来说，组合物可包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。
除活性成分外，本发明的药物组合物还可包含一种或多种另外的药物活性剂。
可以使用常规技术制备本发明药物组合物的控释或持续释放制剂。
如在本文中所使用的，药物组合物的“肠胃外施用”包括任何施用途径，其特征在于受试者组织的物理破坏和通过组织中的破口施用药物组合物。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物施用药物组合物，通过手术切口施用组合物，通过组织穿透性非手术伤口施用组合物等。特别地，预期肠胃外施用包括但不限于眼内、玻璃体内、皮下、腹膜内、肌肉内、皮内、胸骨内注射、肿瘤内、静脉内、脑室内和肾透析输注技术。
适于胃肠外施用的药物组合物的制剂包含活性成分与药学上可接受的载体，例如无菌水或无菌等渗盐水的组合。这种制剂可以适于推注施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可以单位剂量形式制备、包装或销售可注射制剂，例如安瓿或含有防腐剂的多-剂量容器。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于，悬浮液、溶液、油性或水性载体中的乳液、糊剂和可植入的缓释或可生物降解的制剂。这种制剂可进一步包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方式中，活性成分以干燥(即，粉末或颗粒)形式提供，用于在肠胃外施用重构组合物之前用合适的载体(例如，无菌无热原水)重构。
药物组合物可以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。该悬浮液或溶液可根据已知技术配制，并且除了活性成分外，还可包含另外的成分，例如本文所描述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。这种无菌可注射制剂可以使用无毒-肠胃外-可接受的稀释剂或溶剂，例如水或1,3-丁二醇制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于，林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油，例如合成的甘油单酯-或甘油二酯。其他可用于肠胃外施用的制剂包括含有微晶形式的活性成分、脂质体制剂或可生物降解的聚合物体系的组分的那些制剂。用于持续释放或植入的组合物可包含药学上可接受的聚合或疏水材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
本发明的药物组合物可以适于通过颊腔的肺部施用的制剂形式制备、包装或销售。这样的制剂可以包含干燥颗粒，其包含活性成分并且其直径范围为约0.5至约7纳米。在某些实施方式中，制剂可以包含干燥颗粒，其包含活性成分并且其直径范围为约1纳米至约6纳米。这种组合物通常是干粉形式，用于使用包含干粉储库的装置施用，可向该干粉储库引导推进剂流以分散粉末或使用自-推进溶剂/粉末-分配容器如包含溶解或悬浮在密封容器中的低沸点推进剂中的活性成分的装置。在某些实施方式中，这种粉末包含颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒具有大于0.5纳米的直径，并且按数量计至少95％的颗粒具有小于7纳米的直径。在某些实施方式中，按重量计至少95％的颗粒具有大于1纳米的直径，并且按数量计至少90％的颗粒具有小于6纳米的直径。在某些实施方式中，干粉组合物包括固体细粉末稀释剂，例如糖，并且以单位剂型方便地提供。
低沸点推进剂通常包括在大气压下沸点低于65°F的液体推进剂。通常，推进剂可占组合物的50至99.9％(w/w)，并且活性成分可占组合物的0.1至20％(w/w)。推进剂可进一步包含另外的成分，例如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或固体稀释剂(在某些情况下具有与包含活性成分的颗粒相同等级的粒度)。
适于胃肠外施用的药物组合物的制剂包含活性成分与药学上可接受的载体，例如无菌水或无菌等渗盐水的组合。这种制剂可以适于推注施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可以单位剂量形式制备、包装或销售可注射制剂，例如安瓿或含有防腐剂的多剂量容器。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于，悬浮液、溶液、油性或水性载体中的乳液、糊剂和可植入的缓释或可生物降解的制剂。这种制剂可进一步包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方式中，活性成分以干燥(即，粉末或颗粒)形式提供，用于在肠胃外施用重构组合物之前用合适的载体(例如，无菌无热-原水)重构。
药物组合物可以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。该悬浮液或溶液可根据已知技术配制，并且除了活性成分外，还可包含另外的成分，例如本文所描述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。这种无菌可注射制剂可以使用无毒-肠胃外-可接受的稀释剂或溶剂，例如水或1,3-丁二醇制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于，林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油，例如合成的甘油单酯-或甘油二酯。其他可用于肠胃外施用的制剂包括含有微晶形式的活性成分、脂质体制剂或可生物降解的聚合物体系的组分的那些制剂。用于持续释放或植入的组合物可包含药学上可接受的聚合或疏水材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
如在本文中所使用的，“另外的成分”包括但不限于以下一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；制粒和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理可降解的组合物，如明胶；水性载体和溶剂；油性载体和溶剂；悬浮剂；分散剂或润湿剂；乳化剂、缓和剂；缓冲区；盐；增稠剂；填料；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合或疏水材料。可以包括在本发明的药物组合物中的其他“另外的成分”是本领域已知的并且描述于例如雷明顿药物科学(1985,Genaro,ed.,MackPublishing Co.,Easton,PA)中，其是通过引用并入本文。
治疗方法
本发明提供了在受试者中诱导针对ZIKV的适应性免疫应答的方法，包括施用有效量的包含一种或多种编码一种或多种ZIKV抗原的分离的核酸的组合物。
在一个实施方式中，该方法提供受试者对ZIKV、ZIKV感染或与ZIKV相关的疾病或病症的免疫力。因此，本发明提供了治疗或预防与ZIKV相关的感染、疾病或病症的方法。
在一个实施方式中，将组合物施用于患有与ZIKV相关的感染、疾病或病症的受试者。在一个实施方式中，将组合物施用于有发展与ZIKV相关的感染、疾病或病症的风险的受试者。例如，可以将组合物施用给有风险与ZIKV接触的受试者。在一个实施方式中，将组合物施用于住在、旅行或预期前往ZIKV普遍存在的地理区域的受试者。在一个实施方式中，将组合物施用于与居住、旅行或预期前往ZIKV普遍存在的地理区域的另一个人接触或预期与之接触的受试者。在一个实施方式中，将组合物施用给通过其职业或性接触有意识地暴露于ZIKV的受试者。截至2016年，其中ZIKV流行的示例性地理区域包括但不限于南美洲、中美洲、加勒比海、波多黎各和佛罗里达州。
在一个实施方式中，将组合物施用于怀孕或可能怀孕的受试者，以预防受试者的胚胎、胎儿或未出生的孩子中与ZIKV相关的感染、疾病或病症。例如，在某些实施方式中，该组合物在受试者的胚胎、胎儿或未出生的孩子中诱导针对ZIKV的免疫应答。
在一个实施方式中，该方法包括施用包含一种或多种核苷修饰的核酸分子的组合物，其编码一种或多种ZIKV抗原和一种或多种佐剂。在一个实施方式中，该方法包括施用包含编码一种或多种ZIKV抗原的第一核苷修饰的核酸分子和编码一种或多种佐剂的第二核苷修饰的核酸分子的组合物。在一个实施方式中，该方法包括施用包含编码一种或多种ZIKV抗原的一种或多种核苷修饰的核酸分子的第一组合物，和施用包含编码一种或多种佐剂的一种或多种核苷修饰的核酸分子的第二组合物。
在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用编码多种ZIKV抗原、佐剂或其组合的多个核苷修饰的核酸分子。
在某些实施方式中，本发明的方法允许在施用后持续表达本文所描述的ZIKV抗原或佐剂至少数天。在某些实施方式中，本发明的方法允许在施用后持续表达本文所描述的ZIKV抗原或佐剂至少2周。在某些实施方式中，本发明的方法允许在施用后持续表达本文所描述的ZIKV抗原或佐剂至少1个月。然而，在某些实施方式中，该方法还提供瞬时表达，如在某些实施方式中，核酸未整合到受试者基因组中。
在某些实施方式中，该方法包括施用核苷修饰的RNA，其提供本文所描述的ZIKV抗原或佐剂的稳定表达。在一些实施方式中，核苷修饰的RNA的施用导致很少甚至没有先天免疫应答，同时诱导有效的适应性免疫应答。
在某些实施方式中，该方法提供针对ZIKV的持续保护。例如，在某些实施方式中，该方法提供针对ZIKV的持续保护超过2周。在某些实施方式中，该方法提供针对ZIKV的持续保护1个月或更长时间。在某些实施方式中，该方法提供针对ZIKV的持续保护2个月或更长时间。在某些实施方式中，该方法提供针对ZIKV的持续保护3个月或更长时间。在某些实施方式中，该方法提供针对ZIKV的持续保护4个月或更长时间。在某些实施方式中，该方法提供针对ZIKV的持续保护5个月或更长时间。在某些实施方式中，该方法提供针对ZIKV的持续保护6个月或更长时间。在某些实施方式中，该方法提供针对ZIKV的持续保护1年或更长时间。
在一个实施方式中，组合物的单次免疫诱导针对ZIKV的持续保护1个月或更长时间、2个月或更长时间、3个月或更长时间、4个月或更长时间、5个月或更长时间、6个月或更长时间、或1年或者更长时间。
可以使用本领域已知的方法以多种不同方式实现在治疗方法中施用本发明的组合物。在一个实施方式中，本发明的方法包括对受试者的全身施用，包括例如肠内或肠胃外施用。在某些实施方式中，该方法包括皮内递送组合物。在另一个实施方式中，该方法包括静脉内递送组合物。在一些实施方式中，该方法包括肌肉内递送组合物。在一个实施方式中，该方法包括皮下递送组合物。在一个实施方式中，该方法包括吸入组合物。在一个实施方式中，该方法包括鼻内递送组合物。
应当理解，本发明的组合物可以单独或与另一种药剂联合施用给受试者。
因此，本发明的治疗和预防方法包括使用编码本文所描述的ZIKV抗原、佐剂或其组合的药物组合物来实施本发明的方法。可以施用可用于实施本发明的药物组合物以递送1ng/kg/天和100mg/kg/天的剂量。在一个实施方式中，本发明设想施用剂量，其导致哺乳动物中的本发明化合物的浓度为10nM和10μM。
通常，可以本发明的方法施用给哺乳动物(例如，人)的剂量范围为每千克哺乳动物的体重的量为0.01μg至约50mg，而施用的精确剂量将根据任何数量的因素变化，包括但不限于哺乳动物的类型和受治疗的疾病类型、哺乳动物的年龄和施用途径。在某些实施方式中，化合物的剂量为每千克哺乳动物体重为约0.1μg至约10mg。在某些实施方式中，剂量将为每千克哺乳动物体重约1μg至约1mg。
该组合物可以每天数次的频率施用给哺乳动物，或者可以较不频繁地施用，例如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或甚至更少的频率，例如每几个月一次或甚至一年一次或更少。剂量的频率对于技术人员来说是显而易见的，并且取决于任何数量的因素，例如但不限于所治疗疾病的类型和严重程度、哺乳动物的类型和年龄等。
在某些实施方式中，本发明的免疫原性组合物或疫苗的施用可以通过单次施用进行或通过多次施用来增强。
在一个实施方式中，本发明包括一种方法，包括施用一种或多种编码本文所描述的一种或多种ZIKV抗原或佐剂的组合物。在某些实施方式中，该方法具有累加效应，其中施用组合的总体效果大约等于施用每种ZIKV抗原或佐剂的效果的总和。在其他实施方式中，该方法具有协同效应，其中施用组合的总体效果大于施用每种ZIKV抗原或佐剂的效果的总和。
实验实验例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不旨在是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应该被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
无需进一步描述，认为本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实施例制造和利用本发明并实施所要求保护的方法。因此，以下工作实施例不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：通过单一低剂量核苷修饰的mRNA疫苗接种的寨卡病毒保护
本文证明，使用脂质纳米颗粒包裹的核苷修饰的mRNA(mRNA-LNP)进行单次低剂量皮内免疫，其编码2013ZIKV爆发菌株的前膜和包膜(prM-E)糖蛋白，引发小鼠和非人灵长类动物中的有效和持久的中和抗体应答。用30μg的核苷修饰的ZIKV mRNA-LNP免疫在疫苗接种后2周或5个月保护小鼠免受ZIKV激发，并且单剂量50μg足以保护非人灵长类动物在疫苗接种后5周免受激发。这些数据表明，核苷修饰的mRNA-LNP引发快速和持久的保护性免疫，因此代表了全球抗击ZIKV的新的且有前景的疫苗候选物。
现在描述这些实验中采用的方法和材料。
抗体试剂
使用泛黄病毒(pan-flavivirus)鼠单克隆抗体4G2，克隆D1-4G2-4-15(EMDMillipore MAB10216)通过蛋白质印迹检测ZIKV E蛋白。以下抗体用于流式细胞术：抗-CD4PerCP/Cy5.5(克隆GK1.5，Biolegend)、抗-CD3APC-Cy7(克隆145-2C11，BDBiosciences)、抗-CD27PE(克隆LG.3A10，BD Biosciences)、抗-TNF-αPE-Cy7(克隆MP6-XT22，BD Biosciences)、抗-IFN-γAF700(克隆XMG1.2，BD Biosciences)、抗-IL-2APC(克隆JES6-5H4，BD Biosciences)。LIVE/DEAD可固定水死细胞染色试剂盒(LifeTechnologies)用于鉴别死细胞和碎片。以下抗体用于ELISA测定：山羊抗小鼠IgGHRP(Sigma 4416)、山羊抗猴IgG HRP(Sigma 2054)和ZIKVE蛋白结合mAb NR-4747克隆E19(BEI Resources)。
蛋白质试剂
纯化的重组ZIKV E蛋白(Aalto Bioreagents AZ 6312)用于ELISA以检测E蛋白特异性IgG，在蛋白质印迹中作为阳性对照并且在小鼠脾细胞刺激中。
mRNA产生
使用编码密码子优化的(Thess等人,2015,Mol Ther,23:1456-1464)ZIKV菌株H/PF/2013(GenBank：KJ776791)prM-E糖蛋白的线性化质粒(pTEV-ZIKVprM-E-A101)上的T7RNA聚合酶，如前所描述产生mRNA(Pardi等人,2013,Methods Mol Biol,969,29-42)。mRNA转录成含有101个核苷酸长的聚(A)尾部。使用1-甲基假尿苷-5'-三磷酸(TriLink)代替UTP来产生修饰的含核苷的mRNA。使用具有2'-O-甲基转移酶的m7G加帽试剂盒将mRNA加帽以获得cap1，并通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)方法纯化，如(Weissman等人,2013,Methods Mol Biol,969:43-54)所描述。通过琼脂糖凝胶电泳分析mRNA，并在-20℃下冷冻保存。
细胞培养
人胚胎肾(HEK)293T细胞(ATCC)在补充有2mM的L-谷氨酰胺(Life Technologies)和10％胎牛血清(FCS)(HyClone)(完全培养基)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中培养。在ATCC接收之后并且在扩增和冷冻保存之前检查293T细胞系的支原体污染。如(Kariko等人,2008,Mol Ther,16:1833-1840)所描述的，从单核细胞产生人树突细胞(huDC)，并且在补充50μg/ml重组人GM-CSF和100μg/ml重组人IL-4(R&D systems)的含有2mM的L-谷氨酰胺(Life Technologies)和10％胎牛血清(FCS)(HyClone)(完全培养基)的RPMI 1640培养基中生长。通过每3天添加含有IL-4和GM-CSF的新鲜培养基维持细胞，并在第7天使用。从获自动物股骨的骨髓细胞产生鼠树突细胞(muDC)，并在补充有50μg/ml鼠GM-CSF(R&D systems)的完全培养基中生长。通过每3天添加含有鼠GM-CSF的新鲜培养基维持细胞，并在第7天使用。
mRNA转染
根据制造商的说明用TransIT-mRNA(Mirus Bio)进行人和鼠DC和HEK 293T细胞的转染：在17μl的无血清培养基中将mRNA(0.3μg)与反式IT-mRNA试剂(0.34μl)和增强试剂(0.22μl)合并，并将复合物加入到183μl的完全培养基中的2×105个细胞中。收集上清液，并在转染后18小时在RIPA缓冲液(Sigma)中在冰上裂解细胞1小时。
包膜蛋白表达的蛋白质印迹分析
通过非变性SDS-PAGE蛋白质印迹测定来自ZIKV prM-E转染细胞的全细胞裂解物和上清液的ZIKV E蛋白。将样品与4x Laemmli缓冲液(Bio-Rad)合并，并在4-15％预制聚丙烯酰胺标准TGX凝胶(Bio-Rad)上在200V下分离45分钟。使用半干装置进行PVDF膜的转移(Ellard Instrumentation,Ltd.)在10V下持续1小时。用含有0.5％吐温-20的TBS缓冲液中的5％脱脂奶粉封闭膜。使用1:10,000 4G2腹水检测E蛋白1小时，然后用二次山羊抗小鼠IgG HRP 1:10,000检测1小时。在室温下在封闭缓冲液中进行抗体孵化。使用LuminataForte底物(Millipore)和KodakX-OMAT 1000A处理器将印迹显影。进行至少2次独立实验。
上清液中的E蛋白的表征
测试用ZIKV prM-E mRNA转染的HEK 293T细胞的上清液是否可以用去污剂沉淀和破坏E蛋白，与亚病毒颗粒一致。将上清液在单独的PBS中或含有0.5％Triton X-100的PBS中在冰上孵化1小时。然后，将样品在Beckman TLA-55转子中以42,000rpm旋转2.5小时。然后从沉淀中取出上清液，将其重悬于50μl的PBS中。然后，通过蛋白质印迹分析等体积的输入、沉淀和离心后上清液级分，如本文其他地方所述。
mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)制剂
使用自组装过程将FPLC纯化的mRNA和聚胞苷酸(聚(C)RNA)(Sigma)包封在LNP中，其中pH 4.0的mRNA水溶液与溶解在乙醇中的脂质溶液快速混合(Maier)等人,2013,MolTher,21:1570-1578)。本研究中使用的LNP的成分与之前描述的那些相似(Maier等人,2013,MolTher,21:1570-1578；Jayaraman等人,2012,Angew Chem Int Ed Engl,51:8529-8533)，其含有可电离的阳离子脂质(所有权属于Acuitas)/磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-脂质(50:10:38.5:1.5mol/mol)，并在RNA与总脂质比为约0.05(wt/wt)下包封。使用ZetasizerNano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Uk)仪器通过动态光散射测量它们的直径为约80nm。将RNA-LNP制剂在-80℃下以约1μg/μl的RNA浓度储存。
向小鼠和恒河猴施用LNP
小鼠：8周龄的雌性BALB/c和C57BL/6小鼠购自查尔斯河实验室，并将小鼠的笼子随机分配到组中。功率分析用于计算所有动物组的大小，以确保统计学上显著的结果。将mRNA-LNP在PBS中稀释，并用3/10cc291/2G胰岛素注射器(BD Biosciences)皮内注射到动物中。使用下背部的四个注射部位(每个30μl)。
猴：将氯胺酮麻醉的动物背部剃毛并注射在PBS中稀释的mRNA-LNP。使用10个注射部位(每个60μl)。将相似年龄和体重的动物随机指定为剂量组。
从小鼠和恒河猴采集血液
小鼠：在异氟烷麻醉下从眼眶窦收集血液。将血液以13,000rpm离心10分钟，并将血清储存在-20℃并用于ELISA和病毒中和测定。收集EDTA-血浆以分离RNA用于qRT-PCR分析。
猴：在氯胺酮麻醉下通过股静脉穿刺收集血液，收集血清和EDTA-血浆并储存在-80℃下用于ELISA、中和分析，并分离RNA用于qRT-PCR。
脾细胞的刺激和染色
在完全培养基中制备来自脾脏的单细胞悬浮液。将脾细胞在PBS中洗涤一次，并以2×107细胞/ml重悬于完全培养基中。使用2μg/ml纯化的重组ZIKV病毒E蛋白在37℃下刺激每个样品的2×106个细胞(100μl)6小时。将Golgi Plug(布雷菲德菌素A，BD Biosciences)和Golgi Stop(莫能菌素，BD Biosciences)分别在完全培养基中以1:100和1:143稀释，并将来自两种稀释试剂的20μl加入到每个样品中以抑制1小时后细胞内细胞因子的分泌。包括每只动物的未刺激样品。将PMA(10ng/ml)-离子霉素(250ng/ml)(Sigma)刺激的样品用作阳性对照。
刺激后，将细胞在PBS中洗涤并使用LIVE/DEAD可固定水死细胞染色试剂盒(LifeTechnologies)染色，然后对CD4和CD27进行表面染色。将抗体与细胞在室温下孵化30分钟。表面染色后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤，并根据制造商的说明使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BDBiosciences)进行固定。固定后，将细胞在合适的perm缓冲液中洗涤，并与抗CD3、TNF-α、IFN-γ和IL-2的抗体在室温下孵化1小时。染色后，用适当的烫发缓冲液洗涤细胞，固定(含有1％多聚甲醛的PBS)并在4℃下储存直至分析。结果从一个技术重复获得。
流式细胞术
在改良的LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)上分析脾细胞。每个样本收集了十万个事件。在创建每个函数的门之后，使用布尔门平台来创建可能的细胞因子组合的完整阵列，在测试三个函数时等同于七个响应模式。通过从用E蛋白刺激的百分比阳性细胞中减去百分比阳性未刺激细胞来表达数据。
ZIKV E特异性IgG的酶联免疫吸附测定(ELISA)
将Immulon 4HXB ELISA板用6μg/ml纯化的重组ZIKV E蛋白在0.1M的碳酸氢钠缓冲液中于4℃包被过夜。将板用PBS中的2％BSA封闭1小时，并用洗涤缓冲液(含有0.05％吐温-20的PBS)洗涤三次。将小鼠或恒河猴猕猴血清在封闭缓冲液中稀释，并在板上在室温下孵化1小时，然后进行四次洗涤。将二次抗体HRP缀合物在封闭缓冲液中以1:10,000稀释，并在平板上孵化1小时，然后进行四次洗涤。将TMB底物(KPL)施加到板上，并用2当量硫酸终止反应。使用MRX Revelation酶标仪在450nm下测量吸光度。以两种方式分析ZIKV E蛋白特异性IgG：作为终点稀释效价，定义为血清的最高倒数稀释度，使OD大于背景OD加0.01单位的总和；并且作为绝对IgG浓度的估计，其基于作为标准的鼠mAb Nr-4747(仅适用于小鼠样品)。所有样品至少在技术副本中运行。
ZIKV MR-766蚀斑减少中和试验(PRNT)
ZIKV株MR-766(非洲谱系，乌干达，1947年，GenBank：AY632535)(UTMB虫媒病毒参考收集)在Vero细胞(ATCC CCL-81)中产生，并将50个噬斑形成单位与增加稀释的不含血清的DMEM(Corning)培养基中的热灭活血清在37℃下孵化1小时。将病毒/血清混合物(200μl)以6孔格式加入到Vero细胞的汇合单层中，并在37℃下以间歇摇动孵化1.5小时。然后，将含有最终浓度为0.5％甲基纤维素(4,000厘泊)(Sigma)、1X DMEM(Gibco)、16mM的HEPES、0.56％的碳酸氢钠、1.6X GlutaMAX(Gibco)、1X青霉素/链霉素(Corning)和4μg/ml两性霉素B(Gibco)的3ml的覆盖层加入每个孔中，并将板在37℃选，在5％CO2中孵化5天。吸出覆盖层并固定细胞并用0.5％结晶紫(Sigma)在25％甲醇、75％去离子水中染色。用去离子水冲洗孔以显现噬斑。通过绘制穿过50％抑制的曲线的线性部分的线并计算感染的50％中和所需的血清的倒数稀释来确定中和效价(EC 50)。EC50效价报告为一次或两次技术重复的平均值，并且低于检测限的值报告为检测限的一半。
ZIKV MEX I-44聚焦减少中和试验(FRNT)
ZIKV MEX I-44(亚洲谱系，墨西哥，2016年，GenBank：KX856011)库存通过在Vero76(ATCC CRL-1587)细胞中繁殖产生，并作为澄清的细胞培养物裂解物/上清液收获。通过标准聚焦形成测定法定量库存效价。通过将标准剂量的ZIKV与两倍连续稀释的热灭活血清在37℃下组合1小时来进行FRNT。然后，将病毒-血清混合物(100μl)接种到Vero 76单层上，在37℃下孵化1小时，并用含有微晶纤维素(FMC Biopolymer)的生长培养基覆盖。孵化后3天，将板福尔马林固定、透化、封闭，并通过用生物素-缀合的mAb 4G2(ATCC HB-112)、链霉亲和素-HRP(BDBiosciences)和TrueBlue过氧化物酶底物(KPL)的顺序孵化染色。并行验证病毒输入(可接受的范围：20-60焦点)。FRNT50(EC50效价)报告为最高倒数稀释，给出焦点计数≤50％中和截止值，并计算技术重复的几何平均值。
报告子病毒颗粒(RVP)产生
通过表达GFP的WNV亚基因组复制子与编码病毒结构蛋白的质粒(衣壳-prM-E)的互补产生假感染性RVP(Dowd等人,2016,Cell Rep,16:1485-1491；Pierson等人,2006,Virology,346:53-65)。简略地，ZIKVMR-766和ZIKV H/PF/2013RVP通过使用Lipofectamine3000按照制造商的方案(Invitrogen)共转染HEK-293T细胞与结构基因和复制子质粒(质量比为3:1)来生产。将转染的细胞在30℃下孵化，并在第3-6天收获含有RVP的上清液。将原料通过0.2μm的过滤器，将等分试样储存在-80℃下直至使用。通过用连续稀释的过滤的RVP上清液感染Raji-DCSIGNR细胞来确定库存效价。在感染后48小时通过流式细胞术和计算的RVP效价评价GFP阳性细胞。
RVP中和测定
将先前滴定的RVP稀释以确保在剂量-反应曲线上的信息点处的抗体过量，并与小鼠或猕猴血清的连续稀释液在37℃下孵化1小时以允许稳态结合。然后在重复技术复制物中用抗体-RVP复合物感染Raji-DCSIGNR细胞。感染在37℃下进行，并且24-48小时后通过流式细胞术检测GFP阳性感染的细胞。通过非线性回归分析中和结果，以估计感染的半最大中和所需的血清的倒数稀释度(EC50效价)(Prism 6，GraphPad)。将血清的初始稀释度(基于RVP、细胞和血清的最终体积)设定为测定的置信限度。预测非线性回归低于该阈值的效价被报告为置信度限度的一半。单个EC50效价报告为至少2次技术重复的几何平均值。
激发ZIKV病毒的制备
小鼠：在Vero CCL81细胞中生长激发ZIKV株PRVABC59(亚洲谱系，波多黎各，2016，GenBank：KU501215)(BEI Resources NR-50240)。在10ml无血清DMEM培养基中将75-90％融汇的T175烧瓶用ZIKV的MOI接种。将烧瓶在37℃，5％CO2下孵化1.5小时，间歇轻轻摇动，然后将加热介质添加至最终体积为25ml中的最终浓度的1.5％FCS，1XGlutaMAX(Gibco)和1X青霉素/链霉素(Corning)。将烧瓶孵化4天或直至可见细胞病变效应。然后，收集上清液并在Sorvall SureSpin 630转子中在4℃下以20,000rpm超离心1小时。除去上清液，将沉淀重悬于1ml的无血清DMEM中，等分，并储存在-80℃下。在激发前，将病毒解冻并在PBS中稀释至2,000PFU/ml。
猴：在Vero76CRL-1587细胞中生长激发ZIKV株PRVABC59。使用80-85％融汇的T150烧瓶进行繁殖。用在4ml的补充有10％FCS(Gibco)、10％磷酸胰蛋白胨肉汤(SigmaAldrich)，1X青霉素/链霉素(Gibco)和L-谷氨酰胺(Gibco)的新鲜L-15培养基(Gibco)中稀释的100μl的储备病毒进行感染，并在室温下吸附1小时，每15分钟轻轻搅拌一次。每个烧瓶在吸附后接受7ml的新鲜L-15培养基，并在37℃下孵化4天。通过在Eppendorf A-4-62转子中在4℃以1,200rpm离心5分钟除去细胞碎片。将病毒原液等分并储存在-80℃下。
在小鼠和恒河猴中的寨卡病毒激发
小鼠：疫苗接种后2或20周，对小鼠放血，然后用在100μl的PBS中的200PFU的ZIKV-PR(PRVABC59)静脉内激发。在激发后3、5和7天收集血液以确定血浆中的病毒载量(ZIKVRNA拷贝/ml)。
猴：用氯胺酮麻醉猕猴，并用104TCID50的ZIKV-PR在PBS中以1ml的体积皮下注射到大腿后部。在激发后1、3、5和7天收集血液以确定血浆中的病毒载量(ZIKV RNA拷贝/ml)。
病毒载量定量(qRT-PCR)
使用盲法样品，使用QIAamp MinElute Virus旋转试剂盒(Qiagen)从200μl(猕猴)或50μl(小鼠)血浆中分离RNA。使用SensiFAST探针Lo-ROX One-Step试剂盒(Bioline BIO-78005)在7500实时PCR系统(Applied Biosystems)上使用提取的RNA进行扩增。设计引物和探针以扩增来自ZIKV BeH815744的衣壳基因的保守区域，如下：Fwd：GGAAAAAAGAGGCTATGGAAATAATAAAG(SEQ ID NO:3)；Rev:CTCCTTCCTAGCATTGATTATTCTCA(SEQID NO:4)；探针：AGTTCAAGAAAGATCTGGCTG(SEQ ID NO:5)。使用引物和探针，终浓度为2μM，并运行以下程序：48℃持续30分钟，95℃持续10分钟，然后40个循环的95℃持续15秒和60℃下1分钟。猕猴的测定灵敏度为50拷贝/ml，并且小鼠样品的测定灵敏度为200拷贝/ml。结果至少从两个技术重复计算。
统计分析
使用GraphPad Prism 5.0f进行Mann-Whitney和Kruskal-Wallis(用Dunn校正)测试，分别比较接种疫苗和对照小鼠以及不同剂量组的猕猴的免疫应答。使用SPICE 5.35和Microsoft Excel软件进行学生t检验以比较接种疫苗和对照小鼠中的T细胞应答。
现在描述实验结果。
mRNA已成为一种有前景的新疫苗形态，其可引发强效免疫反应(综述于Weissman,2015,Expert Rev Vaccines,14:265-281和Sahin等人,2014,Nat Rev Drug Discov,13:759-780)，同时避免与一些活病毒疫苗相关的安全风险和抗载体免疫(综述于Minor,2015,Virology,479-480:379-392中)。与其他疫苗平台相比，用mRNA的疫苗接种提供了几个优点：(I)它是非感染性基因载体，其可以很容易地设计为高效表达任何蛋白质，(II)mRNA不整合到宿主基因组中，(III)它具有成本效益和高度可规模制造的潜力，和(IV)小剂量足以诱导保护性免疫应答。
本文提出了一种新型强效抗ZIKV疫苗的设计，其中ZIKV H/PF/2013的prM-E糖蛋白(来自French Polynesia的亚洲谱系分离株，2013)(Baronti等人，2014，GenomeAnnounc，2)由含有修饰核苷1-甲基假尿苷(m1Ψ)的mRNA编码，其防止先天免疫感知并增加体内mRNA翻译(Andries等人,2015,J Control Release,217:337-344)。核苷酸修饰的ZIKVprM-EmRNA被配制用于脂质纳米颗粒(LNP)中的疫苗接种，其已证实在体内介导有效和延长的蛋白质表达(Pardi等人,2015,J Control Release,217:345-351)。对ZIKV和其他黄病毒的研究表明，prM和E蛋白的共表达足以组装和分泌亚病毒颗粒(Dowd等人,2016,Science,354:237-240；Wang等人,2009,PLoS One 4:e8325)。编码ZIKV prM-E的mRNA首先通过转染HEK 293T细胞和人和鼠树突细胞(DC)进行体外表征(图5A)。ZIKVE蛋白由所有三种细胞类型产生，并分泌到293T细胞的上清液中(图5B和图6)。研究了DC是否也分泌E蛋白以及它是否迅速内吞，正如HIV gag所提出的那样(Weissman等人,2000,J Immunol,165:4710-4717)。为了测试293T细胞上清液中的E蛋白是否表现出亚病毒颗粒的特性，将转染上清液进行超速离心并探测输入物、沉淀物和所得的E蛋白上清液部分。当与PBS孵化时，将从293T细胞分泌的所有E蛋白沉淀，但不与0.5％TritonX-100一起，与prM-E mRNA的颗粒产生一致(Wang等人,2009,PLoS One4:e8325)(图5C)。
首先在C57BL/6小鼠中评价由核苷修饰的ZIKV mRNA-LNP疫苗诱导的免疫应答。用30μg的ZIKV prM-E mRNA-LNP或聚(C)RNA-LNP(阴性对照)对动物进行皮内(i.d.)免疫。在注射部位未观察到炎症或其他不良事件。基于接种后第2周的ZIKV E蛋白刺激的脾细胞的细胞内IFN-γ、TNF-α和IL-2产生，检测多功能E蛋白特异性CD4+T细胞应答(图1A和图7)。ZIKV E特异性血清IgG在ZIKV mRNA接种的小鼠中快速发展，并在第8-12周稳定至180,000(约90μg/ml)的终点效价(图1B和图8A)。使用两种独立的测定法测量抗ZIKV中和抗体(NAb)：标准菌斑还原中和试验(PRNT)和ZIKV报告基因病毒颗粒(RVP)测定(Dowd等人,2016,Science,354:237-240)。针对ZIKV MR-766(非洲谱系，乌干达，1947)的平均PRNT50效价在第8周达到约1,300的峰值(图1C)并且相对稳定，在第12周仅降低2倍。针对ZIKV H/PF/2013的平均RVP NAb效价(EC50)在第8周和第12周达到约105(图1D)。相对于PRNT，RVP测定中的较高中和效价的检测与之前ZIKV中和测定的比较一致(Dowd等人,2016,Science,354:237-240)。此外，注意到RVP与PRNT效价的比不是固定的，并且随动物模型和病毒原种而变化。
接着在BALB/c小鼠中评价相同剂量的核苷修饰的ZIKV prM-EmRNA-LNP的免疫原性。E-特异性血清IgG在第8周达到峰值并在第12周和第20周之间保持稳定(终点效价约200,000；90-130μg/ml)(图1E和图8B)。PRNT50NAb在第16周增加至最大值1,300并且保持稳定直至第20周(图1F)。RVP NAb效价在第8周升至50,000并且在第20周之前保持在20,000以上(图1G)。
在用30μg的核苷修饰的ZIKV prM-E mRNA-LNP或聚(C)RNA-LNP免疫的BALB/c小鼠中进行激发研究。用200只噬斑形成单位(PFU)的ZIKV PRVABC59(亚洲谱系，Puerto Rico，2015)在免疫后第2周(短期)或第20周(长期)静脉内(i.v.)激发小鼠。在短期保护研究中，9只对照小鼠中有8只在第3天出现病毒血症，中位峰值为约14,000拷贝/ml。对所有ZIKVmRNA免疫的小鼠(n＝9)进行保护免受可检测的病毒血症(图2A)。在长期研究中，所有对照小鼠(n＝5)在第3天显示病毒血症，中值峰值为1,200拷贝/ml，而ZIKV mRNA免疫小鼠(n＝10)在测试的任何时间点都没有病毒血症(图2B)。这些数据表明，用核苷修饰的ZIKVprM-EmRNA-LNP进行的单次免疫在小鼠中引发了对异源ZIKV菌株的可检测的病毒血症的持久保护。
接下来，在恒河猴(Macaca mulatta)中评价核苷修饰的ZIKVmRNA-LNP疫苗的功效，恒河猴是一种非人类灵长类物种，它概括了人类中ZIKV感染的几个特征(Dudley等人,2016,Nat Commun 7,12204)。通过皮内注射剂量600μg，200μg或50μg的ZIKVprM-E mRNA-LNP免疫猕猴。与小鼠相似，在注射部位未观察到炎症或其他不良事件。所有三种疫苗剂量均有效诱导E蛋白特异性IgG和NAb，组间无统计学显著差异。到第4周，所有组中的终点IgG效价升至>300,000并且维持在≥100,000直至第12周(图3A)。针对MR-766的PRNT50Nab效价在第2周达到约400的峰值(图10A)，并且在第4周至第12周稳定在约200。为了便于比较实验室中的NAb效价，在PRNT测定中显示了人抗-ZIKV中和mAbA3594的中和曲线(图9)。通过调焦中和试验(FRNT)获得的具有与PRNT类似的格式的NAb效价在第2周和第4周针对ZIKV MEXI-44(亚洲谱系，墨西哥，2016)稳定在约400(图3B)。RVP测定显示针对H/PF/2013的NAb效价在第2周为约100,000且在第4周为约17,000(图3C)，并且在第4周针对MR-766的效价为约3,000(图10B)。亚洲和非洲谱系病毒的中和与之前的报告一致，证明仅存在一种ZIKV血清型(Dowd等人,2016,Cell Rep,16:1485-1491)。在任何测定中，核苷修饰的ZIKV prM-EmRNA-LNP疫苗对抗体反应缺乏显著的剂量依赖性影响(Kruskal-Wallis检验，p>0.05)表明低剂量50μg(约0.02mg/kg)足以或可能绰绰有余，以在猕猴中诱导强大的抗ZIKV免疫力。
将104TCID50的ZIKV-PRVABC59通过皮下(s.c.)注射到5只接种疫苗的动物和6只未接种疫苗的对照动物中(表4)，在第5周激发恒河猴。所有对照动物均被感染，中值峰值血浆病毒血症为7,000的ZIKV RNA拷贝/ml(图4)。相反，接种疫苗的猕猴受到高度保护，不受ZIKV感染。五只动物中的四只-包括三只接受50μg的最低剂量的动物和一只接受200μg的中等剂量的动物-在所有时间点都被完全保护，没有可检测的病毒血症(<50拷贝/ml)。
表4：接种和激发实验中的恒河猴的特征。星号表示用ZIKV激发的动物。
在本报告中，证明用核苷修饰的ZIKV prM-E mRNA-LNP进行的单次低剂量皮内免疫在小鼠和恒河猴中均具有保护作用，并且比最近报道的多种ZIKV疫苗候选物的单次免疫引发更高的NAb反应，包括纯化的灭活病毒(PIV)和编码prM-E或ME的质粒DNA疫苗(Larocca等人,2016,Nature,536:474-478；Abbink等人,2016,Science,353,1129-1132；Dowd等人,2016,Science,354,237-240)。在小鼠中，PRNT50NAb在几个月内稳定增加，比用PIV或DNA疫苗单次免疫诱导的水平高50-100倍(Larocca等人,2016,Nature,536:474-478；Dowd等人,2016,Science,354,237-240)。ZIKV mRNA-LNP疫苗为小鼠提供了完整、快速和持久的保护，其保持至少5个月，并且可能更长，因为NAb效价稳定。小鼠激发研究还表明，与25周龄小鼠相比，ZIKV PRVABC59在8周龄BALB/c小鼠中更有效地复制(p＝0.02，曼-惠特尼检验)，当使用激发病毒库存的两个相同的等分试样和剂量时。先前的报告显示，免疫活性小鼠的ZIKV相关死亡率在1至4周龄之间降低(Lazear等人,2016,Cell Host Microbe,19:720-730)，但成年小鼠的ZIKV复制尚未得到很好的描述。该结果可能与未来在小鼠中的ZIKV疫苗测试和对ZIKV发病机制的理解有关。
在恒河猴中，使用具有相同的阳性对照的由相同的实验室运行的相同的实验，用50μg的ZIKV prM-E mRNA-LNP进行的单次免疫诱导RVPNab效价，其比1次1mg DNA疫苗的免疫接种诱导的效价高50倍，并且比两次DNA免疫诱导的效价高2倍以上(Dowd等人,2016,Science,354,237-240)。ZIKV mRNA-LNP NAb效价可与在猕猴中一次注射PIV或RhAd52ZIKV疫苗引发的那些重叠，尽管不同的测定形式阻止了精确比较。与病毒载体疫苗相反，mRNA-LNP不诱导抗载体免疫，并且可以重复施用而不丧失免疫原性。由ZIKV mRNA-LNP在猕猴中引发的FRNTnAb效价在免疫后12周维持在稳定水平，表明保护可能是持久的。
本文引用的各个和每个专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用其全部内容并入本文。虽然已经参考具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计出本发明的其他实施方式和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学理事会
德鲁.韦斯曼（Weissman, Drew）
诺贝特.帕尔迪（ Pardi, Norbert）
迈克尔.霍根（Hogan, Michael）
<120> 用于诱导针对寨卡病毒的免疫应答的核苷修饰的RNA
<130> 046483-6154-00-WO.607149
<150> US 62/444,931
<151> 2017-01-11
<160> 5
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 2094
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 化学合成的
<400> 1
atggccataa gtggagtccc ggtgctagga ttcttcatca tagccgtgct gatgagcgcg 60
caggaatcat gggccgccga ggtgacgaga cgggggagcg catactacat gtacttggac 120
agaaacgacg ccggggaggc catatccttc ccaaccacat tggggatgaa caagtgttac 180
atacagatca tggacctggg acacatgtgc gacgccacca tgagctacga atgccctatg 240
ctggacgagg gggtggaacc agacgacgtc gactgctggt gcaacacgac gtcaacttgg 300
gtggtgtacg gaacctgcca ccacaaaaaa ggcgaagcac ggagatcgag acgggccgtg 360
acgctcccct cccactccac gaggaagctg caaacgcggt cgcaaacctg gttggaatca 420
agagaataca caaagcactt gatcagagtc gaaaactgga tattcaggaa ccctggcttc 480
gcgttagcag cagccgccat cgcttggctg ttgggaagct caacgagcca aaaagtcata 540
tacttggtca tgatactgct gatcgccccg gcatacagca tcaggtgcat aggagtcagc 600
aacagggact tcgtggaagg gatgtcaggc gggacctggg tggacgtggt cttggaacac 660
ggagggtgcg tcaccgtaat ggcacaggac aaaccgacgg tcgacataga gctggttaca 720
acaacagtca gcaacatggc ggaggtaaga tcctactgct acgaggcatc aatatcggac 780
atggcgtcgg acagccgctg cccaacacaa ggcgaagcct acctggacaa gcaatcagac 840
acgcaatacg tctgcaaaag aacgttagtg gacagaggct ggggaaacgg atgcggactg 900
ttcggcaaag ggagcctggt gacatgcgcc aagttcgcat gctccaagaa aatgaccggg 960
aagagcatcc agccagagaa cctggagtac cggataatgc tgtcagtgca cggctcccag 1020
cacagcggga tgatcgtgaa cgacacagga cacgaaacgg acgagaacag agcgaaggtg 1080
gagataacgc ccaactcacc aagagccgaa gccaccctgg ggggcttcgg aagcctagga 1140
ctggactgcg aaccgaggac aggcctcgac ttctcagact tgtactactt gacgatgaac 1200
aacaagcact ggttggtgca caaggagtgg ttccacgaca tcccattacc ttggcacgcc 1260
ggggcagaca ccggaacgcc acactggaac aacaaagaag cactggtaga gttcaaggac 1320
gcacacgcca aaaggcaaac ggtcgtggtc ctagggagcc aagaaggagc agtgcacacg 1380
gccctggccg gagcgctgga ggccgagatg gacggggcaa agggaaggct gtcctccggc 1440
cacttgaaat gccgcctgaa aatggacaaa ctgagattga agggcgtgtc atactccttg 1500
tgcaccgcag cgttcacatt caccaagatc ccggcggaaa cactgcacgg gacagtcaca 1560
gtggaggtac agtacgcagg gacagacgga ccgtgcaagg tgccagcgca gatggcggtg 1620
gacatgcaaa ccctgacccc agtcgggagg ttgataaccg cgaaccccgt aatcacggaa 1680
agcaccgaga actcgaagat gatgctggaa ctcgatccac cattcgggga ctcgtacatc 1740
gtcataggag tcggggagaa gaagatcacc caccactggc acaggagcgg cagcaccatc 1800
ggaaaagcat tcgaagccac ggtgagaggg gccaagagaa tggcagtctt gggagacaca 1860
gcctgggact tcggatcagt cggaggcgcg ctcaactcat tgggcaaggg catccaccaa 1920
atcttcggag cagctttcaa atcattgttc ggaggaatgt cctggttctc acaaatcctc 1980
atcggaacgt tgctgatgtg gttggggctg aacacaaaga acggatcgat ctccctgatg 2040
tgcttggcct tagggggagt gttgatcttc ttatccacag cggtctccgc gtaa 2094
<210> 2
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 化学合成的
<400> 2
Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val
1 5 10 15
Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala Ala Glu Val Thr Arg Arg Gly
20 25 30
Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Asp Arg Asn Asp Ala Gly Glu Ala Ile
35 40 45
Ser Phe Pro Thr Thr Leu Gly Met Asn Lys Cys Tyr Ile Gln Ile Met
50 55 60
Asp Leu Gly His Met Cys Asp Ala Thr Met Ser Tyr Glu Cys Pro Met
65 70 75 80
Leu Asp Glu Gly Val Glu Pro Asp Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn Thr
85 90 95
Thr Ser Thr Trp Val Val Tyr Gly Thr Cys His His Lys Lys Gly Glu
100 105 110
Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr Arg
115 120 125
Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr
130 135 140
Lys His Leu Ile Arg Val Glu Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe
145 150 155 160
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ile Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser
165 170 175
Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr
180 185 190
Ser Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met
195 200 205
Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val
210 215 220
Thr Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr
225 230 235 240
Thr Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala
245 250 255
Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu
260 265 270
Ala Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr
275 280 285
Leu Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly
290 295 300
Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly
305 310 315 320
Lys Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val
325 330 335
His Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu
340 345 350
Thr Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg
355 360 365
Ala Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu
370 375 380
Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn
385 390 395 400
Asn Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu
405 410 415
Pro Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys
420 425 430
Glu Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val
435 440 445
Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly
450 455 460
Ala Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly
465 470 475 480
His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val
485 490 495
Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala
500 505 510
Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr
515 520 525
Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr
530 535 540
Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu
545 550 555 560
Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly
565 570 575
Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His
580 585 590
Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val
595 600 605
Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe
610 615 620
Gly Ser Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln
625 630 635 640
Ile Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe
645 650 655
Ser Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Met Trp Leu Gly Leu Asn Thr
660 665 670
Lys Asn Gly Ser Ile Ser Leu Met Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Leu
675 680 685
Ile Phe Leu Ser Thr Ala Val Ser Ala
690 695
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 化学合成的
<400> 3
ggaaaaaaga ggctatggaa ataataaag 29
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 化学合成的
<400> 4
ctccttccta gcattgatta ttctca 26
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 化学合成的
<400> 5
agttcaagaa agatctggct g 21

Claims (33)

1.一种用于在受试者中诱导针对寨卡病毒(ZIKV)的免疫应答的组合物，该组合物包含至少一种编码至少一种ZIKV抗原的分离的核苷修饰的RNA。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种分离的核苷修饰的RNA包含假尿苷。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种分离的核苷修饰的RNA包含1-甲基-假尿苷。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种分离的核苷修饰的RNA是纯化的核苷修饰的RNA。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种ZIKV抗原包含至少一种选自由以下各项组成的组的ZIKV抗原：包膜(E)蛋白、膜前(prM)蛋白、膜(M)蛋白和衣壳(C)蛋白。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述至少一种ZIKV抗原包含prM和E蛋白。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种ZIKV抗原包含来自MHC II类的信号肽。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种ZIKV抗原包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种核苷修饰的RNA包含含有SEQ IDNO:1的核苷酸序列。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种核苷修饰的RNA进一步编码至少一种佐剂。
12.根据权利要求1所述的组合物，还包含脂质纳米颗粒(LNP)。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述至少一种核苷修饰的RNA包封在所述LNP内。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是疫苗。
15.一种在受试者中诱导针对寨卡病毒(ZIKV)的适应性免疫应答的方法，包括向所述受试者施用有效量的包含至少一种编码至少一种ZIKV抗原的核苷修饰的RNA的组合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种分离的核苷修饰的RNA包含假尿苷。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种分离的核苷修饰的RNA包含1-甲基-假尿苷。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种分离的核苷修饰的RNA是纯化的核苷修饰的RNA。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种ZIKV抗原包含至少一种选自由以下各项组成的组的ZIKV抗原：包膜(E)蛋白、膜前(prM)蛋白、膜(M)蛋白和衣壳(C)蛋白。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种ZIKV抗原包含prM和E蛋白。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种ZIKV抗原包含来自MHC II类的信号肽。
22.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种ZIKV抗原包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种核苷修饰的RNA包含含有SEQ IDNO:1的核苷酸序列。
24.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的佐剂。
25.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一种核苷修饰的RNA进一步编码至少一种佐剂。
26.根据权利要求15所述的方法，其中所述组合物还包含脂质纳米颗粒(LNP)。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述至少一种核苷修饰的RNA包封在所述LNP内。
28.根据权利要求15所述的方法，其中所述组合物是疫苗。
29.根据权利要求15所述的方法，其中所述组合物是通过选自皮内、皮下、吸入、鼻内和肌内的递送途径施用的。
30.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法包括单次施用所述组合物。
31.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法包括多次施用所述组合物。
32.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法治疗或预防所述受试者中的与ZIKV相关的感染、疾病或病症。
33.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法治疗或预防所述受试者的未出生婴儿中的与ZIKV相关的感染、疾病或病症。
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