KR20030052857A - 대장균 발현 재조합 3ａｂｃ 비구조단백질 및단클론항체를 이용한 구제역 진단방법 - Google Patents
대장균 발현 재조합 3ａｂｃ 비구조단백질 및단클론항체를 이용한 구제역 진단방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 구제역 바이러스(Foot-and-Mouth Disease Virus; FMDV) O/SKR/2000유래의 대장균 발현 재조합 3ABC 비구조단백질(Non-Structural Protein; NSP) 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론 항체를 이용한 구제역의 진단방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 구제역 바이러스의 3ABC 비구조단백질을 코딩하는 유전자를 대장균에서 발현시켜 제조한 재조합 3ABC 비구조단백질 항원 및 3ABC 비구조단백질에 특이적인 단클론항체를 제조하고 이를 이용한 효소결합면역측정법을 실시함으로써 백신접종축과 야외감염축을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는 구제역의 진단방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 구제역 바이러스(Foot-and-Mouth Disease Virus; FMDV) O/SKR/200 유래의 대장균 발현 재조합 3ABC 비구조단백질(Non-Structural Protein; NSP) 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론 항체를 이용한 구제역의 진단방법에 관한 것이다.더욱 상세하게는, 본 발명은 구제역 바이러스의 3ABC 비구조단백질을 코딩하는 유전자를 대장균에서 발현시켜 제조한 재조합 3ABC 비구조단백질 항원 및 3ABC 비구조단백질에 특이적인 단클론항체를 제조하고 이를 이용한 효소결합면역측정법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA)을 실시함으로써 백신접종축과 야외감염축을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는 구제역의 진단방법에 관한 것이다.
구제역(Foot-and-Mouth Disease)은 소, 돼지, 양, 염소, 사슴 등 발굽이 둘로 갈라진 동물(우제류)에 감염되는 전염성이 매우 강한 질병으로 최근 영국을 비롯하여 전세계적으로 발생하고 있는 질병이다. 감염 초기에는 입술, 혀, 잇몸, 코, 발굽 사이에 수포가 생기고 체온이 급격히 상승하며 식욕이 저하되다가 결국 급성폐사에 이르게 된다 구제역 바이러스는 치사율이 55%에 이르는 국제수역사무국(OIE) 분류 A급 질병으로서, 우리나라에서도 제 1종의 가축전염병이다. 특히, 구제역 바이러스에 대한 감수성 동물이 많고 바이러스형이 많으면서도 서로간의 교차반응이 일어나지 않아, 신속한 진단 및 처치가 없으면 축산업에 막대한 피해를 준다. 따라서, 구제역 발생국의의 경우 무역규제 대상국가가 되므로 구제역은 국가 경제에 막대한 피해를 일으키는 바이러스이다.
구제역에 대한 최초의 발병보고는 1514년 이태리의 수도승 히로니머스 프래카 스토리우스(Hironymus Fracastorius)에 의하여 베로나(Verona) 지방의 소에서 발생하였으며, 전염성이 강한 질병으로 기록되어 있다.
뢰플러(Loeffler)와 프로쉬(Frosch)에 의하여 1897년 최초로 발견된 구제역바이러스(Foot-and-Mouth Disease Virus; FMDV)는 미생물 분류상 피코르나바이러스과(Family Picornaviridae), 아프토바이러스속(Genus Aphthovirus)에 속하고, O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1 등 7개 타입의 주요 혈청형이 있으며 70여 종 이상의 아형이 알려져 있다. 구제역 바이러스는 약 7,800개의 염기로 구성된 (+) 단쇄 RNA 바이러스로서, pH7.4∼pH7.6에서는 안정하나, pH6 이하의 산성 또는 pH9.5 이상의 알칼리성에서는 급격히 파괴된다. 구제역 바이러스는 뉴클레오캡시드(neucleocapsid)를 구성하는 네 개의 주요한 구조단백질(Structural Protein; SP) VP1, VP2, VP3 및 VP4를 갖고 있으며, 중화항체의 생산을 유도하는 최소한 4개 이상의 주요 항원결정기(epitope)를 갖고 있음이 알려져 있다. 이 구조단백질 외에 감염세포내에서 주로 발현되는 폴리펩티드로 바이러스 증식에 보조적인 기능들을 수행하는 것으로 알려진[Gene,(1994)12(16):6587-6601] L, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D와 같은 비구조단백질(Non-Structural Protein; NSP)도 갖고 있다. 본 발명의 국내발생 구제역 바이러스(O/SKR/2000) 역시 상기 구제역 바이러스의 일반적 특징을 공유하며 7813base의 염기로 구성된 바이러스이다.
한편, 구제역 바이러스를 세포배양한 후 뉴클레오캡시드인 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 상층액에서 정제하고 농축한 후 백신으로 사용하는 경우, 이에 대한 특이항체는 생산되나, 비구조단백질은 백신접종축에서는 검출되지 않고 야외감염축에 한하여 뉴클레오캡시드 단백질 생성으로부터 2∼5일 이후에 검출되는 것으로 보고되었다[Vaccine, (1998)16(5)446-459,Arch Virol, (1997)142:2021-2033,Arch Virol, (1998)143:1461- 1476,Arch Virol, (2000)145: 473-489]. 현재 사용중인구제역 예방백신은 바이러스 입자만을 정제한 후 사용하고 있어, 감염세포내에서 발현되는 비구조단백질은 함유하고 있지 않아 백신을 접종한 동물에서는 비구조단백질에 대한 항체가 생기지 않게 된다. 이러한 점 이외에도, 비구조단백질은 구조단백질에 비해 훨씬 변이가 적어 여러 혈청형에서 동일한 항원 결정기를 가지고 있다는 장점 때문에, 구제역 비구조단백질을 베큘로바이러스 또는 기타 대장균 발현 시스템에서 발현시켜 이용함으로써 다양한 혈청형에서의 감염축 확인은 물론 구제역 예방백신 접종축과 야외감염축을 감별할 수 있는 방법에 대한 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있다.
현재 구제역 바이러스의 진단법으로는 수포액, 수포형성 상피세포 또는 인후두부위 채취액 등을 검사시료로 하여 세포배양을 이용한 구제역 바이러스의 분리, 중합효소연쇄반응(PCR)법을 이용한 구제역 바이러스 특이 유전자 검출방법 및 항원검출용 보체결합반응 또는 ELISA 검사법 등이 이용되고 있으며, 가검 동물의 혈액을 채취하여 혈청내에 구제역 바이러스에 대한 항체가 형성되었는지의 여부를 검출하는 항체 검사용 ELISA 검사법, 항체 중화시험 등도 이용되고 있다. 면역학적인 원리를 이용한 이와 같은 방법들은 빠른 시간내에 많은 수의 시료를 검색할 수 있다는 면에서 매우 유용하지만 불완전하여 보완이 절실히 필요하며, 구제역 야외감염축과 백신접종축을 정확하게 감별할 수 있는 국제적으로 공인된 검사방법은 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 특별한 기술없이 단시간내에 수행가능하고 특이성 및민감성이 높은 진단법으로 알려진 효소결합면역측정법(ELISA)을 이용한 구제역 진단방법에 대해 연구한 결과, 구제역 바이러스 혈청형에 따라 항원결정기의 변이가 심한 구조단백질 대신에 서로 다른 혈청형에서도 일정한 항원 결정기를 갖는 3ABC 비구조단백질 코딩 유전자를 대장균 발현 시스템에서 발현시켜 제조한 FMDV O/SKR/2000 재조합 3ABC 비구조단백질 항원 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용한 ELISA법으로 구제역을 진단할 경우, 백신접종축과 야외감염축을 손쉽고 정확하게 감별할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 대장균 발현 재조합 3ABC 비구조단백질 항원과 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 작성하고 이를 이용한 ELISA를 실시함으로써 특별한 시설 및 기술없이 구제역 백신접종축과 야외감염축을 감별하여 진단할 수 있는 구제역 진단방법을 제공하는데 있다.
도 1은 국내분리 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 비구조단백질을 코딩하는 유전자의 염기 및 아미노산 서열이다.
도 2는 국내분리 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 3ABC 비구조단백질 유전자가 클로닝된 대장균 발현 벡터의 작성 모식도이다.
도 3은 본 발명 단클론항체를 사용하여 개발된 간접 경쟁적인 효소결합면역측정법의 수행 모식도이다.
도 4는 본 발명 3ABC 비구조단백질 항원 및 단클론항체를 이용한 효소결합면역측정법의 수행 모식도이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 구제역 진단방법은 대장균에서 발현된 재조합 3ABC 구제역 비구조단백질 항원 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용한 효소결합면역측정법으로 구제역 바이러스에 대한 항체를 검출하여 구제역을 진단함을 특징으로 한다.
본 발명의 "3ABC 비구조단백질"은 구제역 바이러스 게놈상의 3A, 3B, 3C를 코딩하는 유전자가 통합 발현되어 나타나는 비구조단백질을 의미한다.
본 발명의 방법에 의하여, 구제역 바이러스에 대한 감염 여부의 진단은 보다 신속하고 정확하게 수행될 수 있으며, 특히 비구조단백질 항원을 검출에 이용함으로써 구제역 백신접종군과 야외감염군의 감별이 가능해진다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
효소결합면역측정법을 이용한 본 발명 구제역 진단방법은,
(1) 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 코팅 완충용액으로 희석하고 플레이트에 분주한 후 부착시키는 단계;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 세척하여 제거하는 단계;
(3) 상기 (2)의 플레이트에 검사하고자 하는 가검 혈청을 반응시키는 단계;
(4) 상기 (3)에서 재조합 3ABC 비구조단백질 항원에 결합하지 않은 가검 혈청을 세척하여 제거하는 단계;
(5) 3ABC 단백질 특이 단클론항체를 반응시키는 단계;
(6) 상기 (5)에서 결합하지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계;
(7) 3ABC 단백질 특이 단클론항체에 결합하는 콘쥬게이트를 반응시키는 단계;
(8) 상기 (7)에서 결합하지 않는 콘쥬게이트를 세척하여 제거하는 단계;
(9) 상기 콘쥬게이트에 결합하는 물질이 효소인 경우, 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정하고; 형광물질인 경우, 형광광도를 측정하며; 방사선 물질인 경우, 방사선 방출량을 측정함으로써, 가검 혈청 중의 구제역 바이러스 항체가를 측정하는 단계;
를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 ELISA에 의한 구제역 진단방법이며 상기의 과정은 도 5에 모식화하였다. 이러한 ELISA법에 사용되는 실험과정, 시약 및 반응조건은 종래 당업계에 통상적으로 알려져 있는 것을 이용할 수 있다.
상기의 방법 이외에도, ELISA를 이용한 본 발명 구제역 진단방법은;
(1) 3ABC 비구조단백질에 대한 단클론항체를 코팅 완충용액으로 희석하고 플레이트에 분주한 후 부착시키는 단계;
(2) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계;
(3) 상기 (2)의 플레이트에 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 반응시키는 단계;
(4) 상기 (3)에서 부착되지 않은 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 세척하여 제거하는 단계;
(5) 상기 (4)의 플레이트에 검사하고자 하는 가검 혈청을 반응시키는 단계;
(6) 상기 (5)에서 제조합 3ABC 비구조단백질 항원에 결합하지 않은 가검 혈청을 세척하여 제거하는 단계;
(7) 효소, 방사선물질, 또는 형광물질 등이 부착되어 있고 상기 (5)의 가검 혈청 중의 구제역 바이러스에 대한 항체에 대하여 특이적으로 결합하는 콘쥬게이트를 반응시키는 단계;
(8) 상기 콘쥬게이트에 결합하는 물질이 효소인 경우, 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정하고; 형광물질인 경우, 형광광도를 측정하며; 방사선 물질인 경우, 방사선 방출량을 측정함으로써, 가검 혈청 중의 구제역 바이러스 항체가를 측정하는 단계;
를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 ELISA에 의한 구제역의 진단방법이며, 상기의 과정은 도 6에 모식화하였다. 이러한 ELISA법에 사용되는 실험과정, 시약 및 반응조건은 종래 당업계에 통상적으로 알려져 있는 것을 이용할 수 있다.
상기 방법의 단클론항체를 사용한 효소결합면역측정법은 항원에 특이적인 단클론항체를 작성하여 사용하기 때문에 그 민감도 및 정확도가 매우 뛰어나며, 항원으로 사용한 3ABC 단백질이 구제역 바이러스의 7가지 혈청형에 관계없이 공통으로 발현되는 비구조단백질이기 때문에 이를 항원으로 이용할 경우 각기 다른 혈청형의 구제역 바이러스에 대한 감염여부에 대하여 신속한 진단이 가능하다는 이점이 있다. 또한, 비구조단백질 항원에 대한 항체는 백신접종축에서는 발현되지 않고 야외감염된 경우에 한하여 발현되기 때문에 이를 이용할 경우 백신접종축과 야외감염축을 정확하게 감별할 수 있는 이점이 있다. 특히, 비구조단백질중 3ABC 단백질은 구제역 바이러스에 의한 야외 감염동물에서 강한 면역반응을 유도하는 것으로 보고되어 있다[Vaccine, (1998) 16(5)446-459].
본 발명에서는 한국에서의 구제역 검역을 효과적으로 수행하기 위하여, 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 유전자를 획득하고(Gene Bank Access number AF377945), 이 유전자를 주형으로 한 PCR을 실시하여 한국산 FMDV O/SKR/2000 유래의 3ABC 비구조단백질을 코딩하는 유전자를 획득하였다.
한국산 구제역 바이러스 O/SK/2000 유래의 3ABC 비구조단백질의 발현을 위하여, 상기 유전자를 대장균 또는 곤충세포 발현 벡터에 클로닝할 수 있다. 발현 벡터, 제한효소, 시약 및 반응조건은 당업계에 통상적으로 알려져 있는 것을 이용할수 있다.
3ABC 비구조단백질을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 대장균 또는 곤충세포에서 발현시켜 구제역 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 작성할 수 있다.
대장균 발현 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 일반적으로 동물에 면역하고 이로부터 분리한 면역 세포를 계속적인 세포증식을 위한 암세포종과 융합시킴으로써 하이브리도마 세포주를 작성하고 이로부터 발현되는 재조합 3ABC 비구조단백질 특이 단클론항체를 작성할 수 있다. 상기 하이브리도마는 당업계에 통상적인 방법에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 재조합 3ABC 비구조단백질 항원 특이 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 예로는, 생명공학 연구소 유전자은행에 2001년 12월 14일자로 기탁된 3F-11(KCTC 10138 BP) 있다.
이하, 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위가 이들에 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며 이에 대한 것도 본원 발명의 범위에 포함됨을 밝혀둔다.
실시예 1 : 한국산 FMDV O/SKR/2000 유래의 재조합 3ABC 비구조단백질 작성
본 발명의 국내분리 구제역 바이러스 O/SKR/2000는 국내 감염우의 타액 및 조직에서추출한 것을 사용하였고, 베큘로바이러스는 아우토그라파 캘리포니아 뉴클리어 폴리 헤드로시스 바이러스[Autographa californica nuclear polyhedrosis virus DNA (AcNPV, Clontech)]를 사용하였으며, 재조합 바이러스는 스포도프테라프루지페라 [Spodoptera frugiperda; Sf-9, Invitrogen)] 세포주에서 배양하여 사용하였다. Sf-9 세포주는 10% 태아송아지혈청 (Fetal Calf Serum; FCS)과 안티바이오틱-안티마이코틱(Antibioctic-antimycotic, Gibco)을 첨가한 그레이스 배지(Grace's media)에서 24∼27℃ 저온 항온기에서 배양한 후 사용하였다.
대장균 발현 벡터는 말토오즈 결합 단백질(Maltose biding protein; MBP) 융합 벡터인 pMALc2 (BioLabs,USA)과 His-tag 결합 벡터인 pQE-30(Qiagen, USA)을 사용하였다.
본 발명 단클론항체의 개발을 위한 면역 항원으로는 구제역 국내분리주 O/SKR/2000의 유전자 발현 3ABC 비구조단백질을 이용하였으며, 간접 ELISA법을 실시하여 작성된 단클론항체의 검색(Screeing)을 실시하였다. 이렇게 개발한 특이 단클론항체를 간접 경쟁적인 ELISA법 개발에 응용하였다.
제 1단계. 재조합 벡터 pBacBAK9 NSP의 작성
국내분리 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 유전자(Gene Bank Access number AF377945)로부터 비구조단백질을 코딩하는 유전자를 획득하였다.
국내분리 한국산 FMDV O/SKR/2000의 염기서열중 419개의 염기로 구성된 비구조단백질(Non-Structural Protein)(아미노산 서열; 1417-1835, 서열목록 1) 부위를 N-종결(N-terminal) 말단에 단백질 발현 코돈인 Nco I 제한효소부위 즉, 단백질 발현에 필요한 ATG를 함유하게 한 프라이머(5'-CCATGGTGTCGAGCCACATTTTCAA-3', Bioneer)를 이용하여 PCR 증폭한 후 증폭된 DNA를 pBacPAK9 벡터에 라이게이션하여재조합 벡터 pBacBAK9 NSP를 작성하였다. 재조합 벡터 pBacPAK9 NSP 작성시, 상기 pBacPAK9 벡터 내 NSP EcoR I 후반에 위치한 Xba I 부위의 종결 코돈(stop sequence)(5'-tcTAGa-3')에서 3ABC 비구조단백질의 발현이 종료하게끔 하였다.
제 2단계. 대장균 발현 재조합 벡터의 작성
FMDV O/SKR/2000의 비구조단백질 유전자를 발현하기 위한 대장균 발현 벡터 작성을 위하여 MBP 접합 벡터인 pMALc2(BioLabs, USA) 및 pQE-30(Qiagen, USA)를 사용하였다.
상기 제 1단계의 재조합 벡터 pBacBAK9 NSP와 상기 pMALc2 및 pQE-30을 각각 제한효소 BamH I과 Pst I로 처리한 후 정제하고 T4 DNA 리가아제(New England BioLabs, USA)를 사용하여 연결함으로써 대장균 발현 재조합 벡터를 제조하였다. (pQE30 NSP & pMAL c2 NSP)
제 3단계. 대장균 발현 FMDV O/SKR/2000 재조합 3ABC 비구조단백질의 작성
상기 작성한 대장균 발현 재조합 벡터를E.coliDH5-α및 M15(pREP4) 세포에 도입하여 형질전환(transformation)한 다음 아가 플레이트(agar plate)에서 37℃, 16시간 배양하고 형성된 콜로니에서 플라스미드를 분리한 다음 3ABC NSP 유전자를 전기영동으로 확인하였다.
단백질의 발현 및 정제는 말토오즈 결합 단백질에 융합한 형태의 단백질로 발현시키는 pMAL 발현 시스템(BioLabs, USA)을 사용하였다. 발현 대장균 세포를 완충 용액(100mM NaCl, 10mM Tris, 1 mM EDTA pH 7.4)에서 초음파 분쇄(sonication, Brinkmann)한 다음 아밀로즈를 컬럼에 충진시킨 후 투과하고 10mM 말토스용액으로정제하여 발현된 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 정제하였다.
실시예 2 : 단클론항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)의 작성
제 1단계. 하이브리도마의 작성
세포융합을 위한 종양세포로는 SP2/O-Ag14 mouse myeloma cell line을 사용하였다. 피더 세포로는 발브시 마우스의 복강에서 대식세포(macrophage)를 HAT 증식배지로 수거하여 융합 하루 전날 배양한 후 사용하였다.
상기 실시예 1의 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 인산 완충액(PBS)으로 희석(200㎍/250㎕)한 다음 인컴플리트 프로운드 에쥬벤트(Incomplete Freund's Adjuvant)와 1:1의 비율로 균질하게 섞어서 7주령 발브시 마우스(Balb/c mouse)의 발바닥에 0.05㎖씩 접종하였다.
면역 후 14일 째에 상기 마우스의 양쪽 슬와 림프절을 무균적으로 채취하여 마쇄한 후 무혈청 배지(SFM, Serum Free DMEM)로 세척하여 림프구만을 회수하였다. 이 림프구와 종양세포를 5:1의 비율로 섞은 후 PEG 1500(50%)를 사용하여 융합을 실시하였다. 융합 후 HAT(hypoxanthine aminopterin thymidine) 증식배지(SFM에 10% FBS 함유)에 부유시켜 피더(feeder) 세포가 들어 있는 96공 마이크로플레이트(96well microplate)에 100㎕씩 분주하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 내에서 배양하였다.
제 2단계. 하이브리도마의 선발
상기 작성한 하이브리도마가 증식한 배양 상층액을 수거한 다음 간접 ELISA 방법으로 스크리닝을 실시하여 양성을 보이는 잡종 세포를 well당 0.5∼1개의 세포가 포함되도록 희석한 후 세포 집단을 형성할 때까지 약 2주일동안 배양하였다. 재조합 구제역 3ABC 비구조단백질에 대한 항체를 생성하면서 단 하나의 클론(clone)만을 형성한 세포 집단을 선발하여 배양용 플라스크(Culture Flask)에서 대량 배양한 후 동종 발브시 마우스에서 선발된 세포를 접종한 후 복수를 생성하여 이를 실험에 사용하였다. 본 실험에서 선발된 구제역 재조합 3ABC 비구조단백질 항원 특이 항체 생산 세포주의 특성은 하기 표 1과 같다.
| 원인체 | 면역 항원 | Isotyping | 응용범위 |
| 구제역 O1국내 발생 O/SKR/2000주 | 대장균 발현재조합 3ABC비구조단백질 | IgG2bκ or λ chain | 효소면역법(ELISA),형광항체법(FA),면역크로마토그래피법 (Immunochromatography) 등 |
제 3단계. 웨스턴블럿팅을 이용한 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 비구조단백질 항원 특이 단클론 항체의 특이성 확인
상기 작성한 하이브리도마 세포주에 용해 완충액(lysis buffer; 10mM Tris, 300mM NaCl 0.5% NP-40, 1mM PMSF, pH 7.5-8.0)를 1/50배로 넣고 1분간 초음파 분쇄(sonication, Brinkmann)한 다음 12,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액만을 수확하여 SDS sample 완충액을 넣고 열처리 후 전기영동을 실시하였다.웨스턴 블럿팅(Western blotting)한 상기 겔을 니트로셀룰로오스 필터(Nitrocellulose filter)에 전이한 후 본 발명에서 제조한 단클론항체인 3F11을 이용하여 구제역 바이러스 O/SKR/2000의 재조합 3ABC 비구조단백질의 존재를 확인하였다. 재조합 3ABC 비구조단백질의 분자량은 약 48∼45kDa로 확인되었다.
실시예 3 : 재조합 구제역 3ABC 비구조단백질 항원 및 이에 특이적인 단클론 항체 3F11을 이용한 간접 경쟁적인 ELISA를 통한 구제역의 진단
코팅 항원으로 이용할 재조합 3ABC 비구조단백질을 카보네이트 코팅 완충액(Carbonate coating buffer)으로 500배 희석하여 50㎕씩 96공 마이크로플레이트에 분주하여 4℃에서 하룻밤 정치시킨 후 인산완충액(PBST;Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20)으로 3회 세척하였다. 10% 스킴밀크(skimmed milk) 100㎕를 넣고 37℃에서 한 시간 동안 블러킹을 실시한 후 PBST(Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20)으로 3회 세척하였다. 혈청을 SF-PBST(10% 스킴밀크 및 1% FBS 함유 PBST)로 5배 희석하여 well에 분주한 후 37℃에서 흔들어주면서 한시간 동안 반응시켰다. 본원 발명 실시예 2에서 작성된 재조합 3ABC비구조단백질 특이 단클론항체(마우스 복수)를 PBST에서 20,000배 희석하여 50㎕씩 분주하고 37℃에서 흔들어주면서 한시간동안 반응시킨 다음 PBST(Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20)으로 3회 세척하였다. 항-마우스(Anti-mouse) HRP (Horseradish Peroxidase)를 10% 스킴밀크로 3,000배 희석하여 50㎕씩 분주하고 37℃에서 흔들어주면서 한시간동안 반응시켰다. PBST(Phosphate bufferedsaline-0.05% Tween20)으로 3회 세척한 후, 기질인 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine; KPL,1 component)를 50㎕씩 분주하고 30분간 발색시킨 다음, 0.5M 황산액을 50㎕씩 분주하여 발색 반응을 정지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 다음의 식에 의거하여 양성 혹은 음성으로 판정하였다. 즉, 시험혈청이 단클론 항체를 차단하는 정도인 % 억제도를 계산하여 시험 혈청의 % 억제율이 15% 이상이면 양성으로 간주하였다.
비교예. 단클론항체를 이용한 간접 ELISA의 항체 검출율 비교
구제역 재조합 3ABC 비구조단백질 특이 단클론항체를 이용한 간접 경쟁적인 본 발명 ELISA의 항체 검출률과 이태리 ELISA의 항체 검출률을 비교 조사한 결과를 표 2에 나타내었다.
| 이태리 ELISA(IZSLE, Brescia) | 본 발명 ELISA | |
| 양성 | 14 | 13 |
| 음성 | 25 | 23 |
| [주]민감도 93%, 특이도 92%;시험혈청은 구제역 발생 농가의 감염 개체의 양성 혈청과 비감염 개체의 음성 혈청을대상으로 하였다. % 억제도의 기준이 되는 음성 혈청은 구제역 발생 이전에 채취한혈청이다. |
실시예 4 : 재조합 구제역 3ABC 비구조단백질을 이용한 구제역의 진단
본 발명 재조합 3ABC 비구조단백질 특이 단클론항체를 코팅 완충용액으로 3,000배 희석한 다음 냉장 조건에서 하루 동안 방치하였다. PBST로 5분간 3회 세척한 후 블러킹 용액을 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 다시 PBST로 세척하고 항원으로 준비된 세포펠렛을 파쇄하여 10배의 희석배수로 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
-70℃에 보관된 세포 펠렛을 Tris 완충용액(Nacl, EDTA, PMSF, NP40등을 함유)에 희석시킨 후 초음파기로 세포를 파쇄하고 12,000rpm에서 5분간 원심분리를 실시한 후 상층액만을 취하여 제조한 항원을 반응시킨 후 세척하고 가검 혈청과 표준혈청을 100㎕씩 첨가하였다. 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후 세척하고 콘쥬게이트를 반응시켰다. 세척 후 페옥시다아제의 기질로 TMB를 넣고 30분 후에 반응정지 용액을 첨가한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
비교예. 단클론항체를 이용한 간접 ELISA의 항체 검출율 비교
구제역 재조합 3ABC 비구조단백질을 이용한 간접 ELISA의 항체검출률과 기존의 미국과 이태리에서 사용중인 검사법의 항체검출률을 비교한 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다.
| 지역 | 계 | 본 발명 ELISA | 미국 ELISA | ||
| 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | ||
| 구제역 감염 지역 | 9 | 7 | 2 | 9 | 0 |
| 구제역 청정 지역 | 1 | 0 | 1 | 1 | 0 |
| 백신 접종 지역 | 51 | 0 | 51 | 17 | 44 |
| 시료수 | 이태리 ELISA (IZSLE, Brescia) | 본 발명 ELISA |
| 양성 | 7 | 6 |
| 음성 | 38* | 37* |
| [주]* :미국 ELISA에서 비특이적으로 양성으로 판정되었으나 프로방 시료에서최종적으로 음성으로 확인한 시료 18두를 포함한다. |
음성 개체에 대한 특이도는 본 발명의 ELISAR가 미국 ELISA와 비교했을 때 훨씬 우수하였다. 한편, 미국 ELISA에서 비특이적으로 양성을 나타난 개체에 대하여 본 발명 ELISA가 음성으로 판정을 보이는 것으로 보아, 본 발명의 ELISA가 미국의 ELISA에 비하여 그 효과가 우수함을 알 수 있다.
이상의 실시예 및 비교예를 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 개발한 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 대장균 발현 재조합 3ABC 비구조단백질 및 3ABC 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용한 구제역의 면역학적 진단기법은 백신접종축과 구제역 야생감염축을 유의성 높게 감별진단할 수 있으며, 모든 혈청형의 공통부위인 3ABC 비구조단백질을 이용하기 때문에 각 혈청형에 대해서 한번의 검사로 판정이 가능하므로 조작이 보다 간편하고 신속하게 이용할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로, 백신접종 정책을 실시하고 있는 지역에서의 가축사후관리 및 구제역 예방 및 확산 억제에 기여하며, 현재 구제역 바이러스를 신속하게 진단할 수 있는 진단 킷트가 개발되어 있지 않은 국내 축산업 및 진단키트수출산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (9)
- 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 3ABC 비구조단백질을 코딩함을 특징으로 하는 서열 번호 1에 기재된 유전자.
- 상기 제 1항 기재의 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 3ABC 비구조단백질 코딩 유전자를 대장균 발현 벡터에 클로닝하여 작성함을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 한국산 구제역 바이러스 O/SKR/2000 유래의 3ABC 비구조단백질 코딩 유전자를 클로닝하여 작성한 상기 제 2항 기재의 대장균 발현 재조합 벡터를 대장균에 도입한 후 형질전환하여 발현함을 특징으로 하는 대장균 발현 재조합 3ABC 비구조단백질.
- 대장균 발현 재조합 벡터를 대장균에 도입한 후 형질전환하여 발현한 상기 제 3항 기재의 재조합 3ABC 비구조단백질을 동물에 접종하고 그로부터 채취한 면역 세포를 암세포와 융합하여 제조함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주 3F-11 (KCTC 10138 BP).
- 상기 제 4항 기재의 하이브리도마 세포주로부터 발현됨을 특징으로 하는3ABC 비구조단백질 특이 단클론항체.
- 구제역 바이러스 유래의 비구조단백질 항원을 이용한 구제역 진단방법에 있어서,(1) 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 코팅 완충용액으로 희석하고 플레이트에 분주한 후 부착시키는 단계;(2) 상기 (1)의 플레이트에 검사하고자 하는 가검 혈청을 반응시키는 단계;(3) 3ABC 단백질 특이 단클론항체를 반응시키는 단계;(4) 3ABC 단백질 특이 단클론항체에 결합하는 콘쥬게이트를 반응시키는 단계;(5) 상기 콘쥬게이트에 결합하는 물질이 효소인 경우, 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정하고; 형광물질인 경우, 형광광도를 측정하며; 방사선 물질인 경우, 방사선 방출량을 측정함으로써, 가검 혈청 중의 구제역 바이러스 항체가를 측정하는 단계를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 ELISA에 의한 구제역 진단방법.
- 구제역 바이러스 유래의 비구조단백질 항원 및 이에 대한 단클론항체를 이용한 구제역 진단방법에 있어서,(1) 3ABC 비구조단백질에 대한 단클론항체를 코팅 완충용액으로 희석하고 플레이트에 분주한 후 부착시키는 단계;(2) 상기 (1)의 플레이트에 재조합 3ABC 비구조단백질 항원을 반응시키는 단계;(3) 상기 (3)의 플레이트에 검사하고자 하는 가검 혈청을 반응시키는 단계;(4) 효소, 방사선물질, 또는 형광물질 등이 부착되어 있고 상기 (3)의 가검 혈청 중의 구제역 바이러스에 대한 항체에 대하여 특이적으로 결합하는 콘쥬게이트를 반응시키는 단계;(5) 상기 콘쥬게이트에 결합하는 물질이 효소인 경우, 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정하고; 형광물질인 경우, 형광광도를 측정하며; 방사선 물질인 경우, 방사선 방출량을 측정함으로써, 가검 혈청 중의 구제역 바이러스 항체가를 측정하는 단계를 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 ELISA에 의한 구제역 진단방법.
- 제 6항 또는 7항에 있어서, 상기 재조합 3ABC 비구조단백질이 제 3항 기재의 대장균 발현 재조합 3ABC 비구조단백질임을 특징으로 하는 ELISA에 의한 구제역 진단방법.
- 제 6항 또는 7항에 있어서, 상기 3ABC 비구조단백질에 대한 단클론항체가 제 5항 기재의 재조합 구제역 3ABC 비구조단백질 특이 단클론항체임을 특징으로 하는 ELISA에 의한 구제역 진단방법.
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| KR10-2001-0082975A KR100430935B1 (ko) | 2001-12-21 | 2001-12-21 | 대장균 발현 재조합 3ａｂｃ 비구조단백질 및단클론항체를 이용한 구제역 진단방법 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533663A (zh) * | 2010-12-15 | 2012-07-04 | 财团法人工业技术研究院 | 口蹄疫杂交瘤细胞株、单克隆抗体、检测试剂和试剂盒 |
| US8232048B2 (en) * | 2009-07-14 | 2012-07-31 | Animal Health Research Institute, Council Of Agriculture, Executive Yuan | Hybridoma cell line producing monoclonal antibody against foot-and-mouth disease virus, the monoclonal antibody therefrom, immunoassay reagent and kit, and immunoassay method |
-
2001
- 2001-12-21 KR KR10-2001-0082975A patent/KR100430935B1/ko active IP Right Grant
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| CN102533663A (zh) * | 2010-12-15 | 2012-07-04 | 财团法人工业技术研究院 | 口蹄疫杂交瘤细胞株、单克隆抗体、检测试剂和试剂盒 |
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