KR100791538B1 - 돼지콜레라 바이러스 Ｅｒｎｓ 단백질 및 이에 특이적으로반응하는 단클론항체를 이용한 돼지콜레라 항체 감별진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지콜레라 바이러스 E^rns 단백질 및 이에 특이적으로 반응하는 단클론항체를 이용한 돼지콜레라 항체 감별 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 국내에서 분리된 다양한 유전형의 돼지콜레라 바이러스(swine fever virus) 중 3종의 E^rns 단백질을 코딩하는 유전자를 배큘로바이러스(Baculovirus)를 이용하여 발현한 재조합 돼지콜레라 바이러스 E^rns 단백질, 및 상기 E^rns 단백질에 특이적으로 반응하는 단클론항체(monoclonal antibody)를 이용하여 돼지콜레라 E^rns 에 대한 항체를 검사하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단클론항체를 이용하는 경우에 E^rns 에 대한 항체를 검출할 수 있어 야외에서 감염된 돼지콜레라 바이러스 항체를 용이하게 감별 진단할 수 있으며, 또한 본 발명의 진단 방법은, 3종의 재조합 단백질을 동시에 이용하는 경우에 돼지콜레라 바이러스의 모든 유전형에 대해 유전형에 관계없이 일정한 민감도를 나타내므로, 돼지콜레라 바이러스에 대한 항체를 용이하게 검출할 수 있다.

돼지 콜레라 바이러스, 이알엔에스, 단클론항체, 감별 ELISA

Description

돼지콜레라 바이러스 Ｅｒｎｓ 단백질 및 이에 특이적으로 반응하는 단클론항체를 이용한 돼지콜레라 항체 감별 진단방법{SWINE FEVER VIRUS ERNS PROTEIN AND METHOD FOR SCREENING AND DETECTING A SWINE FEVER VIRUS ANTIBODY THAT SPCIFICALLY REACTS WITH THE SAME}

도 1은 본 발명의 재조합 단백질과 단클론항체를 이용한 돼지콜레라 바이러스 항체를 진단하는 방법을 도식적으로 나타낸 흐름도이다.

도 2는 본 발명에 의한 단백질 분획 확인 결과 사진이다.

본 발명은 국내에서 분리한 다양한 유전형(CSFV 1형, 2형 및 3형)의 돼지콜레라 바이러스(Hog cholera virus, HCV. Classical swine fever virus, CSFV)에서 추출한 3종의 E^rns 단백질을 배큘로바이러스에서 발현한 재조합 단백질 및 상기 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용하여 돼지콜레라 진단 방법에 관한 것으로서, 차 단 효소결합면역측정법(Blocking Enzyme Linked Immunosorbent Assay; Blocking-ELISA)을 이용하여 유전형에 관계없이 돼지 콜레라 항체를 검출할 수 있고 돼지콜레라 바이러스의 유전자 재조합 마커백신(gene-engineered marker vaccine)의 사용시에 야외감염에 의한 항체를 신속하게 감별 및 검사할 수 있는 진단방법에 관한 것이다.

돼지콜레라는 돼지콜레라 바이러스에 의해 감염되는 전염병으로 돼지가 유일한 자연 숙주이며, 급성형 돼지콜레라인 경우에 고열, 피부발적, 식욕결핍, 변비, 설사, 백혈구 감소, 후구마비, 유사산 등의 번식장애 등과 같은 증상을 수반하여 폐사율과 이환율이 높은 질병이며, 우리나라에서는 제1종 법정 가축 전염병으로 분류하고 있고 국제수역사무국(OIE)에서는 목록 A(list A) 질병으로 분류하고 있다.

돼지콜레라 바이러스는 플래비비리데 페스티바이러스(Flaviviridae, Pestivirus)에 속하는 RNA 바이러스로서, 상기 바이러스의 크기는 12.3 내지 12.5Kb로 알려져 있다. Genomic RNA는 5'-enoncoding resion(NCR), single open reading frame(ORF) 및 3'-NCR로 구성되어 있다. 단일 ORF는 바이러스의 구조 단백질인 캡시드 C(capsid C), E^rns, E1, E2로 각각 절단(cleavage)된다. 또한, 비구조 단백질로서 N^pro, p7, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B로 각각 절단된다. 이중 E2 단백질은 돼지콜레라 바이러스의 주요 구조 단백질이며 바이러스 중화항체반응을 유발하는 단백질로서, 면역학적으로 돼지콜레라의 방어 기작에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에 유럽에서는 E2를 이용한 마커백신에 관한 연구가 이루어 지고 있고 특정한 조건하에서 이의 사용이 권장되고 있는 추세이다.

우리나라에서는 돼지콜레라 순화 생독 바이러스인 LOM 균주가 제조되어 생독 백신으로서 예방 접종되고 있으나 돼지콜레라 근절정책을 시행함에 따라 E2 단백질을 이용한 유전자 재조합 마커백신의 산업화에 초점을 맞추고 있으며 향후에 사용될 수 있는 기반을 확립하고 있다. 그러나, 유전자 재조합 마커백신의 사용시 백신 항체와 야외감염 항체를 감별할 수 있는 검사법이 수립되지 않아 백신을 사용한 후 예찰검사에 어려운 것으로 예상된다. 따라서 야외강독 돼지콜레라 바이러스에 의한 항체와 마커백신 접종 항체를 감별할 수 있는 감별 키트의 개발이 요구되고 있다.

돼지콜레라 바이러스의 구조 단백질 중 E^rns는 E2와 함께 중화항체반응을 유발하고 상기 바이러스 감염시에 면역반응을 유발하는 두 번째 결정부위(epitope)인 것으로 알려져 있다. 따라서 마커백신 접종시 E2에 대한 항체 이외에 돼지콜레라의 다른 항체(E^rns)도 형성하므로, E2에 대한 항체를 제외한 다른 항체를 검출할 수 있다면 야외에서 감염된 동물을 신속하게 감별할 수 있을 것이다.

이미 외국에서는 마커백신 접종 후 돼지콜레라 바이러스의 E^rns 재조합 단백질을 이용하여 감별검사하는 방법은 평가되어 있고 2개사(CEDI사 및 CHECKIT사)에서 키트가 개발되어 상용화되어 있지만, 이들 제품을 평가한 결과 바이러스 유전형에 따라 일정하지 않은 검사결과를 나타내는 것으로 보고되어,돼지 콜레라 바이러스의 모든 유전형에 대해 일정한 검사결과를 나타낼 수 있는 감별 키트의 개발이 절실히 요구되고 있다.

따라서, 본 발명자는 돼지콜레라 바이러스의 모든 유전형에 관계없이 E^rns 항체를 검사할 수 있는 방법을 개발하고자 연구를 수행한 결과, 국내에서 분리된 3종의 돼지콜레라 바이러스에서 유래한 다양한 유전형을 갖는 3종의 E^rns 재조합 단백질을 발현하고 상기 E^rns 에 대해 특이적인 반응성을 나타내는 단클론항체를 개발하였다. 3종의 유전자재조합 단백질을 혼합하여 이에 대한 항원을 형성하고, 이에 대해 특이적인 단클론항체를 이용하여 차단 ELISA(Blocking ELISA)를 통해 유전형에 따른 검출 결과의 차이를 극복하였다.

본 발명의 목적은 돼지콜레라 바이러스 야외균주에 감염된 동물의 E^rns 항체를 진단할 수 있는 3종의 유전자재조합 단백질, 이에 대한 단클론항체, 이를 이용한 돼지콜레라 바이러스의 진단 방법, 및 상기 재조합 단백질에 대한 항체를 이용한 감별 키트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 국내에서 분리된 다양한 유전형의 돼지콜레라 바이러스 중 3종의 E^rns 단백질을 코딩하는 유전자를 배큘로바이러스(Baculovirus)를 이용하여 발현한 재조합 돼지콜레라 바이러스 E^rns 단백질을 제 공한다.

본 발명에서는 상기 돼지콜레라 바이러스로서 LOM주, 철원주, 용인주로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 돼지콜레라 바이러스의 E^rns에 특이적으로 반응하는 단클론항체를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 단클론항체를 생산하기 위하여 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 돼지콜레라 바이러스 LOM 균주-유래 E^rns 재조합 유전자를 제작함으로써 얻어진 재조합 E^rns단백질을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 다양한 유전형의 돼지콜레라바이러스에 대한 항체 모두를 동시에 검출할 수 있도록 E^rns 재조합 단백질의 혼합 항원, 및 상기 항원을 특이적으로 인식하는 단클론항체를 이용한 효소면역분석법을 사용하여 돼지콜레라 야외주 바이러스 항체를 감별 진단하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하여 이루어진 진단 방법을 제공한다:

(a) 돼지콜레라 바이러스의 E^rns 재조합 단백질 3종을 적정 농도로 혼합하여 항원 칵테일(antigen cocktail)을 제조하는 단계;

(b) 상기 제조된 항원 칵테일을 코팅 완충액에 희석한 후 플레이트에 분주하여 흡착하는 단계;

(c) 상기 플레이트에 흡착되지 않은 재조합 항원을 세척하여 제거하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계 후, 상기 플레이트에 가검 시료를 첨가하여 반응시키는 단계;

(e) 상기 (d) 단계 후, 상기 플레이트에 흡착된 재조합 E^rns 항원 단백질과 특이적으로 결합하지 않은 가검 시료를 세척하여 제거하는 단계;

(f) 상기 (e) 단계 후, 효소와는 결합하지 않지만 E^rns 단백질에 대해 특이적인 반응을 하는 단클론항체를 첨가하여 반응시키는 단계;

(g) 상기 (f) 단계 후, 상기 플레이트에 흡착된 재조합 E^rns 항원 단백질과 결합하지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계;

(h) 상기 (g) 단계 후, 효소와 반응하는 기질을 첨가하여 돼지콜레라 바이러스 감염 여부를 판단하는 단계.

본 발명에서 상기 효소면역분석법으로는 경쟁적 효소면역분석법을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기에서 기재된 돼지콜레라 바이러스 E^rns 단백질에 대한 항체를 검사하기 위한 돼지콜레라 감별 진단 키트를 제공한다.

실시예

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: CSFV 유전형별 유전자 재조합 E^rns 단백질 제조

(1)유전자 재조합 배큘로바이러스 제조

국내에서 분리된 3종의 유전형 돼지콜레라 바이러스(1형, 2형 및 3형)로부터 E^rns 단백질을 코딩하는 유전자를 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerse Chain Reaction, RT-PCR)에 의하여 증폭하였다. 증폭된 cDNA를 pAcgp67B Baculovirus 벡터에 연결(ligation)하여 발현벡터 pAcgp67B-E^rns를 제조하였다. 이어, 상기 발현벡터를 E. coli DH5-α 세포에 형질전환한 다음 아가플레이트(Agar palte)에서 배양하여 형성된 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고, 상기 플라스미드를 제한효소 BamH1, ECOR1으로 절단한 후에 E^rns유전자를 전기영동을 통해 확인하였다. 이어, pAcgp67B-E^rns 가 도입된 세포를 대량 증식시켜 플라스미드를 확보한 후, sf9 곤충세포에 Baculovirus linearized DNA와 공형질감염(co-transfection)을 실시하여 재조합 배큘로바이러스를 확보하였다.

(2) CSFV E^rns 재조합 단백질의 생산

재조합 배큘로바이러스를 곤충세포에 감염시킨 뒤 감염된 세포를 수확하였다. 감염된 세포를 용해(lysis)시켜 재조합 E^rns 단백질을 용출시켰다. 발현된 E^rns 단백질을 Ni-NAT 아가로즈(Qiagen, USA)와 결합시킨 후 이미다졸(imidazole, Qiagen, USA)의 농도를 조절함으로써 재조합 단백질을 정제하였다. 정제된 재조합 단백질을 SDS-PAGE를 사용하여 단백질 분획을 확인한 결과 (도 1)와 같이 E^rns 단백질 분획(40-5-KDa)을 확인할 수 있었다. 정제가 확인된 3종의 단백질을 적정농도로 혼합하여 ELISA 용 혼합 항원을 제조하였다.

실시예 2: 단클론항체를 생산하는 하이브리도마의 제조

단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 생산하는 과정은 간략히 다음과 같다. 종양세포주(Myeloma cell line)인 SP2/O-Ag14를 한국생명공학연구원 생물자원 센타(KCTC : Korea Collection for Type Culture, Korea)에서 구입 후 10% 우태아 혈청이 첨가된 DMEM (GibcoBRL, USA)배지에 접종하여 5% 탄산가스가 공급되는 배양기에서 37℃로 배양하였다. 상기 실시예 1에서 재조된 재조합 E^rns 단백질 항원을 인컴프리트 프로이드 에주벤트(Incompleted Freund's Adjuvant, Sigma, USA)와 동량으로 균질하게 혼합하여 6주령의 BALB/C 마우스(오리엔트, 한국)의 근육에 접종하였다. 면역 후 2주와 4주 후에 동량의 항원을 추가로 면역한 후 마우스의 비장을 무균적으로 채취하고 파쇄한 후 림프구만을 회수하였다. 분리한 림파구와 종양세포를 PEG 1500(Sigma, USA)를 사용하여 림프세포와 종양세포가 융합되도록 유도하였다. 그리고 나서, 융합이 완료된 세포를 HAT(Hypoxanthin Aminopterin Thymidine, GibcoBRL, USA)가 우태아 혈청에 10% 첨가된 DMEM 선택 배지에 적당히 희석한 후 96웰(Well) 조직배양 플레이트에 상기 융합된 세포를 분주하여 배양하였다. 2주후 상층액을 검사하여 양성반응으로 나타나는 세포주를 희석하여 96웰의 조직 배양플레이트에서 클로닝하여 양성 클론을 선발함으로써 CSFV E^rns에 특이적인 세포주를 선정하였고, 그 반응성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

상기한 정제된 3종의 E^rns재조합 단백질을 카보네이트 비카보네이트 완충액(Carbonate bicaonate buffer, Sigma USA)에 희석하여 엘라이자 플레이트에 흡착시킨 후 양성대조혈청, 야외 감염양성혈청, 음성대조혈청을 반응시켰다. 반응 후 선발된 세포주에서 생산된 단클론 항체와 반응시키고 항 마우스 HRP 콘쥬게이트와 반응시켰다. 반응 후 여기에 발색제를 첨가하여 발색시키고 발색 정지액을 첨가한 후 흡광도를 측정하였다. 단일클론항체의 3종 항원에 대한 양성혈청과의 경쟁반응 능력을 확인하기 위하여 다음의 (수학식 1)에 따라 경쟁반응율을 계산하여 반응정도를 확인하였다.

경쟁반응율(%) = 100 - ( 시료의 흡광도 / 음성대조의 흡광도 × 100 )

그 결과 (표 1)과 같이 3종의 E^rns 단백질에서 양성혈청과 60% 이상의 특이적인 경쟁반응을 나타내는 것을 확인하여 양성혈청이 반응하는 3종 항원의 항원결정부위에 경쟁적으로 반응하고 있음을 확인하였다.

단클론항체 ERNS-02의 경쟁반응율 검사결과

제조합항원	시료	흡광도(OD)	경쟁반응율(%)
Erns-LOM	Positive control	0.969	72.6
	Positive serum	0.828	76.5
	Negative control	3.532	0.0
Erns-용인	Positive control	0.685	62.5
	Positive serum	0.742	59.4
	Negative control	1.826	0.0
Erns-철원	Positive control	0.529	62.3
	Positive serum	0.537	61.7
	Negative control	1.402	0.0

실시예 3: 재조합 E^rns 단백질 및 이에 대한 특이적 단클론항체를 이용한 차단 ELISA

(1) 단클론항체와의 효소(HRP) 콘쥬게이션 제조

단클론항체를 생산하는 세포주를 마우스의 복강내에 접종하여 복수가 생산되면 이를 채취하였다. 얻어진 복수는 프로테인 A가 결합된 아가로즈 겔(Affiprep Protein A agarose, BioRad, Germany)을 이용하는 면역크로마토그라피를 이용하여 정제한 후 이를 퍼옥시다제 콘쥬게이션 키트(Peroxidase Conjugate Kit, Roche, Germany)의 사용 매뉴얼에 따라 단클론항체와 결합시킴으로써 콘쥬게이션을 완성하였다.

(2) 재조합 E^rns 단백질의 혼합 항원의 제조

발현된 3종의 유형별 항원을 상기와 같이 정제하여 각각의 항원을 준비한 후, 3종의 항원을 적정 농도로 혼합함으로써 혼합 항원을 제조하고, 이를 ELISA용 항원으로 사용하였다.

(3) 차단 ELISA를 이용한 돼지콜레라 바이러스 항체의 검사

상기에서 제조된 3종의 항원을 유형별로 각각 ELISA 플레이트에 흡착시키고 흡착되지 않은 항원은 세척과정을 통하여 제거하였다. 또한, 혼합 항원도 동일한 방법으로 상기 플레이트에 흡착시켰다. 3% 소 혈청 알부민이 첨가된 인산 완충액을 제조하여 플레이트에 분주한 후 실온에서 반응시켰다. 반응 후 각 유전형별 바이러스로 감염된 돼지의 혈청을 희석 완충액과 1:4로 희석하여 항원이 흡착된 플레이트에서 반응시키고, 세척액으로 세척하였다. 상기 효소(HRP)가 결합된 단클론항체를 적정 희석농도로 희석하여 플레이트에 첨가 후 다시 반응시키고, 다시 세척반응을 거친 후 TMB 발색제를 이용하여 발색시킨 후 흡광도를 측정하였다. 상기 결과의 판정은 가검 혈청의 흡광도와 음성 대조군 흡광도의 비율값(SN Ratio Value)를 산정한 후, SN값이 0.60 이하일 때 양성으로, 0.60 이상일 때 음성으로 판정하였으며, 검체 혈청의 SN값은 하기 수학식 2로 산출하였다.

SN 비율값(SN)= [ 가검 시료의 평균 흡광도 / 음성대조의 평균 흡광도]

각각의 항원 반응성을 확인한 결과, 하기 표 2와 같이 1형 항원을 사용한 경우는 2형 및 3형 바이러스를 감염시킨 혈청에 대해서 상기 바이러스를 검출하지 못하였고, 2형 및 3형 항원을 이용한 경우도 또한 2형 및 3형 바이러스를 감염시킨 혈청에서 상기 바이러스를 검출하지 못하였다. 그러나, 1형 바이러스를 감염시킨 혈청에 대해서는 검출 감도가 떨어지는 반면, 혼합 항원을 사용한 경우에는 전 개체에서 항체에 대한 민감도가 향상되는 돼지 콜레라 바이러스의 항체를 검출할 수 있었다.

하기 표 2에는 바이러스 감염 혈청그룹에서의 E^rns재조합 항원별 유효성 평가한 결과가 나타나 있다.

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, E^rns LOM을 항원으로 사용하는 경우, LOM 백신주를 접종한 시험군에서는 접종 14일 후에 전 개체에서 항체가 검출되었으나 철원주나 논산주를 접종한 시험군에서는 접종 21일 후에도 항체가 검출되지 않는 개체가 관찰되었다. 또한, E^rns 용인주와 철원주를 사용하는 경우는 1형 바이러스를 접종한 그룹에서 항체가 검출되지 않는 개체가 발견되었다.

하기 표 3에는 바이러스 감염 혈청그룹에서의 E^rns재조합 혼합 항원의 유효성을 평가한 결과가 나타나 있다.

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 혼합 항원에서는 접종 28일 후에도 한 개체를 제외한 전 개체에서 항체가 검출되어 민감도가 향상되었음을 알 수 있었다.

본 발명의 단클론항체를 이용하는 경우에 E^rns 에 대한 항체를 검출할 수 있어 야외에서 감염된 돼지콜레라 바이러스 항체를 용이하게 감별 진단할 수 있으며, 또한 본 발명의 진단 방법은, 3종의 재조합 단백질을 동시에 이용하는 경우에 돼지콜레라 바이러스의 모든 유전형에 대해 유전형에 관계없이 일정한 민감도를 나타내므로, 돼지콜레라 바이러스에 대한 항체를 용이하게 검출할 수 있다.

Claims (9)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 항원 및 상기 항원을 특이적으로 인식하는 단클론 항체를 이용한 효소면역분석법을 사용한 돼지콜레라 야외주 바이러스 항체 감별 진단 방법으로, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지콜레라 야외주 바이러스 항체 감별 진단 방법:

   (a) 돼지콜레라 바이러스 유전형 1형, 2형 및 3형 각각으로부터 유래된 3종의 E^rns 재조합 단백질을 모두 혼합하여 혼합 항원을 제조 하는 단계;

   (b) 상기 제조된 혼합 항원을 코팅 완충액에 희석한 후 플레이트에 분주하여 흡착하는 단계;

   (c) 상기 플레이트에 흡착되지 않은 항원 단백질을 세척하여 제거하는 단계;

   (d) 상기 (c) 단계 후, 상기 플레이트에 가검 시료를 첨가하여 반응시키는 단계;

   (e) 상기 (d) 단계 후, 상기 플레이트에 흡착된 혼합 항원의 재조합 E^rns 항원 단백질과 특이적으로 결합하지 않은 가검 시료를 세척하여 제거하는 단계;

   (f) 상기 (e) 단계 후, 효소와는 비결합하는 동시에 상기 혼합 항원의 E^rns 단백질에 대해 특이적인 반응을 하는 단클론항체를 첨가하여 반응시키는 단계;

   (g) 상기 (f) 단계 후, 상기 플레이트에 흡착된 재조합 E^rns 항원 단백질과 결합하지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계; 및

   (h) 상기 (g) 단계 후, 효소와 반응하는 기질을 첨가하여 돼지콜레라 바이러스 감염 여부를 판단하는 단계.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 효소면역분석법은 경쟁적 효소면역분석법인 것을 특징으로 하는 돼지콜레라 야외주 바이러스 항체의 감별 진단 방법.
6. 돼지콜레라 바이러스(Classical Swine Fever Virus, CSFV) 유전형 1형, 2형 및 3형 각각으로부터 추출한 3종의 E^rns 단백질을 혼합 항원으로 함과 아울러, 상기 혼합 항원에 대한 항체를 검사하기 위한 돼지콜레라 감별 진단 키트.
7. 제 4 항에 있어서,

   상기 3종의 E^rns 재조합 단백질은, 각각이 LOM주, 철원주, 용인주로 이루어진 군으로부터 선택된 돼지콜레라 바이러스로부터 유래한 것을 특징으로 하는 돼지콜레라 야외주 바이러스 항체의 감별 진단 방법.
8. 제 4 항에 있어서,

   상기 3종의 E^rns 재조합 단백질은, E^rns 단백질을 코딩하는 유전자를 배큘로바이러스(Baculovirus)를 이용하여 발현시켜 재조합한 것을 특징으로 하는 돼지콜레라 야외주 바이러스 항체의 감별 진단 방법.
9. 제 4 항에 있어서,

   상기 단클론항체는, 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 재조합된 상기 3종의 E^rns 재조합 단백질을 이용하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 돼지콜레라 야외주 바이러스 항체의 감별 진단 방법.

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