JP2016132629A - 口蹄疫ウイルスと反応する抗体 - Google Patents
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Abstract
【課題】口蹄疫ウイルスの７つの血清型（Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３）全てと反応する新規な抗体を提供する。
【解決手段】受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマによって産生される抗体。
【選択図】なし
【解決手段】受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマによって産生される抗体。
【選択図】なし
Description
本発明は、口蹄疫ウイルスと反応する抗体に関する。より詳細には、口蹄疫ウイルスの７つの血清型（Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３）全てと反応する抗体に関する。
口蹄疫ウイルス（foot and mouth disease virus：ＦＭＤＶ）は、家畜の伝染病の１つである。口蹄疫ウイルスは、鯨偶蹄目（例えばウシ、ブタ、シカ、ヒツジ、ヤギなど）に属する動物を主な宿主としており、日本ではその感染疾患が家畜伝染病予防法において家畜伝染病（旧法定伝染病）に指定されている。口蹄疫ウイルスは、周囲環境において容易に不活性化しないため伝播性が高く、感染した家畜の生産性を著しく低下させ、感染した幼獣において高い致死率を示す。特に高い伝播性に起因して、口蹄疫ウイルスに感染した家畜は、感染が確認され次第、日本内では家畜伝染病予防法に基づいて殺処分に処される。また、口蹄疫ウイルスに感染した家畜が発見された地域、国家には家畜の移動制限が加えられるため、口蹄疫ウイルスは、畜産業に非常な経済的打撃を与え得る病原体として、世界的に認識されている。
日本では口蹄疫ウイルスに感染した個体は、２０００年までおよそ１世紀にわたって確認されていなかった。しかし、２０００年および２０１０年に、口蹄疫ウイルスに感染した個体が確認された。このため、口蹄疫の流行に対する対処法を確立することの重要性が明らかに高まっている。上記対処法として最も重要なのは、感染の疑いのある家畜が、口蹄疫ウイルスに感染しているか否かを決定することである。
一般的な決定方法としては、ＲＴ−ＰＣＲによって口蹄疫ウイルスの遺伝子を検出する方法である。この方法では、遺伝子の増幅が認められれば、陽性（口蹄疫ウイルスに感染している）と決定されるが、迅速かつ正確に決定するという点では、単独にＲＴ−ＰＣＲを利用する方法は好ましくない。そこで、他の抗原検出法（ＥＬＩＳＡまたはイムノクロマトグラフィーなど）を利用（併用）して口蹄疫ウイルスの検出する方法が検討されている（例えば、本発明者らによる非特許文献１）。
口蹄疫ウイルスは、７つの血清型（Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３）に分類される。非特許文献１には、７つ全ての血清型と反応する抗体が記載されている。
K. Morioka et al., Journal of Clinical Microbiology, Vol.47, No.11, p.3663-3668 (2009)
より高精度に口蹄疫の検出するために、抗口蹄疫ウイルス抗体のさらなる開発が望まれる。
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、口蹄疫ウイルスの７つ全ての血清型を認識することができる抗口蹄疫ウイルス抗体を産生するハイブリドーマの作製に成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（８）を提供する。
（１）受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマによって産生される抗体。
（２）受託番号NITE P−01972で特定される抗体産生用ハイブリドーマ。
（３）上記（１）に記載の抗体を含む口蹄疫ウイルス検出キット。
（４）口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応する、上記（１）に記載のモノクローナル抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体をさらに含む、上記（３）に記載の口蹄疫ウイルス検出キット。
（５）上記（１）に記載の抗体を用いる口蹄疫ウイルスの検出方法。
（６）被験体から採取した試料と、上記（１）に記載の抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と、当該抗体とを抗原抗体反応させる工程；および抗原抗体反応物を検出する工程を含む、上記（５）に記載の検出方法。
（７）被験体から採取した試料と基材に固定された抗口蹄疫ウイルス一次抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と当該一次抗体とを抗原抗体反応させる工程；上記抗原と標識に結合された抗口蹄疫ウイルス二次抗体とを接触させて、当該抗原と当該二次抗体とを抗原抗体反応させる工程；および上記標識を検出する工程を含み、上記一次抗体および上記二次抗体のうちの少なくとも一方が、上記（１）に記載の抗体である、上記（５）に記載の検出方法。
（８）上記一次抗体および上記二次抗体のうちの一方が、上記（１）に記載の抗体であり、上記一次抗体および上記二次抗体のうちのもう一方が、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応する、上記（１）に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体である、上記（７）に記載の検出方法。
（１）受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマによって産生される抗体。
（２）受託番号NITE P−01972で特定される抗体産生用ハイブリドーマ。
（３）上記（１）に記載の抗体を含む口蹄疫ウイルス検出キット。
（４）口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応する、上記（１）に記載のモノクローナル抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体をさらに含む、上記（３）に記載の口蹄疫ウイルス検出キット。
（５）上記（１）に記載の抗体を用いる口蹄疫ウイルスの検出方法。
（６）被験体から採取した試料と、上記（１）に記載の抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と、当該抗体とを抗原抗体反応させる工程；および抗原抗体反応物を検出する工程を含む、上記（５）に記載の検出方法。
（７）被験体から採取した試料と基材に固定された抗口蹄疫ウイルス一次抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と当該一次抗体とを抗原抗体反応させる工程；上記抗原と標識に結合された抗口蹄疫ウイルス二次抗体とを接触させて、当該抗原と当該二次抗体とを抗原抗体反応させる工程；および上記標識を検出する工程を含み、上記一次抗体および上記二次抗体のうちの少なくとも一方が、上記（１）に記載の抗体である、上記（５）に記載の検出方法。
（８）上記一次抗体および上記二次抗体のうちの一方が、上記（１）に記載の抗体であり、上記一次抗体および上記二次抗体のうちのもう一方が、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応する、上記（１）に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体である、上記（７）に記載の検出方法。
本発明に係る抗体は、口蹄疫ウイルスのうち７つ全ての血清型と高感度で反応することができる。
〔１．抗体〕
本発明に係る抗体は、受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマによって産生される抗体（「１６Ｄ６」と名付けた）である。１６Ｄ６抗体は、口蹄疫ウイルスの７つ全ての血清型（Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３）を認識することができるモノクローナル抗体である。１６Ｄ６抗体は、受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマを、例えば、１０％胎児血清を含む培地中でまたは無血清培地中で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で培養し、産生された１６Ｄ６抗体を公知の方法に従って回収・精製することによって、製造することができる。
本発明に係る抗体は、受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマによって産生される抗体（「１６Ｄ６」と名付けた）である。１６Ｄ６抗体は、口蹄疫ウイルスの７つ全ての血清型（Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３）を認識することができるモノクローナル抗体である。１６Ｄ６抗体は、受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマを、例えば、１０％胎児血清を含む培地中でまたは無血清培地中で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で培養し、産生された１６Ｄ６抗体を公知の方法に従って回収・精製することによって、製造することができる。
〔２．ハイブリドーマ〕
本発明はまた、受託番号NITE P−01972で特定される抗体産生用ハイブリドーマも提供する。本発明に係るハイブリドーマは、ウシから分離された口蹄疫ウイルスＡ２２／ＩＲＱ／２４／６４株（文献：ARROWSMITH, A. E. M. (1975). Variation among strains of type A foot-and-mouth disease virus in the Eastern Mediterranean region 1964-1972. Journal of Hygiene 75, 387-397）を抗原として、マウスに免疫し、免疫したマウスの脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞由来株とを融合させて作成されたハイブリドーマ（抗口蹄疫ウイルス ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６Ｄ６（受託番号NITE P−01972））である。ハイブリドーマ１６Ｄ６は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８ １２２号室）に寄託されている。
本発明はまた、受託番号NITE P−01972で特定される抗体産生用ハイブリドーマも提供する。本発明に係るハイブリドーマは、ウシから分離された口蹄疫ウイルスＡ２２／ＩＲＱ／２４／６４株（文献：ARROWSMITH, A. E. M. (1975). Variation among strains of type A foot-and-mouth disease virus in the Eastern Mediterranean region 1964-1972. Journal of Hygiene 75, 387-397）を抗原として、マウスに免疫し、免疫したマウスの脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞由来株とを融合させて作成されたハイブリドーマ（抗口蹄疫ウイルス ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６Ｄ６（受託番号NITE P−01972））である。ハイブリドーマ１６Ｄ６は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８ １２２号室）に寄託されている。
〔３．口蹄疫ウイルス検出キット〕
本発明はさらに、１６Ｄ６抗体を含む口蹄疫ウイルス検出キットを提供する。本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィー法、または免疫拡散測定法等を利用したキットであり得る。
本発明はさらに、１６Ｄ６抗体を含む口蹄疫ウイルス検出キットを提供する。本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィー法、または免疫拡散測定法等を利用したキットであり得る。
本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応する、１６Ｄ６抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体をさらに含んでいてもよい。そのような抗口蹄疫ウイルス抗体は、モノクローナル抗体であり得る。そのような抗口蹄疫ウイルス抗体としては、例えば、非特許文献１に記載された１Ｈ５抗体等が挙げられる。後述の実施例に示されるとおり、１６Ｄ６抗体を７つ全ての血清型と反応する他の抗口蹄疫ウイルス抗体と組み合わせて用いることによって、より高感度で口蹄疫ウイルスを検出することができる。なお、「反応する」とは、抗体が口蹄疫ウイルス（抗原）と抗原抗体反応することをいい、「結合する」または「認識する」と表現することもできる。
また、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れかと特異的に反応する抗口蹄疫ウイルス抗体を含んでいてもよい。そのような抗口蹄疫ウイルス抗体は、モノクローナル抗体であり得る。そのような抗口蹄疫ウイルス抗体としては、例えば、非特許文献１に記載された１６Ｃ６抗体（血清型Ａ特異的）、７０Ｃ４抗体（血清型Ｏ特異的）、および６５Ｈ６抗体（血清型Ｏ特異的）、ならびに、特開２０１３−４９６４５号に記載された１２Ｃ７抗体（血清型Ａｓｉａ１特異的）、および１３Ｆ１抗体（血清型Ｃ特異的）等が挙げられる。これらの抗体と反応性を比較することで、一度の検査で、被験体の検体中に含まれる口蹄疫ウイルスの血清型を判別することができる。
また、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れか２つ以上と特異的に反応する抗口蹄疫ウイルス抗体を含んでいてもよい。
上述した１６Ｄ６抗体以外の抗体のうちの複数が、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットに含まれていてもよい。また、１６Ｄ６抗体と１６Ｄ６抗体以外の抗体とは、混合されて使用されてもよいし、混合されずに使用されてもよい。
また、１６Ｄ６抗体および／または上述の１６Ｄ６抗体以外の抗体は、標識に結合されていてもよい。標識としては、例えば、酵素、酵素基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、ビオチンおよび着色物質等が挙げられる。酵素の例としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼおよびグルコース−６−リン酸脱水素酵素等が挙げられる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物等の架橋剤を用いる公知の方法により行うことができる。酵素基質としては、使用する酵素に応じて公知の物質を使用することができる。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）およびＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）等を、また酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合には、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）の混合基質等を用いることができる。
放射性同位元素としては、１２５Ｉ、３Ｈまたは１４Ｃ等の通常のラジオイムノアッセイで用いられているものが挙げられる。抗体への放射標識は公知の方法を用いて行うことができる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートおよびフィコエリスリン等の通常の蛍光抗体法に用いられるものが挙げられる。また、発光物質としては、イソルミノール、アクリジンエステルおよびルシゲニン等が挙げられる。この際、標識の方法は、公知の方法を用いることができる。また、着色物質としては、例えば、着色ラテックス粒子および金コロイド等が挙げられる。
また、１６Ｄ６抗体および／または上述の１６Ｄ６抗体以外の抗体は、基材に固定されていてもよい。この場合、基材も口蹄疫ウイルス検出キットの構成要素である。基材としては、ニトロセルロースメンブレン、シリカメンブレン、ガラスフィルター、ポリスチレン粒子、ポリスチレンプレート、またはシリカ磁性粒子等の公知のものを使用することができる。一例において、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、基材に固定された１６Ｄ６抗体および標識された１６Ｄ６抗体以外の抗体を含んでいる。他の一例において、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、基材に固定された１６Ｄ６抗体以外の抗体および標識された１６Ｄ６抗体を含んでいる。
本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、標識を検出するための試薬をさらに含んでいてもよい。また、本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィー法、およびウエスタンブロット法等の免疫反応を行うために必要な部材（二次抗体、発色試薬、ブロッキング試薬等）、プレート（９６ウェルプレート等）およびチューブ等が含まれていてもよい。また、１６Ｄ６抗体を検出するための二次抗体および二次抗体に結合させた標識酵素の基質等を備えていてもよい。
また、本発明に係る検出キットを構成する成分を格納するための１つ以上の容器（例えば、バイアル、管、アンプルおよびビンなど）を備えていてもよい。また、本発明に係る検出キットにおいて使用する検出方法について詳細が記載された使用説明書をさらに備えていてもよい。当該検出方法としては、後述する〔４．口蹄疫ウイルスの検出方法〕で説明される検出方法が挙げられる。
〔４．口蹄疫ウイルスの検出方法〕
本発明はさらに、１６Ｄ６抗体を用いる口蹄疫ウイルスの検出方法を提供する。被験体としては、ウシ、ブタ、シカ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、イノシシ、およびカモシカ等が挙げられる。被験体から採取した試料としては、血液、水疱液、糞、尿、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、水疱上皮乳剤、病変部拭い液、種々の組織・器官などが挙げられる。本発明に係る検出方法を用いて、試料中の口蹄疫ウイルスを検出することで、この試料が由来する被験体が口蹄疫ウイルスによる感染症に罹患しているか否かを迅速、容易かつ確実に診断できる。
本発明はさらに、１６Ｄ６抗体を用いる口蹄疫ウイルスの検出方法を提供する。被験体としては、ウシ、ブタ、シカ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、イノシシ、およびカモシカ等が挙げられる。被験体から採取した試料としては、血液、水疱液、糞、尿、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、水疱上皮乳剤、病変部拭い液、種々の組織・器官などが挙げられる。本発明に係る検出方法を用いて、試料中の口蹄疫ウイルスを検出することで、この試料が由来する被験体が口蹄疫ウイルスによる感染症に罹患しているか否かを迅速、容易かつ確実に診断できる。
本発明に係る検出方法は、例えば、ＥＬＩＳＡ法（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法等）、イムノクロマトグラフィー法、または免疫拡散測定法等に基づくことができる。
本発明に係る検出方法の一態様は、被験体から採取した試料と、１６Ｄ６抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と、１６Ｄ６抗体とを抗原抗体反応させる工程；および抗原抗体反応物を検出する工程を含む。
抗原抗体反応させる工程では、試料と抗体とをインキュベートすればよい。抗原抗体反応物を検出する工程は、例えば、予め標識された上記抗体を検出する等の公知の方法を用いて行うことができる。
本発明に係る検出方法の一態様では、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたものであり、被験体から採取した試料と基材に固定された抗口蹄疫ウイルス一次抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と当該一次抗体とを抗原抗体反応させる工程；上記抗原と標識に結合された抗口蹄疫ウイルス二次抗体とを接触させて、当該抗原と当該二次抗体とを抗原抗体反応させる工程；および上記標識を検出する工程を含み、上記一次抗体および上記二次抗体のうちの少なくとも一方が、１６Ｄ６抗体である。
本発明に係る検出方法では、一次抗体および二次抗体の両方が１６Ｄ６抗体を使用して調製されることもできるが、一次抗体および二次抗体のうちの一方が、１６Ｄ６抗体を使用して調製され、他方が口蹄疫ウイルスの７つの血清型の何れとも反応する、１６Ｄ６抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体を使用して調製されることもできる。このような１６Ｄ６抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体として、例えば、上述した１Ｈ５抗体が挙げられる。１６Ｄ６抗体と１Ｈ５抗体との組合せにより、口蹄疫ウイルスの検出感度を一層向上させることができる。さらに、基材に固定した一次抗体として１６Ｄ６抗体を用い、二次抗体として１Ｈ５抗体を用いることが好ましい。口蹄疫ウイルスの検出感度をより一層向上させることができる。
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
〔モノクローナル抗体の作製〕
口蹄疫ウイルスＡ２２／ＩＲＱ／２４／６４株をＩＢ−ＲＳ−２細胞に接種し、一晩回転培養した。回収した培養液を１５００Ｇで１０分間遠心した後、上清を回収した。上清を飽和硫酸アンモニウム溶液と等量混和し、一晩４℃で撹拌することによってウイルスを析出させた。析出させたウイルスを、５０００Ｇで３０分間遠沈し、上清を除去してから適量のＰＢＳに懸濁した。再び５０００Ｇで３０分間遠心し、上清を除去し、１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。スクロース密度勾配（１５〜４５％）ウイルスの懸濁液を添加し、２００００ｒｐｍで２時間遠心を行い、目的のバンドを回収することによって、１４６Ｓの完全粒子を精製した。
口蹄疫ウイルスＡ２２／ＩＲＱ／２４／６４株をＩＢ−ＲＳ−２細胞に接種し、一晩回転培養した。回収した培養液を１５００Ｇで１０分間遠心した後、上清を回収した。上清を飽和硫酸アンモニウム溶液と等量混和し、一晩４℃で撹拌することによってウイルスを析出させた。析出させたウイルスを、５０００Ｇで３０分間遠沈し、上清を除去してから適量のＰＢＳに懸濁した。再び５０００Ｇで３０分間遠心し、上清を除去し、１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。スクロース密度勾配（１５〜４５％）ウイルスの懸濁液を添加し、２００００ｒｐｍで２時間遠心を行い、目的のバンドを回収することによって、１４６Ｓの完全粒子を精製した。
８〜１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に、上述のように精製した口蹄疫ウイルスＡ２２／ＩＲＱ／２４／６４株の完全粒子を接種した。初回免疫ではフロイントコンプリートアジュバント（ヤトロン社製）と精製したウイルス液との等量混合物、追加接種ではフロイントインコンプリートアジュバント（ヤトロン社製）と精製したウイルス液との等量混合物を、連結針を用いてミセル化させた。最終免疫後にマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とをポリエチレングリコール４０００（メルク社製）を用いて融合させ、ＨＡＴ培地（０．１ｍＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジン、および２０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ニッスイ））を用いて９６ウェルプレートにおいて培養した。２週間後からはＨＴ選択培地（０．１ｍＭのヒポキサンチン、１６μＭのチミジン、および２０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ニッスイ））を用いて培養した。
上述のように培養することによって、ハイブリドーマのコロニーを形成させ、ＥＬＩＳＡおよび口蹄疫ウイルス感染細胞を用いた免疫染色によって目的のモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマをスクリーニングした。スクリーニングの詳細は以下の通りである。
ＥＬＩＳＡでは、ウサギ抗口蹄疫ウイルス抗体を、固相に吸着させ、Ａ２２／ＩＲＱ／２４／６４株の完全粒子と反応させた。次いで、ウイルスを取り除いてからハイブリドーマの培養上清を加えて反応させた。そして、培養上清を取り除いてからＨＲＰ標識したマウス抗ＩｇＧ抗体を加えて反応させた。標識抗体を捨ててから発色基質と反応させて、吸光度を測定した。
口蹄疫ウイルス感染細胞を用いた免疫染色では、複数のウェルを有しているプレートにＩＢ−ＳＲ−２細胞を播種した後に口蹄疫ウイルスを血清型に分けて接種した。感染後の適当な時間（感染細胞がはがれない程度）に培養液を捨て、冷却したアセトンを用いて感染細胞を固定した。スクリーニングの各タイムポイントにおいて使用するまで、各プレートを−８０℃に保存しておいた。つまり、スクリーニング対象のハイブリドーマの１つに対して７種類の血清型に必要な分だけ感染細胞を準備した。保存しておいたプレートにスクリーニングするハイブリドーマの培養上清を加えてインキュベートした。上清を捨ててからＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を加えて反応させた。標識抗体を捨ててから発色基質と反応させ、顕微鏡下において抗体の有無を判定した。
培養上清に抗体が存在しているハイブリドーマをＥＬＩＳＡによって特定し、さらに、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングの結果が非特異的な反応ではないことを確認するために、口蹄疫ウイルス感染細胞を用いた免疫染色によって再度スクリーニングした。
スクリーニングによって選択したハイブリドーマを、標準的な方法に従ってクローニングすることによって、目的のモノクローナル抗体を安定して産生している１種類のハイブリドーマを確立した。このハイブリドーマを抗口蹄疫ウイルス ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６Ｄ６と名づけた。また、このハイブリドーマを独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号NITE P−01972）。このハイブリドーマによって産生されているモノクローナル抗体（７種類全ての血清型の口蹄疫ウイルスと反応するモノクローナル抗体）を、１６Ｄ６と名づけた。
なお、１６Ｄ６抗体について、他のウイルスとの交差反応性を調べるために、豚水胞病ウイルス（swine vesicular disease virus；ＳＶＤＶ）のＪＩ株およびＵＫＧ ２７／７２株を用いたところ、交差反応性は認められなかった（口蹄疫ウイルスの全ての型においてＯＤ＞０．５のときに、ＳＶＤＶでは何れもＯＤ＜０．０１であった）。
CellTram/vario（エッペンドルフ社）を用いたマニピュレーション法により、クローニングしたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、BriClone Hybridoma Cloning Medium（キューイーディーバイオサイエンス社）を用いて培養した。
〔モノクローナル抗体の性能比較のための間接サンドイッチＥＬＩＳＡ〕
モノクローナル抗体１６Ｄ６の性能を確かめるために、間接サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。比較として、７種類全ての血清型の口蹄疫ウイルスと反応する既知のモノクローナル抗体１Ｈ５を用いた。１Ｈ５抗体については、非特許文献１を参照すればよい。
モノクローナル抗体１６Ｄ６の性能を確かめるために、間接サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。比較として、７種類全ての血清型の口蹄疫ウイルスと反応する既知のモノクローナル抗体１Ｈ５を用いた。１Ｈ５抗体については、非特許文献１を参照すればよい。
捕捉抗体として各血清型の抗口蹄疫ウイルスウサギ抗体を０．０５Ｍの炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で×８００に希釈し、５０μＬずつ９６ウェルプレート（Immulon II HB Thermo）に４℃で一晩固相化した。３００μＬ／ｗｅｌｌの０．００２Ｍ ＰＢＳで３回洗浄した後、口蹄疫ウイルス（抗原）を含むサンプルを５０μＬずつウェルに加え、１００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間反応させた。このとき、陰性検体として０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．０５%（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を加えたＡ液を使用した。同様に洗浄した後、Ａ液に５％のスキムミルクを加えＢ液とし、３７℃で３０分間ブロッキングした。Ｂ液を捨てた後、洗浄せずに、Ａ液で１μｇ〜０．００００６４μｇの５倍階段希釈を行ったモノクローナル抗体１Ｈ５および１６Ｄ６をそれぞれ加えた。３７℃で１時間反応させた後、Ｂ液で×３０００に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンヤギ抗体を５０μＬずつ加え、室温で４５分間反応させた。８回洗浄した後、発色基質ＴＭＢを５０μＬずつ加え、暗所にて室温で１５分間反応させた。５０μＬの１．２５Ｍ 硫酸で反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの波長を測定した。
なお、血清型ＯとしてＯ／ＪＰＮ／２０００株、血清型ＡとしてＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株およびＡ２２／ＩＲＱ／２４／６４株、血清型Ａｓｉａ１としてＡｓｉａ１ Ｓｈａｍｉｒ（ＩＳＲ ３／８９）株、血清型ＣとしてＣ／ＰＨＩ／７／８４株、血清型ＳＡＴ１としてＳＡＴ１／ＫＥＮ／１１７／２００９株、血清型ＳＡＴ２としてＳＡＴ２／ＳＡＵ／６／２０００株、血清型ＳＡＴ３としてＳＡＴ３／ＺＩＭ／３／８３株を用いた。
結果を図３に示す。図３に示すように、１６Ｄ６抗体では８種類の株のうち７種類の株において１Ｈ５抗体よりも反応性が高かった。特に、１Ｈ５抗体では反応性が比較的低いＡ／ＩＲＮ／１／２０１１株、ＳＡＴ１／ＫＥＮ／１１７／２００９株、ＳＡＴ２／ＳＡＵ／６／２０００株、およびＳＡＴ３／ＺＩＭ／３／８３株において、顕著に反応性が高くなっている。このように、１６Ｄ６抗体は１Ｈ５抗体と比較して非常に優れた反応性を示すことがわかった。
〔モノクローナル抗体を用いた口蹄疫ウイルス抗原検出ＥＬＩＳＡ〕
（抗体の精製）
使用するモノクローナル抗体をプロテインＧアフィニティーカラム（MAb Trap Kit；GE Healthcare 17-1128-01）にかけて、アッセイに使用するためのＩｇＧ分画のみを精製した。
（抗体の精製）
使用するモノクローナル抗体をプロテインＧアフィニティーカラム（MAb Trap Kit；GE Healthcare 17-1128-01）にかけて、アッセイに使用するためのＩｇＧ分画のみを精製した。
（抗体懸濁液における緩衝液の置換）
抗体の精製によって得られたＩｇＧ分画を含んでいる抗体懸濁液における緩衝液を、Amicon ultra Centrifugal filter units（Millipore社、商品コード：UFC805024）を用いて０．０１ＭのＰＢＳに置換した。
抗体の精製によって得られたＩｇＧ分画を含んでいる抗体懸濁液における緩衝液を、Amicon ultra Centrifugal filter units（Millipore社、商品コード：UFC805024）を用いて０．０１ＭのＰＢＳに置換した。
（ペルオキシダーゼ標識のモノクローナル抗体の作製）
Peroxidase Labeling Kit-SH（同仁化学社、商品コード：LK09）用いて、各抗原に対する抗原検出用のモノクローナル抗体（１６Ｄ６または１Ｈ５）にペルオキシダーゼ標識をした。
Peroxidase Labeling Kit-SH（同仁化学社、商品コード：LK09）用いて、各抗原に対する抗原検出用のモノクローナル抗体（１６Ｄ６または１Ｈ５）にペルオキシダーゼ標識をした。
（ＭＳＤ（monoclonal antibody based sandwich direct）−ＥＬＩＳＡ法）
捕捉抗体としてのモノクローナル抗体（１６Ｄ６または１Ｈ５）を０．０５Ｍの炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で０．２μｇ／５０μＬに希釈し、９６ウェルプレート（Immulon II HB Thermo）の各ウェルに５０μＬずつ分注し、４℃で一晩固相化した。洗浄液（０．００２ＭのＰＢＳ、３００μＬ／ｗｅｌｌ）で４回洗浄した後、口蹄疫ウイルス抗原を含むサンプルを５０μＬずつウェルに加え、１００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間反応させた。このとき、陰性検体として０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を加えたＡ液を使用した。固相化後の洗浄と同様に洗浄した後、Ｂ液（Ａ液に８％のスキムミルクを加えた溶液）を用いて、室温で２０分間ブロッキングした。Ｂ液を捨てた後、洗浄せずに、Ｂ液で５００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体を５０μＬずつウェルに加え、３７℃で４５分間反応させた。上記洗浄液で８回洗浄した後、５０ｍＬの０．０５Ｍのリン酸クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に３０ｍｇのＯＰＤおよび３％（ｗ／ｖ）の過酸化水素を加えた発色基質を５０μＬずつウェルに加え、暗所にて室温で１５分間反応させた。５０μＬの１．２５Ｍの硫酸で反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４９２ｎｍおよび６９０ｎｍの波長を測定した。
捕捉抗体としてのモノクローナル抗体（１６Ｄ６または１Ｈ５）を０．０５Ｍの炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で０．２μｇ／５０μＬに希釈し、９６ウェルプレート（Immulon II HB Thermo）の各ウェルに５０μＬずつ分注し、４℃で一晩固相化した。洗浄液（０．００２ＭのＰＢＳ、３００μＬ／ｗｅｌｌ）で４回洗浄した後、口蹄疫ウイルス抗原を含むサンプルを５０μＬずつウェルに加え、１００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間反応させた。このとき、陰性検体として０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を加えたＡ液を使用した。固相化後の洗浄と同様に洗浄した後、Ｂ液（Ａ液に８％のスキムミルクを加えた溶液）を用いて、室温で２０分間ブロッキングした。Ｂ液を捨てた後、洗浄せずに、Ｂ液で５００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体を５０μＬずつウェルに加え、３７℃で４５分間反応させた。上記洗浄液で８回洗浄した後、５０ｍＬの０．０５Ｍのリン酸クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に３０ｍｇのＯＰＤおよび３％（ｗ／ｖ）の過酸化水素を加えた発色基質を５０μＬずつウェルに加え、暗所にて室温で１５分間反応させた。５０μＬの１．２５Ｍの硫酸で反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４９２ｎｍおよび６９０ｎｍの波長を測定した。
結果を図２〜４に示す。図２〜４に示すように、１６Ｄ６抗体と１Ｈ５抗体とを組み合わせた場合、より高い反応性がみられた。特に、捕捉抗体として１Ｈ５抗体を用い、抗原検出抗体として１６Ｄ６抗体を用いた場合、さらに高い反応性がみられた。
本発明は、口蹄疫ウイルスの検出に利用することができる。
NITE P−01972
Claims (8)
- 受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマによって産生される抗体。
- 受託番号NITE P−01972で特定される抗体産生用ハイブリドーマ。
- 請求項１に記載の抗体を含む口蹄疫ウイルス検出キット。
- 口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応する、請求項１に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体をさらに含む、請求項３に記載の口蹄疫ウイルス検出キット。
- 請求項１に記載の抗体を用いる口蹄疫ウイルスの検出方法。
- 被験体から採取した試料と、請求項１に記載の抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と、当該抗体とを抗原抗体反応させる工程；および
抗原抗体反応物を検出する工程を含む、請求項５に記載の検出方法。 - 被験体から採取した試料と基材に固定された抗口蹄疫ウイルス一次抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と当該一次抗体とを抗原抗体反応させる工程；
上記抗原と標識に結合された抗口蹄疫ウイルス二次抗体とを接触させて、当該抗原と当該二次抗体とを抗原抗体反応させる工程；および
上記標識を検出する工程を含み、
上記一次抗体および上記二次抗体のうちの少なくとも一方が、請求項１に記載の抗体である、請求項５に記載の検出方法。 - 上記一次抗体および上記二次抗体のうちの一方が、請求項１に記載の抗体であり、
上記一次抗体および上記二次抗体のうちのもう一方が、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３の何れとも反応する、請求項１または２に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体である、請求項７に記載の検出方法。
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| CN106405092A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-15 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种基于型特异性单抗的o型口蹄疫病毒抗体固相竞争elisa试剂盒 |
| KR20200059381A (ko) * | 2018-11-20 | 2020-05-29 | 주식회사 메디안디노스틱 | 구제역 바이러스 탐지용 단일클론항체 및 이의 용도 |
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| JP2013050356A (ja) * | 2011-08-30 | 2013-03-14 | National Agriculture & Food Research Organization | 抗体を用いて口蹄疫ウイルスを検出する方法 |
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