JP2016132629A - 口蹄疫ウイルスと反応する抗体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマによって産生される抗体。
【選択図】なし
Description
(1)受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマによって産生される抗体。
(2)受託番号NITE P−01972で特定される抗体産生用ハイブリドーマ。
(3)上記(1)に記載の抗体を含む口蹄疫ウイルス検出キット。
(4)口蹄疫ウイルスの血清型O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2およびSAT3の何れとも反応する、上記(1)に記載のモノクローナル抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体をさらに含む、上記(3)に記載の口蹄疫ウイルス検出キット。
(5)上記(1)に記載の抗体を用いる口蹄疫ウイルスの検出方法。
(6)被験体から採取した試料と、上記(1)に記載の抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と、当該抗体とを抗原抗体反応させる工程;および抗原抗体反応物を検出する工程を含む、上記(5)に記載の検出方法。
(7)被験体から採取した試料と基材に固定された抗口蹄疫ウイルス一次抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と当該一次抗体とを抗原抗体反応させる工程;上記抗原と標識に結合された抗口蹄疫ウイルス二次抗体とを接触させて、当該抗原と当該二次抗体とを抗原抗体反応させる工程;および上記標識を検出する工程を含み、上記一次抗体および上記二次抗体のうちの少なくとも一方が、上記(1)に記載の抗体である、上記(5)に記載の検出方法。
(8)上記一次抗体および上記二次抗体のうちの一方が、上記(1)に記載の抗体であり、上記一次抗体および上記二次抗体のうちのもう一方が、口蹄疫ウイルスの血清型O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2およびSAT3の何れとも反応する、上記(1)に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体である、上記(7)に記載の検出方法。
本発明に係る抗体は、受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマによって産生される抗体(「16D6」と名付けた)である。16D6抗体は、口蹄疫ウイルスの7つ全ての血清型(O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2およびSAT3)を認識することができるモノクローナル抗体である。16D6抗体は、受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマを、例えば、10%胎児血清を含む培地中でまたは無血清培地中で、37℃、5% CO2の条件で培養し、産生された16D6抗体を公知の方法に従って回収・精製することによって、製造することができる。
本発明はまた、受託番号NITE P−01972で特定される抗体産生用ハイブリドーマも提供する。本発明に係るハイブリドーマは、ウシから分離された口蹄疫ウイルスA22/IRQ/24/64株(文献:ARROWSMITH, A. E. M. (1975). Variation among strains of type A foot-and-mouth disease virus in the Eastern Mediterranean region 1964-1972. Journal of Hygiene 75, 387-397)を抗原として、マウスに免疫し、免疫したマウスの脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞由来株とを融合させて作成されたハイブリドーマ(抗口蹄疫ウイルス hybridoma 16D6(受託番号NITE P−01972))である。ハイブリドーマ16D6は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番地8 122号室)に寄託されている。
本発明はさらに、16D6抗体を含む口蹄疫ウイルス検出キットを提供する。本発明に係る口蹄疫ウイルス検出キットは、例えば、ELISA法、イムノクロマトグラフィー法、または免疫拡散測定法等を利用したキットであり得る。
本発明はさらに、16D6抗体を用いる口蹄疫ウイルスの検出方法を提供する。被験体としては、ウシ、ブタ、シカ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、イノシシ、およびカモシカ等が挙げられる。被験体から採取した試料としては、血液、水疱液、糞、尿、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、水疱上皮乳剤、病変部拭い液、種々の組織・器官などが挙げられる。本発明に係る検出方法を用いて、試料中の口蹄疫ウイルスを検出することで、この試料が由来する被験体が口蹄疫ウイルスによる感染症に罹患しているか否かを迅速、容易かつ確実に診断できる。
口蹄疫ウイルスA22/IRQ/24/64株をIB−RS−2細胞に接種し、一晩回転培養した。回収した培養液を1500Gで10分間遠心した後、上清を回収した。上清を飽和硫酸アンモニウム溶液と等量混和し、一晩4℃で撹拌することによってウイルスを析出させた。析出させたウイルスを、5000Gで30分間遠沈し、上清を除去してから適量のPBSに懸濁した。再び5000Gで30分間遠心し、上清を除去し、1mLのPBSに懸濁した。スクロース密度勾配(15〜45%)ウイルスの懸濁液を添加し、20000rpmで2時間遠心を行い、目的のバンドを回収することによって、146Sの完全粒子を精製した。
モノクローナル抗体16D6の性能を確かめるために、間接サンドイッチELISAを行った。比較として、7種類全ての血清型の口蹄疫ウイルスと反応する既知のモノクローナル抗体1H5を用いた。1H5抗体については、非特許文献1を参照すればよい。
(抗体の精製)
使用するモノクローナル抗体をプロテインGアフィニティーカラム(MAb Trap Kit;GE Healthcare 17-1128-01)にかけて、アッセイに使用するためのIgG分画のみを精製した。
抗体の精製によって得られたIgG分画を含んでいる抗体懸濁液における緩衝液を、Amicon ultra Centrifugal filter units(Millipore社、商品コード:UFC805024)を用いて0.01MのPBSに置換した。
Peroxidase Labeling Kit-SH(同仁化学社、商品コード:LK09)用いて、各抗原に対する抗原検出用のモノクローナル抗体(16D6または1H5)にペルオキシダーゼ標識をした。
捕捉抗体としてのモノクローナル抗体(16D6または1H5)を0.05Mの炭酸バッファー(pH9.6)で0.2μg/50μLに希釈し、96ウェルプレート(Immulon II HB Thermo)の各ウェルに50μLずつ分注し、4℃で一晩固相化した。洗浄液(0.002MのPBS、300μL/well)で4回洗浄した後、口蹄疫ウイルス抗原を含むサンプルを50μLずつウェルに加え、100rpmで振とうしながら37℃で1時間反応させた。このとき、陰性検体として0.01MのPBS(pH7.4)に0.05%(v/v)のTween20を加えたA液を使用した。固相化後の洗浄と同様に洗浄した後、B液(A液に8%のスキムミルクを加えた溶液)を用いて、室温で20分間ブロッキングした。B液を捨てた後、洗浄せずに、B液で500倍に希釈したペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体を50μLずつウェルに加え、37℃で45分間反応させた。上記洗浄液で8回洗浄した後、50mLの0.05Mのリン酸クエン酸バッファー(pH5.0)に30mgのOPDおよび3%(w/v)の過酸化水素を加えた発色基質を50μLずつウェルに加え、暗所にて室温で15分間反応させた。50μLの1.25Mの硫酸で反応を停止させ、ELISAプレートリーダーを用いて492nmおよび690nmの波長を測定した。
Claims (8)
- 受託番号NITE P−01972で特定されるハイブリドーマによって産生される抗体。
- 受託番号NITE P−01972で特定される抗体産生用ハイブリドーマ。
- 請求項1に記載の抗体を含む口蹄疫ウイルス検出キット。
- 口蹄疫ウイルスの血清型O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2およびSAT3の何れとも反応する、請求項1に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体をさらに含む、請求項3に記載の口蹄疫ウイルス検出キット。
- 請求項1に記載の抗体を用いる口蹄疫ウイルスの検出方法。
- 被験体から採取した試料と、請求項1に記載の抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と、当該抗体とを抗原抗体反応させる工程;および
抗原抗体反応物を検出する工程を含む、請求項5に記載の検出方法。 - 被験体から採取した試料と基材に固定された抗口蹄疫ウイルス一次抗体とを接触させて、当該試料中の抗原と当該一次抗体とを抗原抗体反応させる工程;
上記抗原と標識に結合された抗口蹄疫ウイルス二次抗体とを接触させて、当該抗原と当該二次抗体とを抗原抗体反応させる工程;および
上記標識を検出する工程を含み、
上記一次抗体および上記二次抗体のうちの少なくとも一方が、請求項1に記載の抗体である、請求項5に記載の検出方法。 - 上記一次抗体および上記二次抗体のうちの一方が、請求項1に記載の抗体であり、
上記一次抗体および上記二次抗体のうちのもう一方が、口蹄疫ウイルスの血清型O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2およびSAT3の何れとも反応する、請求項1または2に記載の抗体とは別の抗口蹄疫ウイルス抗体である、請求項7に記載の検出方法。
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