ES2555790B1

ES2555790B1 - Método de obtención de un array de micropartículas planares con multiplexado molecular superficial, array obtenido y su uso

Info

Publication number: ES2555790B1
Application number: ES201430864A
Authority: ES
Inventors: Jaume Esteve Tintó; Jose Antonio Plaza Plaza; Marta Duch Llobera; Núria TORRAS ANDRÉS; Maria Luisa PÉREZ GARCÍA; Juan Pablo AGUSIL ANTONOFF
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universitat de Barcelona UB
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Universitat de Barcelona UB
Priority date: 2014-06-05
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2016-10-13
Anticipated expiration: 2034-06-05
Also published as: WO2015185782A1; ES2758182T3; US20170184576A1; EP3153855A1; US20210181189A1; EP3153855A4; DK3153855T3; US11921110B2; ES2555790A1; EP3153855B1; US20230118650A1

Abstract

Método de obtención de un array de micropartículas planares con multiplexado molecular superficial, array obtenido y su uso.#La invención se refiere a la fabricación controlada de un array de micropartículas planares con multiplexado de moléculas en su superficie, cuya misión es funcionar como sensores y/o actuadores moleculares. La presente invención propone una matriz (array) de micropartículas en cuya superficie están impresos todos los componentes moleculares necesarios para dotarlas de funcionalidad. Es posible fabricar este producto gracias al diseño de un proceso en el cual los diferentes elementos moleculares son multiplexados en la superficie de cada partícula mientras están soportadas sobre un sustrato gracias al grabado de un pie debajo de ellas. Estas micropartículas pueden ser liberadas mecánicamente del soporte donde se fabrican por un método mecánico de ruptura controlada, que es un método no agresivo químicamente y por tanto no afecta a las moléculas previamente impresas en su superficie. El array y las partículas que contiene presentan una gran versatilidad en aplicaciones tanto químicas y/o biológicas.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

DESCRIPCION

Metodo de obtencion de un array de macropartlculas planares con multiplexado molecular superficial, array obtenido y su uso.

SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCION

La presente invention esta dirigida a la aplicacion de nuevas tecnicas de fabrication de arrays de micropartlculas en el amplio campo de la ingenierla. Por la propia naturaleza del array obtenido asl como de las micropartlculas que contiene y que pueden ser individualizadas mediante metodos mecanicos, el area de aplicacion de esta invencion es muy amplia, englobando tanto los sectores de la qulmica, la biologla celular, la medicina y la farmacia.

ESTADO DE LA TECNICA

En el campo de la ingenierla y la ciencia de materiales se entiende como partlcula cualquier ente, de escala micro o nanometrica, dotado de masa y que puede ser obtenido de forma natural o artificial a partir de procedimientos flsico-qulmicos. Actualmente, las distintas tecnicas existentes para la obtencion de micro y nanopartlculas pueden clasificarse en dos grandes grupos, en funcion de si estas se fabrican directamente de forma individualizada, o bien si son obtenidas en forma de matriz ordenada o array.

Todas las tecnicas englobadas en el primero de los grupos enumerados (fabricacion individualizada de partlculas) estan basadas en dos tipos de aproximaciones distintas, denominadas aproximacion descendente (top-down approach) y aproximacion ascendente (bottom-up approach). La primera de ellas se basa en la obtencion de material particulado a partir de un bulk o bloque de material o estructuras mas grandes, a traves de progresivas reducciones de tamano (Dorian A. Canelas, Kevin P. Herlihy and Joseph M. DeSimone. Wiley Inter. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. (2009), 1, 4, 391-404). La aproximacion ascendente, por otro lado, consiste en la slntesis qulmica supramolecular, que utiliza la information qulmica contenida en los distintos componentes individuales (atomos o moleculas) para conseguir su agrupacion espontanea en partlculas complejas mas grandes, mediante procesos de auto-ensamblaje (self-assembly; Wei Wang, Baohua Gu, Liyuan Liang and William Hamilton. J. Phys. Chem. B (2003), 107, 3400-3404). En los ultimos anos ha aumentado el interes cientlfico para el desarrollo de nuevos materiales y compuestos basados en pollmeros. Mediante el uso de tecnicas de slntesis qulmica, se han desarrollado tecnicas tan diversas como flow-focusing o pulverization o la microemulsion que, combinadas con la microfluldica, estan siendo empleadas tambien para la fabricacion de partlculas, tanto simples como compuestas (K. P. Yuet, D. K. Hwang, R. Haghgooie and P. S. Doyle. Langmuir (2010), 26, 6, 4281-4287).

Todas estas tecnicas de autoensamblado tienen en comun la obtencion directa de grandes cantidades de partlculas identicas, de forma individualizada y a un bajo coste. El principal inconveniente que presentan estos metodos de fabricacion de partlculas es que para su funcionalizacion deben aplicarse metodos estrictamente qulmicos, pudiendo obtener asl una funcionalizacion unica (identica) y total en todas ellas, o bien una combination de dos o mas funcionalizaciones mediante el uso de sustancias qulmicas siempre que no se afecten entre si; es un proceso diflcil y de gran complejidad debido a las multiples incompatibilidades que ello comporta (ni versatilidad ni discretization). Las partlculas obtenidas por los metodos anteriormente descritos suelen emplearse en el campo de la farmacia y la biomedicina como sistemas de transporte de farmacos o drug delivery systems (Tasciotti E., Liu XW, Bhavane R., Plant K., Leonard A.D., Price B.K., Cheng M.M.C., Decuzzi P., Tour J.M., Robertson F.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

and Ferrari M. Nature Nanotechnol. (2008), 3, 3, 151-157) y como portadores o nanocarriers (D. Peer, J.M. Karp, S. Hong, O.C. Farokhzad, R. Margalit and R. Langer. Nat. Nanotechnol. (2007), 2, 751-760); aunque tambien son muy empleadas, en el caso de partlculas magneticas, como separadores magneticos o magnetic separation bioprocesses, mediante procesos de magneto- y electromagnetoforesis, as! como para la investigation de nuevos materiales y compuestos.

Por otro lado, esta el conjunto de tecnicas de fabrication de matrices ordenadas de partlculas, basadas en procesos de fabricacion de micro- y nanoelectronica. Estas tecnicas, tanto las basadas en los procesos de fotolitografla convencional (M.-H. Wu and G. M. Whitesides. Appl. Phys. Lett., (2001), 78, 16, 2273-2275) como las basadas en procesos conocidos como soft-lithography o litografla blanda (Y. N. Xia and G. M. Whitesides. Angew. Chem., Int. Ed. (1998), 37, 551-557), tales como el micromodelado o micromolding, la impresion por microcontacto o microcontact printing (MCP), entre otras, permiten tambien la production simultanea de miles de unidades (concepto batch processing), de forma controlada y a bajo coste, pero con una alta adaptabilidad para el uso de materiales tan diversos como metales y pollmeros, incluyendo un gran numero de biomateriales, y la posibilidad de realizar combinaciones entre ellos. Estos procesos dotan a las partlculas disenadas de una gran versatilidad, tanto de forma como de dimensiones, pudiendose obtener, de forma simultanea, distintos tipos de partlculas. Aunque en algunos casos el proceso de fabricacion de este tipo de partlculas sea mas complejo que los anteriormente mencionados, estas tecnicas permiten la obtencion de partlculas con multiples superficies, abriendo el abanico a gran variedad de posibles aplicaciones. Gracias a su localizacion ordenada y controlada en la superficie del sustrato donde se fabrican, estas partlculas permiten aplicar distintos tipos de funcionalizacion en una misma partlcula, de forma localizada dentro de la misma. Actualmente, las tecnicas existentes para la separation de partlculas, obtenidas por procesos litograficos, del sustrato de fabricacion, concepto conocido como liberation o individualization de partlculas, requieren la utilization de metodos basados en el uso de agentes qulmicos que puede ser agresivos para la moleculas multiplexadas en su superficie, como es el caso de la tecnica de surface (E. Fernandez- Rosas, R. Gomez, E. Ibanez, L. Barrios, M. Duch, J. Esteve, C. Nogues and J. A. Plaza. Small (2009), 5, 21, 2433-2439), donde una capa sacrificial, situada entre la partlcula y el sustrato, es atacada qulmicamente.

Los chips multiplexados (entendido como aquellos chips que reunen en un unico sustrato - partlcula- varios tipos de canales susceptibles de proporcionar y recibir information diferente, por medio de cada una de las funcionalizaciones impresas en su superficie) compuestos por una matriz ordenada de elementos moleculares y con dimensiones en el orden de los centlmetros, como por ejemplo los chips de ADN o DNA chips, han sido ampliamente utilizados en campos como la medicina y la biologla para identification, cuantificacion y determination del funcionamiento de determinadas moleculas S. F. Kingsmore. Nat. Rev. Drug. Discov (2006), 5, 310-320). Para los casos en los cuales se requiere del analisis de pequenos volumenes de muestras la solution tecnologica actual es la produccion de suspensiones de partlculas en las cuales cada elemento esta comprendido por una subpoblacion de partlculas que se diferencian de los otros grupos por tener diferentes atributos anisotropos (forma, dimensiones, color, etc). La falta de multiplexado en una misma partlcula de las que contienen estas suspensiones, caracterlstica que si ofrecen los chips multiplexados, constituye una limitation importante a la hora de analizar pequenos volumenes (por ejemplo, el interior de una celula).

La presente invention recoge una nueva propuesta, basada en la fabricacion de una matriz ordenada de micropartlculas planares con multiplexado molecular en su superficie, de geometrla y dimensiones variables en funcion de su aplicacion final, obtenidas a partir de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

tecnicas de fabrication de microelectronica. La funcionalizacion de su superficie se puede realizar de manera controlada y ordenada con una gran variedad de moleculas simultaneamente, como por ejemplo protelnas y ADN. Las micropartlculas se moldean y preparan sobre un sustrato y estan sostenidas sobre el mismo gracias a un pie de sujecion que se graba debajo de ellas, pudiendo ser separadas (liberadas) por un metodo mecanico de ruptura controlada y en ausencia de tecnicas qulmicas de liberation, gracias a la formation de este nuevo elemento estructural llamado "pie” de la micropartlcula en el array.

Este pie, similar a una columna o pilar, ejerce de elemento de sujecion de dichas micropartlculas que componen el array o matriz al sustrato durante los procesos de moldeo y multiplexado molecular en su superficie, y actua a su vez como elemento concentrador de esfuerzos mecanicos, convirtiendose asl en el punto mas debil de todo el conjunto. Esto permite que, en el caso de querer liberar las partlculas, sea posible la aplicacion de esfuerzos mecanicos direccionados para romper de forma controlada el pie , sin que las micropartlculas ni las moleculas multiplexadas en su superficie se danen porque no se emplean sustancias qulmicas de liberation que puedan afectar a la estructura o funcion de dichas moleculas. Es decir, ademas de poder obtener un array de micropartlculas funcionalizadas en superficie, a diferencia de otros metodos conocidos es posible individualizar las micropartlculas del array mediante un metodo no agresivo qulmicamente, es decir, que no requiere el empleo de agentes qulmicos que puedan danar la integridad de la micropartlcula ni que afecten a la funcionalizacion molecular realizada previamente. Una vez liberadas, dichas micropartlculas, al igual que el array, son capaces de actuar como sensores o actuadores de distintas actividades, tanto qulmicas como biologicas que se produzcan en el medio en el que se encuentren, como por ejemplo determinadas reacciones qulmicas o variaciones de parametros flsicos como son la temperatura y pH, entre otras.

DESCRIPCION BREVE DE LA INVENCION

La invention que aqul se describe se refiere a un array de micropartlculas planares con multiplexado de moleculas en su superficie preparadas a partir de un material originario depositado o crecido sobre un sustrato que hace de soporte, cuya mision es funcionar como detector, sensor y/o actuador molecular en un medio de muestra que puede ser tanto qulmico como biologico. Concretamente, el array se fabrica con tecnologla de microelectronica, y las micropartlculas funcionalizadas que contiene se caracterizan por tener dimensiones que pueden estar comprendidas en el intervalo de 1 pm a 100 pm segun sea requerido en su aplicacion final, siendo posible prepararlas sobre el sustrato en grandes cantidades, con formas y dimensiones bien definidas. Debido a su tamano (micrometrico) y su funcionalizacion en superficie, el array de micropartlculas obtenible a partir del metodo referido presenta una gran versatilidad en lo que a aplicaciones concretas se refiere, pudiendo ser empleadas tanto en medios qulmicos como biologicos, siempre con objetivos cientlfico-tecnicos.

El pie que se graba debajo del material originario de las micropartlculas (que corresponde a la parte superior del soporte) ejerce la funcion de elemento estructural, uniendo individualmente cada micropartlcula al sustrato durante los procesos de fabrication y multiplexado molecular y permitiendo la localization de las micropartlculas de forma ordenada en el sustrato. Ademas, gracias a la formation de este nuevo elemento estructural, las micropartlculas pueden ser separadas del sustrato e individualizadas de forma controlada mediante la aplicacion de esfuerzos mecanicos direccionados, como son los esfuerzos mecanicos transversales, un metodo no agresivo qulmicamente y por tanto que respeta la integridad de las moleculas multiplexadas en su superficie. Asl, toda funcionalizacion previa realizada es preservada sin verse alterada, permitiendo la liberation de las micropartlculas despues de su funcionalizacion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La gran ventaja industrial de este metodo propuesto reside en la posibilidad de fabricar en serie microparriculas de superficie funcionalizada sobre un sustrato, concretamente sobre un pie que hace de soporte y que permite el uso de metodos de estampacion en paralelo para la funcionalizacion molecular de todas las microparriculas simultaneamente, por ejemplo del mismo modo. Ademas, en un caso preferido de la invention, el pie formado debajo del material de origen que da lugar a las microparriculas durante el proceso de fabrication permite conseguir su liberation o individualization por separation mecanica del pie mediante rotura del mismo. Debido a su propio diseno y geometria, semejante a una columna o pilar que sostiene la microparricula, este pie se convierte en la zona mas fragil de la estructura, actuando como concentrador de esfuerzos mecanicos y asegurando la zona de fractura en caso de que se desee la liberacion de las microparriculas para su uso individual.

Idealmente el pie debe tener una section variable (no constante), es decir, con dos zonas diferentes de tal forma que una de ellas es mas estrecha, preferiblemente estando la zona mas estrecha de la seccion en el centro. De esta forma, el pie ofrece la resistencia necesaria para sostener la microparricula durante el proceso de funcionalizacion, y a la vez presenta una zona mas estrecha donde se concentran mayormente los esfuerzos mecanicos en el caso de desear su liberacion controlada. En un caso particular, el pie puede tener tambien una seccion constante siempre que esta sea mas pequena que la seccion de la propia microparricula, preferiblemente menor o igual al 50% del tamano de la seccion de la microparricula.

Debido a su diseno y geometria, tanto el pie como las microparriculas del array pueden estar formados del mismo material, aunque es preferible que el pie este fabricado con materiales fragiles y no ductiles, lo que facilita aun mas su ruptura controlada.

Por tanto, el primer objeto de la presente invencion lo constituye el propio metodo de obtencion de un array de parriculas micrometricas planares funcionalizadas en superficie, metodo que comprende las siguientes etapas:

a) preparar una capa de un material de origen de las microparriculas (tambien denominada capa de estructuracion) sobre un sustrato que sirve de soporte, ripicamente una oblea de silicio aunque puede ser cualquier otro igualmente adecuado para este fin; dicha capa de material originario de las microparriculas puede ser de un material ripico de la microelectronica, como por ejemplo silicio policristalino, oxido de silicio, nitruro de silicio, oro, platino, aluminio, etc.;

b) dar forma a las microparriculas en la capa de estructuracion previamente preparada sobre el soporte mediante tecnicas habituales de la microelectronica basadas en litograria, por las cuales se define la geometria y las dimensiones laterales, y tecnicas de grabado con las que se define el espesor tras preparar la capa;

c) el punto clave del metodo es la formacion de un pie en la parte superior del sustrato que se encuentra debajo de las microparriculas previamente moldeadas, de tal forma que cada pie sustenta una microparricula. La formation del pie de cada microparricula se realiza mediante grabado de dicha parte superior del sustrato, pudiendo dicho grabado realizarse mediante tecnicas habituales de microelectronica. De esta manera, se preparan los pies de las microparriculas suficientemente estables desde el punto de vista mecanico para sustentarlas durante la etapa posterior de funcionalizacion molecular en su superficie, pero suficientemente fragiles tambien para permitir en el caso deseado su ruptura de forma contralada, al aplicar fuerzas mecanicas direccionadas, que permiten la ruptura del pie y la liberacion de la microparricula del

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

array. Por ello es recomendable que el pie este fabricado de un material fragil como el silicio; y

d) funcionalizar la superficie de las micropartlculas que estan sostenidas por los pies mediante al menos un componente molecular, preferentemente mediante un metodo que permita funcionalizar en paralelo un gran numero de micropartlculas, a modo de ejemplo: tecnicas de litografla blanda como la impresion por microcontacto (microcontact printing, MCP), la nanolitografla por dip-pen (dip-pen nanolithography, DPN), la litografla por polymer-pen (polymer-pen lithography, PPL) o la litografla por nanoimpresion (nano-imprint lithography, NIL).

Basicamente, el sustrato que actua de soporte para la fabrication de las micropartlculas es recubierto de una capa que define el material primigenio de las mismas, que se van a moldear posteriormente, y que puede ser seleccionado dentro del grupo de materiales compuesto por: silicio y sus derivados (oxido o nitruro de silicio, silicio policristalino), oro, platino, aluminio, cobre, nlquel, cobalto o cromo; oxidos metalicos; y silicatos o siliciuros de metales compatibles como el de tantalio, hierro, o aluminio. Esta capa es estructurada o moldeada sobre el sustrato para definir la forma deseada de las micropartlculas, y posteriormente se estructura o define el pie que esta localizado debajo de las mismas.

El pie ejerce una doble funcion. Por un lado, mantiene unida la micropartlcula al sustrato durante todo el proceso de fabricacion de las mismas as! como durante los subsiguientes pasos de funcionalizacion, asegurando su posicion en todo momento. Por otro lado, al ser la parte mas debil y fragil de toda la estructura, actua como elemento concentrador de esfuerzos permitiendo su ruptura en el caso de que se desee separar o liberar las micropartlculas de la matriz.

Tras preparar o moldear el pie de las micropartlculas mediante grabado parcial (es decir, solo en parte o no toda la section de forma constante, porque es preferible una forma de columna o pilar), se funcionaliza la superficie de dichas micropartlculas con los diferentes elementos moleculares que se seleccionen (como por ejemplo, compuestos organicos, cadenas polimericas, protelnas, ADN, etc.). Esta action se realiza en paralelo, aunque dado que el sustrato contiene varias micropartlculas en su superficie la funcionalizacion en paralelo puede repetirse en serie para dotar a las partlculas de mas de una funcionalizacion, o bien es posible repetir la impresion de la misma sustancia varias veces. Asl, gracias a la funcionalizacion se consigue el multiplexado de las micropartlculas, de tal forma que en la superficie de cada una de ellas se localizan ordenadamente un unico elemento molecular impreso mas de una vez o mas de un elemento molecular diferente, a diferencia de los chips planares de matrices moleculares, con dimensiones en el orden de los centlmetros, que no permiten el analisis de pequenos volumenes como puede ser por ejemplo una celula de una muestra ex vivo e in vitro, y a diferencia de las suspensiones de subpoblaciones de micro- nanopartlculas conocidas donde cada subpoblacion presenta un unico elemento molecular pero que no permiten el analisis multiplexado en una misma micropartlcula. La realization de un array de micropartlculas multifuncionalizadas molecularmente en el orden de las micras como es el caso de la presente invencion permite ademas el analisis molecular multiplexado en pequenos volumenes.

El array de micropartlculas, tras su funcionalizacion, puede ser almacenado en seco.

Un segundo objeto de la presente invention se refiere al propio array de micropartlculas planares funcionalizadas en superficie obtenible a partir del metodo antes descrito, asl como de las propias micropartlculas que pueden ser separadas de la matriz mediante un metodo de ruptura mecanica controlada del pie. De manera preferible, se puede preparar una suspension de estas micropartlculas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

El array de las micropartlculas, asl como las propias micropartlculas funcionalizadas y liberadas del soporte, y la suspension que se puede preparar con las micropartlculas pueden actuar gracias a sus propiedades como detectores, sensores y/o actuadores moleculares . O dicho de otro modo, la invention cubre tambien como un tercer objeto el uso de estos productos como sensores, actuadores o detectores de parametros flsicos, qulmicos y biologicos simultaneamente o por separado en un medio o muestra.

La presente invencion se basa en la observation relativa del array de las micropartlculas, las cuales son fabricadas sobre el soporte con dimensiones micrometricas (dimensiones flsicas laterales comprendidas preferentemente entre 1 pm y 100 pm, y preferiblemente con un espesor de entre los 20 nm y las 5 pm) y debidamente funcionalizadas molecularmente mediante determinados rasgos trazados de forma selectiva y controlada en su superficie.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1: Representation de dos posibles configuraciones de micropartlculas en el array obtenido mediante el metodo descrito, una con forma de paraleleplpedo de anchura A, longitud L y espesor E, y la otra con forma circular o de disco, de diametro D y espesor E, de acuerdo con la invencion, donde (1) representa el material que hace de pie, (2) la micropartlcula y el sustrato (4). 1.A muestra las vistas en perspectiva y 1.B muestra la vista de una seccion.

Figura 2: Representacion de una posible configuration de micropartlcula sobre el soporte en el array, donde su superficie superior ha sido recubierta, de manera localizada, con diferentes elementos moleculares, disenadas para su funcionalizacion (3). 2.A muestra una vista de una section y 2.B muestra una vista en perspectiva.

Figura 3: Esquema de un proceso preferido de fabrication del array de micropartlculas basado en tecnologla microelectronica, procesos fotolitograficos y ataques de capas, de acuerdo con el Ejemplo 1, donde tras obtener la matriz de micropartlculas estas son liberadas y preparadas en suspension. Seccion recta que muestra el proceso de fabricacion de una micropartlcula, con un sustrato principalmente oblea de silicio (4) que actua de soporte, sobre el cual se tiene una capa (5), tlpicamente de silicio policristalino, oxido de silicio, nitruro de silicio, oro, platino, aluminio, cromo, que constituyo el material primigenio que dio lugar a las micropartlculas (2) (Fig. 3.A). Para definir las micropartlculas, se deposito sobre dicha capa de material primigenio de las micropartlculas una capa de fotoresina (6) (Fig. 3.B), la cual fue a continuation eliminada parcialmente de determinadas zonas (7) formando una capa de fotoresina estructurada (8) que contenla la geometrla y dimensiones laterales de las micropartlculas a fabricar (Fig. 3.C). Dichas micropartlculas se formaron (estructuraron) mediante un ataque a la capa de material primigenio de las mismas (5) en las zonas descubiertas (7) donde previamente se habla eliminado la capa de fotoresina (6), formando asl el cuerpo de la/s micropartlcula/s (2), (Fig. 3.D). Posteriormente se realizo un grabado del sustrato de silicio (4) inmediatamente por debajo de las micropartlculas (2) para formar el pie (1) (Fig. 3.E). La fotoresina remanente (8) fue eliminada de la parte superior de las micropartlculas (2). Posteriormente se procedio a la funcionalizacion molecular de las micropartlculas con mas de un elemento molecular (3) (Fig. 3.F). Finalmente, las micropartlculas (2) funcionalizadas fueron liberadas del sustrato (4) mediante ruptura controlada, y fueron recolectadas en un medio acuoso, en este ejemplo, agua desmineralizada previamente filtrada, obteniendose la suspension de las micropartlculas (9).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

DESCRIPCION DETALLADA Y MODO DE REALIZACION DE LA INVENCION

Como se ha dicho en el apartado anterior, el pie se fabrica mediante moldeado por grabado de la parte superior del sustrato, que esta en contacto directo con la parte inferior de la capa de material originario de las micropartlculas. En una realization particular de la invention, el sustrato esta formado por un unico material, siendo mas preferiblemente una oblea de silicio, aunque puede ser otro tipo de sustrato adecuado que de soporte mecanico para la fabrication de las micropartlculas, como por ejemplo el vidrio borosilicatado (comunmente conocido por el nombre comercial de Pyrex o Duran) o el vidrio de silicato sodocalcico, mas conocido por su termino en ingles soda-lime, entre otros. No obstante, la invencion no se limita unicamente a estos materiales del soporte, ya que cualquier entendido conoce que tipos de materiales son adecuados y pueden ejercer la funcion pretendida; basicamente, son todos aquellos que cumplen las siguientes condiciones:

- ser resistentes a los procesos termicos de deposito, evaporation y crecimiento de capas;

- ser estables a temperatura ambiente;

- ser resistentes a ciertos agentes qulmicos (compuestos en fase llquida o gas) para permitir la estructuracion/grabado/procesado en general de las capas que hay en ellos sin que el propio sustrato se vea afectado (aunque a veces, es necesario protegerlos pues los agentes qulmicos suelen ser muy agresivos); y

- permitir su propia estructuracion/grabado (parcial o total). Este serla el caso en que el pie de las micropartlculas se fabrica a partir del mismo sustrato.

En definitiva, el sustrato debe ejercer principalmente la funcion de soporte, y por tanto debe ser suficientemente rlgido para soportar las estructuras y debe mantener su integridad frente al procesado de estas sin romperse. Y ademas, en esta realizacion preferida, debe permitir tambien la formation del pie en su parte superior, que se encuentra en contacto con el material originario de las micropartlculas. En un caso particular de la invencion, el soporte o sustrato puede ser del mismo material que se emplee para la capa originaria de las micropartlculas. Por ejemplo, pueden fabricarse micropartlculas sobre un sustrato que es una oblea de silicio con un pie de silicio (es decir, grabado en el mismo sustrato) donde las partlculas han sido moldeadas en una capa de polisilicio; esto permite la posible realizacion posterior de procesos termicos de dopado para dotar a las micropartlculas de cargas.

En otra realizacion particular de la invencion, alternativa a la anterior, el sustrato esta formado por al menos dos materiales, de tal forma que contiene un segundo material en su estructura que se localiza en la parte superior en forma de capa, donde ha sido depositado o crecido. De esta forma, el pie puede moldearse por grabado de este segundo material contenido la parte superior del sustrato. Si el sustrato contiene un segundo material en la parte superior de su estructura, donde se van a grabar los pies, este puede ser el mismo material que el usado para la fabricacion de las propias micropartlculas o bien un material distinto, preferiblemente mas fragil y menos ductil que la capa de estructuracion para garantizar as! su correcto comportamiento frente a los posteriores esfuerzos de ruptura, como es el silicio policristalino. Por ejemplo, es posible usar un sustrato de silicio (oblea) unicamente como soporte de la capa que va a dar origen al pie y a las micropartlculas, sin que intervenga para nada en la fabricacion de los dispositivos que se definen en el. El silicio es muy aconsejable, aunque no el unico, porque es el material por excelencia en la microelectronica, siendo compatible con la mayorla de procesos y resistente a cambios de temperatura y agentes qulmicos.

Del mismo modo, la preparation en la etapa a) de la capa de estructuracion, o lo que es lo mismo la capa que constituye el material que da lugar a las micropartlculas, puede llevarse

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

a cabo mediante deposition o mediante crecimiento sobre el propio sustrato. Los materiales de los que puede estar hecha la capa de estructuracion pueden ser seleccionados dentro del grupo compuesto por: silicio y sus derivados (oxido o nitruro de silicio, silicio policristalino), oro, platino, aluminio, cobre, nlquel, cobalto, cromo; oxidos metalicos; y silicatos o siliciuros de metales compatibles como el de tantalio, hierro o aluminio. Esta capa puede ser depositada o se puede hacer crecer por cualquier metodo utilizado en microelectronica: crecimiento termico, deposito qulmico en fase de vapor, pulverization catodica (sputtering), evaporation u otros metodos comunes actualmente. El metodo seleccionado para ello vendra determinado por la election de los materiales a utilizar.

Para garantizar un buen comportamiento mecanico de toda la estructura (micropartlcula mas pie), es preferible que el material elegido para la capa de estructuracion y el material del sustrato que se va a grabar en forma de pie, ya sea el sustrato de un material o que contiene un segundo material en su parte superior, tengan una relation entre sus llmites de ruptura igual o superior a uno (Lrupt_part/Lrupt_pie >1). De esta manera, se garantiza no solo la sujecion de las partlculas durante su funcionalizacion, sino tambien que el pie sea mas fragil que la micropartlcula y por tanto, sea mas vulnerable a la ruptura frente a la aplicacion de esfuerzos mecanicos en caso de que se desee la liberacion controlada de dichas micropartlculas del sustrato (facilita su liberation). No obstante, si la aplicacion final lo requiere, la capa de estructuracion y el segundo material que contiene el sustrato en su parte superior pueden estar fabricados del mismo material, ya que su propio diseno y geometrla asl lo permiten.

El metodo de fabrication de las micropartlculas basado en tecnologla microelectronica permite la definition de sus dimensiones mediante el uso de tecnicas fotolitograficas preferentemente, tecnicas de uso comun en el campo de la microelectronica. La utilization del tecnicas fotolitograficas permite la formation de micropartlculas en formas y dimensiones especlficas, elegidas bajo un criterio tecnico, preferiblemente identicas entre si, aunque esta tecnica tambien permite la fabrication de grupos de micropartlculas identicas entre si pero distintas a otros grupos del mismo array. Asl, las partlculas micrometricas del array obtenido mediante el metodo descrito pueden presentar preferentemente dimensiones comprendidas entre 1 pm a 100 pm, incluidos ambos llmite en el plano de la micropartlcula. Tambien preferentemente, las micropartlculas pueden tener un espesor comprendido entre los 20 nm y las 5 pm, incluidos ambos llmites. Las micropartlculas pueden tener geometrlas variadas, como por ejemplo, forma de paraleleplpedo o circular, sin que estas formas sean limitantes de la invencion.

La definition de la forma del pie debajo de la micropartlcula se puede realizar por cualquier tecnica de grabado que permita la elimination parcial, justo debajo de cada micropartlcula, del material que forma dicho pie, ya sea el unico material del que consta el sustrato o del segundo material que dicho sustrato puede contener en su parte superior. De este modo, se consigue dotar a dicho elemento de una forma preferida tipo columna o pilar, con una section que presenta dos partes diferenciadas, una mas estrecha que la otra para forzar la concentracion de estreses mecanicos, o con una seccion uniforme en toda su extension y a la vez mas pequena que la de la propia micropartlcula, preferiblemente inferior o igual al 50% del tamano de la section de esta. La tecnica usada para la formation de los pies debe ser preferiblemente un ataque flsico (ataque seco reactivo), o bien un ataque qulmico (humedo), que presente un ataque lateral, en funcion del material o materiales presentes en las estructuras (tanto el que forma la micropartlcula como el pie) y que a su vez permitiran obtener un pie de section constante o variable segun convenga por la aplicacion requerida.

A su vez, las micropartlculas pueden contener una o mas clases de moleculas organizadas en monocapas en zonas localizadas, que les permitan tener varias utilidades

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

simultaneamente, y a su vez, realizar determinadas medidas u observaciones de uno o varios parametros y/o actividades en el interior del medio en que se encuentren. Mas concretamente, dicha funcionalizacion qulmica puede comprender varias moleculas de origen natural o sintetico, con actividad qulmica y/o biologica, que incluyan, pero no esten restringidos a, compuestos organicos sencillos, pollmeros, peptidos, protelnas, nucleotidos y acidos nucleicos. Las moleculas se pueden depositar sobre la cara superior de las micropartlculas preferiblemente por tecnicas del campo de la impresion de moleculas a la escala micro y nanometricas como puede ser microcontact printing (Impresion por microcontacto), dip-pen nanolithography (nanolitografia por dip-pen ) o el polymer-pen lithography (litografla por polymer pen).

Como se ha explicado anteriormente, puede ser posible liberar las micropartlculas del array obtenido mediante el metodo descrito. En este caso particular de la invention, tras la etapa d) de funcionalizacion de la superficie de las micropartlculas, el metodo descrito comprende ademas:

e) proceder a la ruptura controlada de los pies que soportan las micropartlculas mediante la aplicacion de cargas mecanicas direccionadas, para separarlas del sustrato (individualizarlas). Estas cargas se puede aplicar mediante tecnicas diversas, como son: raspado del pie; aplicacion de una sustancia adhesiva en la superficie ya funcionalizada de las micropartlculas y posterior arrancado de las mismas, con disolucion posterior del adhesivo en medios que no afecten a la funcionalizaciones moleculares; criofractura, etc.

De esta forma, mediante la aplicacion de esfuerzos mecanicos direccionados es posible romper los pies de forma controlada, por ejemplo con un corte limpio, para liberar las micropartlculas del sustrato del array sin que estas se rompan o danen, preservando intacta la funcionalizacion aplicada previamente a las mismas por tratarse de un metodo completamente flsico, no agresivo qulmicamente.

De manera preferida, la ruptura mecanica de los pies para la individualization de las micropartlculas que estos sostienen se puede llevar a cabo mediante un corte direccionado, aplicando una fuerza lateral controlada suficiente para romper el pie. Dicho corte puede realizarse con una micro-herramienta disenada y adecuada para tal fin, que comprende una espatula de punta plana y afilada de dimensiones micrometricas. En otra realization preferida, la ruptura mecanica se puede realizar mediante criofractura, con la congelation de toda la estructura del array (el sustrato con micropartlculas funcionalizadas y sus respectivos pies), que comprende: humectar el sustrato con una solution, como puede ser una solution tamponada de fosfato salino (PBS) con un contenido del 0.05% de solucion Tween 20 (PBS- T); sumergir toda la estructura en nitrogeno llquido hasta la congelacion de la solucion; volver a humectar del mismo modo y volver a congelar con nitrogeno llquido; para finalmente ejercer una fuerza o movimiento de palanca con una pinza o elemento similar hasta la ruptura del pie. La solucion congelada que contiene las micropartlculas se deja fundir a temperatura ambiente para su liberation. En otra realizacion diferente, se puede depositar sobre las micropartlculas funcionalizadas qulmicamente una sustancia adhesiva, como puede ser una capa de una matriz polimerica como es el Fluoromount®, en fase llquida para permitir su entrada incluso por debajo de las micropartlculas, que tras polimerizarse, se endurece parcialmente. Esta substancia es un medio de montaje biologico de base acuosa muy comunmente utilizado para la cobertura de tejidos que contienen marcadores fluorescentes, para posterior inspection en microscopios opticos como confocales y microscopios de fluorescencia, incluso en microscopios electronicos de transmision y barrido (SEM y TEM). En ese momento, dicha capa de la matriz polimerica se puede separar manualmente del sustrato llevandose las micropartlculas en su seno y

5

10

15

20

25

30

35

40

45

rompiendo los pies al separarlas, tras lo cual esta capa endurecida se puede disolver en algun medio que no afecte a la funcionalizacion qulmica, por ejemplo en medio acuoso, para eliminarla de la superficie de las micropartlculas.

Asimismo, en una realization mas preferida del caso anterior, el metodo comprende ademas:

f) recolectar las micropartlculas funcionalizadas y separadas (o individualizadas) en un medio de suspension, pudiendo ser dicho medio cualquiera que no afecte a las funcionalizaciones qulmicas.

Asl, las micropartlculas, una vez separadas del sustrato por medios mecanicos, se pueden mantener para su almacenamiento en una suspension en un medio acuoso que puede ser acido, neutro o basico indistintamente, segun sea requerido por el tipo de funcionalizacion realizada.

Gracias al metodo de fabrication, es posible la obtencion de un array de micropartlculas planares con multiplexado molecular en superficie. Asimismo, en el caso particular del metodo en que se rompen mecanicamente los pies de la estructura, se consigue la obtencion de estas mismas micropartlculas funcionalizadas, pero individualizadas. En otro caso mas preferido, se consigue una suspension de estas micropartlculas, segun lo comentado anteriormente. Cualquiera de estos productos, array, micropartlcula/s y suspension de las micropartlculas se puede utilizar para analizar, a modo de ejemplo, “parametros quimicos”, que son todas aquellas magnitudes qulmicas medibles como por ejemplo el pH o el potencial redox (reduction-oxidation). Aun mas, puede emplearse para la medida simultanea de varios "parametros biologicos", refiriendose asl a cualquier magnitud que ponga en evidencia la presencia de determinados compuestos biologicos, o bien su action dentro del medio en que se encuentren las micropartlculas. Dichos parametros son tales como la concentration de iones en solution, la actividad de una determinada enzima, la presencia de protelnas y/o ligandos, incluso el estudio de ADN, entre otros. Estos parametros en un medio de muestra se pueden medir a traves de la senal emitida por una o mas de las micropartlculas del array, por una o mas micropartlculas liberadas e individualizadas o por una o mas de las micropartlculas individualizadas y en suspension que se anade al medio de muestra. El medio de muestra en el que se puede utilizar el array, la o las micropartlculas individualizadas o la suspension de ellas como sensor, actuador o similar, puede ser cualquier medio qulmico o biologico, por ejemplo una muestra in vitro de celulas. De hecho, una unica celula puede ser un medio de muestra adecuado en el que medir determinados parametros gracias a la funcionalizacion de las micropartlculas, por lo que en este caso se puede separar una micropartlcula del array para introducirla en la celula.

Es preciso comentar aqul que si el array, las micropartlculas individualizadas o la suspension de micropartlculas se utilizasen como actuadores, estas tambien pueden servir en el caso mas preferido para la vehiculizacion de sustancias, como por ejemplo farmacos o determinados reactivos. Asl, en algunos de los ejemplos de uso del array o de sus micropartlculas una vez individualizadas por los metodos anteriormente descritos, cabe destacar que pueden emplearse en el campo de la farmacia y la biomedicina como sistemas de transporte de farmacos o drug delivery systems.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Obtencion de un array de micropartlcuias planares, funcionalizadas cada una de las ellas con tres proteinas distintas y obtenidas por el metodo propuesto en la presente invencion, y liberacion de las microparticulas funcionalizadas para fabricar una suspension

El objetivo de este ejemplo es demostrar la posibilidad de fabricar un array de micropartlcuias planares, con dimensiones 3 pm x 3 pm x 1 pm funcionalizadas con tres tipos de moleculas diferentes. En este caso particular el metodo de colocacion de las moleculas sobre la superficie planar se basa en la tecnica de litografla por polymer-pen, polymer-pen lithography. Mediante esta tecnica se han impreso tres proteinas distintas.

A- Fabrication de las microparticulas.

Para fabricar las microparticulas se tomo una oblea de silicio monocristalino con orientation cristalografica (100) de un diametro de 100 mm y un espesor de 525 pm. Sobre ella se crecio termicamente a 1100°C un oxido de silicio termico. Este material crecido se utilizo para la estructuracion o moldeo posterior de las microparticulas. A continuation, y tal como se ha expuesto en los parrafos de la Description Detallada, se realizo el proceso fotolitografico, esto es, la definition de las estructuras de las microparticulas. Para ello, se deposito sobre la oblea 1.2 pm de fotorresina positiva (HiPR 6512). Utilizando como mascara un retlculo de vidrio sobre el cual estaba definida en cromo la geometrla de las microparticulas, la resina se irradio con luz monocromatica (longitud de onda 435 nm). Para el caso concreto de este Ejemplo de la Invencion, se dispuso de formas geometricas cuadradas en el plano, de 3 pm de lado y separadas 3 pm entre si. Tras irradiar la fotorresina durante 5 a 8.5 s, esta se elimino parcialmente en una disolucion de revelador ODP 462. De tal manera que solo quedo resina sobre las zonas de la capa de oxido de silicio que definieron despues las microparticulas. Posteriormente, la resina remanente se recocio a 200°C durante 30 min para aumentar su resistencia frente al ataque posterior. El proceso siguiente consistio en la realization de un ataque vertical a toda la superficie, con la finalidad de grabar la capa de oxido de silicio en aquellos lugares que no estaban protegidos por la resina. Para ello se utilizo un equipo de grabado mediante iones reactivos (reactive ion etching) seco usando una mezcla de C2H6 y CHF3. Este ataque finalizo al alcanzar la oblea de silicio. Despues de este paso del proceso, las microparticulas estaban ya bien definidas pero todavla unidas a la oblea de silicio. En la siguiente etapa del proceso de fabricacion se realizo un ataque isotropo de la oblea de silicio, usando como mascara las estructuras de oxido de silicio junto con la capa de resina remanente, en un equipo de proceso de grabado profundo mediante iones reactivos DRIE (Deep Reactive Ion Etching). Para ello se utilizaron los gases SF6 y C4F8. Este proceso ataco lateralmente 1.3 pm, desde todas las direcciones, el silicio situado debajo de las microparticulas de oxido silicio para la formation de los pies que mantuvieron unidas las microparticulas a la oblea de silicio durante el proceso de funcionalizacion qulmica. Finalmente, se procedio a eliminar la fotorresina que se utilizo como mascara hasta dejar la superficie de las microparticulas limpia de compuestos organicos, quedando las microparticulas listas para su funcionalizacion molecular y posterior ruptura para recolectarlas y suspenderlas.

B- Funcionalizacion de la superficie de las microparticulas

Como ejemplo de funcionalizacion de la superficie de las microparticulas anteriormente descritas se procedio con la aplicacion de la tecnica denominada polymer-pen lithography Esta tecnica (Fengwei Huo, Zijian Zheng, Gengfeng Zheng, Louise R. Giam, Hua Zhang and Chad A. Mirkin, Science (2008), 321, 1658-1660) combina la posibilidad de impresion o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

ensamblado de monocapas moleculares en una gran superficie, caracterlstica de la tecnica de microcontact printing o impresion por microcontacto, con la precision de la impresion individualizada mediante la tecnica de nanolitografla por dip-pen o Dip-Pen Nanolithography.

Esta tecnica requirio previamente de la fabrication de un molde o sello, llamado stamp, de material polimerico blando para transferir las moleculas a la superficie de la muestra. En este ejemplo de realization, se uso polidimetilsiloxano (PDMS), una silicona organica de base polimerica en estado llquido, cuyos componentes (un agente curante y el elastomero base) se mezclan en una proportion de 10:1 en peso y se curan a una temperatura entre 60°C y 100°C durante un tiempo que puede oscilar entre los 45 min y los 120 min, en funcion de la dureza deseada. Para la fabricacion del molde para el sello de PDMS, se utilizo otra oblea de silicio donde se crece termicamente a 1100°C una capa de 1 pm de oxido de silicio. Sobre esta capa se realizo un proceso de fotolitografla como el descrito anteriormente pero con una mascara invertida a la utilizada para definir las micropartlculas (donde antes quedaba resina ahora no, y viceversa). Al igual que en el caso anterior se procedio al grabado de la capa de oxido de silicio a traves de la mascara existente y posteriormente se elimino la resina remanente. Una vez en este estado, se hizo un ataque anisotropo en KOH, con el cual se definieron unas piramides invertidas en las zonas donde no habla oxido de silicio. Estas piramides permitieron la obtencion posterior de las puntas de pollmero. Gracias a la utilization de la misma mascara pero invertida se consiguio fabricar una punta de pollmero para cada micropartlcula. Por tanto en este ejemplo concreto se definio una matriz de piramides invertidas de base cuadrada, de 3 pm por 3 pm, separadas 3 pm, de 2.12 pm de profundidad. Una vez obtenido el molde, se hizo un tratamiento superficial con el fluorosilano tricloro-1,1,2,2-tetrahidroperfluorooctilsilano al 97%, para evitar la adherencia del pollmero con el molde. En este estado se deposito PDMS llquido sobre este molde y tras su curado, se retiro el sello de PDMS.

Este sello fue usado para la transferencia de las moleculas adsorbidas a la punta de las piramides sobre las superficies de las micropartlculas. Para poner las moleculas sobre el molde de PDMS se utilizaron las llamadas tintas. Estas tintas son disoluciones que pueden contener cualquier tipo de sustancia que se desee imprimir; desde moleculas organicas, como por ejemplo marcadores fluorescentes o fluoroforos, como tambien biomoleculas como monocadenas de ADN, protelnas, etc., en funcion de su posterior aplicacion. En el caso de este ejemplo de realizacion, se utilizaron tres tipos de tintas distintas: i) la lectina WGA (Wheat germ agglutinin) conjugada con el marcador fluorescente Streptavidin Texas Red® (SAV-TR) en rojo; ii) la protelna BSA (Bovine serum albumin) conjugada con el marcador fluorescente Neutravidin OregonGreen® (NAV-OG) en verde; iii) el anticuerpo Goat Anti-Rabbit IgG conjugado con el marcador AMCA (Acido 7-amino-4-metil-3- cumarinilacetico) en azul, respectivamente. Como control de proceso y para la visualization de los resultados obtenidos, se utilizo un microscopio de fluorescencia.

C- Liberation mecanica de las micropartlculas previamente funcionalizadas mediante fractura mecanica controlada

Para liberar las micropartlculas impresas de la oblea de silicio se deposito una gota de medio de montaje Fluoromount® sobre la oblea, formando una capa que cubrio homogeneamente las micropartlculas de la oblea. Se dejo que el medio polimerizara a temperatura ambiente durante 1 h, creando una capa solida que envolvla a las micropartlculas. Esta capa se separo mecanicamente de la oblea llevandose consigo las micropartlculas que se hablan roto por los pies. Este metodo evito el deterioro de las moleculas previamente impresas porque el medio era qulmicamente inerte.

5

10

15

20

25

30

35

40

La capa polimerizada y separada de la oblea con las micropartlculas separadas pudo almacenarse en este estado, para su uso posterior en suspension. Para obtener las micropartlculas en suspension, se disolvio la capa separada en un medio acuoso, como por ejemplo, agua desmineralizada o soluciones tamponadas.

Ejemplo 2: Reconocimiento molecular de proteinas: demostracion del uso de la suspension de micropartlculas con multiplexado molecular preparada en el Ejemplo 1 como sensor y/o actuador.

Para demostrar que las moleculas funcionalizadas en la superficie de las micropartlculas siguen siendo activas (mantienen su integridad y funcionalidad y por tanto, son capaces de reaccionar con distintos elementos del medio) despues de ser inmovilizadas y una vez las micropartlculas se han liberado del sustrato del array mediante la ruptura controlada de los pies, se procedio a realizar un ensayo de afinidad de anticuerpos (antibody binding assay). Para tal ensayo se escogieron como anticuerpo primario el Goat anti-WGA IgG y como anticuerpo secundario, el anti-Goat IgG (H+L), conjugado con el marcador fluorescente AMCA (Acido 7-amino-4-metil-3-cumarinilacetico) en azul. Estos anticuerpos se incorporaron ordenadamente (en primer lugar el anticuerpo primario y despues el secundario) en un medio acuoso, siguiendo los procedimientos estandar de estos ensayos, donde previamente se habla incorporado la suspension de micropartlculas, dando lugar al reconocimiento de las proteinas por parte del anticuerpo primario y a la consiguiente union de ambas moleculas (anticuerpos primario y secundario) a dichas proteinas.

Como resultado, se percibieron los esperados cambios en las emisiones de fluorescencia de las proteinas previamente impresas en las micropartlculas debido a la correcta combination de emisiones de los marcadores fluorescentes presentes tanto en las proteinas como en los anticuerpos; cambios perfectamente visibles mediante un microscopio convencional de fluorescencia y que demuestran que los centros de reconocimiento molecular de las proteinas siguen funcionales. Dichos cambios fueron los siguientes:

a) la lectina WGA conjugada con SAV-TR que inicialmente emitla senal de fluorescencia en rojo, paso a ser magenta,

b) la protelna BSA conjugada con NAV-OG que inicialmente emitla senal de fluorescencia en verde, paso a ser cian, y

c) el anticuerpo Goat Anti-Rabbit IgG conjugado con AMCA que inicialmente emitla senal de fluorescencia en azul, siguio emitiendo en dicho color.

Como control de la funcionalidad del sistema multiplexado, dicho inmunoensayo se realizo con exito con el array fabricado, es decir, entre los pasos B y C del Ejemplo 1 de realization (despues de la fabrication y funcionalizacion de las micropartlculas y antes de su liberation del sustrato), para demostrar que el proceso de multiplexado de moleculas mediante la tecnica de litografla por polymer-pen seguida del sistema de liberacion mecanica de las micropartlculas no afecto a la correcta actividad de las moleculas.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de obtencion de un array de microparticulas planares funcionalizadas en superficie, que comprende las siguientes etapas:

a) preparar una capa de estructuracion de un material originario de las microparticulas sobre un sustrato que hace de soporte;

b) moldear las microparticulas en la capa de estructuracion mediante una tecnica microelectronica de litografla que da forma a la geometrla y las dimensiones laterales, y una tecnica de grabado con la que se define el espesor de las microparticulas;

c) formar un pie en la parte superior del sustrato que se encuentra debajo de la capa de estructuracion para sustentar cada micropartlcula, mediante tecnicas de grabado; y

d) funcionalizar qulmicamente la superficie de las microparticulas que estan sostenidas sobre el sustrato por los pies, mediante uno o mas componentes moleculares.
2. El metodo de la reivindicacion anterior, donde el sustrato esta formado por un unico material, siendo dicho material una oblea de silicio.
3. El metodo de la reivindicacion 1, donde el sustrato esta formado por dos materiales, conteniendo un segundo material en forma de capa que se localiza en la parte superior del sustrato, debajo de la capa de estructuracion de las microparticulas.
4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la capa de estructuracion de las microparticulas es un material seleccionado del grupo que consiste en silicio policristalino, oxido de silicio, nitruro seleccionado del grupo que consiste en silicio, oro, platino, cobre, aluminio, nlquel, cobalto, cromo, oxidos metalicos, silicatos de tantalio, hierro y aluminio; y siliciuro seleccionado del grupo que consiste en siliciuro de tantalio, siliciuro de hierro y siliciuro de aluminio.
5. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el material originario de la capa de estructuracion y la parte superior del sustrato donde son grabados los pies tienen una relacion entre sus llmites de ruptura igual o superior a 1.
6. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la preparation de la capa de estructuracion en la etapa a) se lleva a cabo mediante deposition o mediante crecimiento de dicha capa de estructuracion sobre el sustrato, por una tecnica de microelectronica seleccionada del grupo que consiste en crecimiento termico, deposicion qulmica en fase de vapor, pulverization catodica y evaporation.
7. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la formation del pie de cada micropartlcula en la etapa c) se realiza grabando parcialmente la parte superior del sustrato que se encuentra debajo de las microparticulas mediante una tecnica microelectronica, con una section variable del pie de dos partes diferentes donde una parte es mas estrecha que la otra, o con una seccion constante del pie que es menor a la seccion de la micropartlcula.
8. El metodo segun la reivindicacion anterior, donde el pie presenta una seccion constante menor o igual al 50% de la seccion de las microparticulas.
9. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, donde el grabado parcial del pie se realiza mediante ataque lateral flsico o ataque lateral qulmico.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50
10. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el moldeo de las micropartlculas en la etapa b) se lleva a cabo mediante tecnicas fotolitograficas.
11. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde todas las micropartlculas son moldeadas con la misma forma y tamano.
12. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde las micropartlculas son moldeadas en dos o mas grupos de forma y tamano diferente.
13. El metodo segun una de las reivindicaciones anteriores, donde la funcionalizacion de la etapa d) se lleva a cabo mediante una tecnica de impresion de moleculas seleccionada del grupo que consiste en impresion por microcontacto, nanolitografla por dip-pen y tecnica de litografla por polymer-pen.
14. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el componente molecular es una molecula con actividad qulmica y/o biologica, seleccionada del grupo que consiste en compuestos organicos, pollmeros, peptidos, protelnas, nucleotidos, acidos nucleicos y cualquier combinacion de los mismos.
15. El metodo segun una de las reivindicaciones anteriores, donde la superficie de cada micropartlcula es funcionalizada en la etapa d) con mas de un elemento molecular diferente, o con un unico elemento molecular mas de una vez.
16. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas:

e) romper los pies que sustentan las micropartlculas mediante la aplicacion de cargas mecanicas de ruptura, para separar dichas micropartlculas del sustrato e individualizarlas.
17. El metodo segun la reivindicacion anterior, donde la carga mecanica de ruptura controlada del pie de cada micropartlcula se aplica mediante una tecnica seleccionada del grupo que consiste en raspado, corte, criofractura y aplicacion de un material adhesivo sobre la superficie ya funcionalizada de las micropartlculas y su posterior arrancado, con disolucion del adhesivo en medios que no afectan a la funcionalizacion molecular de la micropartlcula.
18. El metodo segun una de las reivindicaciones 16 o 17, que comprende ademas:

f) recolectar las micropartlculas individualizadas en un medio de suspension.
19. El metodo segun la reivindicacion anterior, donde el medio de suspension es un medio acuoso.
20. Un array de micropartlculas planares con multiplexado molecular en superficie obtenible a partir del metodo definido en una de las reivindicaciones 1 a 15.
21. El array segun la reivindicacion anterior, donde las micropartlculas presentan un tamano de plano comprendido entre 1 pm y 100 pm y un espesor comprendido entre 20 nm y 5 pm.
22. Una micropartlcula planar con multiplexado molecular en superficie individualizada y liberada mediante el metodo definido en una de las reivindicaciones 16 o 17.
23. Una suspension de microparticulas con multiplexado molecular en superficie obtenible mediante el metodo definido en una de las reivindicaciones 18 o 19.
24. Dispositivo sensor, detector y/o actuador molecular de parametros flsicos, qulmicos y/o 5 biologicos en un medio de muestra, caracterizado por que comprende un elemento

seleccionado del grupo que consiste en: un array como el definido en las reivindicaciones 20 o 21, una o mas microparticulas como las definidas en la reivindicacion 22 y una suspension de microparticulas como la definida en la reivindicacion 23.

10 25. Uso de un array como el definido en las reivindicaciones 20 o 21, una o mas

microparticulas como las definidas en la reivindicacion 22 o una suspension de microparticulas como la definida en la reivindicacion 23 como elemento sensor, detector, y/o actuador molecular en un dispositivo.

15 26. Uso segun la reivindicacion anterior, para la vehiculizacion de farmacos o agentes

reactivos.