ES2710908T3 - Sistema para microfluidos que tiene estructuras nanoplasmónicas monolíticas - Google Patents

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Abstract

Un proceso de producción de un sustrato (20) polimérico modelado que comprende: grabar uno o más patrones ordenados en un sustrato (12) duro, los patrones ordenados comprenden matrices ordenadas de elementos (13) a escala nanométrica que tienen dimensiones de sección transversal en un intervalo de 10 nm a 1.000 nm, teniendo las matrices una distancia de separación entre sus elementos respectivos donde la relación entre la dimensión de la sección transversal y la distancia de separación es mayor que 0,2; micromodelado de una película polimérica para formar una membrana (10) que comprende una primera superficie que tiene un patrón de características a escala micrométrica y/o escala mesométrica para definir uno o más canales y/o cámaras, una o más características a escala micrométrica y/o escala mesométrica que comprenden agujeros (11) pasantes y una o más de las características de escala micrométrica y/o mesométrica que no son agujeros pasantes; colocar la membrana (10) sobre el sustrato (12) duro con una superficie opuesta a la primera superficie contra el sustrato (12) duro, los agujeros (11) pasantes alineados para exponer los uno o más patrones ordenados, y aplicar presión suficiente para sellar los bordes de la membrana (10) que rodean los agujeros (11) pasantes contra el sustrato (12) duro; colocar un polímero (15) o metal líquido fraguable en los agujeros (11) pasantes y sobre la primera superficie y colocar el polímero (15) o metal líquido fraguable para formar un sello (18), comprendiendo el sello relieves (19) a escala micrométrica y/o escala mesométrica para definir uno o más canales y/o cámaras para microfluidos y además comprende uno o más patrones de relieve a escala nanométrica en los relieves de escala micrométrica y/o escala mesométrica que complementan los uno o más patrones ordenados; modelar un sustrato (20) polimérico estampando el sustrato polimérico con el sello para formar los uno o más canales y/o cámaras (21) para microfluidos en el sustrato polimérico y para formar, en una o más superficies del sustrato polimérico, uno o más patrones (22) ordenados de elementos a escala nanométrica que son sustancialmente idénticos a los uno o más patrones ordenados grabados sobre el sustrato (12) duro; y metalizar los elementos a escala nanométrica en una o más superficies del sustrato polimérico para la lectura de resonancia plasmónica.

Description

DESCRIPCION
Sistema para microfluidos que tiene estructuras nanoplasmonicas monoltticas
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a sistemas y dispositivos para microfluidos que tienen caractensticas nanoplasmonicas, en particular para su uso en aplicaciones de cultivo celular, y a procesos para producir tales sistemas y dispositivos.
Antecedentes de la invencion
El analisis de la union molecular y el comportamiento celular son importantes para el diagnostico de enfermedades, la investigacion biomedica y el descubrimiento de farmacos. La gran mayona de los estudios basados en matrices de interacciones de bioafinidad emplean biomoleculas marcadas con fluorescencia o ensayos colorimetricos ligados a enzimas. Sin embargo, existe la necesidad de metodos que detecten las interacciones de bioafinidad sin marcadores moleculares, especialmente para las interacciones biomoleculares y celulares, en las que la marcacion es problematica y puede interferir con sus propiedades biologicas. El desarrollo de biosensores simples y espedficos para detectar biomarcadores y medir la respuesta celular tiene implicaciones de gran alcance en su deteccion oportuna, lo que es una gran preocupacion para la salud y la seguridad humanas.
Los avances en genomica y proteomica han revelado un catalogo exhaustivo de biomarcadores que pueden usarse potencialmente como indicadores de diagnostico y pronostico de enfermedades geneticas e infecciosas. Los enfoques de deteccion basados en la fluorescencia de anticuerpos y acidos nucleicos actualmente consisten en formatos de ensayos complejos, de varias etapas, que requieren mucho tiempo y trabajo, y un analisis de analitos objetivo para asegurar la especificidad de la deteccion. Ademas, estos metodos no son adecuados para la deteccion rapida de patogenos o cancer ya que requieren un extenso hemocultivo del patogeno o tejido enfermo en el laboratorio central antes de la deteccion de anticuerpos.
El analisis de las interacciones biomoleculares tambien es una parte clave del proceso de descubrimiento de farmacos que implica determinar la afinidad de union del farmaco a la protema objetivo de interes. A pesar de que los desarrollos en el campo del cribado de alto rendimiento (HTS) y la qrnmica computacional aceleraron y facilitaron enormemente el proceso de busqueda de farmacos, existen importantes limitaciones que superar. Un ejemplo es el ensayo HTS basado en fluorescencia, que puede generar falsos positivos (por ejemplo, union a la enzima informadora o interaccion hidrofobica directa del marcador con el objetivo) o resultados falsos negativos (por ejemplo, oclusion del sitio de union). La aplicacion de tecnologfas nuevas y eficientes sin marcadores es de gran importancia para el proceso de descubrimiento de medicamentos, ya que reduciran los costos de desarrollo y disminuiran el tiempo de comercializacion.
Para el descubrimiento de farmacos, asf como en la investigacion biomedica, el estudio del efecto de las senales espedficas (por ejemplo, qrnmica, topografica, de flujo, etc.) sobre la union y motilidad celular, la viabilidad celular, la proliferacion celular y el ciclo celular es de primordial importancia. La induccion y la medicion subsiguiente de una respuesta celular espedfica requiere proporcionar a las celulas las indicaciones adecuadas, controlar las condiciones en el microambiente celular y monitorear las respuestas celulares en multiples niveles jerarquicos dentro de un gran numero de experimentos paralelos. Los ensayos actualmente empleados que se basan en el cultivo celular en placas de Petri y la posterior deteccion de biomoleculas y de imagenes de celulas vivas con base en fluorescencia son lentos, engorrosos y no pueden cumplir estos requisitos. Los analisis de placas de multiples pozos pueden aumentar el rendimiento a traves de imagenes automaticas proporcionadas por el cribado de celulas de alto contenido (HCCS). Sin embargo, una consideracion importante para los ensayos de multiples pozos es asegurar un patron o tratamiento uniforme de cada pozo, lo que a menudo se ve impedido por las variaciones en el volumen de lfquido dispensado en cada pozo. La variabilidad resultante en la concentracion de reactivos aplicados dificulta las comparaciones justas y cuantitativas y limita la capacidad del HCCS para resolver pequenas diferencias en las respuestas de senalizacion celular. Este problema se exacerba en protocolos mas complejos, como la exposicion secuencial de celulas a diferentes medios, debido a los errores que se acumulan al cambiar los medios. Ademas, las aspiraciones repetidas de los medios pueden eliminar involuntariamente las celulas de los pozos. Debido a que estos ensayos tambien son diffciles de miniaturizar, los experimentos de HCCS pueden consumir grandes cantidades de celulas y reactivos costosos o valiosos. Finalmente, el HCCS todavfa se basa en marcadores fluorescentes que pueden desencadenar efectos de impedimento esterico no deseados.
En consecuencia, la investigacion sobre el efecto de las senales (unicas o multiples) en la respuesta celular hasta la fecha se ha visto limitada por la falta de metodos robustos y reproducibles para la produccion homogenea de material, el control preciso de las condiciones de cultivo celular y el monitoreo libre de la respuesta celular sin marcadores en tiempo real in situ, el comportamiento celular, la viabilidad celular o las interacciones de union biomolecular. Espedficamente, los metodos de produccion de material han carecido del control requerido para fabricar de manera reproducible superficies homogeneas que permitan investigaciones sobre interacciones espedficas entre celulas y variables aisladas, es decir, patrones a nanoescala definidos con precision en un espacio definido con control sobre el cambio inducido en la topograffa y los cambios asociados a energfa superficial. Los metodos de cultivo celular basados en pozos comunmente empleados son costosos y sufren errores en la dispensacion de Kquidos, tanto de forma manual como robotica, lo que impide el manejo uniforme de cada pozo, lo que a su vez limita la forma en que tan finamente se pueden resolver las respuestas de senalizacion. Finalmente, aunque el uso de tecnicas de imagenes fluorescentes para el analisis celular puede proporcionar informacion que no se puede alcanzar facilmente con otros metodos, generalmente se confunden por la necesidad de sobreexpresar la protema de senalizacion de interes y por los posibles efectos del marcador fluorescente en la funcion de la protema. Por lo tanto, debido a la naturaleza fenomenologica de los estudios actuales, las respuestas logradas han sido heterogeneas tanto a nivel de poblacion de celulas como de celulas individuales (Balasundaram 2007; Barbucci 2003; Blummel 2007; Curtis 2006; Dalby 2007a; Ernsting 2007; Kimura 2007; Salber 2007).
La deteccion de fluorescencia y quimioluminiscencia son los metodos mas comunes empleados para el reconocimiento de biomoleculas. Ambos esquemas requieren el uso de un elemento de reconocimiento marcado que se une a una molecula de interes, produciendo asf una senal selectiva al unirse (Marquette, 2006). Actualmente, la deteccion y cuantificacion de biomarcadores genomicos y proteomicos a partir de suero u otras muestras fisiologicas se basan en la deteccion en fase solida, donde a menudo se necesita una fuerte qmmica de amplificacion para producir una lectura. En el caso de los marcadores de ADN, el estado de la tecnica se basa en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), mientras que para los marcadores de protemas prevalece el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Se han informado muchos intentos de miniaturizar sistemas de laboratorio usando microfluidos para aumentar los lfmites de deteccion y reducir los tiempos de incubacion, el consumo de reactivos y el tamano de la muestra (Zhang 2009a; Zhang 2009b; Lim 2007; Lee 2006; Malic 2007). Sin embargo, a pesar del creciente enfoque de la comunidad de investigacion de microfluidos, tanto la PCR como el ELISA se basan en marcadores de fluorescencia, que aumentan la complejidad y el costo del ensayo. Ademas del requisito de un elemento de reconocimiento marcado, estas tecnicas requieren tfpicamente sistemas opticos complejos que consisten tfpicamente en un microscopio grande o un lector de microplacas. Como resultado, el campo de los microfluidos aun tiene que producir muchos dispositivos comerciales para el diagnostico de enfermedades (Myers, 2008). Existe la necesidad de acoplar e integrar microfluidos con metodos de deteccion directa sin marcadores que se basan en las caractensticas ffsicas de los fenomenos biologicos y tienen el potencial de reducir los costos de los reactivos y la complejidad de las pruebas (Weigl, 2008).
El desarrollo de tecnicas mmimamente invasivas para inducir una respuesta celular espedfica se centra en controlar el contacto directo y la interaccion entre un tipo de celula dado y un material bien definido. Una forma de controlar la adhesion celular y la morfologfa posterior es mediante la nanotopograffa. La investigacion ha demostrado que las celulas pueden detectar y responder a una variedad de topograffas y pueden verse afectadas por el nivel de orden de una topograffa inducida, con efectos claros sobre la funcionalidad celular (Dalby, 2009; Dalby, 2008; Dalby, 2007b; Dalby, 2007c; Dalby, 2007d; Hochbaum, 2010). De manera similar, las bacterias tambien responden a senales topograficas (espaciales y mecanicas) y recientemente se ha mostrado el patron espontaneo de bacterias en una matriz periodica de nanoestructuras (Hochbaum, 2010). Otro metodo emplea una superficie modificada qmmicamente para inducir la respuesta celular (Cavalcanti-Adam, 2008). Para que ambas estrategias tengan exito, el material debe ser homogeneo, robusto y fabricado o funcionalizado de manera reproducible. Hasta la fecha, se han utilizado varios metodos para este proposito, que incluyen litograffa por haz de electrones, litograffa de nanoimpresion y nanolitograffa por inmersion de pluma (Cavalcanti-Adam, 2007; Curran, 2010). Sin embargo, los ensayos en estos estudios se realizaron utilizando metodos tradicionales de cultivo celular y se analizaron mediante microscopfa de fluorescencia en vivo con los inconvenientes inherentes a estas tecnicas, lo que puede haber resultado en una interpretacion enganosa de los resultados debido al error en el manejo del ffquido, la perturbacion causada por marcadores fluorescentes y bajo rendimiento en el que solo se tomaron imagenes de algunas celulas para cada procedimiento experimental.
La citometna de flujo (FC) y la citometna de barrido con laser (LSC) son las tecnicas mas utilizadas para el analisis celular con distribuciones bien caracterizadas del comportamiento celular. Ambas tecnicas usan tintes fluorescentes para marcar biomoleculas de interes dentro de la celula para revelar la informacion sobre la cantidad de biomoleculas dentro de la celula. La citometna de flujo implica el aislamiento hidrodinamico de celulas individuales, lo que permite un analisis en serie de alto rendimiento. Sin embargo, la FC se limita a caracterizar senales fluorescentes (protemas de fusion con GFP, inmunofluorescencia y sustratos fluorogenicos para enzimas intracelulares) (Fayet, 1991; Nolan, 1998; Krutzik, 2006), que pueden conducir a un impedimento esterico y son incapaces de realizar mediciones importantes que dependen del tiempo de la poblacion celular. Por el contrario, la citometna de barrido con laser (LSC) se basa en el uso de un laser de barrido para excitar los colorantes en celulas inmovilizadas en la superficie (Griffin, 2003; Bedner, 1993), lo que permite la medicion cinetica de la informacion dependiente del tiempo en celulas individuales. Sin embargo, solo se puede escanear una region limitada de una placa, lo que limita el desempeno de la tecnica. Ademas, la introduccion de reactivos se realiza con una pipeta y solo son significativos los cambios dependientes del tiempo lento despues del intercambio de la solucion. Esto se debe particularmente a la introduccion desigual de la solucion en todo el portaobjetos o placa, y al proceso en serie del escaneo con laser. Ademas, las celulas analizadas utilizando ambos metodos generalmente se cultivan en matraces, portaobjetos o placas de Petri tradicionales antes del analisis, por lo que la uniformidad del entorno se limita a la del matraz o la placa. En particular, el contacto celula-celula no es controlable, y las secreciones que pueden difundirse se mantienen en el ambiente del cultivo.
Para superar algunas de estas limitaciones, la investigacion se ha desplazado recientemente hacia la explotacion de las capacidades precisas de suministro de productos qrnmicos de los dispositivos para microfluidos. El enfoque mas popular para la fabricacion de dispositivos para microfluidos para ensayos basados en celulas se basa en la litograffa suave de polidimetilsiloxano (PDMS). El PDMS es un elastomero que se moldea sobre un molde fabricado tipicamente con fotolitograffa y se cura durante varias horas, lo que da como resultado una transferencia de caractensticas del molde al PDMS. Su amplio uso como material de eleccion se debe a su propiedad mecanica, que es susceptible de integracion de valvulas de fluidos, elementos esenciales para las principales aplicaciones de microfluidos. Las plataformas de PDMS para cultivos celulares se informaron en el pasado, especialmente para celulas morfologicas bidimensionales, como las celulas epiteliales, y varios disenos han sido objeto de solicitudes de patentes (Jin, 2010; Lee, 2010). Sin embargo, la mayona de estos estudios acoplaron el dispositivo de microfluidos al equipo tradicional a escala macro (es decir, microscopios de fluorescencia) y se basaron en el uso de imagenes de fluorescencia para el analisis de respuesta celular.
Ademas, hay sorprendentemente poco trabajo informado sobre la combinacion de superficies nanomodeladas y microfluidos, especialmente de una manera ventajosa para estudiar la respuesta celular inducida topograficamente. Esto se debe en parte a la dificultad en la fabricacion reproducible de superficies nanoestructuradas dentro de dispositivos para microfluidos de cultivo celular. Se han informado varios procesos de produccion para la fabricacion de nanoestructuras dentro de microcanales, incluida la deposicion de vapor de nanopartfculas (Song 2009), la formacion in situ de nanopartfculas dentro de los canales de la reaccion catalftica (Fonverne, 2009) y la polimerizacion de un polfmero alrededor de una plantilla de oxido de aluminio anodico (Soper, 2008). Sin embargo, es diffcil lograr el control de la regularidad, la geometna y/o el espaciado de las matrices de nanopartfculas utilizando estas tecnicas, limitando la reproducibilidad de las mediciones experimentales.
Para obtener una geometna espacialmente controlada y el espaciado de las nanoestructuras dentro de un canal para microfluidos de PDMS, se requieren moldes multicapa que comprenden nano y microestructuras con procedimientos de fabricacion que incluyen litograffa de haz de electrones secuencial, litograffa de interferencia o litograffa por nanoimpresion en combinacion con fotolitograffa SU-8 resist. La compatibilidad de los materiales y reactivos involucrados en estos procesos es diffcil de lograr. Ademas, una vez que se fabrica el molde y se definen los microcanales, el menor cambio en el diseno para microfluidos requerira la repeticion del proceso completo de fabricacion, comenzando con el sustrato nanoestructurado. Esto puede dar lugar a variaciones topograficas de la superficie inducidas por las diferencias de fabricacion de una muestra a otra. Ademas, la tecnica de fabricacion de litograffa suave de PDMS en sf misma no es adecuada para la produccion en masa de dispositivos para microfluidos, lo que dificulta su aplicacion en la industria, incluido el diagnostico medico y la farmacia. Finalmente, el uso de PDMS como material para modelos in vitro para cultivo celular debe considerarse en un contexto biologico debido a la lixiviacion de oligomeros no curados de la red de polfmeros a los medios de microsistemas (Regehr, 2009).
Ademas, se han desarrollado dispositivos para microfluidos con superficies hidrofobicas nanoestructuradas para controlar la tension superficial y la presion del lfquido en los canales de flujo del fluido (Extrand, 2005), pero las tecnicas estandar utilizadas para nanomodelar las superficies del canal no son lo suficientemente flexibles para permitir el modelado simple y rapido de nanoestructuras, especialmente diferentes patrones nanoestructurados, en ubicaciones espedficas en los canales o camaras del dispositivo pero no en otros. Por lo tanto, las diferentes caractensticas de diseno dentro del mismo dispositivo son diffciles de lograr y los disenos son diffciles de adaptar a los requisitos de las tecnicas de deteccion plasmonica.
El documento WO 2009/022985 A1 describe un chip sensor de resonancia de plasmon de superficie acoplado a la rejilla que tiene un cuerpo de sustrato que comprende al menos un canal de fluido formado integralmente en la superficie del mismo mediante un sello de impresion, y una capa de material reflectante que se transfiere integralmente a al menos parte de dicho canal de fluido al mismo tiempo de la etapa de impresion. El dispositivo para microfluidos de acuerdo con el documento WO 2009/022985 A1 muestra estructuras de rejilla unidimensionales que dependen de la polarizacion y, por lo tanto, se pueden usar para la lectura de resonancia de plasmon de superficie solo en el modo de reflexion. En consecuencia, el documento W o 2009/022985 A1 tambien divulga un metodo para usar el chip sensor anterior que comprende las etapas de dirigir una fuente de luz que incide en una capa de material reflectante, transmitiendo un fluido de muestra a traves de al menos dicho canal de fluido, detectando la luz reflejada desde dicha capa de material reflectante, y midiendo la intensidad de dicha luz reflejada, en donde un cambio en la intensidad de dicha luz reflejada durante el flujo de dicho fluido de muestra a traves de al menos dicho canal indica un cambio en el mdice de refraccion de dicha capa de material reflectante.
El documento US 2007/0015288 A1 describe un sustrato que comprende (a) una peffcula polimerica monofftica que comprende una base que tiene una primera y una segunda superficies principales opuestas, en la que al menos una parte de la primera superficie principal esta definida al menos parcialmente por una microestructura modelada exteriormente que se extiende desde la base; y una nanoestructura que tiene una altura promedio de al menos 100 y menos de 200 nanometros, en la que la nanoestructura se engloba al menos parcialmente dentro de, o se superpone, a la microestructura modelada, y (b) una capa de metal dispuesta de forma conformable en al menos una parte de la nanoestructura, en la que el sustrato estructurado es flexible. Dicho sustrato se usa en un metodo para analizar una sustancia que comprende proporcionar un analito en estrecha proximidad a al menos una porcion de la capa metalica; y observar una propiedad optica del analito mejorada en la superficie. Los canales del dispositivo para microfluidos de acuerdo con el documento US 2007/0015288 A1 comprenden nanoestructuras distribuidas al azar adecuadas para la deteccion con SERS.
En general, los sistemas de la tecnica anterior tienen una o mas deficiencias. Hace falta un sistema para microfluidos integrado que se base en tecnologfas de deteccion no invasivas y sin marcadores que incluya tecnicas plasmonicas, como la resonancia de plasmon de superficie (SPR) (por ejemplo, SPR en modo de reflexion, SPR de modo de transmision, resonancia de plasmon de superficie localizada (LSPR)) y la espectroscopia Raman mejorada en la superficie (SERS) para monitorear el comportamiento celular, las interacciones celula-sustrato, la respuesta celular a los estfmulos y la deteccion de biomoleculas. Faltan tecnicas de fabricacion que permitan un sistema de cultivo celular nanoestructurado monoltticamente integrado en materiales biocompatibles a largo plazo con funcionalidad de grna celular simultanea y capacidad de deteccion plasmonica utilizando senales topograficas y respuesta plasmonica de nanoestructura, respectivamente. Hay un pobre control del microambiente celular en las placas de Petri o de micropozos. Hay una falta de topograffa de superficie reproducible y robusta (nanomodelado) para el control preciso de la respuesta celular y los estudios de interaccion celula-sustrato. Existe una falta de superficie nanoestructurada integrada dentro de los canales para microfluidos. Y, hay una falta de tecnicas rapidas y de bajo costo de fabricacion de moldes que permitan el diseno de nano y microestructuras intercambiables.
Sigue existiendo la necesidad de un sistema integrado que pueda cumplir uno o mas de los siguientes requisitos: (i) control eficiente de la adhesion celular inicial; (ii) control eficiente de la respuesta celular al estimulo espedfico durante un penodo prolongado; (iii) monitoreo in situ, sin marcadores y en tiempo real de la respuesta celular, la movilidad celular, el comportamiento celular, la viabilidad celular o la deteccion de biomoleculas para evitar una respuesta falsa debida a la secrecion celular de las moleculas a las que responden y el impedimento esterico inducido por los marcadores fluorescentes. Ademas, el sistema es idealmente de bajo costo, portatil y susceptible de produccion en serie.
Sumario de la invencion
En un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un proceso para producir un sustrato polimerico modelado que comprende: grabar uno o mas patrones ordenados en un sustrato duro, comprendiendo los patrones ordenados matrices ordenadas de elementos a escala nanometrica que tienen dimensiones de seccion transversal en un intervalo de 10 nm a 1.000 nm, teniendo las matrices una distancia de separacion entre sus elementos respectivos en las que la relacion de la dimension de la seccion transversal con respecto a la distancia de separacion es mayor a 0,2; micromodelado de una pelfcula polimerica para formar una membrana que comprende una primera superficie con un patron de caractensticas de escala micrometrica y/o escala mesometrica para definir uno o mas canales y/o camaras, comprendiendo una o mas de las caractensticas a escala micrometrica y/o a escala mesometrica agujeros pasantes y una o mas de las caractensticas de escala micrometrica y/o escala mesometrica que no son agujeros pasantes; colocando la membrana en el sustrato duro con una superficie opuesta a la primera superficie contra el sustrato duro, los agujeros pasantes alineados para exponer uno o mas patrones ordenados, y aplicando suficiente presion para sellar los bordes de la membrana que rodea los agujeros pasantes contra el sustrato duro; colocar un polfmero o metal lfquido fraguable en los agujeros pasantes y sobre la primera superficie y colocar el polfmero o metal ifquido fraguable para formar un sello, comprendiendo el sello relieves a escala micrometrica y/o a escala mesometrica para definir uno o mas canales y/o camaras para microfluidos y que ademas comprenden uno o mas patrones de relieve a escala nanometrica en los relieves de escala micrometrica y/o escala mesometrica que complementan uno o mas patrones ordenados; modelar un sustrato polimerico estampando el sustrato polimerico con el sello para formar uno o mas canales y/o camaras para microfluidos en el sustrato polimerico y para formar, en una o mas superficies del sustrato polimerico, uno o mas patrones ordenados de elementos a escala nanometrica que son sustancialmente identicos a los uno o mas patrones ordenados grabados en el sustrato duro; y metalizar los elementos a escala nanometrica en una o mas superficies del sustrato polimerico para la lectura de resonancia plasmonica.
En otro aspecto de la divulgacion, que no se reivindica, se proporciona un sello para modelar un sustrato polimerico, comprendiendo el sello: un polfmero o metal de dureza suficiente para poder modelar el sustrato polimerico; y, un patron de relieves de escala micrometrica y/o escala mesometrica para formar uno o mas canales y/o camaras para microfluidos, teniendo uno o mas de los relieves de escala micrometrica y/o escala mesometrica superficies en la parte superior que comprenden uno o mas patrones de relieve a escala nanometrica para formar una o mas matrices ordenadas de elementos a escala nanometrica en el sustrato polimerico, teniendo los elementos a escala nanometrica dimensiones transversales en un intervalo de 10 nm a 1.000 nm, teniendo las matrices una distancia de separacion entre los elementos donde la relacion entre la dimension de la seccion transversal y la distancia de separacion es mayor que 0,2.
En un segundo aspecto de la presente invencion, se proporciona un dispositivo para microfluidos como se define en la reivindicación 10, que comprende un sustrato polimerico monolttico producido por el proceso del primer aspecto, siendo dicho sustrato polimerico monolftico modelado con uno o mas canales a escala micrometrica en comunicacion fluida con una o mas camaras para microfluidos, una superficie en el sustrato polimerico que comprende una matriz ordenada de elementos a escala nanometrica que tienen dimensiones de seccion transversal en un intervalo de 10 nm a 1.000 nm, teniendo la matriz una distancia de separacion entre los elementos donde la relacion entre la dimension de la seccion transversal y la distancia de separacion es mayor que 0,2, en donde los elementos a escala nanometrica se metalizan para la lectura de resonancia plasmonica en modo de reflexion o transmision, y en donde la matriz ordenada de elementos a escala nanometrica esta en al menos uno, pero no todos, de los uno o mas canales y una o mas camaras.
Los dispositivos para microfluidos de la presente invencion son estructuras para microfluidos monolfticas en un sustrato polimerico que tiene nanoestructuras monoltticamente integradas en el sustrato. Los dispositivos tienen al menos un canal de escala micrometrica en comunicacion fluida con al menos una camara para microfluidos. Los canales incluyen, por ejemplo, canales de carga de muestras, canales de carga de celulas, canales de perfusion de medios, canales de mezcla, canales de separacion o fraccionamiento de partfculas, canales de generacion de gradiente y conductos de perfusion de alta resistencia, que pueden tener diferentes dimensiones de canal dictadas por la aplicacion espedfica. Las camaras para microfluidos incluyen, por ejemplo, camaras de cultivo celular, camaras de captura de bacterias o celulas, camaras de interaccion biomolecular o camaras de mezcla. Tambien pueden estar presentes otras estructuras para microfluidos, por ejemplo, valvulas y bombas para controlar el flujo de fluido, conductos, entradas, salidas y similares.
Al menos una superficie en un canal o camara para microfluidos del dispositivo esta modelada con una serie ordenada de elementos a escala nanometrica adecuados para la lectura de la resonancia plasmonica de un fluido en la superficie. Se puede modelar mas de una superficie y el patron puede ser igual o diferente. La superficie o superficies modeladas pueden estar en cualquier parte del dispositivo, e incluso podnan estar en todas partes del dispositivo. La ubicacion de la superficie o superficies modeladas esta dictada por el uso final del dispositivo. Dichas superficies modeladas pueden denominarse "superficies nanoplasmonicas" y los elementos pueden denominarse "elementos nanoplasmonicos". Los elementos a escala nanometrica pueden servir para un doble proposito como elementos nanoplasmonicos y senales nanotopograficas. Para funcionar como una superficie nanoplasmonica, la matriz ordenada de elementos a escala nanometrica tiene un patron altamente regular o periodico disenado para tener una resonancia plasmonica espedfica para permitir la lectura optica en tiempo real sin marcadores usando tecnicas plasmonicas. La regularidad del patron se refleja en un tamano, espaciado y/o geometna muy consistentes de los elementos a escala nanometrica, y surge del proceso altamente reproducible empleado en la presente invencion para producir el sustrato polimerico modelado del dispositivo. Preferiblemente, para cada uno del tamano, espaciado y/o geometna de los elementos en la matriz, la desviacion estandar del promedio respectivo no es mas de aproximadamente el 3%, preferiblemente no mas de aproximadamente el 2,5%, y puede no ser mas que aproximadamente el 1%.
Los elementos a escala nanometrica tienen dimensiones de seccion transversal en un intervalo de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1.000 nm, que esta en el intervalo a escala nanometrica. Preferiblemente, las dimensiones de la seccion transversal estan en un intervalo de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 750 nm. Los elementos individuales a escala nanometrica tienen preferiblemente una relacion de aspecto (altura con respecto a anchura) de aproximadamente 100 o menos, mas preferiblemente 50 o menos, y aun mas preferiblemente 10 o menos. Las relaciones de aspecto pueden estar en un intervalo de 100:1 a 1:100, 50:1 a 1:50 o 10:1 a 1:10.
El espaciado de los elementos a escala nanometrica en la matriz ordenada es un factor importante para mantener una regularidad adecuada para las tecnicas de lectura de resonancia plasmonica. La distancia de separacion ideal depende del tamano de los elementos a escala nanometrica. Para las tecnicas plasmonicas, la relacion entre la dimension transversal y la distancia de separacion generalmente es mayor que aproximadamente 0,2. Preferiblemente, la relacion de la dimension de la seccion transversal a la distancia de separacion esta en un intervalo de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1,5, o aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1. La relacion de la dimension de la seccion transversal a la distancia de separacion es comunmente de aproximadamente 0,5 o aproximadamente 1.
Los elementos a escala nanometrica pueden tener cualquier geometna de nanoestructura adecuada para la tecnica de lectura a utilizar. Las geometnas adecuadas incluyen, por ejemplo, nanopilares, nanopostes, nanopuntos, nanobarras, nanopiramides, nanomedialunas, nanodiscos, nanocupulas, nanoagujeros, nanorejillas o nanosurcos. Se pueden integrar multiples matrices con diferentes geometnas de nanoestructura para diferentes funciones (por ejemplo, rejillas para acoplamiento de luz o nanopilares para la mejora del campo electromagnetico de SPR) dentro del mismo dispositivo. Multiples matrices que tienen diferentes geometnas de nanoestructura pueden combinarse para ocupar la misma superficie, o diferentes matrices pueden estar en diferentes superficies en el dispositivo. Diferentes matrices pueden resonar a diferentes longitudes de onda permitiendo la implementacion de un esquema de interrogacion de frecuencia multiple para la deteccion multicanal en paralelo de diferentes objetivos.
Las matrices ordenadas de elementos a escala nanometrica pueden integrarse en una superficie de caractensticas de escala micrometrica (por ejemplo, micropilares) en el dispositivo. En aplicaciones de cultivo celular, esto puede proporcionar dos niveles de senales topograficas (senales espaciales y mecanicas) en las escalas micro y nanometricas para el control de la union celular y el movimiento, al tiempo que conserva la capacidad de deteccion plasmonica para estudiar el comportamiento y las interacciones celulares. Ademas, las caractensticas microopticas (por ejemplo, microlentes, rejillas resplandecientes, etc.) se pueden formar en el dispositivo para microfluidos para diversos propositos, incluyendo mejorar el acoplamiento de la luz o mejorar la eficiencia de recoleccion de luz, dependiendo de las tecnicas de lectura particulares utilizadas.
Los elementos a escala nanometrica pueden tratarse adicionalmente para mejorar o alterar las propiedades de la matriz ordenada. Tales tratamientos incluyen la metalizacion de los elementos a escala nanometrica para aumentar la reflectividad de la matriz o la modificacion qmmica de la superficie para permitir la union de biomoleculas. Para las tecnicas plasmonicas, se prefiere particularmente la metalizacion de un lado de los elementos a escala nanometrica para formar nanoelementos metalicos de un solo lado. Plata, oro, cobre, platino y paladio son los metales preferidos para la metalizacion, particularmente para aplicaciones SERS. La metalizacion se puede lograr mediante cualquier metodo adecuado, por ejemplo, evaporacion, pulverizacion o electrodeposicion. La modificacion qmmica de la superficie incluye la modificacion con grupos finales reactivos espedficos, por ejemplo -COOH, -OH, -NH3, -biotina, -silano, etc., para permitir la posterior union de anticuerpos, oligonucleotidos, aptameros o protemas para captura de celulas, bacterias o biomoleculas.
El sustrato polimerico puede comprender cualquier material polimerico que sea lo suficientemente suave para ser estampado por el sello. Preferiblemente, el material polimerico es adecuado para la fabricacion de dispositivos para microfluidos. Preferiblemente, el material polimerico comprende un poffmero de cicloolefina (por ejemplo, ZeonorMR), un polfmero termoplastico (por ejemplo, poliolefinas), un polfmero biodegradable (por ejemplo, almidon, acido polilactico), un elastomero (por ejemplo, elastomero termoplastico (TPE) o cualquier mezcla de los mismos. Mas preferiblemente, el material polimerico comprende un polfmero de cicloolefina (COP) (por ejemplo, ZeonorMR) o un elastomero termoplastico (TPE).
El sello puede comprender cualquier polfmero o metal que se pueda fraguarse en forma lfquida para producir un polfmero o metal que sea mas duro que el sustrato polimerico y lo suficientemente duro para imprimir el patron ordenado en el sustrato polimerico. Si se usa un metal, el metal en su estado lfquido no debe estar lo suficientemente caliente como para fundir el sustrato duro y la pelfcula polimerica. Preferiblemente, se usa un polfmero fraguable y el polfmero es un polfmero curable, preferiblemente un poffmero termoestable curable. El poffmero para el sello puede ser fraguable o curable termicamente, qmmicamente o con luz. Los poffmeros fotocurables, especialmente los curados por luz UV, son particularmente preferidos. Algunos ejemplos de poffmeros fotocurables incluyen MD-700 y mezcla DarcourMR. El sello se utiliza para transferir todas las caractensticas del dispositivo para microfluidos al sustrato polimerico en una etapa de procesamiento. La etapa de procesamiento puede involucrar cualquier metodo adecuado para modelar sustratos polimericos utilizando moldes o matrices, por ejemplo, estampado en caliente, litograffa por nanoimpresion o moldeo por inyeccion. El sello puede tratarse para facilitar el modelado del sustrato, por ejemplo, tratar los sellos con un agente de liberacion puede facilitar la separacion del sustrato polimerico modelado del sello. Dado que el sello comprende relieves para todas las caractensticas del dispositivo para microfluidos, el dispositivo para microfluidos se puede formar completamente en una etapa, lo que da como resultado un dispositivo monofftico que tiene todas las caractensticas del dispositivo integrado en el sustrato polimerico. Ademas, el sello se puede reutilizar para hacer mas dispositivos y el uso del sello proporciona un patron y consistencia dimensional entre los dispositivos producidos en diferentes procesos de produccion. Estas son ventajas claras sobre los procesos de la tecnica anterior para producir dispositivos para microfluidos.
El sello se puede fabricar a partir de un molde maestro transfiriendo caractensticas del molde maestro al poffmero fraguable. El molde maestro comprende un sustrato duro y una o mas membranas colocadas sobre el sustrato duro. El sustrato duro puede comprender un metal, una oblea de silicio, un sustrato de vidrio o un poffmero duro. El termino "sustrato duro" se refiere a un sustrato que es mas duro que las membranas colocadas sobre el sustrato. Preferiblemente, el sustrato duro comprende un poffmero duro, por ejemplo, un poffmero de cicloolefina (por ejemplo, ZeonorMR), un polimetilmetacrilato (PMMA), un policarbonato (PC) o una polieteretercetona (PEEK). Las una o mas membranas comprenden peffculas polimericas de un poffmero blando, por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS), un poffmero termoplastico blando (por ejemplo, una poliolefina blanda) o un elastomero termoplastico blando (por ejemplo, KratonMR, MedipreneMR, CL-30 o estireno-etileno-butadieno-estireno (SEBS)). Las peffculas polimericas son preferiblemente peffculas de elastomero termoplastico blando (TPE). El termino "poffmero blando" se refiere a un poffmero que es mas blando que el sustrato duro.
Uno o mas patrones ordenados que comprenden elementos a escala nanometrica se graban sobre el sustrato duro. El grabado puede realizarse por cualquier medio adecuado apropiado para el sustrato duro. Por ejemplo, el grabado puede realizarse con laseres, con bombardeo ionico o con grabado qmmico, por ejemplo, grabado ionico reactivo, grabado ionico reactivo profundo, grabado qmmico en humedo, litograffa por haz de electrones, litograffa por nanoimpresion, fresado por haz de iones, ablacion laser o litograffa de interferencia. Las membranas comprenden peffculas polimericas que tienen una superficie sobre la cual se han micromodelado las caractensticas de escala micrometrica y/o escala mesometrica. El modelado de las peffculas polimericas se puede realizar por cualquier medio adecuado, por ejemplo, estampado en caliente, moldeo por inyeccion, litograffa por nanoimpresion o replicacion en rodillo. Las caractensticas de escala micrometrica y/o escala mesometrica en las membranas definen uno o mas microcanales y/o camaras para microfluidos que eventualmente se crearan en el dispositivo final para microfluidos. Una o mas de las caractensticas modeladas en la peffcula polimerica pueden ser agujeros pasantes que estan alineados para exponer uno o mas patrones ordenados en el sustrato duro. Los agujeros pasantes tienen la forma de las caractensticas para microfluidos (por ejemplo, microcanales, camaras para microfluidos, micropilares, etc.) que estan destinados a portar los patrones ordenados en el dispositivo final.
Las membranas se colocan sobre el sustrato duro de modo que las superficies que tienen las caractensticas de escala micrometrica tambien esten expuestas. Se puede apilar mas de una membrana sobre el sustrato duro y los agujeros pasantes alineados con los patrones ordenados para obtener las caractensticas microestructurales deseadas en el dispositivo. El uso de membranas apiladas es particularmente util para formar caractensticas microestructurales, tales como micropilares, que tienen una superficie superior cubierta con los elementos a escala nanometrica. Cuando se colocan las membranas en el sustrato duro, se puede lograr un sello alrededor de los agujeros pasantes aplicando suficiente presion para sellar los bordes de la membrana que rodea los agujeros pasantes contra el sustrato duro.
El molde maestro asf formado se puede usar para fabricar el sello colocando el poftmero fraguable en los agujeros pasantes y en la superficie de la membrana en la que las caractensticas de escala micrometrica y/o escala mesometrica han sido micromodeladas. El poftmero fraguable normalmente se vierte o se inyecta en forma ftquida sobre y dentro del molde maestro y luego se fragua como se describio anteriormente. De esta manera, el poftmero fraguable esta en contacto con las caractensticas de la membrana y el patron ordenado sobre el sustrato duro, por lo que cuando el poftmero fraguable se endurece, las caractensticas de escala micrometrica y/o escala mesometrica y el patron ordenado de elementos a escala nanometrica se transfieren al poftmero fraguado. Una vez que el poftmero fraguable se ha endurecido, el sello asf fabricado se puede desmoldar y luego usar para modelar el sustrato polimerico para formar el dispositivo final. Por lo tanto, el molde maestro es una replica exacta del dispositivo final, y el sello es el peaje utilizado para transferir el patron en el molde maestro al sustrato polimerico para producir el dispositivo final. Una ventaja de la presente invencion es que cuando se necesita usar un diseno de canal diferente con el mismo patron ordenado de elementos a escala nanometrica, el nuevo molde maestro se puede fabricar facilmente deslaminando las membranas blandas del sustrato duro y reemplazando las membranas con membranas que tienen el nuevo diseno.
La presente invencion proporciona ventajosamente sistemas monoftticos integrados de bajo costo para microfluidos con capacidad de multiplexacion (por ejemplo, mediante valvulas, bombeo) para un control preciso de las condiciones de cultivo celular que pueden integrar simultaneamente tecnicas plasmonicas mejoradas sin marcadores, como la resonancia de plasmones de superficie (SPR) (por ejemplo, SPR en modo de reflexion, SPR en modo de transmision, resonancia de plasmon superficial localizada (LSPR)) o dispersion Raman mejorada en la superficie (SERS). El presente sistema monofttico integrado para microfluidos a base de poftmeros tiene micro y nanoestructuras que proporcionan senales topograficas para la union celular y el cultivo para controlar el comportamiento celular al tiempo que permite el monitoreo del comportamiento celular, la motilidad, la union, la viabilidad, las interacciones de biomoleculas o cualquier combinacion de estas utilizando deteccion plasmonica. El sistema se fabrica utilizando un proceso simple, robusto y rentable en una sola etapa.
El sistema presente es ventajoso tanto para los procesos convencionales como para los recientemente informados empleados para el cultivo celular y el monitoreo del comportamiento celular, ya que el sistema actual se integra en un solo sustrato biocompatible monofttico, tanto como una superficie nanoestructurada requerida para el monitoreo de la respuesta plasmonica, como una red de microcanales para control preciso del entorno celular, con ventajas adicionales de bajo consumo de volumen, fabricacion rapida a bajo costo de moldes con disenos de canales para microfluidos facilmente intercambiables, capacidad de produccion en masa y deteccion en tiempo real sin marcas in situ de la respuesta celular, viabilidad, comportamiento y enlace biomolecular mediante SPR mejorado (SPR en modo de reflexion, SPR en modo de transmision, LSPR) o SERS.
La presente invencion tiene aplicacion para problemas tales como el cribado molecular u objetivos celulares, la identificacion celular, el cribado de celulas individuales para la expresion de ARN o protemas, el monitoreo de la respuesta celular a diferentes estfmulos (qmmicos, topograficos, flujos, etc.), el cribado de diagnostico genetico a nivel de celulas individuales, o realizando estudios de transduccion de senal de celulas individuales.
Otras caractensticas de la invencion se describiran o se haran evidentes en el transcurso de la siguiente descripcion detallada.
Breve descripcion de los dibujos
Con el fin de que la invencion pueda entenderse mas claramente, las realizaciónes de la misma se describiran ahora detalladamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Fig. 1 representa un diagrama esquematico de un proceso de la presente invencion para producir un sistema monolftico integrado nanoplasmonico de cultivo celular para microfluidos.
La Fig. 2a-d representa esquemas de seccion transversal de un sistema de cultivo celular nanoplasmonico nanoestructurado para microfluidos, en los que (a) es una seccion transversal de una camara a traves de un canal de perfusion y un conducto de perfusion, (b) es una seccion transversal de una camara a traves de un canal de carga celular, (c) es una seccion transversal a traves de una camara que muestra micropilares integrados con superficie superior nanoestructurada y (d) es una seccion transversal a traves de una camara que muestra un elemento microoptico integrado en el lado inferior del sustrato de capa de flujo.
La Fig. 2e-f representa vistas en tres dimensiones del fondo de la camara representado en la Fig. 2a que contiene micropilares con un area de superficie superior nanoestructurada utilizada para (e) controlar la union/motilidad de las celulas y (f) estudiar las interacciones celula-sustrato.
La Fig. 3 muestra micrograftas de SEM de estructuras fabricadas que muestran (a) diferentes nanoestructuras nanoplasmonicas posibles que incluyen nanoagujeros, nanopilares, nanopostes y nanorejillas, (b y c) micro y nanoestructuras tridimensionales definidas en un solo sustrato utilizando un proceso de fabricacion de una etapa de la presente invencion.
La Fig. 4 muestra un esquema de un sistema de cultivo celular nanoplasmonico para microfluidos con capacidad de deteccion plasmonica.
Descripcion de realizaciónes preferidas
Ejemplo 1: Proceso para fabricar un sistema de cultivo celular monolftico integrado nanoplasmonico para microfluidos
Un sistema de cultivo celular monolftico integrado nanoplasmonico para microfluidos de la presente invencion se puede producir generalmente como se muestra en la Fig. 1, que ilustra el proceso que muestra una camara de una sola celula y ninguno de los canales, conductos, valvulas u otras caractensticas para microfluidos para mayor claridad. Una peftcula de elastomero termoplastico blando se estampa en caliente para formar caractensticas de escala micrometrica y escala mesometrica (microcanales, conductos, camaras, etc.) en la membrana 10 de TPE, incluido el agujero 11 pasante. Esto se realiza a una presion aplicada que vana de 5 kN a 15 kN, durante 5-30 minutos, a una temperatura en un intervalo de 100°C a 160°C, dependiendo de las caractensticas deseadas. El sustrato 12 ZeonorMR duro esta modelado por estampado en caliente a una presion aplicada de 10 kN a 20 kN durante 10-30 minutos a una temperatura que vana de 140°C a 170°C, dependiendo del grado espedfico de ZeonorMR para formar una matriz regular de elementos 13 de rejilla a escala nanometrica. Con las caractensticas de escala micrometrica y escala mesometrica hacia arriba, la membrana de TPE se coloca sobre el sustrato ZeonorMR de manera que el agujero pasante este alineado con los elementos de la rejilla. La membrana luego se une de manera reversible al sustrato ZeonorMR para sellar la membrana alrededor del agujero pasante contra el sustrato ZeonorMR para formar el molde 14 maestro a temperatura ambiente. El poftmero 15 fotocurable se vierte en el agujero pasante y sobre la membrana para cubrir la membrana y las caractensticas de escala micrometrica y escala mesometrica del mismo. La placa 16 de soporte de vidrio o metal se coloca sobre la parte superior del poftmero fotocurable y el poftmero fotocurable se expone luego a la radiacion 17 UV para curar el poftmero. Cuando se utiliza una placa de soporte de metal, el conjunto se voltea al reves para curar el poftmero con UV. Despues del curado, el molde 14 maestro y la placa 16 de vidrio (o metal) se retiran para proporcionar el sello 18 de trabajo que tiene relieves 19 que comprenden una imagen inversa de las caractensticas de escala micrometrica y escala mesometrica y la matriz regular de elementos de rejilla a escala nanometrica. El sello de trabajo se utiliza luego para estampar en caliente el sustrato 20 del poftmero termoplastico "duro o blando" (por ejemplo, ZeonorMR, PMMA o un elastomero termoplastico como CL-30, MedipreneMR, etc.) para proporcionar, en una sola etapa, un sistema de cultivo celular monolftico para microfluidos con caractensticas 21 de escala micrometrica y escala mesometrica y una matriz regular de elementos 22 de rejilla a escala nanometrica en su interior.
Los sistemas de cultivo celular para microfluidos producidos de esta manera pueden comprender cualquier numero de camaras de cultivo celular, microcanales, conductos, valvulas, etc. Dibujos esquematicos mas detallados de una camara de cultivo celular en el sistema de cultivo celular monolftico integrado nanoplasmonico para microfluidos producido por este proceso se muestran en la Fig. 2. Haciendo referencia a las Figs. 2a a 2d, la capa 40 de flujo del sistema de cultivo celular comprende canales 41 de carga celular, canales 42 de perfusion, conductos 43 de perfusion y camaras 44 de cultivo, que tienen diferentes dimensiones dictadas por la aplicacion espedfica. Como se muestra en las Figs. 2a, 2b y 2d, la parte inferior de las camaras de cultivo celular puede estar modelada con una matriz ordenada de nanoestructuras 45, en este caso un nanorejilla. Alternativamente, como se muestra en la Fig. 2c, la parte inferior de la camara de cultivo celular puede tener micropilares 46 integrados que tienen nanoestructuras 47 modeladas en la misma. Como se muestra en las Figs.2e a 2f, tales micropilares nanoestructurados pueden proporcionar dos niveles de senales topograficas (espaciales y mecanicas) a escala micro y nanometrica para controlar la union/movimiento (aislamiento o confinamiento de celulas) de las celulas 48, al tiempo que conservan la capacidad de deteccion plasmonica para el estudio del comportamiento celular e interacciones. Ademas, como se muestra en la Fig. 2d, la capa 40 de flujo se puede fabricar para incluir elementos microopticos, tales como microlentes 49 de nanorejilla 45, para un mejor acoplamiento de la luz o una mejor eficiencia de recoleccion de luz, dependiendo del esquema de interrogacion particular (por ejemplo, transmision o reflexion de SPR, LSPR o SERS).
La capa 50 de control y la membrana 51 delgada se pueden colocar encima de la capa 40 de flujo para controlar el flujo de fluido en los canales y conductos del sistema de cultivo celular para microfluidos. La capa 50 de control contiene una red de canales utilizados para suministrar presion en la membrana 51 delgada intercalada entre la capa de control y la capa de flujo para cerrar las valvulas y controlar el flujo de fluido. Si bien para ciertas aplicaciones, el uso de valvulas para el manejo de fluidos puede no ser necesario, para una integracion de alto nivel en el sistema de microfluidos es de gran importancia para permitir el direccionamiento bidimensional de cada camara individual. La integracion monolftica de nanoestructuras con la capa de flujo permite el uso de la capa de control para la integracion de valvulas que de otra manera senan imposibles al simplemente ensamblar una capa de SPR nanoestructurada inferior con una estructura de microfluido superior.
Con referencia a la Fig. 3, se muestran micrograffas de microscopfa electronica de barrido (SEM) de la muestra de posibles nanoestructuras y su integracion monolftica dentro de camaras para microfluidos del sistema de cultivo celular para microfluidos. En la Fig. 3a, de izquierda a derecha se muestran nanoagujeros, nanopilares, nanopostes y nanorejillas. En cada una de las Figs. 3b y 3c de izquierda a derecha se muestran aumentos sucesivos de micrograffas de SEM de microestructuras y nanoestructuras tridimensionales monolfticas fabricadas utilizando el presente metodo, donde el SEM a la izquierda muestra las microestructuras, el SEM a la derecha muestra las nanoestructuras en una microestructura y el SEM en el medio tiene un aumento entre la izquierda y la derecha. En 3b y 3c, el SEM en el medio tiene un aumento 2,5 veces mayor que el SEM a la izquierda, y el SEM en la derecha tiene un aumento 20 veces mayor que el SEM en el medio. El campo de vision para el SEM a la izquierda es de 500 pm.
Ejemplo 2: Uso de un sistema de cultivo celular monolftico integrado nanoplasmonico para microfluidos en la deteccion plasmonica
En la operacion, un sistema de cultivo celular monolftico integrado nanoplasmonico para microfluidos de la presente invencion emplea un flujo impulsado por presion para transportar celulas en suspension desde una pluralidad de depositos a traves de una pluralidad de canales de carga celular hasta una pluralidad de camaras de cultivo celular nanoestructuradas mediante cierre de valvulas de los canales de perfusion y apertura de valvulas en los canales de carga celular. Una pluralidad de lrneas celulares se cargan utilizando una pluralidad de reservorios diferentes. Luego de la union inicial de la celda en la parte inferior de las camaras nanoestructuradas, las valvulas en los canales de carga de celulas se cierran, y se inyectan continuamente medios nuevos en cada uno de los canales de perfusion. Los multiples conductos de perfusion de alta resistencia aseguran una distribucion equitativa de los medios dentro de la camara al tiempo que minimizan el esfuerzo de corte sobre las celulas.
Una vez que las camaras de cultivo celular se cargan con celulas, se toman lecturas de resonancia plasmonica utilizando metodos de deteccion optica de resonancia de plasmon de superficie en modo de reflexion o de transmision, resonancia de plasmon de superficie localizada o espectroscopia Raman mejorada de superficie. La Fig. 4 ilustra la configuracion del dispositivo 60 de microfluidos en relacion con la fuente 62 de luz y el detector 64 del metodo de deteccion optica. Con estos metodos de deteccion, la interaccion celula-sustrato se puede monitorear in situ, en tiempo real y sin marcadores, analizando el cambio en los picos plasmonicos de la respuesta del sustrato nanoestructurado. Los desplazamientos resultantes en los picos plasmonicos para la resonancia de plasmon de superficie (SPR) y la resonancia de plasmon de superficie localizada (LSPR) o la espectroscopia de Raman mejorada de superficie (SERS) se ilustran a la izquierda y a la derecha, respectivamente, en la Fig. 4.
Ademas, el presente diseno permite monitorizar la respuesta celular debido a diferentes senales bioqmmicas que pueden complementarse en los medios de perfusion. Ademas, antes de la carga celular, utilizando los mismos microcanales, la parte inferior de las camaras se puede funcionalizar mediante el flujo de diferentes productos qmmicos y/o especies biologicas para monitorear las interacciones celula-sustrato o para la deteccion de objetivos bioqmmicos excretados o extrafdos de la celula.
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Otras ventajas que son inherentes a la estructura son obvias para un experto en la tecnica. Las realizaciónes se describen aqrn ilustrativamente y no pretenden limitar el alcance de la invencion como se reivindica.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso de produccion de un sustrato (20) polimerico modelado que comprende:
grabar uno o mas patrones ordenados en un sustrato (12) duro, los patrones ordenados comprenden matrices ordenadas de elementos (13) a escala nanometrica que tienen dimensiones de seccion transversal en un intervalo de 10 nm a 1.000 nm, teniendo las matrices una distancia de separacion entre sus elementos respectivos donde la relacion entre la dimension de la seccion transversal y la distancia de separacion es mayor que 0,2;
micromodelado de una pelfcula polimerica para formar una membrana (10) que comprende una primera superficie que tiene un patron de caractensticas a escala micrometrica y/o escala mesometrica para definir uno o mas canales y/o camaras, una o mas caractensticas a escala micrometrica y/o escala mesometrica que comprenden agujeros (11) pasantes y una o mas de las caractensticas de escala micrometrica y/o mesometrica que no son agujeros pasantes;
colocar la membrana (10) sobre el sustrato (12) duro con una superficie opuesta a la primera superficie contra el sustrato (12) duro, los agujeros (11) pasantes alineados para exponer los uno o mas patrones ordenados, y aplicar presion suficiente para sellar los bordes de la membrana (10) que rodean los agujeros (11) pasantes contra el sustrato (12) duro;
colocar un polfmero (15) o metal lfquido fraguable en los agujeros (11) pasantes y sobre la primera superficie y colocar el polfmero (15) o metal lfquido fraguable para formar un sello (18), comprendiendo el sello relieves (19) a escala micrometrica y/o escala mesometrica para definir uno o mas canales y/o camaras para microfluidos y ademas comprende uno o mas patrones de relieve a escala nanometrica en los relieves de escala micrometrica y/o escala mesometrica que complementan los uno o mas patrones ordenados;
modelar un sustrato (20) polimerico estampando el sustrato polimerico con el sello para formar los uno o mas canales y/o camaras (21) para microfluidos en el sustrato polimerico y para formar, en una o mas superficies del sustrato polimerico, uno o mas patrones (22) ordenados de elementos a escala nanometrica que son sustancialmente identicos a los uno o mas patrones ordenados grabados sobre el sustrato (12) duro; y
metalizar los elementos a escala nanometrica en una o mas superficies del sustrato polimerico para la lectura de resonancia plasmonica.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tamano, el espaciado, la geometna o cualquier combinacion de los elementos (13) a escala nanometrica en los patrones ordenados tienen desviaciones estandar de sus respectivos promedios de no mas del 3%.
3. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la relacion entre la dimension de la seccion transversal y la distancia de separacion esta en un intervalo de 0,2 a 1,5; o de 0,5 a 1.
4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que:
el sustrato (12) duro comprende un polfmero de cicloolefina;
la pelfcula polimerica comprende un elastomero termoplastico; y
el sustrato (20) polimerico comprende un polfmero de cicloolefina, un polfmero termoplastico, un polfmero biodegradable, un elastomero, polidimetilsulfona (PDMS) o cualquiera de sus mezclas, en el que el sustrato (20) polimerico comprende preferiblemente un polfmero de cicloolefina o un elastomero termoplastico.
5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los elementos a escala nanometrica se modelan en microestructuras para proporcionar dos niveles de senales topograficas, en el que los elementos (13) a escala nanometrica comprenden uno o mas de nanopilares, nanopostes, nanopuntos, nanobarras, nanopiramides, nanomedialunas, nanodiscos, nanocupulas, nanoagujeros, nanorejillas y nanosurcos, y en el que la relacion de aspecto de elementos individuales a escala nanometrica (13) esta en un intervalo de 10:1 a 1:10.
6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las caractensticas de escala micrometrica y/o escala mesometrica definen ademas una o mas valvulas, conductos, entradas o salidas.
7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que al menos una membrana adicional que comprende un patron de caractensticas a escala micrometrica y/o escala mesometrica para definir uno o mas canales y/o camaras se apila en la membrana colocada sobre el sustrato (12) duro.
8. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el sello se forma a partir de un polfmero (15) fraguable, el polfmero (15) fraguable comprende un polfmero fotocurable y el polfmero fotocurable se cura exponiendo el polfmero fotocurable a luz ultravioleta.
9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que al menos una serie ordenada de elementos (13) a escala nanometrica esta en una camara para microfluidos.
10. Un dispositivo para microfluidos que comprende un sustrato (40) polimerico monolftico modelado con uno o mas canales (42) de escala micrometrica en comunicacion fluida con una o mas camaras (44) para microfluidos, una superficie en el sustrato polimerico que comprende una matriz ordenada de elementos (45, 47) a escala nanometrica que tienen dimensiones de seccion transversal en un intervalo de 10 nm a 1.000 nm, teniendo la matriz una distancia de separacion entre los elementos donde la relacion de la dimension de la seccion transversal con respecto a la distancia de separacion es mayor que 0,2, en donde los elementos de escala nanometrica se metalizan para la lectura de resonancia plasmonica en modo de reflexion o transmision, y en el que la matriz ordenada de elementos a escala nanometrica esta en al menos uno, pero no todos, de los uno o mas canales y las una o mas camaras.
11. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el sustrato (40) polimerico comprende un polfmero de cicloolefina, un polfmero termoplastico, un polfmero biodegradable, un elastomero, polidimetilsiloxano (PDMS) o cualquiera de sus mezclas.
12. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en el que el dispositivo es un sistema de cultivo celular y comprende una o mas valvulas, conductos (43), entradas o salidas, en el que al menos una de las matrices ordenadas de elementos (45) a escala nanometrica estan en al menos una de las camaras para microfluidos, y/o los elementos (47) a escala nanometrica estan modelados en microestructuras (46) para proporcionar dos niveles de senales topograficas.
13. El dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que los elementos (45, 47) a escala nanometrica comprenden uno o mas de nanopilares, nanopostes, nanopuntos, nanobarras, nanopiramides, nanomedialunas, nanodiscos, nanocupulas, nanoagujeros, nanorejillas y nanosurcos con la relacion de aspecto de elementos a escala nanometrica individuales en un intervalo de 10:1 a 1:10 y en el que su relacion de dimension transversal con respecto a la distancia de separacion esta en un intervalo de 0,2 a 1,5, preferiblemente en un intervalo de 0,5 a 1.
14. Uso del dispositivo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, para la lectura de resonancia plasmonica de celulas.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la lectura de resonancia plasmonica es resonancia de plasmon de superficie en modo de reflexion, resonancia de plasmon de superficie en modo de transmision, resonancia de plasmon de superficie localizada o espectroscopia Raman mejorada en superficie.
16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15 para monitorizar el comportamiento celular, la motilidad, la union, la viabilidad, las interacciones de biomoleculas o cualquier combinacion de las mismas.
17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 para cribar objetivos moleculares o celulares, identificacion celular, cribar celulas individuales para la expresion de ARN o protemas, monitorizar la respuesta celular a diferentes estfmulos, cribar el diagnostico genetico a nivel de una celula individual o realizar estudios de transduccion de senales de celulas individuales.
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