CN106769800B - 一种高通量测量间充质干细胞数量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高通量测量间充质干细胞数量的方法，步骤如下：⑴标准品选择、⑵样本制备、⑶样本阳性对照品的制备、⑷空白对照品制备、⑸加样、⑹测量、⑺结果有效性判断、⑻结果计算。本发明能够减少人为误差：使用常规计数方法时，往往因为机器要求或者人工计数要求等问题需要将样本进行高倍数的稀释，而高倍数的稀释易造成较大误差，本方法可直接取样进行检测，避免高倍数稀释从而减少实验误差。

Description

一种高通量测量间充质干细胞数量的方法
技术领域
本发明属于细胞培养领域，涉及一种高通量测量间充质干细胞数量的方法。
背景技术
细胞计数是在细胞培养过程中最为常见的操作，复苏、传代、制剂等操作都需要对培养细胞进行计数，以确认细胞数量。
目前常见的技术方法有两种。一种是人工计数法，基本方法是将细胞悬液稀释，然后将少量悬液注入人工计数版，利用显微镜人工目测计数，最后依据计数板规格，通过公式计算出细胞数量；另一种是机器计数法，细胞稀释和处理过程与人工计数类似，只是计数时将少量稀释后的悬液注入机器配件中，再扫描计数。
两种计数方法的基本原理没有脱离：测量少量样本个数，计算总样本个数这一思路。但这两种方法都有着自身的局限性：
1、计数过程误差：人工计数法需要利用显微镜肉眼观测计数，这一过程人为主观性较大，常会出现不同人计数同一样本但结果不同的情况；而机器计数多采用扫描计数，有时会将不是细胞的颗粒计入其中，或者将过小的细胞漏计，造成计数误差。
2、操作过程误差：人工计数和机器计数最终所需样本多为10-50μL左右，细胞数过多时还需要高倍稀释。因为样本量过少，在吸取样本和稀释的过程中，非常容易产生误差，而在加样过程中，因为计数池过薄，样本在扩散过程中也容易分布不均。这些操作过程的误差都会导致最终计算时所得结果的不准确。
不适用于大批量操作：现今常用的细胞计数方法中，在不做重复实验的情况下，人工计数一次实验结束至少需要10-15分钟，机器计数也至少需要5分钟。并且这种两种方法每次只能对一个样本进行计数，针对大批量样本效率较低，有时甚至会因为计数时间问题影响后续的细胞实验。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种计数误差小、计数效率高的高通量测量间充质干细胞数量的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种高通量测量间充质干细胞数量的方法，步骤如下：
⑴标准品选择：利用标准间充质干细胞溶液，使用PBS为溶剂，制备标准间充质干细胞标准曲线；
⑵样本制备：取1mL待测细胞样本，加入至1.5mL离心管中，300g离心5分钟；弃去上清液，向沉淀细胞中加入PBS至1mL，反复吹打混匀；
⑶空白对照品制备：取上述步骤⑵制成的样本1mL，300g离心5分钟，取上清液做空白对照品备用；
⑷加样：分别取制备好的对照品、标准品和样本200μL，加入至96孔板中，每个样本/标准品做一个复孔；
⑸测量：使用酶标仪或紫外分光光度计，选择360nm波长对样本进行检测；
⑹测量：使用酶标仪或紫外分光光度计，选择360nm波长对样本进行检测；
⑺结果有效性判断：重复实验吸光度值的CV值应小于5％；相关系数R2应大于0.980；实验方成立；
⑻结果计算：
矫正系数的计算：按以下公式计算矫正系数
λ＝A标/(A阳-A样)
上式中：λ为矫正系数
A标＝最低浓度标准品的吸光度值
A阳＝样本阳性对照品的的吸光度值
A样＝样本的吸光度值
标准曲线制备：以5个标准品的吸光度检测结果为纵坐标，标准品细胞密度为横坐标，制出线性方程；
样本结果计算：将未知样本和空白对照品的吸光度值代入线性方程，求出细胞密度，计算未知样本和空白对照品的细胞密度差值，再乘以矫正系数即为样本的的细胞密度。
而且，所述标准曲线为5个点，各点之间为2倍稀释，根据所测细胞的估算数量，制定相应夸度范围的标准曲线；标准曲线在106个/mL则标准曲线选点应为：0.25*106个/mL、0.5*106个/mL、1*106个/mL、2*106个/mL、4*106个/mL。
本发明具有的有益效果：
1、高通量计数：使用本方法进行细胞计数，在使用96孔板并做复孔和空白对照的情况下，一次实验可进行20多个样本的检测(如使用其他规格的孔板，则可获得更大的检测通量)，极大的提高了实验效率，实现了高通量计数。
2、减少取样误差：本方法在测量时所使用的样本量为200μL，与常规计数法相比，增加了检测样本量，降低了取样误差，提高计数准确度。
3、减少人为误差：使用常规计数方法时，往往因为机器要求或者人工计数要求等问题需要将样本进行高倍数的稀释，而高倍数的稀释易造成较大误差，本方法可直接取样进行检测，避免高倍数稀释从而减少实验误差。
4、在本方法中，一些蛋白类的可溶物可能会对实验带来微小误差，但通过多次离心稀释减小误差并不现实，所以本方法的空白对照品采用了制备后样本的离心上清液，以减少误差。
5、控制样本影响：考虑到样本自身性质或含有的一些物质可能会影响吸光度大小，使得检测结果与真实值可能有轻微偏移，从而引起一定误差产生；所以本方法引入了矫正系数，通过标准品的检测获得误差信息，再通过矫正系数换算计算出结果。
6、本方法节约成本：在机器计数法中，每次计数都会消耗一定计数耗材，本法意图节约本部分经济开支。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种高通量测量间充质干细胞数量的方法，步骤如下：
⑴标准品选择：利用标准间充质干细胞溶液，使用PBS为溶剂，制备标准间充质干细胞标准曲线，标准曲线为5个点，各点之间为2倍稀释，根据所测细胞的估算数量，制定相应夸度范围的标准曲线。(如目的样本的细胞数应在106个/mL则标准曲线选点应为：0.25*106个/mL、0.5*106个/mL、1*106个/mL、2*106个/mL、4*106个/mL)。
⑵样本制备：取1mL待测细胞样本，加入至1.5mL离心管中，300g离心5分钟；弃去上清液，向沉淀细胞中加入PBS至1mL，反复吹打混匀。
⑶空白对照品制备：取上述步骤⑵制成的样本1mL，300g离心5分钟，取上清液做空白对照品备用。
⑷加样，分别取制备好的对照品、标准品和样本200μL，加入至96孔板中，每个样本/标准品做一个复孔。
⑸测量：使用酶标仪(紫外分光光度计)，选择360nm波长对样本进行检测。
⑹结果有效性判断：重复实验吸光度值的CV(变异系数)值应小于5％；相关系数R2应大于0.980；实验方成立。根据发明人的验证试验，当变异系数大于5％时，并不能确保本方法的精密度。
⑺结果计算：以5个标准品的吸光度检测结果为纵坐标，标准品细胞密度为横坐标，制出线性方程；将未知样本和空白对照品的吸光度值代入线性方程，未知样本和空白对照品的差值即为未知样本细胞数量。
⑻结果有效性判断：重复实验吸光度值的CV值应小于5％；相关系数R2应大于0.980；实验方成立；(在验证实验的过程中重复组的CV值均保持在5％以下，故本方法建议重复组的CV值小于5％，以保证实验的准确性)；
⑻结果计算：
矫正系数的计算：按以下公式计算矫正系数
λ＝A标/(A阳-A样)
上式中：λ为矫正系数
A标＝最低浓度标准品的吸光度值
A阳＝样本阳性对照品的的吸光度值
A样＝样本的吸光度值
标准曲线制备：以5个标准品的吸光度检测结果为纵坐标，标准品细胞密度为横坐标，制出线性方程；
样本结果计算：将未知样本和空白对照品的吸光度值代入线性方程，求出细胞密度，计算未知样本和空白对照品的细胞密度差值，再乘以矫正系数即为样本的的细胞密度。

Claims (1)

1.一种高通量测量间充质干细胞数量的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴标准品选择：利用标准间充质干细胞溶液，使用PBS为溶剂，制备标准间充质干细胞标准曲线；
⑵样本制备：取1mL待测细胞样本，加入至1.5mL离心管中，300g离心5分钟；弃去上清液，向沉淀细胞中加入PBS至1mL，反复吹打混匀；
⑶样本阳性对照品制备：取1mL待测细胞样本，加入至1.5mL离心管中，300g离心5分钟；弃去上清液，向沉淀细胞中加入步骤⑴中最低浓度的标准品溶液1mL，反复吹打混匀；
⑷空白对照品制备：取上述步骤⑵制成的样本1mL，300g离心5分钟，取上清液做空白对照品备用；
⑸加样：分别取制备好的空白对照品、样本阳性对照品、标准品和样本各200μL，加入至96孔板中，每例各做一个复孔；
⑹测量：使用酶标仪或紫外分光光度计，选择360nm波长对样本进行检测；
⑺结果有效性判断：重复实验吸光度值的CV值应小于5％；相关系数R2应大于0.980；实验方成立；
⑻结果计算：
矫正系数的计算：按以下公式计算矫正系数
λ＝A标/(A阳-A样)
上式中：λ为矫正系数
A标＝最低浓度标准品的吸光度值
A阳＝样本阳性对照品的吸光度值
A样＝样本的吸光度值
标准曲线制备：以5个标准品的吸光度检测结果为纵坐标，标准品细胞密度为横坐标，制出线性方程；
样本结果计算：将未知样本和空白对照品的吸光度值代入线性方程，求出细胞密度，计算未知样本和空白对照品的细胞密度差值，再乘以矫正系数即为样本的的细胞密度。
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