CN101382482A - 一种细胞计数的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种细胞计数的方法，将需要计数的实验组细胞和已知数量的标准组细胞贴壁培养于平面之上；吸去原培养基，清洗细胞，加入戊二醛溶液浸泡，用磷酸盐缓冲液清洗细胞后晾干细胞；使用红外激光检测样品的荧光强度；结合已知细胞数量与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光强度I标准与细胞数量N标准的关系公式：I标准＝a×N标准+b；根据标准曲线和实验组细胞样品的荧光强度计算实验组细胞数量，即N实验＝(I实验－b)/a。本发明体现了简化实验步骤，降低成本，提高实验精度及结果平行性的有益效果。

Description

一种细胞计数的方法
技术领域
本发明涉及一种测量方法，具体地说，是关于细胞计数的方法及其用途，尤其是该方法在细胞内蛋白印迹中的应用。
背景技术
细胞计数是在生命科学研究中经常使用的技术。目前有许多方法用于细胞计数，但是又各有局限：经典的血球计数板法及其系列衍生方法(如申请号为01213605.0的中国专利所述细胞计数方法)虽然测量直观，但由于细胞分散不利或检测人员的熟练程度等原因会产生计数误差，且单个样本计数耗时较长，无法同时对大量样本进行操作，降低了实验结果的平行性；染色法虽然可以满足批量操作的要求，但是各种染料的消耗又提高了实验的成本(如日本专利WO2006003696)。尤其是在使用细胞内蛋白印迹(In-cell western，ICW)测量某种蛋白在细胞内的表达的实验中，需要对细胞的总数进行计算，使用的荧光染料(如美国专利US5563070，欧洲专利EP0634640等)价格更是昂贵，同时数据的准确性不高。
发明内容
为了克服现有技术计数准确度不高、成本高昂等不足，本发明提供了一种成本低廉，数据可靠，批处理结果平行性好的细胞计数方法。
本发明所采用的技术方案步骤包括以下步骤：
1.将需要计数的未知数量的实验组细胞和至少4组已知数量的标准组细胞贴壁培养于平面之上；
2.需要细胞计数时吸去原培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞一次；
3.加入浓度为0.1％～1％的戊二醛溶液浸泡细胞10分钟～1小时；
4.吸去戊二醛溶液，用PBS清洗细胞两次以上；
5.吸去残存PBS，并晾干细胞培养平面；
6.使用红外激光扫描成像系统，选择660nm—710nm之间任一波长激光激发，在大于激发激光波长40nm处检测样品的荧光强度；
7.结合标准组已知细胞数量与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光强度I标准与细胞数量N标准的关系公式：I标准＝a×N标准+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；
8.根据标准曲线和实验组细胞样品的荧光强度计算实验组细胞数量，即N实验＝(I实验—b)/a。
所述的戊二醛溶液采用水、生理盐水、PBS缓冲液作为溶剂配制。
本发明能够应用于细胞内蛋白印迹，在所述的步骤5中，吸出PBS溶液，用Ttriton-X100溶液洗涤若干次，每次3～5分钟；加入封闭剂室温振荡1～3小时；加入纤维连接蛋白抗体于4℃保持10～16小时或室温下保持4小时，用吐温洗涤液洗涤若干次，每次3～5分钟；加入800nm荧光标记二抗于室温振荡1～3小时，再用吐温洗涤液洗涤若干次，每次3～5分钟；吸去残存液体并晾干96孔细胞培养板；在所述的步骤6之前使用红外双色激光扫描成像系统Odyssey对96孔板进行扫描，780nm激光激发，检测820nm波长处样品的荧光强度，该荧光强度代表纤维连接蛋白的含量；在所述的步骤8之后用代表纤维连接蛋白的含量820nm波长处荧光强度除以该实验组的细胞数，求出平均每个细胞所表达的纤维连接蛋白的数量。
本发明的有益效果是：由于采用戊二醛对细胞进行浸泡处理，在起到固定细胞作用的同时，利用戊二醛与蛋白质相互作用产生红外荧光这一现象，结合红外荧光检测设备对细胞数目进行计算，与现有技术相比，本发明体现了简化实验步骤，降低成本(与使用荧光染料相比费用降低十几倍)，提高实验精度及结果平行性的有益效果。
下面结合实施例对本发明进一步说明。
具体实施方式
实施例1：使用本发明所述方法进行细胞计数
1.人骨肉瘤细胞MG-63以未知密度(实验组)及已知的每孔密度(标准组)16×104、8×104、4×104、2×104、1×104、0.5×104、0.25×104个细胞，接入96孔细胞培养板；
2.培养6小时待细胞充分贴壁后，吸出培养基，用PBS溶液清洗孔内细胞一次；
3.向孔内加入加入0.5％戊二醛溶液，其体积应至少可以覆盖所培养的细胞，静置30分钟；
4.吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔内细胞至少两次；
5.吸去残存水分，并晾干96孔细胞培养板；
6.使用红外双色激光扫描成像系统Odyssey，680nm激光激发，检测720nm波长处样品的荧光强度；
7.结合标准组已知细胞数量与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光强度I标准与细胞数量N标准的关系公式：I标准＝a×N标准+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；
8.根据标准曲线和实验组细胞样品的荧光强度计算实验组细胞数量，即N实验＝(I实验—b)/a。
采用本发明所述的方法对细胞进行计数，在线性范围广(0.25×104～16×104)，数据结果平行性好，线性程度高(R2＝0.998)，根据所得一元方程及测量样本的720nm处荧光强度，可以快速、准确的计算出样本中的细胞数目。
实施例2：使用本发明所述方法进行细胞计数
1.人骨肉瘤细胞MG-63以未知密度(实验组)及已知的密度(标准组)按每孔16×104、8×104、4×104、2×104、1×104、0.5×104细胞，接入48孔细胞培养板；
2.培养6小时待细胞充分贴壁后，吸出培养基，用PBS溶液清洗孔内细胞一次；
3.向孔内加入加入1％戊二醛(PBS配置)溶液，其体积应至少可以覆盖所培养的细胞，静置10分钟；
4.吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔内细胞至少两次；
5.吸去残存水分，并晾干48孔细胞培养板；
6.使用红外激光扫描成像系统，660nm激光激发，检测700nm波长处样品的荧光强度；
7.结合标准组已知细胞数量与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光强度I标准与细胞数量N标准的关系公式：I标准＝a×N标准+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；
8.根据标准曲线和实验组细胞样品的荧光强度计算实验组细胞数量，即N实验＝(I实验—b)/a。
采用本发明所述的方法对细胞进行计数，在线性范围广(0.5×104～16×104)，数据结果平行性好，线性程度高(R2＝0.995)，根据所得一元方程及测量样本的700nm处荧光强度，可以快速、准确的计算出样本中的细胞数目。
实施例3：使用本发明所述方法进行细胞计数
1.人骨肉瘤细胞MG-63以未知密度(实验组)及已知密度(标准组)按每孔8×104、4×104、2×104、1×104、0.5×104细胞，接入384孔细胞培养板；
2.培养6小时待细胞充分贴壁后，吸出培养基，用PBS溶液清洗孔内细胞一次；
3.向孔内加入加入0.1％戊二醛(PBS配置)溶液，其体积应至少可以覆盖所培养的细胞，静置1小时；
4.吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔内细胞至少两次；
5.吸去残存水分，并晾干384孔细胞培养板；
6.使用红外激光扫描成像系统，710nm激光激发，检测750nm波长处样品的荧光强度；
7.结合标准组已知细胞数量与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光强度I标准与细胞数量N标准的关系公式：I标准＝a×N标准+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；
8.根据标准曲线和实验组细胞样品的荧光强度计算实验组细胞数量，即N实验＝(I实验—b)/a。
采用本发明所述的方法对细胞进行计数，在线性范围广(0.25×104～8×104)，数据结果平行性好，线性程度高(R2＝0.996)，根据所得一元方程及测量样本的720nm处荧光强度，可以快速、准确的计算出样本中的细胞数目。
实施例4：本发明在细胞内蛋白印迹中的应用
以检测人骨肉瘤细胞MG-63的纤维连接蛋白表达为例：
1.将未知数量的细胞(实验组)和已知数量的系列标准组MG-63细胞(4×104、2×104、1×104、0.5×104)接入96孔细胞培养板培养适当时间；
2.吸去培养基，用PBS溶液小心清洗孔内细胞；
3.加入0.5％戊二醛(PBS配置)溶液，静置30分钟后；
4.吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔内细胞至少两次；
5.吸出PBS溶液，用Ttriton-X100溶液洗涤5次，每次5分钟；加入封闭剂室温振荡2小时；加入纤维连接蛋白抗体于4℃保持16小时，用吐温洗涤液洗涤5次，每次5分钟；加入800nm荧光标记二抗于室温振荡1小时，再用吐温洗涤液洗涤5次，每次5分钟；吸去残存液体并晾干96孔细胞培养板；
6.使用红外双色激光扫描成像系统Odyssey对96孔板进行扫描，780nm激光激发，检测820nm波长处样品的荧光强度，该荧光强度代表纤维连接蛋白的含量；
7.使用红外双色激光扫描成像系统Odyssey对96孔板进行扫描，680nm激光激发，检测720nm波长处样品的荧光强度，该荧光强度代表细胞数量；
8.结合标准组已知细胞数量与荧光强度绘制标准曲线，得到720nm波长处荧光强度I标准与细胞数量N标准的关系公式：I标准＝a×N标准+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；
9.根据标准曲线和实验组细胞样品的荧光强度计算实验组细胞数量，即N实验＝(I实验—b)/a；
10.用代表纤维连接蛋白的含量820nm波长处荧光强度除以该实验组的细胞数，求出平均每个细胞所表达的纤维连接蛋白的数量。
实施例5：本发明在细胞内蛋白印迹中的应用
以检测人骨肉瘤细胞MG-63的纤维连接蛋白表达为例：
1.将未知数量的细胞(实验组)和已知数量的系列标准组MG-63细胞(4×104、2×104、1×104、0.5×104)接入96孔细胞培养板培养适当时间；
2.吸去培养基，用PBS溶液小心清洗孔内细胞；
3.加入0.5％戊二醛(PBS配置)溶液，静置30分钟后；
4.吸出戊二醛溶液，用PBS溶液清洗孔内细胞至少两次；
5.吸出PBS溶液，用Ttriton-X100溶液洗涤4次，每次3分钟；加入封闭剂室温振荡3小时；加入纤维连接蛋白抗体于室温4小时，用吐温洗涤液洗涤4次，每次3分钟；加入800nm荧光标记二抗于室温振荡3小时，再用吐温洗涤液洗涤4次，每次3分钟；吸去残存液体并晾干96孔细胞培养板；
6.使用红外双色激光扫描成像系统Odyssey对96孔板进行扫描，780nm激光激发，检测820nm波长处样品的荧光强度，该荧光强度代表纤维连接蛋白的含量；
7.使用红外双色激光扫描成像系统Odyssey对96孔板进行扫描，680nm激光激发，检测720nm波长处样品的荧光强度，该荧光强度代表细胞数量；
8.结合标准组已知细胞数量与荧光强度绘制标准曲线，得到720nm波长处荧光强度I标准与细胞数量N标准的关系公式：I标准＝a×N标准+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；
9.根据标准曲线和实验组细胞样品的荧光强度计算实验组细胞数量，即N实验＝(I实验—b)/a；
10.用代表纤维连接蛋白的含量820nm波长处荧光强度除以该实验组的细胞数，求出平均每个细胞所表达的纤维连接蛋白的数量。
细胞内蛋白印迹目的在于检测细胞中某种蛋白的表达量，为了对不同样本进行归一化处理，以消除实验样品中细胞数量的差异而导致的数据误差，需要对各个样本的细胞数进行量化，一般使用两种与核酸结合的荧光染料进行细胞计数。将本发明所述方法运用于细胞内蛋白印迹中，使用戊二醛进行细胞计数，大大降低了成本，同时戊二醛作为一种已知的固定剂，在该细胞内蛋白印迹中兼有固定细胞和细胞计数的双重作用，从而简化了实验的操作步骤。

Claims (3)

1、一种细胞计数的方法，其特征在于包括下述步骤：
(a)将需要计数的未知数量的实验组细胞和至少4组已知数量的标准组细胞贴壁培养于平面之上；
(b)需要细胞计数时吸去原培养基，用磷酸盐缓冲液清洗细胞一次；
(c)加入浓度为0.1％～1％的戊二醛溶液浸泡细胞10分钟～1小时；
(d)吸去戊二醛溶液，用磷酸盐缓冲液清洗细胞两次以上；
(e)吸去残存磷酸盐缓冲液，并晾干细胞培养平面；
(f)使用红外激光扫描成像系统，选择660nm—710nm之间任一波长激光激发，在大于激发激光波长40nm处检测样品的荧光强度；
(g)结合标准组已知细胞数量与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光强度I标准与细胞数量N标准的关系公式：I标准＝a×N标准+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；
(h)根据标准曲线和实验组细胞样品的荧光强度计算实验组细胞数量，即N实验＝(I实验—b)/a。
2、根据权利要求1所述的一种细胞计数的方法，其特征在于：所述的戊二醛溶液采用水、生理盐水、磷酸盐缓冲液作为溶剂配制。
3、根据权利要求1所述的一种细胞计数的方法，其特征在于：所述的步骤(e)中，吸出PBS溶液，用Ttriton-X100溶液洗涤若干次，每次3～5分钟；加入封闭剂室温振荡1～3小时；加入纤维连接蛋白抗体于4℃保持10～16小时或室温下保持4小时，用吐温洗涤液洗涤若干次，每次3～5分钟；加入800nm荧光标记二抗于室温振荡1～3小时，再用吐温洗涤液洗涤若干次，每次3～5分钟；吸去残存液体并晾干96孔细胞培养板；在所述的步骤(f)之前使用红外双色激光扫描成像系统Odyssey对96孔板进行扫描，780nm激光激发，检测820nm波长处样品的荧光强度，该荧光强度代表纤维连接蛋白的含量；在所述的步骤(h)之后用代表纤维连接蛋白的含量820nm波长处荧光强度除以该实验组的细胞数，求出平均每个细胞所表达的纤维连接蛋白的数量。
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