CN101782509B

CN101782509B - 一种基于毛细管区带电泳方式的细胞活性检测方法

Info

Publication number: CN101782509B
Application number: CN2010101026354A
Authority: CN
Inventors: 屈锋; 丁金美; 张璐; 江伦; 郝帅; 胡美龄
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2030-01-29
Also published as: CN101782509A

Abstract

本发明公开了一种基于毛细管区带电泳方式的细胞活性检测方法，属于生物细胞活性检测技术领域。本发明首先将待测细胞染色并固定，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，利用毛细管区带电泳(CZE)对细胞进行单波长、或多波长紫外可见吸收检测，以检测的峰面积总和表示细胞在检测波长下的吸光值，以紫外和可见双波长吸收值的乘积表征细胞活性。本发明所述方法准确、快速、简便、成本低且能定性定量地检测细胞活性，可用于细胞活性检测以及毒物的细胞毒性分析，在细胞生物学、细胞毒理学及药物研发，毒物的毒性评价等相关领域均可应用。

Description

一种基于毛细管区带电泳方式的细胞活性检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于毛细管区带电泳方式的细胞活性检测方法，属于生物细胞活性检测技术领域。

背景技术

细胞活性和毒性检测在细胞生物学、细胞毒理学、药物研发等领域应用极其广泛，是生物学、医学中重要的技术和手段。近年来，根据细胞死亡过程中的各个状态的细胞特性变化，建立了多种细胞活性检测方法。常规细胞活性检测方法主要有细胞计数法、台盼蓝拒染法、中性红染色法、四噻唑蓝(MTT)比色法、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测等方法。在细胞活性检测过程中，显微镜、酶标仪和流式细胞仪等仪器发挥着重要的作用。

显微镜观察是推动细胞生物学发展的技术手段，也是细胞活性检测的基本手段。而荧光显微镜的使用，使得这种技术手段在细胞活性检测方面发挥了更大的作用。运用显微镜观察来检测细胞活性，通常是将细胞染色、制片后，显微镜直接观察、拍照。该方法是通过肉眼观察，从形态学或染色程度分辨活细胞或死细胞，人工判断细胞的染色程度和数目，借此判断细胞的活性。但是，这种方法主要依靠人眼的主观判断，易引起较大的人为误差。

酶标仪检测是根据细胞群体染色后的吸光值大小判断细胞活性。其中的四噻唑蓝(MTT)比色法是进行细胞活性判断的常用方法。MTT染料被活细胞摄取后，可被线粒体脱氢酶氧化生成紫色结晶，其生成量与活细胞数成正比。MTT法利用测量组的吸光度值与对照组相比得出的百分率作为所测细胞的存活率，表征细胞活性。此外，还有利用活细胞染料进行染色的方法，细胞群体染色后的吸光值与活细胞数目成正比，根据吸光值的差异可判断活细胞的数目，从而得出细胞群体的相对活性。该方法的不足是仅考虑了活细胞的数目，而不能结合更多因素测定细胞活性。

流式细胞术是现代细胞分析检测技术。可高速分析上万个细胞，快速实现细胞活性检测，并可同时从一个细胞中测得多个生物化学参数。但是流式细胞仪价格昂贵，实验成本很高，非普通从事生物学研究的科研和医疗单位所能拥有。而且，由于流式细胞仪仪对人员操作的技术要求高，使其大规模的应用难以实现。

现代微量分析技术毛细管电泳是通过样品组分在μm级内径的毛细管通道内进行电泳，因组分具有的荷质比差异实现彼此分离。毛细管电泳具有高效、快速、仪器成本和实验费用低等明显优势。在生物、医药和临床等研究中，毛细管电泳已广泛用于生物大分子(蛋白质、核酸等)，有机小分子和无机离子等的分析检测，并可用于细胞内的成分分析。毛细管电泳在生物学、医学、药学、环境科学等研究领域具有广泛的应用，是分析化学的前沿和热点。

目前，已有连续流毛细管电泳应用于细胞活性检测的方法报道。例如，文章“Continuous intact cell detection and viability determination by CE withdual-wavelength detection，Electrophoresis”(DOI 10.1002/elps.200900417，2010，31：1-7)介绍的方法，该方法使单细胞连续地通过毛细管检测窗口，使用紫外-可见双波长检测细胞，其对细胞活性的检测与表征已经过MTT和台盼蓝染色两种常用方法的验证，结果准确。但是，该方法在实施时，由于单细胞连续电泳模式的实现依赖于细胞浓度，不易实现，导致对细胞活性的检测较难实施。此外，数据处理过程复杂，数据分析较为耗时。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毛细管区带电泳结合二极管阵列检测器检测细胞活性的方法，以克服现有方法存在的人为误差，仪器设备昂贵、实验成本高，不适合高通量分析等不足，实现准确、快速、简便、成本低且可定性定量检测细胞活性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于毛细管区带电泳方式的细胞活性检测方法，包括以下步骤：

步骤一、为使毛细管区带电泳能够对细胞活性进行检测，先对待测细胞样品进行预处理。即，用细胞染料将待测细胞染色，离心后，弃去上清液，再加入磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，直至将残留细胞染料洗净为止。之后，向清洗后的细胞沉淀中加入细胞固定液，由此对细胞进行固定化处理，固定化反应温度优选为15-30℃，细胞固定液和固定时间可根据染料特点和细胞性质进行选择。最后，用磷酸盐缓冲液清洗细胞，直至除去剩余的细胞固定液。

其中，所述细胞染料为各种活细胞染料，细胞的染色程度可反映细胞的活性。

所述细胞固定液为常用细胞固定液中的任意一种。例如，可采用4％中性甲醛溶液，固定化处理时反应至少4h；80％-95％的乙醇固定液，固定化处理时反应至少15min；4％多聚甲醛固定液，固定化处理时反应至少10min；5％冰醋酸，固定化处理时反应至少15min；乙醇-甲醛(乙醇-福尔马林，AF)固定液，固定化处理时反应至少10min；醋酸钠-升汞-甲醛(B5)固定液，固定化处理时反应至少10min；Bouin固定液，固定化处理时反应至少30min；Carnoy固定液，固定化处理时反应至少20min；Zenker固定液，固定化处理时反应至少2h。

步骤二、为控制样品中的细胞浓度，进行细胞悬浮液的配制。即，向步骤一得到的细胞沉淀中加入电泳缓冲液，混匀后得到细胞悬浮液。然后，用细胞计数板计数确定出细胞浓度，再用电泳缓冲液调节细胞浓度至10⁴-10⁷个/ml范围。由此可确保每个样品分析时所用细胞悬浮液中的细胞浓度一致。

其中，所述电泳缓冲液选用常用毛细管电泳缓冲液中的任意一种，例如硼酸-硼砂缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸铵缓冲液、羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液等。

步骤三、采用毛细管电泳仪进行毛细管区带电泳检测细胞。即，将步骤二中配制好的细胞悬浮液转移至毛细管电泳进样瓶中，采用压力进样或电进样，使细胞溶液进入毛细管一端。然后加电压，使细胞溶液在毛细管内移动并通过二极管阵列检测器。此时，在选定的紫外波长和可见波长下同时检测进样细胞。由于进样细胞聚集成一个或多个细胞团，因此每种波长检测时得到的电泳峰可能为一个或多个，因此，将所有电泳峰的峰面积相加，得到峰面积总和，由其表示细胞在相应波长下的吸光值。用紫外和可见两波长的吸光值的乘积即可表示细胞活性的量值。

其中，所述毛细管区带电泳所用毛细管的长度为30-60cm，内径为10-100μm。采用压力进样时压强为5-250mbar，进样时间为3-30s；采用电进样方式时的电压为500V-30KV，进样时间为3-30s。电泳电压为5-30KV。检测时采用的紫外波长为180-300nm，可见波长直接采用染料的最大吸收波长。

有益效果

本发明方法，对比现有技术，具有以下优点：

1)本发明应用毛细管电泳技术进行细胞活性检测，具有简单、快速、实用、高效、安全和低成本等优点，并且避免了人工观察带来的误差。毛细管电泳是现代微量分析技术，其在仪器成本、实验成本和操作技术等方面具有优势，利用毛细管电泳进行细胞活性检测是一种简单、实用和低成本的细胞分析新方法。使用毛细管电泳，结合传统细胞生物学细胞染色的方法，进行细胞活性的检测，用仪器检测的客观量值代替以往人工观察的主观判断，实现细胞活性的定量分析。

2)由于本方法中的细胞样品经过固定化处理，因此能够耐受电泳分析过程中电压的不利影响。同时，方法具有样品存放时间长的优点。这是因为固定化后的细胞其原有状态得以保持，且在分析过程中细胞的活性和状态不再改变，所以样品可长时间存放。

3)本方法以紫外-可见双波长吸光值的乘积表示细胞活性，综合考虑多种因素，具有较高的准确性和灵敏度。采用紫外-可见双波长检测细胞，细胞在紫外波长下的吸收主要反映了细胞的大小和细胞的蛋白含量，由于细胞活性改变的凋亡过程伴随着细胞的皱缩和细胞内蛋白的流失，所以凋亡细胞在紫外波长下的吸光值较低，即细胞活性与紫外波长下的吸光值正相关；而细胞在可见波长下的吸收主要反映了细胞被染料染色的深浅程度，用活细胞染料对细胞进行染色，则细胞活性与可见波长下细胞的吸光值也呈正相关。以双波长吸光值的乘积表示细胞活性，同时考虑了细胞大小、细胞蛋白含量以及活细胞染料染色程度三个因素对细胞活性的反映，提高了检测结果的准确性。而且，用双波长吸光值的乘积表示细胞活性，对于数据的批间差异有放大的作用，因此提高了检测方法的灵敏度。

4)与连续流毛细管电泳进行细胞活性检测的方法相比，本方法使用毛细管区带电泳检测细胞活性，具有分析时间短，数据处理简单，染料选择范围广，对细胞的大小限制小等优点。

5)本发明建立的细胞活性检测方法有望应用于细胞生物学、细胞毒理学、药物分析、环境毒性物质检测、食品安全毒性分析、医用材料的生物相容性评价等相关领域。

附图说明

图1为毛细管区带电泳进行细胞活性检测的示意图。其中，1-毛细管，2-二极管阵列检测器，3-正负电极，4-电泳图谱。

图2为实施例1的正常细胞毛细管区带电泳214nm和健那绿染料最大吸收波长(596nm)双波长检测的结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明方法做进一步详细说明。

表1、2、3为细胞活性检测的数据表。其中第一列为处理细胞所用药物的浓度，对于甲基汞等毒性物质，药物浓度的增大将导致细胞活性的降低。表中第二列和第三列分别为紫外波长下和可见波长下细胞样品的吸光值。表中第四列数据为上述两个吸光值的乘积，以此表示细胞的活性，该乘积值越大，表明细胞活性越大。表中第五列为重复电泳三次所得数据的相对标准偏差(RSD)值，RSD值越小，说明测定结果的精密度越高，数据越可靠。

实施例1

培养6组Hela细胞，可使用六孔板或者规格相同的培养瓶。其中一组作为对照组，不加诱导剂，其余5组分别加入浓度为2、4、6、8、10μg/ml的甲基汞。在37℃，5％CO₂条件下培养12h，得到正常细胞样品和经不同浓度甲基汞诱导的待测细胞样品。

步骤一、对正常细胞样品和待测细胞样品均进行预处理。即，用0.2mg/mL的健那绿将正常细胞样品和待测细胞样品染色10min，离心后移去上清液，再加入磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，直至将残留的健那绿染料洗净。

之后，向清洗后的细胞沉淀中加入200μL浓度为4％的甲醛溶液，由此对细胞进行固定化处理，固定化过程是在室温下反应4h。最后，用磷酸盐缓冲液清洗细胞，直至除去剩余的细胞固定液。

步骤二、为控制样品中的细胞浓度，进行细胞悬浮液的配制。即，向步骤一得到的6组细胞沉淀中分别加入50mM的硼酸-硼砂缓冲液，混匀后得到细胞悬浮液。然后，用细胞计数板计数确定出细胞浓度，再用50mM的硼酸-硼砂缓冲液调节细胞浓度至1.25×10⁵个/ml范围。由此可确保每个样品分析时所用细胞悬浮液中的细胞浓度一致。

步骤三、采用毛细管电泳仪进行毛细管区带电泳检测细胞，如图1所示。即，将步骤二中配制好的细胞悬浮液转移至毛细管电泳进样瓶中，采用压力进样，使细胞溶液进入毛细管一端。然后加电压进行电泳，使细胞溶液在毛细管内移动并通过二极管阵列检测器，此时，在紫外波长为214nm和可见波长为596nm下同时检测进样细胞。由于进样细胞聚集成一个或多个细胞团，因此每种波长检测时得到的电泳峰可能为一个或多个，因此，将所有电泳峰的峰面积相加，得到峰面积总和，由其表示细胞在相应波长下的吸光值。用紫外和可见两波长的吸光值的乘积即可表示细胞活性。

其中，所述毛细管区带电泳所用毛细管的长度为30cm，内径为100μm。采用压力进样时的条件为50mbar，进样6s；电泳电压20KV。

电泳图谱如图2所示，记录了细胞在214nm和596nm波长下的吸光值。以214nm波长下的吸光值表征细胞皱缩情况和细胞蛋白丢失情况，以596nm波长下的吸光值表征细胞内线粒体数目和线粒体膜电位的下降情况。两个波长下的吸光值变化都在一定程度上反映了细胞样品的活性，而二者的乘积可同时表征细胞样品几方面的变化。并且，选择乘积作为表征参数，对于细胞样品的变化具有放大的作用，可提高检测灵敏度。因此选择以214nm和596nm下的吸光值的乘积作为细胞样品活性的表征。求出对照组正常细胞以及2、4、6、8、10μg/ml甲基汞处理的待测细胞样品的双波长吸光值乘积数值见表1。

表1甲基汞处理的细胞样品活性检测结果(健那绿染色)

甲基汞浓度μg/ml	214nm峰面积	596nm峰面积	双波长吸光值乘积(×10³)	RSD(×10³)
					0	46.68	44.65	2.08	0.20
2	45.95	39.20	1.81	0.29
					4	34.78	27.71	1.03	0.68
6	29.93	25.77	0.84	0.58
					8	20.02	19.38	0.40	0.14
10	19.55	15.90	0.31	0.02

实施例2

步骤一、对正常细胞样品和待测细胞样品均进行预处理。即，用10μg/mL的Rhodamine 123将待测细胞样品在37℃下染色10min，离心后移去上清液，再加入磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，直至将残留的Rhodamine 123洗净。

之后，向清洗后的细胞沉淀中加入200μL浓度为4％的多聚甲醛，由此对细胞进行固定化处理，固定化过程是在室温下反应30min。最后，用磷酸盐缓冲液清洗细胞，直至除去剩余的细胞固定液。

步骤二、为控制样品中的细胞浓度，进行细胞悬浮液的配制。即，向步骤一得到的6组细胞沉淀中分别加入50mM的硼酸-硼砂缓冲液，混匀后得到细胞悬浮液。然后，用细胞计数板计数确定出细胞浓度，再用50mM的硼酸-硼砂缓冲液调节细胞浓度至6.25×10⁴个/ml范围。由此可确保每个样品分析时所用细胞悬浮液中的细胞浓度一致。

步骤三、采用毛细管电泳仪进行毛细管区带电泳检测细胞。即，将步骤二中配制好的细胞悬浮液转移至毛细管电泳进样瓶中，采用压力进样，使细胞溶液进入毛细管一端。然后加电压进行电泳，细胞溶液在毛细管内移动并通过二极管阵列检测器，此时，在紫外波长为214nm和可见波长为500nm下同时检测进样细胞。由于进样细胞聚集成一个或多个细胞团，因此每种波长检测时得到的电泳峰可能为一个或多个，因此，将所有电泳峰的峰面积相加，得到峰面积总和，由其表示细胞在相应波长下的吸光值。用紫外和可见两波长的吸光值的乘积即可表示细胞活性的量值。其中，所述毛细管区带电泳所用毛细管的长度为30cm，内径为100μm。采用压力进样时的条件为50mbar，进样12s；电泳电压20KV。即：

以214nm波长下的吸光值表征细胞皱缩情况和细胞蛋白丢失情况，以500nm波长下的吸光值表征细胞内线粒体数目和线粒体膜电位的下降情况。两个波长下的吸光值变化都在一定程度上反映了细胞样品的活性，而二者的乘积可同时表征细胞样品几方面的变化。并且，选择乘积作为表征参数，对于细胞样品的变化具有放大的作用，可提高检测灵敏度。因此选择以214nm和500nm下的吸光值的乘积作为细胞样品活性的表征。求出对照组正常细胞以及2、4、6、8、10μg/ml甲基汞处理的待测细胞样品的双波长吸光值乘积数值见表2。

表2甲基汞处理的细胞样品活性检测结果(Rhodamine123染色)

甲基汞浓度μg/ml	214nm峰面积	500nm峰面积	双波长吸光值乘积(×10³)	RSD(×10³)
					0	79.5	21.7	1.73	0.35
2	71.2	19.4	1.40	0.50
					4	30.0	13.2	0.43	0.32
6	22.7	9.8	0.23	0.08
					8	19.8	11.8	0.23	0.02
10	7.1	1.8	0.01	0.001

实施例3

培养6组Hela细胞，可使用六孔板或者规格相同的培养瓶。其中一组作为对照组，不加诱导剂，其余5组分别加入浓度为2、4、6、8、10μg/ml的甲基汞。在37℃，5％CO₂条件下培养16h，得到正常细胞样品和经不同浓度甲基汞诱导的待测细胞样品。

步骤一、对正常细胞样品和待测细胞样品均进行预处理。即，用0.1mg/mL的中性红染色将待测细胞样品在37℃下染色10min，离心后移去上清液，再加入磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，直至将残留的中性红染料洗净。

步骤二、为控制样品中的细胞浓度，进行细胞悬浮液的配制。即，向步骤一得到的6组细胞沉淀中分别加入50mM的硼酸-硼砂缓冲液，混匀后得到细胞悬浮液。然后，用细胞计数板计数确定出细胞浓度，再用50mM的硼酸-硼砂缓冲液调节细胞浓度至3.125×10⁴个/ml范围。由此可确保每个样品分析时所用细胞悬浮液中的细胞浓度一致。

步骤三、采用毛细管电泳仪进行毛细管区带电泳检测细胞。即，将步骤二中配制好的细胞悬浮液转移至毛细管电泳进样瓶中，采用压力进样，使细胞溶液进入毛细管一端。然后加电压进行电泳，使细胞溶液在毛细管内移动并通过二极管阵列检测器，此时，在紫外波长为214nm和可见波长为525nm下同时检测进样细胞。由于进样细胞聚集成一个或多个细胞团，因此每种波长检测时得到的电泳峰可能为一个或多个，因此，将所有电泳峰的峰面积相加，得到峰面积总和，由其表示细胞在相应波长下的吸光值。用紫外和可见两波长的吸光值的乘积即可表示细胞活性的量值。其中，所述毛细管区带电泳所用毛细管的长度为30cm，内径为100μm。采用压力进样时的条件为50mbar，进样24s；电泳电压20KV。即：

以214nm波长下的吸光值表征细胞皱缩情况和细胞蛋白丢失情况，以525nm波长下的吸光值表征细胞内溶酶体数目和溶酶体活性的变化情况。两个波长下的吸光值变化都在一定程度上反映了细胞样品的活性，而二者的乘积可同时表征细胞样品几方面的变化。并且，选择乘积作为表征参数，对于细胞样品的变化具有放大的作用，可提高检测灵敏度。因此选择以214nm和525nm下的吸光值的乘积作为细胞样品活性的表征。求出对照组正常细胞以及2、4、6、8、10μg/ml甲基汞处理的待测细胞样品的双波长吸光值乘积数值见表3。

表3甲基汞处理的细胞样品活性检测结果(中性红染色)

甲基汞浓度μg/ml	214nm峰面积	525nm峰面积	双波长吸光值乘积(×10³)	RSD(×10³)
					0	90.8	43.2	3.92	0.13
2	82.6	45.0	3.72	0.22
					4	55.2	36.6	2.02	0.05
6	50.3	32.6	1.64	0.08
					8	48.7	29.8	1.45	0.10
10	42.9	29.6	1.27	0.03

Claims

1.一种基于毛细管区带电泳方式的细胞活性检测方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、对待测细胞样品进行预处理

用细胞染料将待测细胞染色，离心后移去上清液，再加入磷酸盐缓冲液清洗细胞，直至将残留细胞染料洗净为止；之后，向清洗后的细胞沉淀中加入细胞固定液，由此对细胞进行固定化处理，细胞固定液和固定时间根据细胞染料特点和细胞性质进行选择；最后，用磷酸盐缓冲液清洗细胞，直至除去剩余的细胞固定液；

其中，所述细胞染料为各种活细胞染料；所述细胞固定液为常用细胞固定液中的任意一种；

步骤二、进行细胞悬浮液的配制

向步骤一得到的细胞沉淀中加入电泳缓冲液，混匀后得到细胞悬浮液；然后，用细胞计数板计数确定出细胞浓度，再用电泳缓冲液调节细胞浓度至10⁴-10⁷个/ml范围；

其中，所述电泳缓冲液选用常用毛细管电泳缓冲液中的任意一种；

步骤三、采用毛细管电泳仪进行毛细管区带电泳检测细胞

将步骤二中配制好的细胞悬浮液转移至毛细管电泳进样瓶中，采用压力进样或电进样，使细胞悬浮液进入毛细管一端；然后加电压，使细胞悬浮液在毛细管内移动并通过二极管阵列检测器；此时，在选定的紫外波长和可见波长下同时检测进样细胞，将所有电泳峰的峰面积相加，得到峰面积总和，由其表示细胞在相应波长下的吸光值，用紫外和可见两波长的吸光值的乘积即可表示细胞活性的量值；

其中，所述毛细管区带电泳所用毛细管的长度为30-60cm，内径为10-100μm；采用压力进样时的压强为5-250mbar，进样时间为3-30s；采用电进样方式时，电压为500V-30KV，进样时间为3-30s；加电压时的电泳电压为5-30KV；检测时采用的紫外波长范围为180-300nm，可见波长直接采用细胞染料的最大吸收波长值。

2.如权利要求1所述的一种基于毛细管区带电泳方式的细胞活性检测方法，其特征在于：所述步骤一中的固定化处理过程在15-30℃温度范围内进行。