CS219900B2

CS219900B2 - Method of immunological determination of the enzyme and means for executing the same method

Info

Publication number: CS219900B2
Application number: CS813163A
Authority: CS
Inventors: Siegfried Neumann; Gerhard Gunzer; Norbert Hennrich; Hermann Lang
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1980-04-30
Filing date: 1981-04-28
Publication date: 1983-03-25
Also published as: JPS57551A; IL62728A0; DD158676A5; EP0038935B1; EP0038935A1; DE3016575A1; ZA812773B; IL62728A; JPH0370184B2; DE3167677D1

Description

Vynález se týká způsobu a prostředku pro imunologická stanovení enz^ymů, která s inhibitorem tvoří komplex enzym-inhibitor, obzvláště ^pro stanovern proteol^ytických enzymů.

Při zánětlivých procesech hrají proteázy z polymorfních leukocytů a makrofágů zásadní roli při poškozování přítomné tkáně. Leukocytární proteázy, jako je například elastáza nebo- kollagenáza, .jsou lokalisovány v lysosomech bílých krvinek a po patologickém podráždění jsou vylučovány do extracelulárrnho prost'^ře^dí. Zásobují z^de o^dbourávání tkáňových vazebných substancí a po vstupu do- krevního o^běhu způsobuj poruchy homeostázy například odbouráváním srážecích faktorů a fibrinogenu. Kvantitativní důkaz leukocytárních proteáz v krvi je tedy velmi cenný pro posouzení akutity z^án^ětlivého onemocněný pro- ^pozorován^í průběhu při chronických zánětech, pro kontrolu terapie a pro prognostiku. Stanovení těchto· faktorů se jev^í jako nutné zvlášté tehdy, když v .souvislosti s onemocněním nastává leukocytóza, jako- například při určitých -infekčních nemocech, intoxikacích, nekrose tkáně, endokrinologických -onemocněních, maligních nádorech a podobně.

Exaktní kvantitativní důkaz proteáz leukocytů v krvi byl dosud ztěžován tím, že tyto proteolytické enzymy při vstupu do· krevního - oběhu tvoří rychle komplexy s inhibitory ·^proteolytických enzymů kter^é jsou v krvi bohatě zastoupeny, jako je například alfai-antitrypsin, -alfa2-makroglobulin a podobně. ^Kom^plex^y s alfai-antl'tr^ypsinem jsou stechiometricky stavěné sloučeniny z jedné molekul^{y p}roteol^ytick^ého enz^ymu a jedn^émolekuly inhibitoru za tvorby kovalentní vazby. V uvedeném komplexu je proteáza enzymaticky inaktlvní. Z tohoto- důvodu je stanⁱoven^í enzymatické . aktMty zcela nevhodné pro kvantitativní zjištění koncentrace proteolytických enzymů v plazmě, séru nebo také v jiných tělních tekutinách, jako je synoviální kapalina exsudát, tkáňový extrakt -a podobně.

Z leukocytárních proteolytických enzymů má elastáza (EC 3.4.21.11) obzvláštní význam: Ve značném množství -se vyskytuje v leukocytech a představuje společně s kolla^genázou 5 % su'šin^{y g}ranulocytů. Tento enzym má nepatrnou substrátovou specifitu a může ^proteotytick^y -odbourávat mnoho různých, bⁱolo^gicky důležitý^ látek, jako je napříWad elastik ^proteo^gl^ykan^y, kolagen imunoglobulin, faktory komplementu, fibrlnoge a -srážecí faktory. Elastáza je v ^plazm^ě z 92 % vázaná na alrápantitry^ sin a z 8 % vázan^á na jin^é molekul^y inhibitorů. ^Komplex^y iz elastáz^y a alíapantitrypsinu byly prokázány -při zánětlivých procesech například v plazmě, séru, peritoneální kapalině, hnisu a podobně.

Vzhledem k tomu, že proteolytické enzym^y jsou v tětotoh tekutinách.stéle vázané na inhibitory, je jejich důkaz možný prak ticky pouze za pomoci imunologických meto^d. Známé takové ^-meto^dy jsou například elektroimunodifúze, radioimunologícký test a aglutinační tesý ^po^přípa^dě test blokování aglutinace. Uve.dené meto^dy vsak maj^í značné nevýhody. Elektroimunodifúze je zdlouhavá a pro rutinní stanovení nevhodná; vyhodnocení je pouze kvalitativní a špatně reprodukovatelné. Radioimunologícký test je rovněž časov^ě náro^čný a je nevýhodný kvůli použití radioaktivních látek. Obzvláštní nevýhody jsou následující:

Nutnost speciálních laboratorních zařízený zvláštní bez^pečnostní -o^pat^ření kvůli ne^bez^pe^čí -ozářený ne^patrná stabihta ra^dioaktivně značených substancí, zabezpečení a podobně.

^Z DOS č. ²I6 ⁴¹ 840 je známý aglutmační •tesý ^při kterém se zkoumaná ^plazma uv^{ádí d}o styku se sus^penz^í částeček syntetické pryskyřice nebo- částeček krve, na jejichž povrchu je nanesena protilátka komplexu enz^ym-mhibitor^, a ^potom se bezprostředně pozoruje, -zda aglutinace nastává nebo ne. Uvedená metoda -má -tu nevýhodu, že poskytuje pouze semikvaniitatl·vm výsledky a nelze ji používat jako rutinního stanovení. Použité protilátky je třeba pomocí nákladných výrobních způsobů převést na specifickou formu pro -antigenní determinanty, které jsou přítomny pouze v komplexech enzym -inhibitor.

V DAS č. 22 06 103 je popsána metoda, při které se nechá reagovat jedna určovaná komponenta se zakotveným vazebným členem a jeden -z obou těchto- vazebných členů se stanov^{í p}omocí molekul mdikátoru značených enzymem. ^Sptecfické kvantitativní stanovení kom^plexu enzym-inhibitor ted^ypomocí této metody není možné.

Předložený vynález tedy řeší úkol vypracovat způsob a prostředek pro kvantitativn^í stanovení -enz^ymů, ^které se v^yskytují ve formě komplexů enzym-inhibitor, pomocí kterého- by bylo -možno odstranit nevýhody známých -metod.

P-odle ^před^ožen^ého ^-v^ynálezu je tento^- ůko^lvytošen tak ^že -se kom^ptex enzym-inhibitor naváže za pomoci zakotvené fáze protilátky enzymového- podílu a potom následuje stanovení ^pomoc^í značen^{é p}rotilátk^y intébitorového ^-podílu molekulové vazby.

Předmětem ^pře^dlo^žené^ho v^ynátezu ted^yje z^půso^b stanovení en'z^ymů - za ^pomoci ^protilátek stanovovaného· enzymu, vázaných nave vo^dě neroz^pustný ntfsfÍý který je charakterizovaný tím, že se enzymy, které tvoří s inhibitorem komplex enzym-inhibitor, inkubují s vázanými protilátkami, reakční roztok se odstraní, promytý nosič s protilátkou, nas^ycený ^kom^plexem enzym-inhibi^tor^, se inkubuje s produktem kopulace, vytvořeným z protilátky specificky reagující s inhibitorem a značkované substance, -nenavázaný produkt kopulace se -odstraní a míra koncentrace určovanéiho enz^ymu se zjistí na

219 9 0'0 základě koncentrace značené substance na pevné fázi.

Dále se ^předložený v^yn^ález tý^{ká p}ro-střed^ku ^{k p}rov^ádění tohoto z^půso^bu, který sestává z reakční nádoby potažené protilátkou stanovovaného enzymu a z produktu kopulace, tvořeného z protilátky specificky reagujím s inhibitorem a znač^:kov^é substance.

Dalším ^předmětem ^pře^dlozené^ho vynMezu je použití tohoto prostředku ke stanovení enzypiů, které s inhibitory tvoří komplexy enzym-inhibitor.

Pomocí z^působu a prostroďku podte předloženého vynálezu je možno principiálně stanovovat všechny enzymy, které mohou s inhibitorem tvořit komplex enzym-inhibitor, a které proto není možno· stanovit přímým měřením enzymatické aktivity. Předložený vynález je obzvláště vhodný ke stanovern komplexů proteolytických enz^ymů se vždy relevantními inhibitory proteáz, jako· je např. elastáza/a^jfal-antitrypsln^, thrombin/antithrombin ΙΙξ p^lasmin^/antiplasmin^,trypsmMlfai-antňrypsin a podobně.

Tento· způsob je specifický, jednoduchý, rychty a cittivý. ^pro jeho prováděl jsou potřebné -pouze tři specificky vyrobené reakční složky (reakční nádoba potažená protilátkou, enzymem značená protilátka, roztok s definovanou koncentrací komplexu enzym-inhibitor], přičemž provádění je možné s aparativním vybavením běžné klini-cko-chemické laboratoře.

Způso^b je založen na tvorbě speciímké vazby komplexu enzym-inhibitor na imobilízované protilátce enzymu a na následujícím kvantitativním stanovení vázaného komplexu se značenou protilátkou inhibitoru. Pro· důkaz se tedy používají dvě antiséra s absolutně rozdílnou vazebnou speccfitou, tot^iž spemfická pro· je^den z olbou člen^ůmolekulové vazby.

Specifický reaktant pro proteolytický enzym, vyskytující se například v komplexu prcteo-ytický enzym-inhibitor proteázy, se zakotví na pevný nosič. Reaatanty speccfickými pro proteolytické enzymy jsou protilátky .nebo· jejich fragmenty, vázající anti^gen. pacifické preparáty protnátek se kolují ze s^t^c^cificky imunizovaných zvířat. Jako imunogeny se ^používa^,j^í protedytické enzymy v neúčinném stavu po reakci s nízkomolekulárními inhibitory, nebo také v nezpracovaném stavu. Vhodnými pokusnými zvířaty pro· přípravu antisér jsou například ovce nebo· králíci, vhodná jsou však také jiná pokusná zvířata.

V pevné fázi používané protilátky proteolytíckých enzymů je možno použít také bez nosiče, například po zesítění pomocí polyfunkčních činidel, jako jsou například dialdehydy, dioxidy a podobně, čímž s-e stanou nerozpustnými. Výhodně se ale protilátky vážou na pevný nosný materiál. Pevný nosič může sestávat z materiálu, který je inertm ^k reakčním ^slož^kám pouzty-aným při testu a na který je možno protilátky prote-olytíckých enzymů připojit.

^Vho^dnýmⁱ nosi^či jsou nap^říkla^d tvarová tělíska, jako amorfní částice, kuličky, destič^ fóRe nebo .reakčrn nátótay . z anorganického _ materiálu např. sklo) nebo organického materiálu (například homopolymery nebo kopolymery vinylových sloučenin jako olefinů, vinylacetátu, vinylchloridu, vinilidenchloridu, tetrafluorethylenu, styrenu, kyseliny arkylov-é nebo metakrylové, dále polymery formaldehydu a cyklických acetalů, jakož i polykondenzáty, jako je polyester, polykarbonáty nebo polyamidy, nebo zesítěné uhlohydráty a zesítěné polypeptidy), a dále biologické částice, jako jsou například buňky (erythrocyty).

Vazba protilátky · na pevný nosič může být adsorpční, adhesní nebo případně kovalentní. Je možné fixovat protilátku na pevný nosič pomocí běžných metod chemie peptidů kovalentní vazbou biologicky aktivních polypeptidů. Typickými metodami tohoto- je aktivace povrchu nosiče bromkyanovou metodou nebo povrchové zesítění protilátky na činidel, jako· je glutarďialdehyď a podobně.

Bylo -zjištěno, že u rozličných nosičů se mohou protilátky proteáz na povrch nosné látky dostatečně pevně vázat adsorpcí nebo adhesí. Při potahování se nosič uvádí do styku s protilátkou nebo s jejími antigen vázajícími fragmenty. Například se protein roz^pustí ve vodném roztek výho^dn^ě v 0^,15 M roztoku chloridu odného nebo v isotonickém roztoku chlortóu setoého· puírovaném fosfátem (^dále zkracov^áno na ^pBS) o ^pH ^7,2o koncentraci proteinu 1 pg/l až 1 g/1, výhodn^{ě 10} mg/1. Roztok proteinu se vyrobí zředěním krevní plazmy nebo krevního séra s^ť^c^cificky imunizovaných zvířat, výhodně ale rozpuštěním čištěného imunoglobulinu z antiséra. Roztek se necM stát s nosmem ^po dobu v rozmel je^dn^é mmuty a^ž pěti top výhodně po dobu 24 h. Potom se roztok od nosiče oddělí, například slitím z nádoby, a nos^ič se ^prom^yje pu^frem, který výhodně obsahuje detergent (například PBS o pH 7,2 s ^0,05 % hmotnostnímⁱ po^lyox^yethylensc=rbⁱtanmonolaurátu).

Stanovení komplexů proteolytický enzym-mhíbitor protek se prov^í tim způsobem, že se nosič, který byl potažen specifickou protilátkou stanoveného enzymu nebo fragmenty vázajícími antigen této protilátky, inkubuje po· dobu v rozmezí jedné minuty až ⁴8 hod-n výhodně po ^dobu ² hodin, s komplexem proteolytický · enzvm-mhibitor proteáz^y obsazeném, v ka^palinё^, například se vzorkem séra. V paralelním stanovení se použije vzorek o známé koncentraci komplexu proteolytický enzym-inhibitor proteázy. Tyto vzorky se připraví zředěním reakční směsi z vysoce čisté · proteázy a vysoce čistého inhibitoru proteázy v pufru (napřík^ ^PBS o ^{pH 7,}2) nebo v hds^ ^plazmě^,která byla předem inaktvvována po dobu 30 minut při teplotě 56 °C.

Potom' se takto zpracovaný nosič po inkubaci zbaví roztoku a kvůli odstranění přebytečné kapaliny a zbytků vzorku se promy219900

Je pufrem (například PBS při pH 7,2). Potom se tento nosič inkubuje s .roztokem značkovaného druhého reafóního členu. 'který je specifický pro komplexně vázaný inhibitor proteázy. Doba inkubace závisí na určitém .rozsa^hu podmrne^k se zřetelem na hodnotu ^pH. teptotu a koncentraci. Všeo^becně .se doba působert ^po^hybuje v rozmez^í2 až 24 hodm. Redctanty pro tento reaMtí stupeň jsou protdátky nebo fragmenty protilátek, které jsou říze:n^{y p}roti antigennta determinantům kom^plexně vázaných moleкЫ Inhibitoru proteol^ytiokýc^h enzymů.

Specifické preparáty protilátek se izolují ze séra· specificky imunizovaných zvířat. Ja^ko účeln^é se ukázalo obotacován protilátkových frakcí .z. těchto antisér postupem imunoadsorpce na immobilízovaném antigenu a odd&ern o^{d p}rotiláte^k neznám^é specifity.

Jako značkovcí látky pro druhé reaktanty se ^po^^i^vaj^í napřfalad enzymy. lummiscenčn^í .značkovarn látky. Huorescenčm nebo radioaktivrá substance. V rámci předloženého vynálezu jsou výhodné použít takové značkovací enzymy. jejichž aktivita se dá lehce zjistit opttráým testem. obzvláště při ^barevné reakti ve viditelném. světů nebo pn zm^ěně koncentrace NADH · nebo NADPH. Typíc^ké pNklady vhodných .značkovacích enzymů jsou alkalické fofatázy. peroxidázy. glukosooxidáz^y. alfa-^gaiaktosid^áza. beta-gala^ tosidáza. . glukoamyláza. invertáza. maltdetydrogeaáza nebo. gtokoso-O-fosráMehydrogenáza.

Kov.alentm vazb^y značkovamch enz^ym^ů se speccfickými protilátkami inhibitorů proteolytíckých enz^ym^ů nebo anttyen vázajfc^ fragmentů protilátek se .získaj^í podle z^působů popsaných v literatuře [například J. Hlstochem. C^ytochem. 22, 1084 (1974); Bull. Soc. Chim. Blol. 50, 1169 (1968)].

^V testu použ^ív'an^é opttmálrt zředěrá značenýc^h protil^áte^{k k}omplexně vázaných ⁱnhibitorů proteolytlckých enzymů se zjistí pomoc^í předb^ěžnýc^h pokusů Nesmí na nosi^čpřivádět žádné nespecifické sloučeniny. to· znamená. že nesmí být zjištěna přítomnost těchto sloučenin na na nosiči vdaném komplexu proteolytický enzym-Inhibitor proteáza. К tomuto ^účelu .se ^k rozto^ku značltované protilátky přidává detergentní látka. například jeden milimol natriumdodecylsulfátu.

Po ukončení inkubace se roztok oddělí od nosůe. napřftlad shtím z n^ádo^bky. nosič se n^ěkoli^krát promyje ^pu^frem. který účelně obsahuje detergens a potom se běžným způobsahuje deter^gent a potom se b^ěžným z^působem stanoví množství značkovací substance. v^ázan^é na nosiči. Pro kontrolu nespecific^ké vazby značkovací substance na nosič se prová^dí po^kus stejně ja^ko je vý^še popsáno. av^ša^k bez ^komplexu proteolytického· enzymu a inhibitoru proteázy stanoveného složení.

Obsah komplexu proteolytický· enzym-in hlbitor proteáz^y se stanovovaným ^proteol^ytlckým enzymem v biologickém vzorku se ur^čí srovnáním s výše ^po^psanými standardními zkouškami.

Prostřetek podte predtyženého v^ynátezu může dodatečně obsahovat ještě běžná stabilizačm čintála. ja^ko jsou protetaová aditiva. (aibumin hovězího séra nebo oval^bumln). uhlohydráty. glycerin. bakteriostatika. fungicidy a podobně.

Vynález je blíže objasněn následujícími příklady.

Příklad 1

Kvantitativní imunologický důkaz komplexů .z leukocytové elastázy a alfai-antirypsinu

a) Výroba antiséra leukocytové elastázy

Elastáza .se zfe^káv^á z Hdských polymorfních teu^cytů a ta^k dlouho se čistí afinitní chromatografií a chromatografií na iontoměn^ičíc^h. až při elektroforéze na ^gelu ^pol^yakrylamďdu při pH 4.3 a při imunoelektro^foréze s antisérem proteinů lidského séra nejsou zjtetftelné ^žádn^é zneči^u^^ jiné proteiny. LyoHlizovaný protein prostý soh se rozpustí v 0.15 M roztoku chloridu sodného na ^koncentraci ² m^g/mh Jeden ml tohoto roztoku se emulguje s 1 ml kompletního Freundova. adjuvans. Tato emulze se injekčně aplikuje ovcím nebo kozám na třech až čtyřec^h mfetech v oblasti zadnfto bě^há^ku intramuskulárně. Stejné injekce se podají ješt^ě dvakrát v obdoW vž^dy tří týdnů 21 dnů po)· poslední injekci se odebere krev. Dal^ší rnjetoe se pofóvaj v odstu^pu ¹² tý^dnů po posledrnm odběru ^krve. Vžd^{y 14} dní ^po ⁱnje^kcⁱ se odeMrá ^krev. Sérum se z krve z^ísk^{á běž}ným z^půso^bem. stabilizuje se přh ^dav^kem ⁰.°5 % hmotnostech azidu sodného, jakož i ⁰.⁰⁵ % hmotnostními natriumethylrtuťthiosalic^ylátu a skladuje se při —20 °C.

b] Výroba antiséra alfai-antitrypsinu

Jako antigen se použije vysoce čistý alfai-antůitypsm z ^l^ds^ké plazm^y. Antisérum alfai-antitr^ypsinu se získá z ovcí nebo koz stejným způsobem. jako je popsáno v předchozím odstavci a). Pro imunizaci králíků se rozpustí 1 mg lyofii^io<v^<^i^ť^l^c^' alfai-antitrypsrnu ^prostého .soh v 0.5 ml 0.1⁵ M roztoku chloridu sodného. Tento roztok se emuluje s ⁰.⁵ ml kompletního Freundova adjuvans a emulze se injikuje zvířatům intramuskulárně ve třech místech do zadního ^běhu. ^Stejn^á emulze se ^po čtyřech týdnech aplikuje subltutánně do týla zvířat. Po sedmⁱ dnech se o^d©bere asi ⁴⁰ ml krve z marginální ušní cévy. Po čtyřech týdnech se podává vždy další injekce subkutánně a v odstupu 7 ^dn^ů .se v^ždy odebírá ^krev. Sé10 rum se zpracovává stejně jako je výše popsáno v odstavci a).

c) Izolace imimoglobulinu z antiséra rmunoglclbulinová frakce se z antiséra elastázy, popřípadě alfai-antitrypsinu se běžnými způsoby ze sér izoluje [Srand. J. Im•munol. 2, Suppl. 1, 161 (1973] nebo Arch. Bio-chim. Biophys. 134, 279 (1969)] a skladuje se v lyofilizované formě prosté soli.

d) Čištění protilátek alfai-antitrypsinu imunoadsorpcí

Protilátka inhibitoru proteolytických enzymů se .imunospecificky izoluje chromatografií přečištěného imunglobulinu (získaného podle odst. c)J z antiséra alfai-antitrypsinu [podle odst, b)] přes Senharosu 4B nebo přes substituovanou aga.rosu, která obsahuje kovalentně vázaný alfai-antitrypsin. Protilátka inhibitoru proteolytického enzymu zůstává na immobolizovaném antigenu a •eluuje se pomocí 0,1 M pufru glycin/kyselina chlorovodíková o pH 2,8 nebo 3 M roztokem rhodanidu draselného. Tímto způsobem se imunospecificky izoluje asi 5 až 20 procent hmotnostních přítomného imunogtobulinu. Imunoglobulin s jinou specifitou se tímto způsobem tedy odstraní. Eluát se specifickými protilátkami se dialyzuje proti fosfátem .pufrovanému solnému roztoku a potom proti 0,01 M roztoku hydrogenuhličitanu amonného. Potom se získaný protein vysuší lyofilizací.

e) Výroba konjugátů enzym—protilátka

Imunospecificky přečištěná protilátka [podle odstavce d) ] .se zesítí s alkalickou fosfátázou z telecího; tenkého střeva za použití 0,2 % hmotnostního glutardialdehydu [Biochim. Biophys. Acta 251, 427 (1971)]. Reakční produkt se chromatografuje přes slo-upec Bio-gelu A 1,5 m [26 mm x 900 mm). Kompexy enzym-protilátka byly získány v prvním maximu AP-aktivity eluátu. Získaný roztok se stabilizuje přídavkem ovalbuminu (0,1 % hmotnostních) a azidu sodného (0,05 % hmotnostních) a skladuje •se při 4 °C.

f) Potažení reakčních nádobek 'protilátkami elastázy

Protilátky elastázy, vyrobené způsobem popsaným v odstavci a) a přečištěné způsobem popsaným v odstavci c) se immobilizují 'adsorpcí na reakční nádobky z umělé hmoty. Jako reakční nádobky se použijí zkumavky z polystyrenu o velikosti 12 x x 55 mm, kulaté kyvety nebo destičky pro mikrotitraci. V typickém provedení se zkumavky nebo kyvety naplní 1 ml roztoku imunogloibulinu o koncentraci 10 pg imunoglobulinu/ml ( v 0,15 M roztoku chloridu sod ného s 0,02 % hmotnostního azidu sodného). Pro destičky se pro zásobu používá 0,2 ml roztoku imunoglobulinu o koncentraci 50 <ug/-ml. Nádobky se uzavřou a nechají se potom stát přes noc při teplotě 4 °C. Před použitím při testu se kapalina dekantuje nebo· odsaje. Nádobky se potom několikrát promyjí promývacím roztokem (0,15 M roztok chloridu sodného s 0,05 % hmotnostního detergentu a 0,02 % hmotnostního azidu sodného) a krátce se na vzduchu usuší.

g) Výroba komplexu leukocytické elastázy a alfai-antitrypsinu

Jako analytický vzorek pro kvantitativní důkaz se ‘vyrobí komplex z proteolytického· enzymu a inhibitoru proteázy in vitro· inkubací obou isolovaných vysoce čistých komponent. К tomu se smísí 0,2 ml roztoku 0,5 miligramu čisté humánní leukocytické elastázy v 1 ml [rozpuštěno- v 10 inM pufru Tris/kyselina chlorovodíková o pH 7,4 s 0,12 M chloridem sodným) a 0,2 ml roztoku

2,8 mg čistého alfai-antitrypsinu (z humánní plasmy) v 1 ml (rozpuštěno v 50 mM pufru Tris/kyselina chlorovodíková o pH 8,8 s 0,05 M chloridem sodným) a tato směs se potom inkubuje po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C. Skladování této směsi se potom provádí při teplotě —20 ^CC.

Analýza pomocí imunoelektroforézy ukázala, že na komplex elastáza/aJfai-antitrypsin zreagovala veškerá elastáza přítomná v inkubační směsi.

h) Znovunalezení komplexu z leukocytární elastázy a alfai-antitrypsinu

Na mikrotitrační destičky, které byly způsobem popsaným v odstavci f) potaženy protilátkou elastázy a připraveny к použití, se naplní 0,2 ml vzorku s obsahem 0,1 až 10 ng elastázy v inhibitorovém komplexu pro depot. Vzorky s definovaným obsahem elasítázy se získají zředěním směsi enzymu a inhibitoru podle odstavce g); jako zřeďovací činidlo slouží fosifátem pufrovaný solný roztok. Pro stanovení srovnávací hodnoty se některé depoty naplní paralelně 0,2 ml zreďovacího prostředku bez komplexu enzym-inhibitor. Po inkubaci po dobu 2 hodin při teplotě mísltnosti se obsah depotu odsaje. Potom se třikrát promyje fosfátem pufrovaným solným roztokem a naplní se roztokem konjugátu enzym-protilátka, získaným podle odstavce e] (0,2 ml pro depot). Roztok měl 800 jednotek/1 aktivity alkalické fosfatázy. Zřeďovacím. prostředkem zde byl 10 mM pufr Tris/kyselina chlorovodíková o pH 7,5 se 2 mM chloridu horečnatého·, 0,025 mM chloridu zinečnatého, 1 % hmotnostním ovalbuminu, 1 mM natriumdodecylsulfátu a 0,02 °/o hmotnostních azidu sodného. Přístup vzduchu к destičnám byl uzavřen a tyto byly ínkubovány při teplotě místnosti přes noc. Po této inkubaci se kapalina odsaje. Destičky se třikrát promyjí a krátce se na vzdu11 chu vysuší. Potom se pro zjištění aktivity alkalické fosfatázy naplní roztokem pufr-substrát v množství 0,2 ml pro depot v časové radě. Po deseti minutách inkubace při teplotě místnosti se reakční směs z depota převede do mikrokyvety a měří se extinkce. Jako nulová hodnota slouží 'hodnota extinkce roztoku pufru a substrátu. Depot bez přídavku proteinu představuje extinkci, která je mírou pro· nespecifickou adsorpci konjugátu enzym-protilátka na depot. V depotu, který obsahoval komplexy proteolytického enzymu a inhibitoru proteázy, byla zjištěna zvýšená hodnota extinkce. Pro vyhodnocení se srovnává zjištěná extinkce (minus extinkce pro nespecifickou adsorpci) použitého množství elastázy (ng) v inhibitorovém komplexu. Následující tabulka udává konečné hodnoty extinkce při 405 nm po desetiminutové reakční době v závislosti na množství elastázy.

elastáza (ng)	OD405/IO min
12,5	1,000
6,25	1,030
3,125	0,830
1,563	0,540
0,781	0,315
0,390	0,115
0,195	0,030
0 — konltr.	0,0

Výsledky ukazují, že koncentrace komplexů elastáža-alfai-antitrypsin, se může tímto způsobem kvantitativně stanovit. Existuje úzce korelující souvislost mezi množstvím asi 0,4 ng až 6 ng komplexně vázané elastázy ve vzorku a změřenou extinkci. Jako roztok pufr-substrát se použije roztok, který má v testu následující koncentrace: 10 mM p-nitrofenylfosfát, 0,5 mM chlorid horečnatý, 1,0 mM pufr diethanolamin/kyselina chlorovodíková o pH 9,8.

Příklad 2

Kvantitativní imunologický důkaz komplexu thrombinu a antithrombinu III

a) Isolace imunoglobulinu z antiser

Jako zdroj specifických protilátek proteáz a inhibitorů proteolytických enzymů se použijí komerčně získátelná antiséra králíků pro lidský prothrombin, popřípadě pro antithrombin IIII z lidské plasmy. Imunoglobulinové frakce z těchto antisér se známými způsoby isolují a skladují se v lyofilisované formě prosté solí.

b) Výroba enzymem značených protilátek lidského antithrombinu III

Způsobem podle odstavce a) isolovaná imunoglohulinová frakce z antiséra antithrombinu III lidského se se značícím enzy mem chemicky kovalentně sváže alkalická fosfatáza z telecího tenkého střeva a tímto způsobem 'vyrobené konjugáty z imunoglobulinu a enzymu se dále zpracují analogicky, jako je popsáno v odstavci le).

c) Potažení reakčních nádobek protilátkami prothrombinu

Podle odstavce a) vyčištěná frakce imunoglobulinu z antiséra lidského prothrombinu se imobilisuje adsorpci na nádobkách z umělé hmoty. К tomu se použijí mikrotitrační destičky z polystyrenu, které se plní 0,2 ml pro depot roztoku 50 ^g imunoglobulinu pro jeden ml (v 0,15 M roztoku chloridu sodného· s 0,02 % azidu sodného). Destičky se vzduchotěsně uzavřou a nechají se stát přes noc při teplotě 4 °C. Před použitím v testu se kapalina obsahující imunoglobulin odstraní. Nádobky se několikrát promyjí 0,15 M roztokem chloridu sodného, který obsahuje ještě 0,05 °/o hmotnostních detergentu a 0,02 % hmotnostních azidu sodného a potom se krátce vysuší na vzduchu.

d) Výroba molekulárních komplexů z lidského thrombinu a lidského antithrombinu III

Komplexy z lidského thrombinu a antithrombinu pro použití jako analytický vzorek v testu se vyrobí inkubací směsí obou komponent ve vysoce čisté formě. К tomuto účelu se inkubuje 50 jednotek antithrombinu III (= heparinový kofaktor) a 50 jednotek heparinu v objemu 1,26 ml v 10 mM pufru tris/kyselina chlorovodíková o pH 7,5 po dobu 30 minut a při teplotě 37 °C. Po této inkubaci se к reakční směsi přidá 50 jednotek thrombinu (což odpovídá 16,7 ^g enzymového proteinu) v 50 μΐ stejného pufru. Po inkubaci po dobu 2 hodin při teplotě 37° Celsia se reakční roztok a zhodná zřeďovací látka zavádí do testu.

e) Kvantitativní důkaz komplexů thrombin-antithrombin

Do depotů mikrotitračních destiček, které byly potaženy způsobem podle odstavce c) protilátkami prothrombinu a uspořádány pro test, se naplní 0,2 ml vzorku o známém obsahu thrombinu v komplexně vázané formě. Jako vzorky o známém obsahu se použijí fosfátem pufrované roztoky inkubační směsi získané podle odstavce d) s odstupňovaným zředěním. Pro stanovení nulové hodnoty se použijí některé depoty s 0,2 ml zřeďovacího prostředku bez komplexu enzym-inhibitor. Po dvouhodinové inkubaci při teplotě místnosti se obsah všech depotů odsaje a třikrát se promyjí fosfátem pufrovaným solným roztokem, který dodatečně obsahuje 0,05 % hmotnostních detergentu. Potom se depoty naplní 0,2 ml roztoku enzy210000 mem značených protilátek antithrombinu III, vyrobených podle odstavce b). Rožtok se předem nastaví na asi 300 jednotek/l. AP-aktivita. Jako zřeďovací činidlo se použije 10 mM pu-fru tris/kyselina chlorovodíková o pH 7,5, který dodatečně obsahuje ještě 2 mM chloridu horečnatého, 0,025 mM chloridu zinečnatého, 1 % hmotnostní ovalbuminu, 1 mM nátriumdodecylsulfátu a 0,02 % hmotnostních azidu sodného. Destičky se potom vzduchotěsně uzavřou a přes noc se inkubují při teplotě místnosti. Po inkubaci se kapalina odsaje, destičky se třikrát promyjí a krátce se vysuší na vzduchu. Potom se depoty naplní vždy 0,2 ml ro'ztoku pufr-substrát pro AP-test. Po době inkubace 20 minut se reakční směs z depotů převede do mikrokyvet a na fotometru se změří extinkce. Jako nulová hodnota slouží hodnota extinkce roztoku pufr-substrát.

V depotech, které obsahovaly komplexy proteolytického enzymu s inhibitorem proteázy, byly zjištěny zvýšené hodnoty extinkce. Pro vyhodnocení byly použity extinkce při 405 nm roztoku pufr-substrát z každého· depotu po dvacetiminutové inkubaci ve srovnání s použitým vypočteným množstvím do komplexu vázaného thrombinu.

V následující tabulce jsou uvedeny konečné hodnoty extinkce při 405 nm po dvacetiminutové inkubaci v závislosti, na množství antigenu.

TABULKA thrombin (ng)

OD405/2O minut

1270	0,400
635	0,390
318	0,321
159	0,279
79,5	0,196!
39,8	0,137
19,9	0,099
10,0	0,058
5,0	0,025
0 — slepý pokus	0

Z výsledků uvedených v tabulce vyplývá, že mezi použitým množstvím antigenu a fotometricky změřenou enzymatickou indikátorovou reakcí je úzká souvislost, která umožňuje kvantitativní stanovení komplexů thrombinu a antithrombinu III.

Claims

1. Způsob imunologického stanovení enzymů za pomoci protilátek stanovovaného enzymu, vázaných na ve vodě nerozpustný nosič, vyznačený tím, že se enzymy, které tvoří s inhibitorem komplex enzym-inhibitor, inkubují s vázanými protilátkami, reakčrií roztok se odstraní, promytý nosič s protilátkou, nasycený komplexem en.zym-inhibitor, se nechá inkubovat s produktem kopulace, vytvořeným z protilátky specificky reagující s inhibitorem a ze značené substance, nenavázaný produkt kopulace se odstraní a míra určované koncentrace enzymu se zjistí na základě koncentrace značené substance na pevné fází.

2. Prostředek к provádění způsobu podle bodů 1 až 3 vyznačený tím, že obsahuje re akční nádobu potaženou protilátkou stanovovaného enzymu a produkt kopulace, tvořený z protilátky specificky reagující s inhibitorem a značkovací substance.

3. Prostředek podle bodu 2 vyznačený tím, že obsahuje reakční nádobu potaženou protilátkou proteolytických enzymů a produkt kopulace, tvořený protilátkou specificky reagující s inhibitorem proteáz a značkovací substancí.

4. Prostředek podle bodů 2 a 3 vyznačený tím, že obsahuje reakční nádobu potaženou protilátkou elastázy leukocytů a. produkt kopulace, tvořený protilátkou specificky reagující s alfai-antitrypsinem a značkovacím enzymem.