JPH0634631A

JPH0634631A - アナログ−デジタル信号系を用いる試料中の検体の存在の測定、この測定を行なうための装置およびこの測定を行なう方法

Info

Publication number: JPH0634631A
Application number: JP32742791A
Authority: JP
Inventors: John L Palmer; エル．パーマージョン
Original assignee: Enzymatics Inc
Current assignee: Enzymatics Inc
Priority date: 1990-12-11
Filing date: 1991-12-11
Publication date: 1994-02-10
Also published as: EP0494509A1; CA2056698A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】均質結合測定を実施する方法及び装置を提供
すること。【構成】試料の検体濃度の変化からオン／オフ応答を
生じうる測定系は、検体濃度より実質的に小さい検体解
離定数を有する高親和力結合成分を含み、この結合成分
は検体未添加の最初の状態で実質的な数の結合部位が空
いてなければならず、空いている結合部位の濃度はオン
／オフ切換のための検体閾濃度を決定する。測定系は結
合部位が実質的に完全に満たされた後過剰の検体が存在
する時を決める手段をも含み、この手段は結合成分の検
体に対する親和力よりも実質的に小さい検体に対する親
和力を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は液体中の検体の濃度の測
定に関する。

【０００２】この新規な方法は機器または複雑な実験室
での実験を使用せずに正確な定量的情報を得ることを可
能にする。本発明は特に均質結合測定または相分離工程
無しで読むことができる測定に関する。本発明はこれら
均質結合測定を実施する装置および方法にも関する。

【０００３】

【従来の技術】従来の測定法は発生信号のアナログ−ア
ナログ（Ａ／Ａ）測定を用いる。Ａ／Ａ測定では発生信
号強度は入力信号に相応して変化する。例えば競合的免
疫測定では、置換リガンドの量は検体と呼ぶ関心のある
添加分子の濃度とＳ字形相関を示す。このＳ字形置換曲
線を測定しそして検体濃度を決定する標準曲線として使
用する。

【０００４】本発明は検体濃度の決定にアナログ−デジ
タル（Ａ／Ｄ）測定を利用する。この型の測定では、異
なる検体濃度（アナログ入力）からの応答は信号の存否
（デジタル出力）を決定する。Ａ／Ｄ測定では信号強度
は一般に重要ではなく、一般的には測定されない。むし
ろ信号の存否のみが重要である。

【０００５】アナログ−デジタル化学スイッチの従来例
は、従来技術において必ずではないが、還元−酸化（レ
ドックス）化学を含んでいた。米国特許第４，０５９，
４０７号および米国特許出願ＳＮ９２４，４１４（１９
８６年１２月１６日出願）およびＳＮ０７５，８１７
（１９８７年７月２０日出願）参照。

【０００６】また米国特許出願ＳＮ１６０，５９５（１
９８８年２月２６日出願）は電子トランスフェラーゼに
アナログ−デジタル測定を使用することを教示してい
る。

【０００７】本発明は免疫診断において従来使用されて
きた技法と共に非レドックスアナログ−デジタル化学ス
イッチを用いる。

【０００８】競合的結合測定を行なう多くの方法が従来
知られている。これらの方法は２つの部類に分けること
ができる：一般に均質結合測定法と呼ばれる完全に一液
相中で行なわれる測定法；およびここで多相測定法と呼
ぶ、液相から固相を分離する必要のある測定法。従来の
放射線免疫測定法（ＲＩＡ）は、サンドイッチ測定法が
そうであるように、多相測定法の一例である。これらの
測定法では、信号発生種を含む結合成分が固相に結合ま
たは固相に転化される（例えば沈殿により）。固相は結
合成分に結合していない信号を含む液相から分離され
る。結合した信号の量が測定されそして検体濃度の決定
に使用される。この分離の複雑さは多数の試薬および洗
滌工程を必要としそして高価な測定装置およびオペレー
タ訓練の必要性を大幅に増大させる。

【０００９】上記測定法の複雑さは、すべての試薬を溶
液中で混合しそして結果を直接読む均質免疫測定法の開
発をなさしめた。米国特許第４，４４２，２０４号５−
９欄参照。現今の均質測定法は、信号と結合して複合体
を形成する結合成分を用いる競合測定法である。結合成
分は抗体、免疫蛋白質、酵素、または検体に対し高い親
和力を有する同様の化合物であることができる。検体は
ここで定める結合成分により結合されうる、蛋白質、代
謝物、医薬および医薬代謝物、環境汚染物質、有機分
子、または同様の分子を包含するいかなる化学的または
生物的分子であってもよい。信号分子は典型的には、結
合成分に結合した時に信号が、結合成分がない時とは異
なる測定しうる活性を有するように検体と同等に結合す
る測定可能信号を生ずる分子である。競合測定法におい
て、結合成分の結合部位は信号でほぼ完全にみたされて
いる。検体を結合成分−検体解離定数に近い濃度まで添
加しそして信号と結合部位について競合させる。次に機
器を用いて信号活性を測定し、検体濃度の決定に使用す
る。

【００１０】均質結合測定法は比較的簡易なためかなり
の商業的発展をとげた。例えばアボット（Abbott）社が
市場に出したＴＤｘ（商標）測定法は信号分子として蛍
光分子を使用する。この信号分子は遊離の場合、結合成
分に結合している場合よりも速いタンブリング速度を有
する。このタンブリング速度の相違は円偏光蛍光の相違
を生じさせ、これを蛍光偏光計で測定する。

【００１１】市場に出ている他の均質測定法はSyva Dia
gnostics社のＥＭＩＴ（商標）試験である。この試験で
は信号は、結合成分に結合した場合遊離の場合と異なる
活性を有する酵素−検体コンジュゲートである。分光光
度計を用いて試料中の酵素活性の量を測定し、そしてこ
の値を検体濃度の計算に使用する。

【００１２】Microgenics 社により市場に出されClin.C
hem.３２、１６３７−１６４１頁（１９８６年）に記載
されているＣＥＤＩＡ（商標）均質結合測定法は多段階
信号発生系を使用する。β−ガラクトシダーゼサブユニ
ット断片を検体と共有結合させる。この酵素断片は結合
成分に結合した場合補断片との自己集合を阻止される。
コンジュゲートが結合成分と結合していない場合、自己
集合が起って測定可能なβ−ガラクトシダーゼ活性が生
ずる。

【００１３】これらのおよび他の均質結合測定法は米国
特許第４，３４０，６８８、３，８１７，８３７および
４，０４３，８７２号により詳細に記載されている。こ
れら均質免疫測定法はすべてアナログ−アナログ（Ａ／
Ａ）測定を利用する。本発明は上記の、そしてまたすべ
ての均質結合測定法をいかにして或特定条件下でＡ／Ｄ
測定に変換しうるかを教示する。

【００１４】本発明以前には、免疫測定法は感度増大に
関心が集まっていた。従って信号の強度を記録するＡ／
Ａ信号法が用いられた。従来の測定法の感度は検体−信
号コンジュゲートの濃度が結合成分と１：１の比である
場合に増大する。この比において、検体濃度の変化は結
合した信号の最大の変化をもたらす。添加したすべての
検体が信号置換反応に貢献する。記録される測定値は信
号の存否よりも遊離信号の存在量である。

【００１５】アナログ−デジタル測定では、信号発生成
分は結合成分の全濃度の一部である。Ａ／Ｄ測定が“オ
フ”から“オン”応答へ飛ぶ検体濃度を“検体閾濃度”
と呼ぶ。Ａ／Ｄ測定ではすべての検体が信号を発生する
のではない。特に、閾濃度より低いすべての検体分子は
信号を生じない。この点でＡ／Ｄ測定は測定の容易さが
増大する代りに感度を放棄する。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】複雑な手順または機器
無しに試料中の検体濃度を正確に測定する効果的な測定
法に対するニーズが当該分野に存在する。測定は簡単に
行なえなければならず、そして結果は容易に読めなけれ
ばならない。更に、このような測定を行なう装置に対す
るニーズが当該分野に存在する。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明は当該分野のこれ
らニーズを満たすのを助ける。本発明によれば検体濃度
が所定の閾値を超えた場合に試料中の検体の存在を信号
で送る新規測定法が開示される。

【００１８】この測定は検体に結合する結合成分の或量
を含み、該結合成分は検体閾濃度より実質的に小さい検
体解離定数を有する。結合成分は最初は検体の結合して
いない空いた結合部位の所定量を有する。これらの条件
下で、添加された検体は、最初は空いている結合部位が
使いつくされる点までほぼ完全に結合成分に結合する。
検体がこの点を超えて添加されると、それはｉ）溶液中
に遊離検体として存在し、これは他の試薬と相互作用し
て信号を生ずることができる；かまたはii）最初の状態
で信号発生手段が結合成分に結合されているなら、結合
成分に結合している信号発生手段を置換する。系中の他
の結合定数はＡ／Ｄ測定における結合成分−検体親和力
と同じであるべきでない。測定系が、置換された信号発
生手段または遊離検体が他の試薬に結合することを必要
とするなら、置換された信号または遊離検体はそれらが
結合成分に対し示すよりも実質的に小さい親和力でそう
すべきである。最初は空いている結合部位の量は、検体
閾濃度の存在下で実質的に全部の最初は空いている結合
部位が試料中の実質的に全部の検体により満たされるよ
うに選ばれる。

【００１９】測定系は試料中の検体濃度が検体閾濃度を
超える場合に信号を発生する手段をも含む。信号発生手
段は、結合成分の検体に対する親和力よりも実質的に小
さいまたは無視しうる、検体に対する親和力を有する。
従って検体が最初に結合成分の利用できる結合部位のす
べてを満たす。検体濃度が閾値を超えた時にのみ信号を
発生するのに遊離検体が得られる。

【００２０】上記測定を実施する方法も提供される。

【００２１】本発明は更に上記測定を実施する装置を提
供する。この装置は一組の区画室を含み、各区画室は最
初空いている結合部位を異なる量で有する結合成分と信
号発生手段を含む。

【００２２】用語“結合成分”は関心のある検体と結合
して結合成分−検体複合体を形成するあらゆる分子を含
む。それは酵素、抗体、免疫蛋白質例えばＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ等、並びにＩｇＧのＦａｂ断片のような上記抗体およ
び蛋白質の、関心のある検体と結合しうる断片を包含す
る。用語“抗体”は抗体全体およびその結合能を有する
断片を包含する。ＬおよびＨ鎖抗体領域の遺伝子融合に
より形成される組換蛋白質も“抗体”の定義に含まれ
る。

【００２３】酵素の触媒能と対立するものとしての酵素
の結合能が、関係する活性であるなら、酵素を結合成分
として使用しうる。例えば、酵素は二成分反応の一成分
と結合しうる。第二成分の不在下ではこの結合は反応に
ならないであろう。

【００２４】使用しうる追加的結合成分はカリウムイオ
ンに対する結合成分としてのバリダマイシン；カルシウ
ムイオンに対する結合成分としてのエチレングリコール
四酢酸（ＥＧＴＡ）；第２鉄イオンおよび他の２価およ
び３価金属イオンに対する結合成分としてのＮ，Ｎ，
Ｎ′，Ｎ′−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；お
よび関心のある検体と結合して結合成分−検体複合体を
形成するクラウンエーテル、受容体、キレート化剤およ
び他の同様の結合物質を包含する。

【００２５】本発明では、結合成分の濃度は用いる結合
成分の結合部位の濃度を指す。多数の結合部位を有する
結合成分例えばＩｇＧまたはＩｇＭの場合、容易に明ら
かなように、実濃度は結合部位の濃度よりも低い。

【００２６】結合の特異性は結合成分の望ましい特徴で
あるが、絶対的特異性は必要でない。一般に、結合成分
は検体以外の分析試料成分に対し高親和力結合を示すべ
きでない。また、結合成分は検体より非常にモル過剰で
あるいかなる成分に対してもより低い親和力結合を有す
べきでない。そのような成分は結合成分の結合部位につ
いて検体と競合しているであろう。従って、ＥＤＴＡは
第２鉄イオン検体のみを含む液体における優れた結合成
分であろう。第２鉄イオン検体をマグネシウムおよび他
の２価金属イオンと共に含む試料液はＥＤＴＡよりも特
異性の大きい結合成分の使用を必要とする。

【００２７】本発明は一般に、測定しうる親和力定数を
有する結合成分に限られる。或幅の親和力定数を有する
結合成分は、定数の幅が、検体濃度が結合成分解離定数
より大きいことを決定しうるに充分なだけ狭い場合にの
み通常使用しうる。

【００２８】用語“検体”は、ここで定義する結合成分
により結合されうる、蛋白質、代謝物、医薬および医薬
代謝物、環境汚染物質、有機分子等を包含するあらゆる
化学的または生物的分子を指す。用語“結合成分”がキ
レート化剤を記載するのに使用される場合、“検体”は
キレート化されるイオン性物質を指す。

【００２９】用語“検体閾濃度”はＡ／Ｄ測定が“オ
フ”から“オン”応答へ飛ぶ検体濃度を指す。検体閾濃
度以下では実質的に測定可能信号は存在せず、一方検体
閾濃度以上では信号が検出される。検体閾濃度は典型的
には診断装置の製造においてセットされる。

【００３０】例えば、本発明の一態様では、測定系は一
組の区画を含み、各区画は異なる検体閾濃度を有する。
好ましい態様では、区画閾値は装置に沿った距離の函数
として互いに直線的関係にある。装置に沿って信号が走
る距離は従って検体濃度に対応する。測定しうるいかな
る応答変化も信号として作用しうる。色の変化、特に無
色から着色への変化またはその逆が有用である。“オ
ン”信号が色の発生なら、検体濃度が検体閾濃度以上の
区画に着色バーが生ずる。このバーは検体濃度が閾値、
即ち装置が読みとれる濃度、と等しい位置で終る。この
装置は、信号として作用する水銀が温度計に沿って走る
距離を読むことにより温度を測定する温度計に類似して
いる。

【００３１】親和力定数は或物質が他の物質と結合する
固有の傾向を数値で定める。一般にそれらはいくつかの
該定数を互いに比較する時に使用される。数値が大きい
ほど親和力は大きい。解離定数は複合体がその構成成分
に分解する固有の傾向を数値で定める。それらは一般に
該定数を濃度と比較する時に使用される。親和力定数Ｋ
ａと解離定数Ｋｄは次式の関係にある：Ａ＋Ｂ＜＝＝＝＝＞Ａ−ＢにおいてＫａ＝１／Ｋｄ＝［Ａ−Ｂ］／（［Ａ］［Ｂ］）従ってこれら２つの定数は互いに逆数である。例えば１
０^-6Ｍの検体を含有する溶液は、結合成分が検体濃度よ
り実質的に小さい隔離定数、例えば１０^-10Ｍ（即ち親
和力定数１０¹⁰Ｍ^-1）、を有するなら、最初は空いてい
る結合部位を含む結合成分に定量的に結合する。これら
の定数は本発明の記載中で互換的に使用される。

【００３２】Ａ／Ｄ測定と従来の均質免疫測定の間には
２つの明瞭な差異がある。第１の相違は、Ａ／Ｄ測定で
は結合部位の有意な濃度は検体添加前の最初の状態では
空いている。これら空いている結合部位は添加された検
体を滴定し、それを溶液から除去してそれが信号発生成
分と反応するのを防ぐ。これに対し、従来のＡ／Ａ均質
免疫測定は、Ａ／Ｄ測定と同じ成分のあるものを使用す
るが、添加された検体各分子を測定可能な信号に転化す
ることを目指している。これら２つの測定形態の相違を
図１および図２に示す。

【００３３】図１および図２のグラフの相違は、Ａ／Ｄ
測定とＡ／Ａ測定とで明瞭に異なる条件を使用させるこ
とになる。Ａ／Ａ反応に添加された検体のすべての分子
は、信号発生能が使いつくされるまで信号発生状態と相
互作用する。これに対しＡ／Ｄ測定では、添加された検
体は緊密結合性−非信号発生状態（空いた結合部位）
と、該部位が満たされる（閾）まで反応する。これら空
いた部位を満たした後にのみ検体は信号発生状態と反応
する。容易に明らかなように、すべての現今のおよび未
来の均質Ａ／Ａ測定法を、適当な緊密結合性−非信号状
態の付加により本発明によるＡ／Ｄ測定法に変換しう
る。

【００３４】図１および図２はＡ／ＤとＡ／Ａ測定との
間の明瞭な相違を図で示す。以下に更に記載するよう
に、添加された検体のすべては空いている結合部位が満
たされるまでは該部位にのみ結合することはＡ／Ｄ測定
の重要な特徴である。この添加された検体は該部位に、
信号発生状態と相互作用する遊離検体が得られないよう
に本質的に完全に（以後に記載するように）結合しなけ
ればならない。

【００３５】本質的に完全な結合を高めるために、空い
た部位の解離定数が関心のある検体の濃度よりかなり小
さいことが重要である。実際、超緊密結合のためのこの
要件は、測定しうる検体の低い方の濃度に限界をつけ
る。何故ならば、抗体の解離に物質的限度が存在するか
らである。

【００３６】これら低濃度の限度は従来の均質免疫測定
には同程度には存在しない。表面的複雑さを取去った従
来の均質免疫測定はすべて次式にあてはまる：

【数１】Ａｂ＝抗体、Ａｎ＝検体、Ｓ＝信号生成系前記のように、信号生成系Ｓは直接または反応系の他の
成分との組合せで信号を発生しうる。

【００３７】上式で概括される反応は見掛解離定数Ｋａ
により定められる。系はＫａ値付近の領域でのみ検体濃
度の変化に敏感である。Ｋａよりかなり低い検体濃度で
は、検体濃度の増分変化は信号強度の無視しうる変化し
か生じない。Ｋａよりかなり高い濃度では、本質的にす
べての信号は既に遊離なので、検体濃度の増分変化に応
答して生ずる信号の変化はやはり無視しうる。これに対
し、検体濃度がＫａ濃度付近の場合には検体濃度の増分
変化は信号強度の有意な変化を生ずる。

【００３８】この状況は図３にグラフで示されている。
この図はＫａが１０^-7Ｍの典型的結合成分−検体解離曲
線を示す。このグラフは検体濃度の増分変化が解離定数
１０^-7Ｍ付近に広がる範囲でのみ信号強度の有意な変化
を生じ、有用な範囲幅は約１．４ログ単位であることを
確認する。

【００３９】典型的Ａ／Ｄ応答をこの同じログスケール
で図４に示す。Ａ／Ｄ測定は閾値における検体濃度が結
合成分−検体解離定数から実質的に離れていることを要
する。Ａ／Ｄ測定は従来の意味の測定範囲をもたず、代
りに論理値ゼロ即ち無信号状態から論理値１即ち信号状
態への急な移行が起る。この移行点は、このグラフに描
かれた系では−１４にある結合成分−検体解離定数から
遠い。これら解離定数の相違はＡ／Ｄと従来のＡ／Ａ測
定を区別する主要な特徴である。Ａ／Ａ測定では、有用
な測定範囲は系検体の見掛解離定数付近に分布してい
る。Ａ／Ｄ測定では、測定範囲は結合成分の空いた結合
部位の解離定数より有意に大きい検体濃度である。

【００４０】現存の均質測定技術をＡ／Ｄ測定に適合さ
せる方法を含む本発明のいくつかの態様を開示する。こ
れらの態様は以下の３つの部類に分けることができ、こ
れらの中で説明の目的のみでそして本発明の範囲を限定
することなく、結合成分を抗体として表わす：

【数２】態様１は（１）或量の最初は空いている結合部位を有し
そして検体と結合したとき信号を生じない結合成分と、
（２）実質的により低い検体結合親和力を有し検体と結
合したとき信号を生ずる信号発生手段または受容体、を
利用する。この態様では、検体が最初は空いている結合
部位をほぼ満たした後、追加的検体が受容体と相互作用
して信号を生ずる時に、デジタル”オン”信号が生ず
る。このように、信号発生手段は、検体濃度が結合成分
の最初は空いている結合部位の濃度よりも高い時にの
み、それに結合する検体を有する。他のすべての場合、
結合成分は検体とほぼ定量的に結合して検体が受容体に
結合するのを妨げる。後記実施例１および２は態様１を
説明する。

【００４１】態様２および３は態様１の変形である。態
様２は結合成分に結合した場合未結号の場合とは異なる
応答を生ずる信号手段を利用する。態様１におけるよう
に、結合成分−検体解離定数（１／Ｋ₁）は閾濃度より
も実質的に小さい。最初の状態は或濃度の最初は空いて
いる結合部位と或濃度の信号発生手段で満たされた結合
部位からなる。最初は空いている結合部位の濃度が検体
閾濃度を決定する。最初は空いている結合部位がほぼ満
たされた時、追加的検体が結合成分から信号を追出して
測定可能応答を生ずる。すべての均質結合測定技術に共
通の結合成分反応をＡ／Ｄ測定に利用しうる。

【００４２】第３の態様も結合成分に最初に結合してい
る分子の追出しにより生ずる信号を含む。この分子は
“補因子”と呼ばれる。検体により追出された時、遊離
補因子は“因子”と呼ばれる親和力のより低い成分に結
合して信号を生ずる。補因子は最初、結合成分の結合部
位の濃度より小さい濃度で存在する。従って残りの最初
は空いている結合部位が検体閾濃度を決定する。好まし
い態様では、因子は酵素であり、一方補因子は補欠分子
族、補酵素、または酵素活性に必要な調節成分である。
この態様も、結合成分−検体解離定数が検体閾濃度より
も有意に小さいことおよび補因子に対する因子の親和力
が結合成分補因子親和力よりも小さいことを必要とす
る。

【００４３】態様１態様１の反応は２つの平衡式により定められる：

【数３】アナログ−デジタル測定は、入ってくる信号、即ち検体
濃度が、検体に対する実質的に異なる親和力を有する２
つの異なる状態の間で分配された時に可能である。この
状況で、検体は、親和力の高い方の状態が完全に満たさ
れた時にのみ親和力の低い方の状態に分配される。

【００４４】図５は検体閾濃度に隣接する領域で検体−
受容体濃度を検体全濃度に対してプロットしたものであ
る。抗体濃度は１０^-8Ｍにセットされ、受容体濃度は１
０^-5Ｍにセットされた。１０^-8Ｍの抗体濃度は閾値を１
０^-8Ｍにセットし、この濃度は大部分の医薬および代謝
中間体の正常な生理的濃度よりも小さく、そしてホルモ
ンおよび他の微量生物活性成分の測定に関心のある範囲
内にある。抗体−検体親和力定数Ｋ₁は１０¹²Ｍ^-1、受
容体−検体親和力定数Ｋ₂は１０⁶Ｍ^-1であった。この
図は検体閾濃度１×１０^-8Ｍより小さい濃度における本
質的にゼロから閾値より上へ増加する検体濃度までの検
体−受容体濃度の変化を示す。

【００４５】図５はＡ／Ｄ切換の要点を示す：検体−受
容体濃度は閾値の左側の無視しうる値（論理値０）から
閾値の右側の検出可能値（論理値１）へ急速に増加す
る。どちらの状態の実値も一定または重要でない。Ａ／
Ｄ信号方式では信号が弱から強へ急速に増加する閾濃度
が重要である。この信号増加に必要な検体濃度の増加が
切換分解能である。

【００４６】結合成分の最初空いている結合部位の数は
閾値を決定する。前記のように、２つの状態が検体に対
し実質的に異なる親和力を有することがＡ／Ｄ測定の重
要な特徴である。結合定数の比は添加検体分子に対する
２つの状態の相対的親和力を不充分にしか表示しない。
例えば、低い方の結合状態の非常に高い相対的濃度は高
い結合状態の低い濃度のそれに匹敵する全親和力を有し
うる。これら２つの状態に対する検体の相対的親和力は
それらの結合定数のおよびそれらの濃度の比に比例す
る。この相対的親和力は、結合成分の親和力定数と結合
成分の濃度の積を受容体の親和力定数と受容体の濃度の
積で割った値として定義される分配比により最もよく表
わされる。これは数学的に

【数４】に等しい。

【００４７】この同等性は結合定数Ｋ₁およびＫ₂の数
学的定義に由来する。斯てこの分配比は添加検体分子が
検体−受容体複合体よりも抗体−検体複合体を形成する
傾向を表わす。第１表のデータは分配比の絶対値が親和
力定数の比よりも切換分解能をかなり良く予言すること
を示す。１０，０００の分配比は９００以上の切換分解
能を与え、そして１００の分配比は、親和力定数の比が
１００倍変っていても、１２の切換分解能を与えた。１
０の分配値は分解能の劣る切換を生じ、一方１０より小
さい値はＡ／Ｄ挙動を生じなかった。質量比および平衡
定数が共に反応の程度に影響を及ぼすという認識は十分
に確立されているが、分配比の概念は当該分野で充分に
知られていない。Ｋ₁およびＫ₂の定義に由来するこの
簡単な比はこの態様の重要な特徴、即ち添加検体分子の
信号発生状態体およびより高い親和力の非信号発生状態
の間での分配、を表示するのに理想的に適している。

【００４８】第１表Ｋ₁／Ｋ₂の函数としてのＡ／Ｄ切換分解能［受容体］／［抗体］＝1000 ［受容体−検体］Ｋ1 ／Ｋ2 検体合計 1E8 1E6 1E5 1E4 ……………………………………………………………………………………………… 7.00E-09 2.43E-13 2.30E-11 2.10E-10 1.27E-09 8.00E-09 4.69E-13 3.91E-11 3.24E-10 1.63E-09 9.00E-09 9.80E-13 8.09E-11 5.31E-10 2.06E-09 1.00E-08 2.99E-11 2.97E-10 9.05E-10 2.55E-09 1.10E-08 9.10E-10 9.99E-10 1.48E-09 3.12E-09 分解能 929 12 3 2 分配比 10,000 100 10 1 ［抗体］＝１０^-8Ｍ［受容体］＝１０^-5ＭＫ₂＝常に１０⁶Ｍ^-1 Ｋ₁は変える分解能は検体を９ｎモルから１１ｎモルに増した時にみられる信号増加として定義される。分配比は結合定数の比（Ｋ₁／Ｋ₂）を受容体対抗体の比で割った値として定義される。

【００４９】Ａ／Ｄ切換では、添加検体は結合成分の最
初は空いている結合部位（このような部位が存在すれ
ば）に結合する。この定量的結合が起ることを確実にす
るために、結合成分−検体解離定数は閾値での検体の濃
度より有意に小さくなければならない。この臨界比は数
学的に結合比＝（Ｋ₁）［閾値］に等しい。ここでＫ₁＝結合成分−検体親和力定数、
［閾値］＝閾値における検体の濃度。

【００５０】高分解能の切換には１，０００に等しいか
またはこれより大きい結合比が必要である。この結合比
が高いほど切換分解能は大きい。斯て、１０，０００の
比は非常に高い分解能を生じ、逆に１００の比はＡ／Ｄ
挙動を生じない。この約１，０００またはそれ以上の結
合比の要求は前記Ａ／Ｄ測定の顕著な特徴の数学的表示
である。閾値以下で存在する時、本質的に全部の検体が
結合成分により結合され、溶液中に遊離していないこと
が重要である。この緊密な結合はこの臨界結合比により
達成される。この要求はＡ／Ｄ切換技術で測定しうる検
体濃度の実用的下限を抗体の解離定数より約１，０００
ないし約１０，０００倍高くセットする。モノクローナ
ル抗体製造の最近の進歩、特に抗体またはＦａｂ断片の
クローニングおよび細菌源からの選択を含む方法は、従
来可能と考えられていたよりも高い親和力の抗体を入手
可能にした。今や１０¹⁵Ｍ^-1を超える新和力定数を有す
る抗体を得ることができると考えうる。１０，０００の
高分解能結合比および非常に高い親和力の抗体はＡ／Ｄ
測定を、殆んどの従来の均質免疫測定により達成しうる
より低い濃度範囲である１０^-11モルの範囲に至らせる
であろう。

【００５１】要するに、ここに示されたデータはＡ／Ｄ
挙動が観察されるであろう条件を予言することを可能に
する。この態様において、Ａ／Ｄ切換は、１）分配比が少なくとも約１０、好ましくは少なくと
も約１００、より好ましくは少なくとも約１，０００で
ある、２）結合比が少なくとも約１，０００、好ましくは
１，０００より大、より好ましくは少なくとも約１０，
０００である、場合にすべて起る。

【００５２】これらの比は好ましい値を表わし、そして
これらの値以外の比も受容しうる結果を与えうる。

【００５３】態様１における結合成分は好ましくは検体
に対し高新和力定数を有する抗体である。抗体、特にマ
ノクロール抗体の構造および選択は当該分野でよく知ら
れている。抗体断片および遺伝子工学で作られた抗体も
当業者によく知られており、そして適当な場合使用しう
る。モノクローナル抗体以外の結合成分も本発明で容易
に使用しうる。

【００５４】態様１の信号発生手段または受容体は、検
体と相互作用して触媒活性の変化、可視色吸収、蛍光ま
たは同様の変化を受けるいかなる化合物でもよい。特
に、触媒活性の変化を受ける成分は有用である。という
のはそのような受容体は自己増幅信号として作用するか
らである。例えば、信号発生手段は検体により賦活また
は阻害される酵素であることができる。ジギトキシン検
体を挙げると、受容体はＮa ⁺Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼのＦ
１断片であることができる。当該分野でよく知られてい
るように、ジギトキシンはこのＡＴＰアーゼの強い阻害
剤である。ＡＴＰアーゼにより触媒される反応、即ちＡ
ＴＰのＡＤＰおよびＰi への転化は、結合成分の濃度が
ジギトキシン濃度を超える区画で通常進行する。ジギト
キシン濃度が結合成分濃度より大きい区画では、過剰の
ジギトキシンがＡＴＰアーゼを阻害して反応を止める。
この例では、“オン／オフ”デジタル信号はＡＴＰアー
ゼの活性であり、そしてアナログ入力はジギトキシン濃
度である。

【００５５】態様２態様２は第２のＡ／Ｄ測定系を提供する。態様２は、基
本的には態様１と同じであるが、最初は空いている結合
部位が満たされた時信号を発生する方法が異なる。態様
１では、過剰の検体が受容体に結合して信号を生ずる。
態様２および態様３では過剰の検体は、結合成分に既に
結合している信号発生分子に取って代る。態様２では追
出された分子が直接信号を発生し、一方態様３では追出
された分子単独では不活性で、他の成分に結合して信号
を発生する。

【００５６】現存の均質測定技術を態様２に適用しう
る。例えば米国特許第３，８１７，８３７号はSyva社に
よりＥＭＩＴ（商標）として市場に出されている、信号
が酵素である技術を記載している。米国特許第４，４２
０，５６８、４，４９２，７６２、４，５１０，２５
１、４，５８５，８６２、４，５９３，０８９、４，７
４８，１１０、４，７５１，１９０および４，９０２，
６３０号はAbbott Diagnostics社によりＴＤｘ（商標）
として市場に出されている、信号発生分子が蛍光分子で
あり、信号がレーザー誘起蛍光の偏光の変化である技術
を記載している。これらの現存の均質測定技術は、本発
明で用いる信号のアナログ−デジタル測定よりも、従来
のアナログ−アナログ測定を用いる。

【００５７】この態様で起る反応は、前の態様で遭遇し
た式と類似しているが同一ではない２つの平衡式により
表わされる。

【００５８】

【数５】典型的には信号は、発生信号量が結合状態と有利状態と
では異なるような仕方で検体に共有結合する信号発生分
子である。

【００５９】説明の容易さのため、本発明の範囲を限定
することなく、以下の説明では態様２の信号を、結合成
分抗体に結合した時阻害され、そして遊離の時活性な酵
素検体コンジュゲートと名指す。

【００６０】態様２は検体に対し高親和力を有する結合
成分および該結合成分に結合する信号発生手段を必要と
する。この信号系は結合した時と未結号時で異なる活性
を有する。好ましくは信号系は抗体に結合した時触媒活
性を有しない酵素からなる。この酵素は抗体に未結合の
時充分な触媒活性を示す。このような酵素の製造法は当
該分野でよく知られている。米国特許第３，８１７，８
３７および４，０４３，８７２号参照。一般に検体は酵
素に酵素活性部位に隣接して共有結合する。または酵素
は多数の検体分子で覆われて充分な量の抗体を結合さ
せ、酵素活性を完全に阻害する。

【００６１】態様２に関して３つの所見を述べることが
できる。

【００６２】第一に、Ａ／Ｄ測定は多数の空いている結
合部位を必要とするが、酵素により占められる抗体部位
の百分率は広範囲にわたり重要でない。Ａ／Ｄ応答の分
解能は酵素の濃度を抗体濃度の１％から１０％にまたは
５０％にさえ増大させても影響されない。閾値は、この
増大により最初は空いている抗体部位の数が変るので、
変るけれども。

【００６３】第二に、抗体は酵素に対する親和力が検体
に対するそれよりも小さいのが、より大きい“オン”信
号を生じるので有利である。他の理論を排斥することな
く、この結果は恐らく次のように説明しうる。親和力定
数が同じ場合、結合部位の競合で過剰の検体は酵素より
好まれない。これに対し、親和力定数が１００倍検体に
有利な場合、過剰の検体は必ず部位競合に勝つ。

【００６４】最後に、抗体−酵素解離定数（１／Ｋ₂）
と酵素濃度の比が重要である。この定数のより大きい差
は切換におけるより小さな雑音に相当する。切換“雑
音”はステレオの無線受信における空電に類似してい
る。この比の効果は酵素結合比：酵素結合比＝［酵素］（Ｋ₂）として定義される。非常に高い分解能のＡ／Ｄ信号送り
には約１０³の比が必要である。１００より有意に小さ
い比は充分な分解能のＡ／Ｄ挙動を与えない。

【００６５】ここでも他の理論を排斥することなしに、
この結果は恐らく次のように説明しうる。酵素は、空い
ている結合部位より過剰の検体により置換され放出され
るまでは抗体に完全に結合していることが重要である。
この定量的結合は、検体の定量的結合が閾値より有意に
小さい抗体−検体解離定数を必要とするのと全く同様
に、酵素の濃度よりも有意に小さい抗体−酵素解離定数
を必要とする。

【００６６】態様２によりＡ／Ｄ測定系を作るには以下
の追加的因子を考慮すべきである。

【００６７】第一に、部位競合は酵素“オフ”速度より
早くは進行しえない。ここで、Ｋ₂＝ｋオン／ｋオフ “オン”速度は検体の抗体への結合の速度であり、そし
て一般に拡散律速であることが見出されている。拡散律
速反応は１０⁹Ｍ^-1秒^-1の範囲の速度定数を有する。斯
て、この値をｋオンに対し使用すれば、ｋオフを各平衡
定数Ｋ₂で計算しうる。このｋオフの値は酵素の抗体か
らの放出の速度を支配し、これは検体の酵素を置換し信
号を発生する速度を支配する。

【００６８】ｋオフの動力学的制限は本発明の態様２お
よび３を用いて測定しうる下限濃度に実用的制限を加え
る。例えば１０^-10Ｍの濃度の検体を測定するには１０
^-10Ｍまたはそれより小さい酵素濃度が必要である。約
１００より大きい酵素結合比の要求は１０^-10Ｍ^-1より
大きいＫ₂の抗体を使用しなければならないことを意味
する。斯て、もしＫ₂が１０¹³Ｍ^-1でｋオンが１０^-9Ｍ
^-1秒^-1なら、ｋオフは１０^-4秒^-1に等しい。反応の半減
期は式：Ｔ_1/2＝ｌ_n２／ｋにより表わされる。

【００６９】従って、上記計算されたｋオフは６，９３
１秒または約２時間の半減期を有する。充分な測定には
約２半減期より長い反応時間を要し、これは４時間以上
かかることになる。この反応時間は従来の免疫測定に比
べて有利であるが、ここでのもくろみの一部である簡単
な交替部位試験には受容しえない。

【００７０】これら動力学的制限は、検体閾値および酵
素濃度が１ｕＭにセットされる場合には現われない。１
０^-9Ｍ^-1の酵素／抗体親和力定数Ｋ₂は１，０００の高
分解能酵素結合比を与える。これら条件下でのオフ速度
定数ｋオフは１秒^-1であり、そして半減期は０．６９３
秒である。上記例はオフ速度半減期がＫ₂のログと直線
関係にあることを示す。Ｋ₂が１０¹⁰Ｍ^-1の時、半減期
は約６．９３秒であり、そしてＫ₂が１０¹¹Ｍ^-1の時、
半減期は６９．３秒である。従って、１０¹¹Ｍ^-1のＫ₂
を有する抗体はＡ／Ｄ条件下で３分以内に１０^-8Ｍの検
体を測定しうる。

【００７１】考慮すべき第二の因子は酵素−抗体複合体
により示される残留活性による切換分解能へのマイナス
の影響である。残留活性は酵素−検体コンジュゲーショ
ンの特性により影響される。検体が、ランダム連結とは
対照的に酵素活性部位付近で酵素に連結した場合に最適
効果が得られる。

【００７２】信号の雑音を減らすには結合した酵素は不
活性でなければならない。図６に示すように、検体−酵
素コンジュゲートのランダム合成は、酵素活性部位から
離れた領域への検体の連結を生じうる。或場合には、抗
体がこのコンジュゲートに、酵素の活性に影響を及ぼす
ことなく結合しうる。図６中の限定合成経路は検体を活
性部位の近くに連結する方法を描写する。酵素阻害剤
を、開裂可能部位を有するリンカー、例えばジオールに
より蛋白質変性反応性基に結合する。結合した阻害剤−
酵素（Ｉ）は不活性である。しかし、過沃素酸塩での処
理および透析は酵素活性を復活させる。次に検体を直接
にかまたは追加的リンカーを介して、開裂した部位へ結
合する。この手順は検体を酵素活性部位付近にのみ結合
する。得られる酵素は不利には活性を殆んどまたは全く
有しないことがある。これは長さの増大したリンカーア
ームの使用により直すことができる。中間体（II）は常
に活性を試験すべきである。IIの不十分な活性は反応性
基を変えることによりまたは阻害剤リンカーへの反応性
基の長さを増大させることにより解消しうる。

【００７３】要約すると、態様２のＡ／Ｄ信号送りは以
下の条件が満たされる時に起る：１）態様１で定義した結合比が少なくとも約１，００
０、好ましくは１，０００より大、そしてより好ましく
は少なくとも約１０，０００である；２）酵素結合比が少なくとも約１００、好ましくは少な
くとも約１，０００、そしてより好ましくは少なくとも
約１０，０００である；および３）閾値をセットするためにいくつかの空いている結合
部位が存在するように抗体濃度が酵素濃度よりも大き
い。

【００７４】Ａ／Ｄ信号強度は以下のことにより高めら
れる：１）抗体に対する酵素の量を増すこと。後記実施例１−
３では、酵素を抗体の１％から１０％ないし５０％に増
した時、切換分解能は影響されず、一方信号強度はこれ
により１００倍増大した。

【００７５】２）抗体−検体親和力定数の抗体−酵素親
和力定数に対する比を増すこと。抗体親和力は、上記２
の点の要求のため、有意に減らしえないことに留意すべ
きである。

【００７６】後記実施例２は態様２を説明する。

【００７７】態様３以下の式は態様３を説明する：

【数６】態様３はＡ／Ｄ応答を得るのに検体−補因子信号系を用
いる。添加検体が結合成分から補因子を追出すと、補因
子は因子と反応して測定可能な信号を生ずる。補因子は
ＦＡＤまたはＮＡＤのような補酵素であることができ、
一方因子は補因子の不在下では触媒活性のないアポ酵素
であることができる。酵素アロステリックエフェクタ
ー、ホルモンおよび他の同様の化合物を包含する他の賦
活分子もこの態様で補因子として使用しうる。前記のよ
うに、補因子と因子の対は、単量体酵素の自己集合性成
分（個々の成分は独立した別の活性を有しない）である
こともできる。それらは結合した時エネルギー転移また
は螢光を生ずる螢光分子で標識された自己集合性分子対
であることもできる。他のこのような補因子−因子対も
この態様で容易に使用しうる。唯一の要件は補因子−因
子の組合せが、組合せが離れている時に不在の信号を生
ずることである。

【００７８】態様３に関しては以下の所見を述べうる。

【００７９】第一に、切換分解能は最初満たされている
抗体部位と最初空いている抗体部位の比、または抗体と
補因子の比により影響される。これは、この比が切換分
解能に殆んどまたは全く影響しない態様２と対照的であ
る。１／１００から１／１０への比の低下は切換分解能
（分解能は検体濃度の１０％変化あたりの信号の増加倍
数と定義される）を３０９から２２５へ低下させ、一方
信号強度（５）を５倍増大させた。比を更に１／２に増
大させても信号強度は感じられるほど増大しなかったが
一方切換分解能に対する影響は甚だ不利であった。本発
明のこの態様を使用する場合、個々の用途のニーズに依
って、信号強度の増大と分解能の増大の間で注意深い選
択をしなければならない。これは補因子濃度が信号を検
出しうる限界でできるだけ低くなければならないことを
示唆する。これはＡ／Ｄ信号系の一般的性質の言い直し
である：信号強度はアナログ−アナログ条件下で観察さ
れるものに比べて低い。この強度の損失により分析の新
しい可能性が得られるのである。

【００８０】この信号強度の損失に故に、酵素または他
の触媒のような自己増幅性信号が本発明で特に有用であ
る。例えばもし因子がＦＡＤ−検体コンジュゲートで補
因子がグルコースオキシダーゼアポ酵素なら、信号は活
性グルコースオキシダーゼであろう。

【００８１】第二に、Ｋ₁対Ｋ₂の比が増大すると信号
強度は増大する。態様２におけるように、一旦検体が最
初は空いている結合部位を実質的に満たすと、それは結
合成分に対して補因子と競合する。検体が補因子よりも
強い結合成分に対する親和力を有するなら、検体はこの
競合に勝ち、大部分の補因子を追出して信号を生ずる。

【００８２】第三に、Ｋ₂対Ｋ₃の比が低下すると信号
分解能は低下する（雑音が増大する）。これは態様１で
も観察された。Ｋ₂対Ｋ₃の比は補因子に対する抗体と
酵素の相対的親和力を表わす。Ａ／Ｄ信号系はこれら親
和力が実質的に遠く離れていることを必要とする。斯
て、空いている抗体結合部位が存在する限り、抗体は補
因子に対する競合に常に勝つべきである。ホロ酵素は、
検体が補因子を抗体結合部位から追出した時にのみこの
系中に存在すべきである。充分な切換分解能のためには
約１，０００より大きい、そしてより好ましくは１０⁴
より大きいＫ₂／Ｋ₃比が有利である。この比が大きい
ほどＡ／Ｄ切換の分解能は大きい。

【００８３】最後に、態様１および２におけるように、
態様３も結合比が有利には少なくとも約１，０００、好
ましくは約１，０００より大、より好ましくは少なくと
も約１０，０００であることを必要とする。この結合比
は最初は空いている結合部位が検体を結合する能力を表
わす。１００またはそれより小さい比で試験を行なった
場合、結果はここに開示されたＡ／Ｄ測定の代りに従来
のＡ／Ａ測定に至る。

【００８４】この態様は態様２の酵素結合比に類似の臨
界的特徴を共有する；補因子結合比。この比は結合成分
の補因子に対する親和力定数と補因子の濃度の積として
定義される。この定数は好ましくは約１，０００より
大、より好ましくは約１０，０００より大であるべきで
ある。態様２におけるように、この臨界的比は、補因子
が検体により置換されるまでは結合成分に完全に結合し
ていることを保証する。後記実施例３は態様３を説明す
る。

【００８５】態様１では、低エネルギー状態は結合成分
であり、一方信号を生ずる高エネルギー状態は受容体で
ある。低および高エネルギー状態間の検体親和力定数の
差はこれら状態間のエネルギー差を表わす。Ａ／Ｄ信号
送りを生ずるには実質的なエネルギー差（分配比）を必
要とする。

【００８６】要約すると、この態様ではＡ／Ｄ測定は、 −結合比が約１，０００に等しいかまたはそれより大き
い； −Ｋ₂対Ｋ₃の比が約１０⁴に等しいかまたはそれより
大きい； −抗体が補因子より過剰に存在して或数の最初は空いて
いる結合部位を作り、その濃度が閾値を定める； −補因子結合比（Ｋ₂ ^*［補因子］）が約１，０００、
より好ましくは１０，０００に等しいかまたはそれより
大きい、場合に可能である。切換分解能および信号強度は −最初は空いている抗体結合部位対補因子で満たされて
いる部位の比ができるだけ高く、好ましくは９：１の比
に、より好ましくは９９：１の比に保たれる； −Ｋ₁対Ｋ₂の比が１より大、好ましくは１０またはそ
れより大である、場合に増大する。

【００８７】要約従来のアナログ−アナログ測定は検体と信号発生状態と
の相互作用を含む。アナログ−デジタル測定は検体が信
号を生じない低エネルギー状態と信号を発生する高エネ
ルギー状態の間で分配される時はいつでも可能である。

【００８８】態様２および３では、低エネルギー状態は
最初は空いている結合部位への検体の結合に相当し、こ
こでは検体は競合を行なわない。高エネルギー状態は既
に信号により占められている部位への検体の結合を含
む。

【００８９】本発明を一般的に記載したが、より完全な
理解が以下の特定実施例を参照して得ることができる。
これら実施例は説明の目的のためにのみここに示すもの
であり、限定を意図するものではない。

【００９０】

【実施例】例１一連の試験管に、５mg／mlの卵アルブミンを含有する等
張燐酸塩緩衝液中のジギトキシン抗体を、５×１０^-8Ｍ
から５×１０^-7Ｍまで次第に増える濃度で添加する。抗
体−ジギトキシン結合定数はあらかじめ４×１０¹³Ｍ^-1
と測定されている。１０^-8ＭのＮａ⁺Ｋ⁺−ＡＴＰアー
ゼＦ１断片も添加する。各試験管に１０^-7Ｍのジギトキ
シンを添加し、次にＡＴＰを添加する。ＡＴＰアーゼ活
性を検査するに、１０^-7Ｍ以上の抗体を有する試験管中
に見出される。それ以下の抗体濃度の試験管は、ＡＴＰ
アーゼ活性のジギトキシンによる阻害のため、活性を有
しない。ＡＴＰアーゼ活性は任意の便宜な方法を用いて
測定しうる。特に有用な方法は次のような発色カップリ
ング活性を含む。

【００９１】

【数７】例２メトトレキセート（１ｍＭ）を水中で５倍モル過剰の１
−エチレン−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミドと反応させた。ｐＨ８．５に調整したアミノカ
プロン酸水溶液を最終濃度５０ｍＭまで添加し、そして
反応を室温で一夜進行させた。誘導体化メトトレキセー
トを水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と８０
％メタノール、０．１％ＴＦＡの間で行なわれるＣ１８
逆相カラム上でのセミ分取スケールＨＰＬＣにより精製
した。精製した薬品を水に溶解し、そして凍結乾燥し
た。化合物を再び水に溶解して過剰のカルボジイミドと
反応させた。１ｍＭＨＣｌ中で処理したトリプシン
（ＴＰＣＫ）を反応に添加して４℃で１週間反応させ
た。反応を１ｍＭＨＣｌ、１００ｍＭＮａＣｌに対
して透析し、そして凍結乾燥した。トリプシンの分析は
酵素分子あたり平均３．１のメトトレキセートが凍結し
たことを示した。

【００９２】メトトレキセート結合定数１．５×１０⁹
Ｍ^-1のマウスモノクローナル抗体を選び、これはトリプ
シン活性を完全に阻害することを示した。抗体阻害トリ
プシン（１×１０^-6Ｍ）を６％セラチン、２５ｍＭ燐酸
カリウム、ｐＨ７．８の緩衝液と混合し、そして３ミル
（インチの千分の１）の湿潤層に流した。この相を６％
ゼラチンおよび３％低分子量デキストラン中の抗体５×
１０^-6ないし５×１０^-4Ｍを含有する湿潤厚さ３ミルの
抗体勾配層で被覆した。膜を乾燥し、０．０６インチ幅
のストリップに切断し、そして長方形のプラスチック毛
細管の底に膜とプラスチックの間隔１０．６ミルで置い
た。毛細管の頂部はあらかじめトリプシンに対する色素
基質である。Ｎ−ｐ−トシル−アルグ−ｐ−ニトロアニ
リドを含有するゼラチン溶液で被覆した。

【００９３】血清溶液をトリクロロ酢酸（５％）で処理
して蛋白質を沈澱させ、次に臨床遠心機中で回転させ
る。上澄液を除去し、１０ｍＭのＫ₃ＰＯ₄を添加し、
そして溶液をＫＨＣＯ₃でｐＨ７に調整する。この溶液
を毛細管中に入れると、５分以内に着色バーが現れる。
着色バーの長さはメトトレキセート濃度を示す。着色バ
ーの長さは２時間以上安定であり、そして−２０℃で貯
蔵することにより無期限に安定化しうる。この装置を図
７に図式で示す。

【００９４】例３ E.coliラクＺ遺伝子をClin.Chem.３２、１６３７−１６
４１頁（１９８６年）に説明されているように組換えＤ
ＮＡ技術により作って酵素受容体および酵素供与体断片
を生じさせた。ジゴキシンを酵素供与体断片に共有結合
させた。ジゴキシン親和力定数が３×１０¹⁰Ｍ^-1のマウ
スモノクローナル抗体を得、これは２×１０⁹Ｍ^-1のジ
ゴキシン−酵素供与体コンジュゲートに対する親和力を
有することを示した。コンジュゲートは１．５×１０⁴
Ｍ^-1の酵素受容体に対する親和力を有することも示され
た。ゼラチン中の抗体の溶液の次第に増えるアリコート
をマイクロタイター板に加えそしてゆるい空気流下で乾
燥した。抗体濃度（１００μ１に水和した時）は３５段
階の次第に増える直線濃度において０．１μＭ比の抗体
部位が満たされるようにコンジュゲートを抗体溶液に添
加した。２μＭのクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドを含有する１０μＭ酵素供与体の溶液
を各ウエルに添加しそして再び乾燥した。

【００９５】これらの板は−２０℃で１年以上活性を失
うことなく貯蔵しうる。それらは１００ｍＭのｐＨ７．
４の燐酸塩緩衝液を含有する濃度が０．０８２ないし２
３１μＭのジゴキシンの未知溶液１００μｌの添加によ
り活性化しうる。６分間培養後に結果を読む。ジゴキシ
ンが存在するウエルでは、閾値より大きい濃度は暗赤色
であり、これに対し最初に空いている抗体結合部位が添
加ジゴキシンより過剰に存在する管では、最初の色のま
まである。この測定はウエルの試料添加用自動ピペット
と組合せたマイクロタイターリーダーによって有利に読
むことができる。

【００９６】数学的モデル化本発明はまた本発明の態様の数学的モデル化法を含む。
このモデル化は、一旦使用する成分の結合定数がわかれ
ば、Ａ／Ｄ切換の分解能を実験前に決定しうる点で極め
て有用である。このモデル化は新規測定法の開発におい
てＡ／Ｄ挙動について得なければならない必要な定数を
予言するのに一層有用である。この事前の知識はモノク
ローナル抗体および他の結合成分のスクリーニングに大
きな助けとなる。

【００９７】各態様に対する方程式は次の通りである。

【００９８】態様１Ｋ₁＝〔抗体−検体〕／（〔抗体〕〔検体〕）Ｋ₂＝〔検体−受容体〕／（〔受容体〕〔検体〕）抗体合計＝〔抗体〕＋〔抗体−抗体〕受容体合計＝〔受容体〕＋〔受容体−検体〕検体合計＝〔検体〕＋〔抗体−検体〕＋〔受容体−検
体〕態様２Ｋ₁＝〔抗体−検体〕／（〔抗体〕〔検体〕）Ｋ₂＝〔検体−信号〕／（〔抗体〕〔信号〕）抗体合計＝〔抗体〕＋〔抗体−検体〕＋〔抗体−信号〕検体合計＝〔検体〕＋〔抗体−検体〕信号合計＝〔信号〕＋〔抗体−信号〕態様３Ｋ₁＝〔抗体−検体〕／（〔抗体〕〔検体〕）Ｋ₂＝〔検体−補因子〕／（〔抗体〕〔補因子〕）Ｋ₃＝〔補因子−因子〕／（〔補因子〕〔因子〕）抗体合計＝〔抗体〕＋〔抗体−検体〕＋〔抗体−補因
子〕検体合計＝〔検体〕＋〔抗体−検体〕補因子合計＝〔補因子〕＋〔抗体−補因子〕＋〔補因子
−因子〕因子合計＝〔因子〕＋〔補因子−因子〕これら３つの連立方程式セットのすべてをみるに、それ
らは交さ項を含むことがわかる。これら交さ項は方程式
をいかなる既知の代表的方法によっても解けない連立二
次方程式に変換する。これら方程式の解の殆どは虚数を
必要とする。この代表的解の欠如と極端な数学的複雑さ
はＡ／Ｄ測定の真価を早期に認めることを阻んだことは
疑いない。

【００９９】これら方程式の解はコンピュータシミュー
レーション技術の使用により近似的に求めることができ
る。特に有用なのは加州パロアルトのTutsim Products
Inc.から得られるシミュレーションプログラムTutsim
（商標）である。このシミュレーションプログラムはデ
ジタルコンピュータをアナログコンピュータに変換す
る。上記方程式を模擬するアナログフローチャートを、
定数入力ブロックを全成分の濃度および結合定数にセッ
トして作る。計算をアベンドから防ぎそして解答を物理
的に得ることができる限界へ強制るためにこのフローチ
ャートに時定数および限界ブロックを加える。プログラ
ムをスタートさせ、出力を１０，０００計算ごとにサン
プル抽出する。計算は殆どまたは全く変化のない状態に
落着き、これは平衡に達したことを示す、次に計算され
た濃度を前記方程式に試すことができる。次に１つの因
子の濃度（例えば検体濃度）を変え、計算を再スタート
して次の平行点を得ることができる。態様１−３に合う
TUTSIM（商標）プログラムを図８〜図１０に挙げる。

【０１００】図８はＡ／Ｄ態様１へのアナログシミュレ
ーションプログラムに相当する。このプログラムは示さ
れた数値における各点を見出すために行なう。ｃｏｎブ
ロックは検体、抗体および受容体の合計濃度および結合
定数にセットする。ｓｕｍブロックは遊離検体、抗体お
よび受容体の濃度を得るために使用する。検体−抗体お
よび検体−受容体の濃度を計算するためにｍｕｌブロッ
クで遊離成分濃度を使用し、次にその出力をｓｕｍブロ
ックにフィードバックする。ｆｌｏブロックはこの閉ル
ープ系をアベンドから防ぐ時定数として作用する。ｌｉ
ｍブロックは中間濃度を実数の値に限定し、ａｄｌブロ
ックはデータを好都合にプリントアウトする。操作プロ
グラムTutsim（商標）はTutsim Products から購入し
た。プログラムは３８６コンパチブルmathコプロセッサ
チップを備えるDell 310.DOSコンピュータで行なった。
尚図８中の符号の説明を第２表に示す。

【０１０１】第２表図８の符号の説明１，ｃｏｎ；抗体合計２，ｃｏｎ；検体合計３，ｃｏｎ；受容体４，ｃｏｎ；Ｋ１５，ｃｏｎ；Ｋ２１０，ｓｕｍ，１，−１３；遊離抗体１１，ｆｉｏ，１０；アナログ遅延１２，ｍｕｌ，１１，４，２１；抗体−検体１３，ｌｉｍ，１２；抗体−検体を実数解に限定１４，ａｄｌ，１３；［検体−抗体］２０，ｓｕｍ２，−１３，−３３；遊離抗体２１，ｆｉｏ，２０；アナログ遅延３０，ｓｕｍ，３，−３３；遊離受容体３１，ｆｉｏ，３０；アナログ遅延３２，ｍｕｌ，２１，３１，５；検体−受容体３３，ｌｉｍ，３２；検体−受容体を実数解に限定３４，ａｄｌ，３３；［検体−受容体］図９は態様２へのTutsim（商標）解答に相当する。信号
強度を親和力比Ｋ₁／Ｋ₂の函数として調べる。結果を
図１１および図１２に示す。これらの図で閾値は９×１
０^-8Ｍにセットし、酵素の号計量は１０^-8Ｍである。図
１１で比１（第３表のケース１）においてＫ₁およびＫ
₂は共に１０¹²である。閾値より大きい検体濃度におけ
る信号は利用しうる酵素の約１０％しか表わさないこと
に留意すべきである。図１２でＫ₁／Ｋ₂比１００にお
いてＫ₁は１０¹⁴に増大する。信号強度は１０倍増大す
る；利用しうる酵素の１００％が放出される。第３表の
ケース５および６はＫ¹／Ｋ₂比１０は中間量で信号強
度を利用しうる酵素の約４０％に増大させることを示
す。尚図９の符号の説明を第４表に示す。

【０１０２】

【表１】第４表図９の符号の説明１，ｃｏｎ；検体合計２，ｃｏｎ；抗体合計３，ｃｏｎ；酵素合計４，ｃｏｎ；Ｋ１５，ｃｏｎ；Ｋ２１０，ｓｕｍ，１，−１３；遊離検体１１，ｆｉｏ，１０；アナログ遅延＝１０００１２，ｍｕｌ，１１，４，２１；抗体−検体１３，ｌｉｍ，１２；抗体−検体を実数に限定１４，ａｄｌ，１３；［抗体−検体］２０，ｓｕｍ，２，−１３，−２３；遊離抗体２１，ｆｉｏ，２０；アナログ遅延＝１０００２２，ｍｕｌ，２１，５，３１；抗体−酵素２３，ｌｉｍ，２２；抗体・酵素を実数に限定２４，ａｄｌ，２３；［抗体−酵素］３０，ｓｕｍ，３，−２３；遊離酵素３１，ｆｉｏ，３０；アナログ遅延＝１０００３２，ａｄｌ，３１；［酵素］図１０は態様３のためのアナログシミュレーションプロ
グラムに相当する。このプログラムは、ｆｌｏヒストリ
ーブロックの時定数を1,000 から10,000に増したこと以
外は図８の説明に示したように行なった。解答を実数の
値に限定するために追加約ｌｉｍ（限定）ブロックを導
入した。このプログラムはこの態様のあらゆる可能な組
合せにおいて実数の値を生ずることができなかった。し
かし、Ａ／Ｄ測定により占められる多次元空間において
優れた結果が得られた。尚図１０の符号の説明を第５表
に示す。

【０１０３】第５表図１０の符号の説明１ｃｏｎ：検体合計２ｃｏｎ：抗体合計３ｃｏｎ：補因子合計４ｃｏｎ：酵素合計５ｃｏｎ：Ｋ１抗体＋検体６ｃｏｎ：Ｋ２抗体＋補因子７ｃｏｎ：Ｋ３酵素＋補因子１０ｃｏｎ１ −１４：検体（×２）１１ｆｉｏ１０：アナログ遅延＝１０００１２ｌｉｍ１１：限定［検体］×（２）１３ｍｕｌ１２５２２：抗体−検体（×５）１４ｌｉｍ１３：×５を実数に限定１５ａｄｌ１４：［抗体−検体］２０ｓｕｍ２ −１４ −２４：遊離抗体（×１）２１ｆｉｏ２０：アナログ遅延＝１０００２２ｌｉｍ２１：×１を実数に限定２３ｍｕｌ２２６３２：抗体−補因子（×６）２４ｌｉｍ２３：×６を実数に限定２５ａｄｌ２４：［抗体−補因子］３０ｓｕｍ３ −２４ −３４：遊離補因子（×３）３１ｆｉｏ３０：アナログ遅延＝１０００３２ｌｉｍ３１：×３を実数に限定３３ｍｕｌ３２７４２：ホロ酵素（×７）３４ｌｉｍ３３：×７を実数に限定３５ａｄｌ３４：［ホロ酵素］４０ｓｕｍ４ −３４：アポ酵素（×４）４１ｆｉｏ４０：アナログ遅延＝１０００４２ｌｉｍ４１：×４を実数に限定要するに、本発明は溶液中の検体の濃度を決定する新規
で有効な測定法を提供する。この測定法は、結合成分技
術を用いて、検体の濃度を決定するアナログ−デジタル
信号系を利用する。この新規測定法は複雑な機器または
方法無しに迅速で簡単な測定を可能にする。これらの測
定法は手で保持する持運び可能な温度計様の装置により
行ないうる。

【０１０４】本発明を詳細に記載したが、当業者にはこ
こに述べた本発明の精神および範囲を逸脱することなく
多くの変更および変形がそこになされうることが明らか
であろう。本発明は特許請求の範囲によってのみ限定さ
れうる。

【図面の簡単な説明】

【図１】各添加検体分子が測定可能な信号に変換される
従来のＡ／Ａ均質測定法を示す説明図である。

【図２】有意な数の最初は空いている結合部位を添加検
体が滴定して検体を溶液から除去し、それが信号発生成
分と反応するのを防ぐＡ／Ｄ測定法を示す説明図であ
る。

【図３】モノクローナル抗体について〔抗体−検体〕を
ｌｏｇ〔検体〕に対しプロットした従来法の結合曲線を
示すグラフである。

【図４】本発明の態様２からとったＡ／Ｄ結合曲線を示
すグラフである。

【図５】本発明の態様１において予じめセットされた閾
値に非常に近い領域で信号発生性の検体−受容体を全検
体濃度に対しプロットしたグラフ。

【図６】ランダムおよび限定合成経路を描いた切換分解
能およびコンジュゲート合成を示す説明図である。

【図７】抗体勾配測定装置を示す説明図である。

【図８】Ａ／Ｄ態様１へのTutsimアナログシミュレーシ
ョンプログラムを示す説明図である。

【図９】態様２へのTutsim解答を示す説明図である。

【図１０】態様３のためのアナログシミュレーションプ
ログラムを示す説明図である。

【図１１】Ｋ₁／Ｋ₂の函数としての信号強度を示すグ
ラフである（Ｋ₁／Ｋ₂＝１の場合）。

【図１２】Ｋ₁／Ｋ₂の函数としての信号強度を示すグ
ラフである（Ｋ₁／Ｋ2 ＝１００の場合）。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料の検体濃度が所定の検体閾濃度を超
える場合に試料中の検体の或濃度での存在を信号送りす
る測定であって、上記検体を結合しうる或量の結合成分、および試料の検
体濃度が上記検体閾濃度を超える場合に信号を発生する
手段を含み、上記結合成分は上記検体閾濃度より実質的に小さい検体
解離定数を有し、上記結合成分は所定量の空いている結
合部位を有し、この所定量の空いている結合部位は、上
記閾濃度の検体の存在において上記空いている結合部位
の実質的に全部が試料中の検体の実質的に全部によって
満たされるように選ばれ、上記信号発生手段は検体に対する結合成分の親和力より
も実質的に小さい検体に対する親和力を有する前記測
定。
【請求項２】上記結合成分が抗体である請求項１の測
定。
【請求項３】結合比が少なくとも約１，０００である
請求項１の測定。
【請求項４】結合比が１，０００より大きい請求項３
の測定。
【請求項５】結合比が少なくとも約１０，０００であ
る請求項４の測定。
【請求項６】検体が閾値より大きい濃度である場合に
信号を発生する手段が検体の存在で活性の変化を受ける
触媒である受容体を含む請求項１の測定。
【請求項７】上記受容体が、検体と結合した場合に触
媒活性の変化を受ける蛋白質触媒であり、そして上記検
体が蛋白質触媒の阻害剤、賦活剤、補因子またはエフェ
クタである請求項６の測定。
【請求項８】分配比が少なくとも約１０である請求項
７の測定。
【請求項９】分配比が少なくとも約１００である請求
項８の測定。
【請求項１０】分配比が少なくとも約１，０００であ
る請求項９の測定。
【請求項１１】上記結合成分が抗体である請求項６の
測定。
【請求項１２】結合比が少なくとも約１，０００であ
る請求項６の測定。
【請求項１３】結合比が約１，０００より大きい請求
項１２の測定。
【請求項１４】結合比が少なくとも約１０，０００で
ある請求項１３の測定。
【請求項１５】信号発生手段が上記結合成分の利用で
きる結合部位の一部を満たし、そして閾濃度より過剰の
検体が上記結合部位から信号発生手段を置換して信号を
発生させる請求項１の測定。
【請求項１６】上記信号発生手段が検体−信号コンジ
ュゲートを含む請求項１５の測定。
【請求項１７】上記検体−信号コンジュゲートが検体
−酵素コンジュゲートを含み、上記結合成分と結合した
場合にコンジュゲートの酵素が阻害される請求項１６の
測定。
【請求項１８】上記検体−信号コンジュゲートが検体
−蛍光コンジュゲートを含み、上記結合成分に結合した
場合にコンジュゲートの蛍光分子が、上記結合成分に結
合していない場合に対して蛍光挙動に検出可能な変化を
経る請求項１６の測定。
【請求項１９】上記結合成分が抗体である請求項１６
の測定。
【請求項２０】コンジュゲート結合定数が少なくとも
約１，０００である請求項１６の測定。
【請求項２１】コンジュゲート結合定数が約１，００
０より大きい請求項２０の測定。
【請求項２２】コンジュゲート結合定数が約１０，０
００より大きい請求項２０の測定。
【請求項２３】結合成分の検体に対する親和力とコン
ジュゲートに対する親和力の比が約１よりも大きい請求
項１６の測定。
【請求項２４】親和力定数比が約１０より大きい請求
項２３の測定。
【請求項２５】信号発生手段が上記結合成分の利用可
能な結合部位の一部を満たし、閾濃度より過剰の検体が上記結合成分の結合部位から上
記信号発生手段を置換し、上記信号発生手段が上記結合成分と結合していない場合
に遊離状態の因子と結合して信号発生手段−因子複合体
を形成することができ、それにより信号を発生し、そし
て上記因子の信号発生手段に対する親和力が結合成分の
信号発生手段に対する親和力よりも有意に小さい請求項
１の測定。
【請求項２６】上記信号発生手段が検体−補因子コン
ジュゲートを含む請求項２５の測定。
【請求項２７】コンジュゲート結合定数が少なくとも
約１，０００である請求項２６の測定。
【請求項２８】コンジュゲート結合定数が約１，００
０よりも大きい請求項２７の測定。
【請求項２９】コンジュゲート結合定数が約１０，０
００よりも大きい請求項２７の測定。
【請求項３０】結合成分の検体に対する親和力とコン
ジュゲートに対する親和力の比が約１より大きい請求項
２６の測定。
【請求項３１】親和力定数比が約１０より大きい請求
項３０の測定。
【請求項３２】上記補因子が酵素サブユニット断片を
含み、そして上記因子が上記酵素の他の断片を含む請求
項２６の測定。
【請求項３３】上記補因子が蛍光分子を含み、そして
上記因子が上記補因子の蛍光を変える分子を含む請求項
２６の測定。
【請求項３４】上記補因子が触媒分子の活性を変えう
る分子を含み、そして上記因子が補因子の結果として変
えられた活性を有する触媒分子である請求項２６の測
定。
【請求項３５】上記因子が補因子の不在下で不活性で
ある酵素またはアポ酵素であり、そして上記補因子が上
記酵素またはアポ酵素に活性を媒介する分子である請求
項３４の測定。
【請求項３６】上記因子が不活性であるが添加補酵素
と自発的に結合して活性酵素を生じうるアポ酵素であ
り、そして上記補因子が溶液中で遊離の場合に上記アポ
酵素と反応しうる補酵素−検体コンジュゲートである請
求項３４の測定。
【請求項３７】上記結合成分が抗体である請求項２６
の測定。
【請求項３８】一組の区画を含み、各区画が、所定量の空いている結合部位を有する結合成分、および
信号発生手段、を含む、請求項１の測定を行なうための
装置。
【請求項３９】各区画が、上記信号発生手段の少なくとも１つの層、および上記結
合成分の少なくとも１つの層、を含む請求項３８の装
置。
【請求項４０】上記結合成分が抗体である請求項３８
の装置。
【請求項４１】試料中の検体の濃度が所定の検体閾濃
度を超えるかどうかを決定する測定を行なう方法であっ
て、Ａ．測定反応容器に１．上記検体と結合する或量の結合成分、ここで上記結合成分は上記検体閾濃度よりも実質的に小
さい検体解離定数を有し、そして上記結合成分は結合し
た検体を有しない所定量の結合部位を有し、空いている
結合部位の量は、上記閾濃度の検体の存在下で、上記空
いている結合部位の実質的に全部が試料中の上記検体の
実質的に全部により満たされるように選ばれる、２．試料の検体濃度が上記検体閾濃度を超えた場合に信
号を発生する手段、ここで上記手段は上記検体に対し無視しうる親和力を有
する、を供給し、そしてＢ．上記測定容器に或量の試料検体を添加する、ことを
含む前記方法。
【請求項４２】上記結合成分が抗体である請求項４１
の方法。