JPH0458156A

JPH0458156A - インスリン生物活性の測定方法及びその測定用キット

Info

Publication number: JPH0458156A
Application number: JP16823390A
Authority: JP
Inventors: Tomoko Kobayashi; 智子小林; Hisaya Motojima; 本島　久也
Original assignee: BIO SENSOR KENKYUSHO KK
Current assignee: BIO SENSOR KENKYUSHO KK
Priority date: 1990-06-28
Filing date: 1990-06-28
Publication date: 1992-02-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はインスリン生物活性の測定方法及びその測定に
用いられるキットに関する。

〔従来の技術〕

インスリンを測定する方法としては、従来生物学的測定
法（バイオアッセイ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ
＞、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ＞及びラジオレ
セプターアッセイ（ＲＲＡ）等が用いられてきた。

しかしながら、このうち、生物学的測定法（バイオアッ
セイ）はインスリンの生物活性を直接測定できる利点が
あるが、実験条件が整備され、熟練した研究者によって
行われた場合でないと信頼が得られない他、測定に長時
間を要し、操作が繁雑で測定感度も悪いという問題点が
ある。

次のバーゾン（Ｂｅｒｓｏｎ　）とヤロー（Ｙａｌｏｕ
　）が開発したＲ　Ｉ　Ａ　（Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｌ
ｎｖｅｓｔ、　３９．　（１９６０）　（米）ｐ１１５
７〜１１７５参照）は、バイオアッセイに比べて簡便性
、測定感度および精度に優れた特質を有しているため最
も広く使用されているが、生物活性がなく免疫活性のみ
を有する物質も同時に測定してしまうため、その測定値
は真の生物活性を反映しているパイ、オアツセイ値と一
致しないという問題点がある。

また、Ｅ　ＩＡ　（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　７３　
（１９３７）　（米）ｐ１３１９〜１３２１参照〉は、
放射性同位元素を用いない点でＲＩＡに比べ優れており
、特別な施設を必要としないためどこでも測定できると
いう利点があり、簡便性、測定感度および精度において
もＲＩＡとほぼ同等であるが、ＥＩＡもＲＩＡと同様に
、生物活性を測定していないという問題点がある。

さらに、ＲＲＡ　（ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＣＨＥＨＩＳ丁
ＲＹ、η［９１（１９７７）　（米）　　ｐ１５９０〜
１５９５参照）は、肝、腎、胎盤、単球等から精製した
インスリンレセプターを用いてインスリンを測定する方
法であるが、生物活性に直結するレセプターを結合タン
パクとして用いているため、得られた測定値がバイオア
ッセイの結果と平行するのが一般的であり、その意味で
極めて重要な意義を有しているものの、これにもレセプ
ターと結合しても生理作用がない物質もあり、これを同
時に測定してしまうおそれがあるという問題点が残され
ている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、従来のインスリン測定法が有していた上述の
問題点を解決し、バイオアッセイと同時にインスリンの
真の生物活性を簡便で、且つ感度、精度とも良好に測定
する方法を提供することを課題とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は上記課題を解決するため鋭意研究の結果、イ
ンスリンがインスリンレセプターに結合すると、細胞膜
におけるグルコースの輸送活性が促進されるという事実
に着目し、検体中のインスリンがその濃度に応じて細胞
膜に内在するインスリンレセプターに結合することによ
り、そのシグナルが細胞内に比例的に伝達され、その結
果、インスリン依存性グルコーストランスポーター（糖
輸送担体）の膜への移動もそれに応じて促進されるため
、その量に応じて細胞内に取り込まれるグルコース量も
定量的に増大することを見出し、その知見に基づいて本
発明を完成した。

すなわち本発明は、検体にインスリンレセプター及びイ
ンスリン依存性グルコーストランスポーターを発現して
いる細胞と標識された糖類とを反応させ、次いで該細胞
内にとり込まれるか又は／及び該細胞膜に付着した標識
の量を測定することを特徴とするインスリン生物活性の
測定方法、及びこの発明に用いられるキットを提供する
ものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明においては、まず、反応緩衝液で希釈したインス
リン生物活性を測定しようとする検体試料にインスリン
レセプター及びインスリン依存性グルコーストランスポ
ーターを発現している細胞と標識された糖類を加え、反
応せしめる。

反応により、検体のインスリンが該細胞の膜にあるイン
スリンレセプターに結合するが、その結合量は検体中の
生物活性を有するインスリン量に比例する。そのため、
当該結合によってもたらされるインスリン依存性グルコ
ーストランスポーターへの情報間もこれに対応して増減
することになり、同様にその情報量によって該トランス
ポーターの細胞膜への移動も連動して増減する。

その結果、該トランスポーターを介して細胞内に取り込
まれるグルコースの量もこれにあわせて変動するので、
このグルコースに標識を付与しておくと、この標識を所
定の方法によりカウントすることによって、目的とする
インスリン生物活性が測定できるのである。

本発明で用いる細胞としては、インスリンレセプターと
インスリン依存性のグルコーストランスポーターを発現
している細胞ならいずれも使用できる。

これに該当する細胞としては遺伝子工学的手法により製
造された培養細胞、特にＣＨＯ−ＨＩＲ３細胞が好まし
く、その他に生物から採取した上記機能を有する脂肪細
胞、骨格筋細胞等も用いることができる。

なお、ＣＨＯ−ＨＩＲ３細胞を製造するには、Ｙ、　Ｅ
ｂｉｎａ　ｅｔ　ａｔ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８２、８０１４−８０１８．１９８５に記載されている
方法を用いればよい。

次に、本発明の測定方法で用いる糖類は、アイソトープ
、ケイ光色素等のケイ光標識物質で標識した糖類である
。

本発明で標識用として用いられるアイソトープとしては
３Ｈ１１４Ｃ１′２５■等があり、一方、ケイ光標識物
質としては２−アミノピリジン、イソチオシアン酸フル
オレセイン（ＦＩＴＣ＞、７−二トロベンゼンー２−オ
キサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）　、ダンジルクロ
ライド（ＤＮＳ−ＣｊりテトラメヂルロダミンイソヂＡ
シアネート（ＴＭＲＩＴＣ）　、アクリジニウムエステ
ル等を用いることができる。また、その他に例えばアン
トラニロイル基を用いて糖の水′Ｍ基を標識したり（平
塚、化学と生物、２２．４２〜５６．１９８４＞、ピリ
ジルアミノ基を糖の還元末端に導入することによりケイ
光標識軸を作製することもできる（　Ｓ、　１ｌａｓｅ
　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
　、　Ｂｅｓ　。

Ｃｏｍｍｕｎ、　、　８５．２５７　、１９７８）。

糖類としては、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｄ−グ
ルコース、Ｄ−グルコサミン、３−０−メヂルーＤ−グ
ルコース、６−デＡキシ−６−フルオロ−Ｄ−グルコー
ス、２，２−ジクロロ−２−デオキシ−〇−グルコース
、６−ゾオキシーＤ−グルコース、６−ジオキシ−６−
ツルオローＤ−ガラクトース、３−デオキシ−３−フル
ＡローＤ−グルコース、６−ジオキシ−６−ヨードーＤ
−グルコース、２−クロロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコ
ース、４−０−プロピル−〇−グルコース、β−Ｄ−グ
ルコ−ピラノシルフルオライド、Ｄマンノース、３−０
−アリル−Ｄ−グルコース、３−０−（２’、３’　−
エポキシプロピル）Ｄ−グルコース、Ｄ−グルカールキシ−Ｄ−グルコース、３−クロロ−３−デオキシ−Ｄ
−グルコース、６−〇ープロピルー〇ーガラクトース、
１．２−ジデオキシ−〇ーグルコース、６−０−メチル
−〇ーガラクトース、３−０−エチル−Ｄ−グルコース
、６−０−デオキシ−Ｄ−ガラクトース、３−０−プロ
ピル−Ｄ−グル」−ス、Ｄ−キシロース、３−デオキシ
−〇ーグルコース、１−デオキシ−Ｄ−グルコース、α
−Ｄグルコピコラノシルフルオライド、Ｄ−ガラクトー
ス、２−０−メチル−Ｄ−グルコース及びそれらのアナ
ログ等が用いられる。

上記の糖類を先に示したアイソトープもしくはクイ光標
識物質で標識して用いる。例えば［３Ｈ］２−デオキシ
−Ｄ−グルコース、［３）−ｔ］Ｄ−グルコース、［３
ｆ−１］Ｄ−グルコサミンやピルジルアミノグルコース
等である。

本発明の測定法に用いられる反応条件としては反応温度
が通常２４〜３８℃、好ましくは３５〜３７℃、反応時
「ｍが５〜６０分間、好ましくは２５〜３５分間である
。

反応に用いられる反応緩衝液としては塩化ナトリウム、
塩化カリウム、塩化カルシウム、ＢＳＡを含むリン酸塩
緩衝液を用いることができる。

また、該反応緩衝液にはＢＳＡ玖外にＨＳＡ、ゼラチン
、カゼイン等を添加することができる。

（実施例）以下、実施例で本発明を説明する。

実施例１Ｙ．　　Ｅｂｉｎａ　　ｅｔ　　ａｔ，　　Ｐｒｏｃ，
　　Ｎａｔｌ，　　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　　ｔＪｓＡ
。

堕，　８０１４−８０１８，　　（１９８５）に記載の
方法によってヒト胎盤由来ヒトインスリンレセプターＣ
ＤＮＡをＳＶ−４０プロモーター支配下に組み込み作製
したｐＣＤＬｌ−ト１１Ｒ７をＣＨＯ細胞にリン酸カル
シウム沈澱法で形質導入して得たＣ　）−１　０　−）
１１Ｒ３細胞を２４ウエルプレートで増殖させた後、培
養液を除去し、１４０　ｍＭ塩化ナトリウム、１．７ｍ
Ｍ塩化カリウム、０．９ｍＭ塩化カルシウム、０．１％
ＢＳＡを含む１．４７ｍＭリンＷ！ｉ緩衝液（ｐＨ７，
４、以下反応緩衝液という）’ｌｔｄで２回ウェルを洗
浄する。反応緩衝液で洗浄したインスリン標準品または
リンプル０．２ｄ及び１５０μＭ　［３Ｈ］２−デオキ
シ−Ｄ−グルコースｏ、　１ＷＩｆ！をウェルに添加し
、３７℃、３０分間反応させた後反応液を除去し、水冷
下にて１００ｍＭフロレチンを含む反応緩衝液２Ｉ１１
１で２回ウェルを洗浄プる。ウェルに０．０３％ＳＤＳ
　Ｏ，５ｍを添加し、攪拌して溶液をバイアルに移し、
シンチレータ−３ｄと良く混和し液体シンブーレーショ
ン力１クンターにてカウントすることによりインスリン
生物活性を測定した。

本測定法によって得られた標準曲線を第１図に示す。

実施例２実施例１における［３Ｈ］２−デオキシ−Ｄ−グルコー
スのかわりに［３Ｈ］Ｄ−グルコサミンまたは［３Ｈ］
３−０−メチル−Ｄ−グルコースを用い、実施例１と同
様にしてインスリン標準品を測定した。この結果、実施
例１と同様の標準曲線が得られることを確認した。

実施例３［３Ｈ］２−デオキシ−〇−グルコースのかわりにＴａ
ｋｅｍｏｔｏらの方法（＾ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　
、　１４５゜２４５、１９８５）に従いグルコースにケ
イ光標識物質である２〜アミノピリジンを加え１００℃
、１５分間加熱後、ＮａＢ８３ＯＮを添加し９０℃、８
時間さらに加熱し、反応生成物を精製して調製したピル
シールアミノグルコースを用い、励起波長３１０〜３２
０　ｎｍ、ケイ光波長３７０〜３８０ｎｍで分光ケイ光
光度計により検出した仙は実施例１と同様にしてインス
リン標準品及びサンプルのインスリン生物活性を測定し
た。実施例１と同様、インスリン濃度とケイ光強度が比
例関係にあることが確認された。

なお、得られた結果と次に示す実験例で行ったＥＩＡに
よるインスリン生物活性定量値との相関図を第２図に示
した。

〔実験例〕

本発明の測定法による測定値が正しいことを確認するた
めにＥＩＡとの相関性を調べた。

ＥＩＡの固相（抗体結合チューブ）は抗インスリンモル
モット血清を硫安分画しゲル濾過にて精製した抗体を物
理吸着させたものを用い、酵素標識抗体は抗インスワン
モルモット抗体をペプシン消化および還元することによ
り得られたＦａｂ’フラグメントにマレイミド法でペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）を結合したものを用いた。ＥＩ
Ａの測定原理はサンドイツチ法に基づいて行った。

ＥＩＡ測定操作法は、抗体結合チューブに１５０ｍＭ塩
化ナトリウム、０．２５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ　２０．０，１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０、以下反応緩衝液という）
０．４ｄおよび反応緩衝液で希釈したインスリン標準品
またはサンプル０．１ｍを添加し室温で１〜２時間振と
うした後、さらに酵素標識抗体０、１／を添加し室温で
２〜４時間振とうする。

反応液を除去し、０．００５％塩化ベンザルコニウムを
含む２０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐｆ−１８，０＞　
３ｍｅで３回チューブを洗浄する。０．３％０−フェニ
レンジアミン、０．０１５％過酸化水素を含むリン酸ク
エン酸溶液（ｐｌ−１６，０）　　０．５７を加え、暗
所にて１時間放置後、４Ｎ硫酸１Ｗ１ｆ！で反応を停止
させ、４９２　ｎ　ｍにおける吸光度を測定した。

その結果を生物活性が保持されている未知１度のヒトイ
ンスリンを実施例１で示した方法で測定した結果と対比
したところ、第２図に示すように両者の測定値の相関関
係は良好であることが確認された。

〔発明の効果〕

本発明の測定法は、従来のバイオアッセイに比べて簡便
性、測定感度および精度において非常に優れている上に
、従来のバイオアッセイの値と同じくインスリン生物活
性を測定できるという効果を有する。

また、本発明の測定法にはＲＩＡおよびＥＩＡとは操作
性において同等以上で、しかもそれらの欠点であるイン
スリン生物活性の測定を行うことができるという利点が
あり、リガンドとレセプターとの結合を利用した測定法
であるＲＲＡに対してもその欠点であるレセプターと結
合しても作用しない物質には反応しないことから真の生
物活性を測定できるという利点を持っている。

さらに、ＲＩＡ、ＥＩＡおよびＲＲＡ等の操作時間は、
一般的に汎用されているＥＩＡにおいても３時間から２
４時間以上を要するのに対し、本発明の測定法には短時
間で測定できるという利点もある。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の測定で得られた［３Ｈ］２−デオキ
シ−Ｄ−グルコースの取り込み量と生物活性を有するイ
ンスリン量の関係を示す標準曲線図であり、第２図は本
発明の測定法とＥＩＡによる生物活性を示すインスリン
の定量値の相関性を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１、検体にインスリンレセプター及びインスリン依存性
グルコーストランスポーターを発現している細胞と標識
された糖類とを反応させ、該細胞内にとり込まれるか又
は／及び該細胞膜に付着した標識の量を測定することを
特徴とするインスリン生物活性の測定方法。２、インス
リンレセプター及びインスリン依存性グルコーストラン
スポーターを発現している細胞が遺伝子工学的手法によ
り得られた培養細胞又は生物から採取した脂肪細胞もし
くは骨格筋細胞である請求項１記載のインスリン生物活
性の測定方法。３、遺伝子工学的手法により得られた培養細胞がＣＨＯ
−ＨＩＲ３である請求項１記載のインスリン生物活性の
測定方法。４、標識された糖類が［＾３Ｈ］２−デオキシ−Ｄ−グ
ルコース又はピルジルアミノグルコースである請求項１
記載のインスリン生物活性の測定方法。５、インスリンレセプター及びインスリン依存性グルコ
ーストランスポーターを発現している細胞と標識された
糖類とからなるインスリン生物活性測定用キット。