DK171845B1 - Tripeptidderivater og fremgangsmåde til fremstilling af samme samt fremgangsmåde til bestemmelse af serinproteaser eller komponenter, der kan samvirke med serinproteaser - Google Patents

Description

i DK 171845 B1

Teknisk område

Den foreliggende opfindelse angår nye tripeptidderivater, der er anvendelige til bestemmelse af serinproteaser. De nye derivater er 5 særligt egnede til bestemmelse af faktor X. (E.C.3.4.21.6) eller til undersøgelser af reaktioner, ved hvilke der dannes FX_, FX, hæmmes eller forbruges, hvilket gør det muligt at kvantificere andre enzymer og/eller inhibitorer, der deltager i reaktionerne.

10 Opfindelsens baggrund

Faktor X, er en nøglesubstans i den reaktionskaskade, der fører til d blodets koagulation. Adskillige metoder, der er baseret på bestemmelsen af FX, med kromogene substrater, har vist sig at være d 15 værdifulde ved den kliniske diagnosticering og forklaring af forstyrrelser i blodkoagulationssystemet (Hemker H.C. - Handbook of Synthetic Substrates, 1983, Martinus Nijhoff Publishers, Boston).

Teknikkens standpunkt 20

Kromogene tetrapeptidderivater er beskrevet af Aurell, L., et al. (Haemostasis vol. 7, 1978, 92-94) og har vist sig at være af betydelig værdi i det foreliggende tilfælde. Disse substrater er baseret på aminosyresekvensen (-Ile-Glu-Gly-Arg-), som går forud for spalt-25 ningsstederne i det naturlige substrat, prothrombin. Tetrapeptidsub-straterne er karakteriseret ved høj selektivitet, dvs. at andre enzymer, navnlig thrombin, forstyrrer ikke bestemmelsen af faktor X,.

α

Den begrænsede opløselighed og de mange syntesetrin ved fremstillingen udgør imidlertid væsentlige ulemper. I beskrivelsen til EP 30 34.122 er det beskrevet, at også tripeptidderivater kan være anvendelige som FX -substrater. Disse tripeptider er imidlertid også α følsomme over for thrombin, og tetrapeptidernes høje selektivitet opnås ikke med disse tripeptider.

35 I EP 170.797 beskrives der forbindelser, som adskiller sig fra ' ' forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse derved, at D-Arg er substitueret med D-Lys. Den opfinderiske idé ifølge EP 170.797 udgøres af en ny markør, nemlig 3-carboxy-4-hydroxyanilid, som kromogen gruppe. Den bedste forbindelse blandt de 1 EP 170.797 DK 171845 B1 2 beskrevne substrater (PS 2000) udviser en lavere aktivitet i sammenligning med S-2222. Substraterne ifølge nærværende opfindelse udviser en 6-13 gange højere aktivitet i sammenligning med S-2222 over for FXa.

5

Beskrivelse af opfindelsen

Tripeptidderivaterne Ifølge den foreliggende opfindelse udviser høj følsomhed og opløselighed samtidig med selektivitetsegenskaber, der 10 er sammenlignelige med dem for de tidligere beskrevne tetrapeptider. Tripeptidderivaterne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de har den almene formel:

Rj - X - D-Arg - A - Arg - NH - R2 15 hvor Rj betegner hydrogen, en a- eller Ø-naphthylrest, en lavere al kyl rest, som kan være substitueret med en carboxylgruppe, en usub-stitueret eller substitueret phenyl- eller phenyl al kyl rest, hvorhos alkylgruppen har 1 til 4 carbonatomer, substitutionen fortrinsvis er 20 i paraposition i phenyl ri ngen, og substituenterne er lavere al kyl, lavere alkoxy, halogen eller en nitrogruppe; 0 0 0 NN« X betegner -0-C-, -C-, -S- eller en enkeltbinding på den betingelse, 25 at

N

0 når Rj er hydrogen, da, og kun da er X en enkeltbinding; 3q A betegner Gly eller Sar;

Rg betegner en aromatisk eller heterocyklisk rest, som sammen med -NH-gruppen ved enzymatisk hydrolyse af tripeptidet giver forbindelsen R2-NH2, som kan bestemmes kvantitativt i kraft af sine 35 kromogene, fluorogene eller elektrokemi ske egenskaber; eller di- og tri sal te af uorganiske eller organiske syrer heraf.

Forbindelserne R2-NH2 er tidligere kendte forbindelser med kromogene, fluorogene eller elektrokemi ske egenskaber, som muliggør DK 171845 B1 3 kvantificering af serinproteaser ved bestemmelse af afspaltet markør, direkte eller efter derivatisering (Hemker H.C., loc. cit. og de deri omtalte referencer).

5 Eksempler på forbindelserne Rg-NHg er: p-nitroanilin, 3-carboxy-4-hydroxyan1lin, 3-sulfo-4-nitroanil1n, 3-alkoxy-4-nitroanilin, 3-carboxy-4-nitroanilin, 4-methoxy-/J- naphthylami n, 4-(N-ethyl-N-hydroxyethyl) ami noani1 i n, 5-ami no-i so- 10 phthalsyredimethylester, 5-amino-8-nitroquinolin, 7-amino-4-tr1- fluormethylcoumarin, 7-amino-4-methylcoumarin og 4-aminodiphenyl-amin.

De nye derivater, der indeholder to aminosyrer med stærkt basisk 15 sidekæde, kan danne disalte eller, når Rj er hydrogen, trisalte med uorganiske eller organiske syrer. Foretrukne salte er disalte af uorganiske eller organiske syrer, eftersom de har en høj vandopløse-lighed. Særligt foretrukne salte er hydrochlorider.

20 Ved bestemmelsen finder spaltningen af substraterne med de behørige enzymer sted på carboxylsiden af arginin i l-forra, hvorfor det N-terminale arginin må foreligge som D-isomer. Overraskende har den ved biologisk pH negativt ladede eller neutrale lipofile del af tetrapeptidsubstratet kunnet udbyttes med en positivt ladet, stærkt 25 basisk aminosyre under bibeholdelse af høj selektivitet og øget følsomhed.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til bestemmelse af serinproteaser, navnlig faktor Xa, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig 30 ved, at der anvendes et peptidderivat ifølge opfindelsen.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til bestemmelse af komponenter, der kan samvirke med serinproteaser eller zymogene former heraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der 35 anvendes et peptidderivat ifølge opfindelsen.

Oe nye faktor X -substrater udgør med deres følsomhed, høje op- 4 løselighed og gode selektivitet et værdifuldt tillæg til de DK 171845 B1 4 eksisterende diagnostiske analysemetoder, der er baseret på bestemmelse af faktor X.. En god selektivitet er et vigtigt kriterium ved bestemmelse af FX. i plasma, eftersom der ellers er risiko for påvirkning fra thrombin, som kan være til stede fra begyndelsen 5 eller kan dannes under analysen. Eksempler på vigtige anvendelser er bestemmelsen af FX. i humanplasma efter aktivering med en protease β fra Russel's Viper Venom (RVV-X) af antifaktor X., af heparin og af α FVIIIrC ved haemophilia (Hemker H.C., loc. cit., S. Rosén, Scand. J. Heamatol. Suppl. 40, vol. 33, 1984, 139-145). Særligt vigtige an-10 vendelser er analyser 1 forbindelse med antikoagulationsbehandlinger med lavmolekyl vægtige heparinfraktioner, hvor traditionelle blodstørkningsbaserede metoder ikke kan anvendes (Walenga J.M. et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol. 11, nr. 2, 1985, 100-107). Specifikt inkluderet er metoder, der hviler på bestemmelsen af 15 FXa-aktivitet, og som anvendes til direkte bestemmelse af FX og FXa eller til den direkte bestemmelse af FVII, FVII , FVIIIrC, FVIIIrC,, FIX, FIX., antithrombin III, blodpladefaktor 4, heparin, lavmole-kylvægtige hepariner og heparinoider. De nye substraters egenskaber gør dem særligt egnede til anvendelse i automatiske analyseappa-20 rater.

Opfindelsen angår endelig en fremgangsmåde til fremstilling af tri peptidderivaterne ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der udføres en trinvis syntese ved kobling til 25 Arg, som har en -NH-Rg-gruppe eller en fjernelig carboxyl beskyttende gruppe, som derpå udskiftes med -NH-Rg, eller ved kobling af Rj-X-D-Arg-A til Arg-NH-R2·

Beskrivelse af syntese 30

Ved syntese af de nye FX -substrater anvendes de inden for peptidkemien sædvanligt benyttede beskyttelsesgrupper og koblingsmetoder (M. Bodansky: "Principles of Peptide Syntesis", Springer Verlag 1984), f.eks. trinvis addition af aminosyrer til den med en 35 markør forsynede C-terminale aminosyre eller syntese af det N-terminale peptidfragment, som derpå kobles til den med en markør forsynede C-terminale aminosyre.

Anvendelige aminobeskyttelsesgrupper er benzyloxycarbonyl-, 9- DK 171845 B1 5 fluorenyl-methyloxycarbonyl- eller t-butyloxycarbonylgrupper. Til beskyttelse af guanidinogruppen 1 arginin anvendes protonlsering, en ni trobeskyttelsesgruppe eller en p-toluensulfonylbeskytte!sesgruppe. Koblingen mellem aminosyrerne udføres ved aktivering af a-carboxyl-5 gruppen (f.eks. med aktive estre, symmetriske eller asymmetriske an-hydrider, azid, DCCI eller tilsvarende reagenser).

Opfindelsen vil 1 det følgende blive beskrevet mere detaljeret i form af udførelseseksempler, som viser fremstillingen af forskellige 10 substrater ifølge opfindelsen. Oprensning af mellemprodukter og slutprodukter udføres ved precipitation, krystallisation eller gel fil treringskromatografi. De rensede slutprodukter frysetørres. Præfremstillede glasplader af silicagel anvendes til TLC-analyse. Efter udført kromatografi undersøges pladerne i UV-lys 15 (254 nm) og fremkaldes derpå med ninhydrin samt med chlor/di- carboxidinreagens. De anførte R^-værdier er resultatet af enkelt-kromatografier.

De til TLC anvendte opløsningsmiddel systemer er anført i neden-20 stående tabel.

Betegnelse Opløsninasmiddelsystem Volumenforhold A - n-butanol: AcOH: vand (3:2:1)

Pa6 - chloroform: MeOH: AcOH: vand (34:4:9:2) 25 M n-butanol: AcOH: vand: pyridin (15:3:12:10) "3" - EtOAc: AcOH: vand: pyridin (30:6:11:20) HPLC-analyse blev udført på en Merck RP kolonne ( Hibar LiChra-Cart) med 40% MeOH i 0,5% triethylaminophosphat, pH - 2,35, som elu-30 eringsmiddel (1 ml/min). Den optiske aktivitet af slutprodukterne bestemmes ved 589 nm 1 50% eddikesyre ved en koncentration på 0,4-1,0 g/100 ml og +25*C.

De nedenfor anførte forkortelser har følgende betydning (IUPAC-35 betegnelser er blevet anvendt, hvor sådanne foreligger):

Aminosyrer:

Arg - arginin D-Arg - D-arginin DK 171845 B1 6

Gly = glycin

Sar = sarcosin (N-methylglycin)

Alle aminosyrer i substraterne har L-konfiguration, hvis andet ikke 5 er anført.

Den frie aminosyre eller det frie peptid er angivet ved H- i den N-terminale gruppe og med -OH i den carboxyl terminale gruppe. Amino-gruppen er altid anført til venstre og carboxyl gruppen til højre.

10

Forkortelser Ac = acetyl

AcOH = eddikesyre AMC = 7-amino-4-methylcoumarin 15 Boc * t-butyloxycarbonyl

Bs * benzensulfonyl

Bz = benzoyl

Bzls = benzyl sulfonyl CHA = 3-carboxy-4-hydroxyanilid 20 4-ClBs = 4-chlorbenzensulfonyl DCCI = dicyclohexylcarbodiimid DCU = dicyclohexyluri nstof DMF = dimethyl formamid

Eoc = ethyloxycarbonyl 25 EtOAc = ethyl acetat

EtOH = ethanol

Et^N = triethylamin

Ets = ethansulfonyl HOBT = 1-hydroxybenzotriazol 30 HPLC = højeffektiv væskekromatografi I = ionstyrke

Mbs = 4-methoxybenzensulfonyl

MeOH = methanol

Mes = methansulfonyl 35 Moz = 4-methoxybenzyloxycarbonyl 4-Nbs = 4-nitrobenzensulfonyl NEM = 4-ethylmorpholin 4-Nz = 4-nitrobenzyloxycarbonyl

Ns = Ø-naphthalensulfonyl DK 171845 B1 7 ONp « p-nitrophenylester pNA - p-nitroanilin

Sue « succinyl TFA « tri fluoreddikesyre 5 TLC - tyndtlagskromatografi

Tos p-toluensulfonyl

Tris « tri s(hydroxymethylJaminomethan Z - benzyloxyearbonyl 10 Udføre!seseksempi er

Eksempel 1

Not-Z-D-Ara-Glv-Ara-pNA»2 HC1 Molekylvægt - 714,62 15 la) Boc-G1v-Ara-pNA»HBr Molekylvægt - 532,40 43 mmol H-Arg-pNA»2HBr, der var opløst i 120 ml DMF, blev neutraliseret koldt (-10 * C) med Et^N. Det dannede Et3N«HBr blev 20 frafiltreret, hvorefter der blev tilsat 43 mmol Boc-Gly-OH, 45 mmol HOBT og 50 mmol DCCI. Reaktionen fortsættes koldt under omrøring i 1 time og derefter ved stuetemperatur natten over. Det dannede DCU frafiltreres, og opløsningen inddampes 1 vakuum til en olie, som opløses 1 160 ml EtOAc, vaskes med 2% NaHCOj, HgO, 2% KHS04 og HgO.

25 Efter tørring med Na2S04 inddampes EtOAc-fasen og præcipiteres med di ethyl ether.

Udbytte: 71% TLC: Rf - 0,23 (Pa6).

30 lb) H-Glv-Arg-pNA»TFA«HBr Molekylvægt - 546,36 55 ml TFA sættes til 30 mmol Boc-Gly-Arg-pNA»HBr (fremstillet ifølge eksempel la), der var opløst i 55 ml methylenchlorid. Blandingen 35 omrøres i 30 minutter ved stuetemperatur og præcipiteres derefter med diethyl ether.

Udbytte: -100% TLC: Rf - 0,28 (A).

1. Ntt-Z-D-Ara-G1v-Arq-pNA«2HC1 Molekylvægt = 714,62 DK 171845 B1 8 2,5 mmol Z-D-Arg-OH»HCl, 3 mmol HOBT og 3 mmol DCCI sættes til 2,5 mmol H-Gly-Arg-pNA*TFA«HBr (fremstillet ifølge eksempel Ib), som er 5 opløst i 25 ml DMF, og neutraliseres koldt (-10*C) med Et^N.

Blandingen omrøres koldt i 1 time og derefter 48 timer ved stuetemperatur. Det dannede DCU frafiltreres, og opløsningen inddampes i vakuum til en olie, 30 ml vand tilsættes og opløsningen vaskes med 10 2x20 ml EtOAc. Den vandige fase inddampes i vakuum, produktet ion- p byttes på en Sephadex QAE-25 søjle i chloridform med 50% EtOH som p elueringsmiddel og renses på en Merck Lobar præpakket kolonne p (LiChroprep . RP-8-B) med 30% MeOH som elueringsmiddel (2ml/min) ved afslutningen. Det rensede produkt frysetørres.

15

Udbytte: 37% TLC: Rf - 0,11 (Pa6) HPLC: 98,5% renhed [er] - -18, Γ (c - 0,5%) 20

Eksempel Z

Ntt-Boc-D-Ara-G1v-Ara-pNA»2HC1 Molekylvægt - 680,59 25 2,5 mmol H-Gly-Arg-pNA»TFA*HBr og 2,5 mmol Boc-D-Arg-OH»HCl be handles med samme koblingsfremgangsmåde og under samme reaktionsbetingelser som i eksempel 1.

Udbytte: 35% 30 TLC: Rf - 0,55 (M) HPLC: 96% renhed [er] - -25,5* (c - 0,4%)

Eksempel 3 35 H-D-Aro-Glv-Ara-pNA»3HCl Molekylvægt - 616,96 22 ml TFA sættes til 12 mmol Na-Boc-D-Arg-Gly-Arg-pNA*2HCl (fremstillet ifølge eksempel 2), som er opløst i 22 ml DK 171845 B1 9 methylenchlorid. Blandingen omrøres i 30 minutter ved stuetemperatur og præcipi teres derefter med di ethyl ether. Produktet ionbyttes og renses på samme måde som i eksempel 1.

5 Udbytte: 38% TLC: Rf - 0,30 (M) HPLC: 98% renhed [a] - -62,4* (c - 0,5%) 10 Eksempel 4

Nft-Ets-D-Arq-G1v-Arq-pNA»2HCl Molekylvægt 672,62 0,5 mmol ethansulfonylchlorid og 80 øl EtgN sættes til 0,5 mmol 15 H-D-Arg-Gly-Arg-pNA»3HCl (fremstillet ifølge eksempel 3), som er opløst i 10 ml DMF og neutraliseret koldt (-10*C) med 80 μΐ Et^N. Reaktionen fortsættes koldt under omrøring i 1 time og i 2 timer ved stuetemperatur. Blandingen inddampes i vakuum. Produktet ionbyttes og renses på samme måde som i eksempel 1.

20

Udbytte: 44% TLC: Rf - 0,5 (M) HPLC: 97% renhed [er] - -15,6* (c - 0,65%) 25

Eksempel 5

Nft-Bs-D-Arq-Glv-Arq-pNA»2HCl Molekylvægt - 720,66 30 0,5 mmol H-D-Arg-Gly-Arg-pNA*3HCl (fremstillet ifølge eksempel 3) og 0,5 mmol benzensulfonylchlorid behandles på samme måde og under samme reaktionsbetingelser som 1 eksempel 4.

Udbytte: 37% 33 TLC: Rf - 0,53 (M) HPLC: 98% renhed [a] « +11,6* (c - 0,45%)

Ntt-4-Nz-D-Aro-Glv-Arq-pNA«2HC1 Molekylvægt « 759,64 DK 171845 B1

Eksempel 6 10 5 0,5 mmol H-D-Arg-Gly-Arg-pNA*3HCl (fremstillet ifølge eksempel 3) og 0,5 mmol 4-nitrobenzyloxycarbonylchlorid behandles på samme måde og under samme reaktionsbetingelser som i eksempel 4.

Udbytte: 57% 10 TLC: Rf - 0,3 (A) HPLC: 99% renhed [a] - -20,2*C (c - 0,45%)

Eksempel 7 15

Ntt-4-Nbs-D-Arq-Glv-Arq-pNA«2HCl Molekylvægt « 765,66 0,5 mmol H-D-Arg-Gly-Arg-pNA»3HCl (fremstillet ifølge eksempel 3) og 0,5 mmol 4-nitrobenzensulfonylchlorid behandles på samme måde og 20 under samme reaktionsbetingelser som i eksempel 4.

Udbytte: 25% TLC: Rf - 0,28 (A) HPLC - 97% renhed 25 [a] - -0,8* (c - 0,6%)

Eksempel 8 N0f-Tos-D-Arg-G1v-Arq-pNA»2HC1 Molekylvægt * 734,69 30 0,5 mmol H-D-Arg-Gly-Arg-pNA»3HCl (fremstillet ifølge eksempel 3) og 0,5 mmol p-toluensulfonylchlorid behandles på samme måde og under samme reaktionsbetingelser som i eksempel 4.

35 Udbytte: 45% TLC: Rf - 0,25 (A) HPLC: 98% renhed [<*] - +23,Γ (c - 0,45%)

Ntt-Moz-D-Aro-Glv-Arq-pNA»2HCl Molekylvægt - 744,66 DK 171845 B1

Eksempel 9 11 5 0,5 mmol H-D-Arg-Gly-Arg-pNA*3HCl (fremstillet ifølge eksempel 3) og 0,5 mmol 4-methyloxybenzyloxycarbonylazid behandles på samme måde og under samme reaktionsbetingelser som i eksempel 4.

Udbytte: 31% 10 TLC: Rf - 0,22 (A) HPLC: 97% renhed [or] - -15,9* (c - 0,4%)

Eksempel 10 15

Ntt-Mbs-D-Arq-Glv-Ara-pNA»2HCl Molekylvægt - 750,69 0,5 mmol H-D-Arg-Gly-Arg-pNA*3HCl (fremstillet ifølge eksempel 3) og 0,5 mmol 4-methoxybenzensulfonylchlorid behandles på samme måde og 20 under samme reaktionsbetingelser som i eksempel 4.

Udbytte: 45% TLC: Rf « 0,31 (A) HPLC: 99% renhed 25 [a] - +22,8* (c - 0,4%)

Eksempel 11

Na-4-ClBs-D-Aro-Glv-Ara-nNA«2HC1 Molekylvægt * 755,12 30 0,5 mmol H-D-Arg-Gly-Arg-pNA»3HCl (fremstillet ifølge eksempel 3) og 0,5 mmol 4-chlorbenzensulfonylchlorid behandles på samme måde og under samme reaktionsbetingelser som i eksempel 4.

35 Udbytte: 31% TLC: Rf - 0,38 (A) HPLC: 99% renhed [or] - +10,9* (c - 0,4%)

Eksempel 12

Ntt-Ns-D-Ara-61v-Ara-DNA»2HCl Molekylvægt - 770,73 DK 171845 B1 12 5 0,5 mmol H-D-Arg-Gly-Arg-pNA»3HCl (fremstillet ifølge eksempel 3) og 0,5 mmol /i-naphthalensulfonylchlorid behandles på samme måde og under samme reaktionsbetingelser som i eksempel 4.

Udbytte: 25% 10 TLC: Rf - 0,29 (A) HPLC: 99% renhed [a] = -21,5* (c « 0,4%)

Eksempel 13 15

Ntt-Z-D-Ara-Glv-Ara-AMC»2HCl Molekylvægt - 751,70 2 mmol Z-D-Arg-Gly-0H*HC1, 2,5 mmol HOBT og 2,5 mmol DCCI sættes til 2 mmol H-Arg-AMC»2HC1, som er opløst i 30 ml DMF og neutraliseret 20 koldt (-10*C) med Et^N. Reaktionen udføres koldt under omrøring i 1 time og derefter i 24 timer ved stuetemperatur. Det dannede DCU frafiltreres og inddampes i vakuum til en olie, der ionbyttes og renses på samme måde som i eksempel 1.

25 Udbytte: 39% TLC: Rf = 0,7 ("3") HPLC: 99% renhed [a] - -28,6* (c - 0,5%) 30 Eksempel 14

Ntt-Ac-P-Arg-Gly-ArQ-pNA*2HCl Molekylvægt * 622,54 0,5 mmol H-D-Arg-Gly-Arg-pNA»3HCl (fremstillet ifølge eksempel 3) og 35 0,5 mmol eddikesyreanhydrid behandles på samme måde og under samme reaktionsbetingelser som i eksempel 4.

Udbytte: 43% TLC: Rf « 0,45 (M) DK 171845 B1 13 HPLC: 97% renhed [a] - -27,9* (c - 0,4%)

Eksempel 15 5

Ntt-Suc-D-Arq-Glv-Arg-pNA«2HC1 Molekylvægt « 680,57 0,5 mmol H-D-Arg-Gly-Arg-pNA»3HCl (fremstillet ifølge eksempel 3) og 0,5 mmol ravsyreanhydrid behandles på samme måde og under samme 10 reaktionsbetingelser som 1 eksempel 4.

Udbytte: 40% TLC: Rf - 0,23 (A) HPLC: 98% renhed 15 [a] - -21,4* (c - 0,5%)

Eksempel 16

Ntt-Bzls-D-Arg-GIv-Aro-pNA»2HC1 Molekylvægt - 734,69 20 0,5 mmol H-D-Arg-Gly-Arg-pNA»3HCl (fremstillet ifølge eksempel 3) og 0,5 mmol benzyl sulfonylchlorid behandles på samme måde og under samme reaktionsbetingelser som i eksempel 4.

25 Udbytte: 38% TLC: Rf - 0,26 (A) HPLC: 98% renhed [a] - -7,8* (c - 0,4%) 30 Eksempel 17

Na-Bz-D-Arq-Glv-Arq-pNA»2HCl Molekylvægt - 684,61 17a) Z-Glv-Arg(0^)-pNA Molekylvægt - 530,51 35 0,35 mol H-Arg-fNOgJpNA'HBr, som er opløst i 750 ml DMF, neutraliseres koldt (-10*C) med Et^N. Det dannede EtjN*HBr frafiltre-res, hvorefter 0,35 mol Z-Gly-OH, 0,35 mol HOBT og 0,38 mol DCCI tilsættes. Reaktionen udføres koldt under omrøring i 1 time og DK 171845 B1 14 derefter ved stuetemperatur natten over. Det dannede DCU frafi Ureres og opløsningen inddampes i vakuum til en olie, som behandles med 3x400 ml 2% NaHCO^ og 500 ml vand. Produktet rekrystalliseres fra 3,5 1 MeOH.

5

Udbytte: 80% TLC: Rf - 0,6 (Pag) 17b) H-Glv-ArqfNO^l-pNAtHCl Molekylvægt - 432,72 10 0,3 mol Z-Gly-Arg(N02)-pNA (fremstillet ifølge eksempel 17a) suspenderes i 630 ml AcOH. 415 ml 5,6 M HBr in AcOH tilsættes under omrøring. Blandingen omrøres i 45 minutter ved stuetemperatur og udhældes 1 7,5 1 tør diethylether under omrøring. Præcipitatet fi 1 -15 treres, vaskes med diethylether og tørres i vakuum.

Udbytte: 90% 3 g af produktet ionbyttes på samme måde som i eksempel 1.

20

Udbytte: 73% TLC: Rf - 0,15 (Pag) 17c) Ntt-Boc-D-Arq(N02)-Glv-Arq(N02l-DNA Molekylvægt * 697,69 25 4 mmol H-Gly-Arg(N02)-pNA»HCl (fremstillet ifølge eksempel 17b), som er opløst 1 25 ml DMF, neutraliseres koldt (-10*C) med Et^N. Det dannede Et^HCl fraf i 1 treres, hvorefter 4 mmol or-Boc-D-Arg(N02)-OH, 4 mmol HOBT og 4,2 mmol DCCI tilsættes. Reaktionen udføres koldt 30 under omrøring i en time og derefter ved stuetemperatur natten over.

Det dannede DCU frafiltreres, og opløsningen inddampes i vakuum til en olie, som suspenderes med 2% NaHCO^, vand, 2% KHSO^, vand og diethylether.

35 Udbytte: 73% TLC: Rf - 0,32 (Pag) 17d) H-D-Ara(N0,l-G1v-Ara(N(L)-DNA»HC1 Molekylvægt - 634,04 DK 171845 B1 15 3 mmol I^-Boc-D-Arg-iNOgJ-Gly-ArgtlM^J-pNA (fremstillet ifølge eksempel 17c), suspenderes i 11 ml AcOH, 11 ml TFA tilsættes, og 5 blandingen omrøres i 4 timer ved stuetemperatur. Produktet præcipi-teres med diethylether og ionbyttes på samme måde som i eksempel 1.

Udbytte: 72% TLC: Rf - 0,61 (M) 10 17e) Ntt-Bz-D-Arq(N02)-G1y-Arq(N02)-pNA Molekylvægt - 701,68 0,6 mmol benzoesyreanhydrid og 70 μΊ EtgN sættes til 0,5 mmol H-D-ArgiNOgJ-Gly-ArgiNOgJ-pNA’HCl (fremstillet ifølge eksempel 17d), 15 som er opløst i 20 ml DMF og neutraliseret koldt (-10*C) med 70 μΐ EtgN. Reaktionen udføres koldt under omrøring i 1 time og derefter i 2 timer ved stuetemperatur. Opløsningen inddampes i vakuum og præci-piteres med vand. Produktet suspenderes med 30 ml varm MeOH, filtreres og tørres.

20

Udbytte: 68% TLC: Rf - 0,31 (Pa6) 17. Ntt-Bz-D-Arq-Glv-Arq-pNA«2HC1 Molekylvægt * 684,61 25 0,35 mmol N^Bz-D-ArgiNOgJ-Gly-ArgJNOgJ-pNA (fremstillet ifølge eksempel 17e) afbeskyttes ved omsætning med 15 ml tør HF i nærværelse af 0,5 ml anlsol i et egnet apparat ifølge Sakakibara (S. Sakaki-bara et al., Bull. Chem. Soc., Japan, vol. 240, s. 7164-67, 1967) i 30 60 minutter ved 0*C. Efter at reaktionen er afsluttet, afdestilleres al HF, og råproduktet ionbyttes og renses på samme måde som i eksempel 1.

Udbytte: 36% 35 TLC: Rf - 0,55 (M) HPLC: 98% renhed [a] - -24,4* (c - 0,6%)

Ntt-Eoc-D-Ara-Glv-Ara-oNA«2HC1 Molekylvægt - 652,57 DK 171845 B1

Eksempel 18 16 5 18a) Ntt-Eoc-D-Åra(N0,.l-G1y-Arq(NCU-PNA Molekylvægt - 669,63 0,6 mmol ethylchlorformlat og 70 μΐ EtgN sættes til 0,5 mmol H-D-ArgiNOgJ-Gly-ArgiNOgJ-pNA'HCl (fremstillet ifølge eksempel 17d), som er opløst i 20 ml DMF og neutraliseret koldt (-10*0) med 70 μΐ 10 EtjN. Reaktionen forsættes koldt under omrøring i 1 time og derefter i 2 timer ved stuetemperatur. Blandingen inddampes i vakuum og præ-cipi teres med vand, filtreres og vaskes med vand og di ethyl ether.

Udbytte: 89% 15 TLC: Rf - 0,26 (Pag) 18. Ntt-Eoc-D-Aro-Glv-Arq-pNA«2HC1 Molekylvægt - 652,57 0,45 mmol Na-Eoc-D-Arg(N02)-Gly-Arg(N02)-pNA (fremstillet ifølge 20 eksempel 18a) afbeskyttes ved omsætning med 20 ml tør HF i nærværelse af 0,5 ml anisol på samme måde som i eksempel 17.

Udbytte: 41% TLC: Rf - 0,55 (M) 25 HPLC: 98% renhed [or] - -25,2* (c - 0,35%)

Eksempel 19 30 N0f-Mes-D-Arq-Glv-Arq-pNA«2HCl Molekylvægt - 658,60 19a) Ntt-Mes-D-Aro(NO:l-Glv-Arq(NQ2l-DNA Molekylvægt - 675,66 0,5 mmol H-D-ArgiM^J-Gly-ArgiM^-pNA^HCl (fremstillet ifølge 35 eksempel 17d), som er opløst i 20 ml DMF og 0,6 mmol methansulfonyl-chlorid behandles på samme måde og under samme reaktionsbetingelser som i eksempel 17e.

Udbytte: 70% DK 171845 B1 17 TLC: Rf - 0,47 (A) 19. Ntt-Mes-D-Arg-Glv-Arq-pNA« 2HC1 Molekylvægt - 658,60 5 0,35 mmol Ntt-Mes-D-Arg(N02)-Gly-Arg(N02)-pNA (fremstillet Ifølge eksempel 19a) afbeskyttes og renses på samme mide som i eksempel 17.

Udbytte: 43,5% TLC: Rf - 0,48 (M) 10 HPLC: 97% renhed [or] - 17,6* (c - 0,5%)

Eksempel 20 15 Nft-Z-D-Aro-Sar-Aro-pNA»2HCl Molekylvægt » 728,66 20a) H-$ar-Arq-pNA.2HCl Molekylvægt « 438,33 5 mmol Boc-SarOH, 5 mmol HOBT og 6 mmol DCCI sættes til 5 mmol 20 H-Arg-pNA»2HCl, som er opløst i 25 ml DMF og neutraliseret koldt (-10eC) med Et^N. Blandingen omrøres koldt i 1 time og derefter ved stuetemperatur natten over. Det dannede DCU frafiltreres og opløsningen inddampes i vakuum til en olie, som opløses i 100 ml n-butanol, vaskes med 2% NaHCOj, H20, 2% KHSO^ og H20. Efter tørring 25 med Na2S0^ inddampes n-butanolfasen og præcipiteres med diethyl-ether. Præcipitatet filtreres, vaskes med diethylether og tørres. Substansen suspenderes i 25 ml HCl-opløsning (1,5 M i AC0H) og omrøres i 2 timer ved stuetemperatur, præcipiteres med diethylether og ionbyttes pi samme måde som i eksempel 1.

30

Udbytte: 63,5% TLC: Rf - 0,15 (A) 20. Ntt-Z-D-Arq-Sar-Arq-pNA«2HCl Molekylvægt - 728,66 35 3 mmol Z-D-ArgOH*HCl, 3 mmol HOBT og 3,5 mmol DCCI sættes til 3 mmol Sar-Arg-pNA»2HCl (fremstillet ifølge eksempel 20a), som er opløst i 30 ml DMF og neutraliseret koldt (-10*C) med EtjN. Blandingen omrøres koldt i 1 time og derefter i 72 timer ved stuetemperatur.

DK 171845 B1 18

Det dannede DCU frafiltreres og opløsningen Inddampes 1 vakuum. Produktet ionbyttes og renses på samme måde som i eksempel 1.

Udbytte: 43% 5 TLC: Rf - 0,2 (A) HPLC: 99% renhed [a] - -24,7* (c - 0,55%)

Eksempel z\ 10

Ntt-Z-D-Arq-Glv-Ara-CHA»2HC1 Molekylvægt - 729,65 21a) Boc-Ara-CHA.HCl 15 3,2 mmol 1sobutylchlorform1at sættes til 3,0 mmol Boc-Arg-CHA»HCl, som er opløst i 10 ml DMF og neutraliseret koldt (-10*C). Reaktionsblandingen omrøres koldt i 15 minutter, og en blanding af 3 mmol 3-carboxy-4-hydroxyanilin, 3 mmol NEM og 10 ml DMF tilsættes. Reaktionen fortsættes koldt under omrøring i 2 timer og derefter ved 20 stuetemperatur natten over. Opløsningen inddampes i vakuum til en olie. Der tilsættes 50 ml n-butanol, og blandingen omrøres i 3 timer ved stuetemperatur. Det dannede Boc-Arg-CHA»HCl frafiltreres.

Udbytte: 50% 25 TLC: Rf - 0,5 (A) 21b) Boc-Aro-CHA«HCl Molekylvægt - 382,25 8 ml 2N HC1 in AcOH sættes til 2 mmol Boc-Gly-Arg-CHA*HCl. Reak-30 tionen forløber i 45 minutter ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen inddampes 1 vakuum til en olie, der opløses i isopropanol og præcipi teres med EtOAc.

Udbytte: 97% 35 TLC: Rf - 0,15 (A) 21c) Boc-Glv-Arq-CHA«HCl Molekylvægt 502,95 2 mmol H-Arg-CHA*2HC1, som er opløst 1 12 ml DMF, neutraliseres DK 171845 B1 19 koldt (-10*C) med NEM, hvorefter 2,1 mmol Boc-Gly-ONp tilsættes. Reaktionen fortsættes koldt under omrøring i 1 time og derefter ved stuetemperatur natten over. Opløsningen inddampes i vakuum til en olie, som opløses i 10 ml MeOH og præcipiteres med EtOAc.

5

Udbytte: 88% TLC: Rf - 0,4 (A) 21d) H-Glv-Aro-CHA«2HC1 Molekylvægt - 439,30 10 10 ml 2N HC1 in AcOH sættes til 2 mmol Boc-Gly-Arg-CHA*HCl. Reaktionsblandingen omrøres i 45 minutter ved stuetemperatur og præcipiteres derpå med EtOAc.

15 Udbytte: 98% TLC: Rf - 0,15 (A) 21. Ntt-Z-D-Arq-Glv-Ara-CHA»2HC1 Molekylvægt - 729,65 20 1 mmol H-Gly-Arg-CHA«2HC1, som er opløst i 10 ml DMF, neutraliseres koldt (-10*C) med NEM, hvorefter der tilsættes 1,1 mmol Z-D-Arg-0Np»HN03. Reaktionen fortsættes koldt under omrøring i en time og derefter i 2 timer ved stuetemperatur. Opløsningen inddampes i vakuum til en olie, som præcipiteres med EtOAc. Produktet renses på p 25 en Sephadex -søjle med 10% AcOH som elueringsmiddel og ionbyttes på en Sephadex1* QAE-25 søjle i chloridform med 50% EtOH som elueringsmiddel .

Udbytte: 57% 30 TLC: Rf - 0,21 (A) HPLC: 99% renhed [a] - -18,6* (C - 0,3%)

Eksperimenter 35

Bestemmelse af enzvmkinetiske egenskaber

De kinetiske data for substraterne bestemmes ved måling af den initiale hydrolysehastighed (Vi) ved forskellige DK 171845 B1 20 substratkoncentrationer (Si) og konstante enzymkoncentrationer (Eo). Bindingskonstanten (K^) og den maksimale hastighed (Vmax) opnås på kendt måde ud fra et Lineweaver-Burk-plot, hvorefter Kcat beregnes (Hemker H.C. loc. sit.).

5

Metoder

Enzymer og substrater blandes i en pufferopløsning ved 37*C. Absorbansændringen pr. minut aflæses ved 405 nm i et spektrofoto-10 meter (pNA-substrat) eller i et spektrofluorometer ved en excita-tionsbølgelængde på 380 nm og en emissionsbølgelængde på 440 nm (AMC-substrat).

Ved afprøvningerne anvendes nedenstående kommercielt opnåelige 15 referencesubstrater:

Referencesubstrater S-2222: Bz-Ile-Glu-(7-0R)-Gly-Arg-pNA.HCl 20 R: H - 50%; CH3 - 50%

KabiVitrum AB, Stockholm, Sverige.

CBS 31.39: CH3S02-D-Leu-Gly-Arg-pNA.Ac0H Diagnostica Stago, Asnieres s/Seine, Frankrig.

25

Afprøvning 1. Bestemmelse af kinetiske konstanter for bovint £JSa 30 FX. bovin (KabiVitrum) med en konstant enzymkoncentration cl

Eq - 4 nmol/1 (pNA-substrat)

Eq - 2 nmol/1 (AMC-substrat) og substratet i koncentrationer på mellem 0,01-0,4 mmol/1 (Si) 35 blandes med en tris-pufferopløsning på 0,05 mol/1, pH * 8,3, I -0,25 (NaCl) ved 37*C. Absorbansændringen pr. minut aflæses ved 405 nm i et spektrofotometer for pNA-substrat henholdsvis i et spektro-fluorometer ved en emissionsbølgelængde på 440 nm for AMC-substrat-et. Ud fra disse værdier beregnes derefter 1^ og Kcat, der er anført DK 171845 B1 21 1 tabel I.

Af tabel I fremgår det, at trlpeptidsubstraterne ifølge opfindelsen udviser en høj affinitet for enzymet bovint FX. samtidig med, at de 5 fleste substrater har en høj omsætningshastighed. Selektivitetskonstanten indicerer, at de nye substrater har en bedre selektivitet over for bovint FX. end S-2222, og at de fleste af de nye substrater endog er overlegne i forhold til CBS 31.39.

10 Afprøvning 2. Bestemmelse af kinetiske konstanter for human FX

9

Substraterne blev 1 koncentrationer på 0,1-0,7 mmol/l (Si) blandet med human FX. plasma og behandlet ved den af Aurell, L., et al. beskrevne fremgangsmåde (Perspectives 1n Hemostasis, Ed. Fareed, J.

15 et al., New York, Pergamon Press 1981, s. 382-388).

10 μΐ prøveplasma, kontrol eller standard, og 200 μΐ tris-pufferopløsningen (0,05 mol/1 tris, pH 7,0, I - 0,25 (NaCl)), polybrene (0,1 g/1) blandes og inkuberes ved 37#C i 2-4 minutter.

20 Der tilsættes 200 μΐ (37*C) 1 koncentrationer på 0,1-0,7 mmol/l og opløst i tris-pufferopløsning, der er fremstillet ifølge det ovenfor anførte. Blandingen omrøres godt, og 1 løbet af 30 sekunder tilsættes der 200 μΐ RVV+CaClg (20-25’C), og blandingen omrøres. Absorbansændringen måles straks 1 et spektrofotometer ved 405 nm og 25 37*C. - Resultaterne er anført 1 tabel II.

Af tabel II fremgår det, at de nye tripeptidsubstrater udviser en højere affinitet for enzymet human FX. i sammenligning med refe-rencesubstraterne samtidig med, at de også har en høj omsætnings-30 hastighed, hvilket bevirker, at de overgår de kommercielt opnåelige substrater.

Afprøvning 3. Bestemmelse af thrombinsensitivitet 35 Ved bestemmelse af FX 1 plasma foreligger der altid en risiko for dannelse af aktivt thrombin, der vil forstyrre FX -bestemmelsen.

9

Bovint thrombin (KabiVitrum) 1 en konstant koncentration på Eq * 1,3 nmol/1 og substrater 1 koncentrationer på 0,1-0,4 mmol/l (Si) DK 171845 B1 22 blandes i en trispufferopløsning (0,05 mol/1, pH « 8,3, I » 0,25 (NaCl)) ved 37*C. Afprøvningen udføres i overensstemmelse med afprøvning 1.

5 Absorbansændringen pr. minut aflæses ved 405 nm i et spektro-fotometer, og Km- og Kcat-værdierne beregnes og er anført i tabel III.

Af tabel III fremgår det, at forholdet mellem selektivitets-10 konstanterne for bovint FX. og for thrombin for de nye tripeptid- d substrater kan sammenlignes med dem for tetrapeptiderne og er overlegne i forhold til de kendte tripeptider, når det gælder følsomheden over for bovint FX i forhold til følsomheden for thrombin.

d 15 Afprøvning 4. Opløse!iohed

Opløseligheden i vand henholdsvis i tris-pufferopløsning (0,05 mol/1, pH - 8,3, I - 0,25 (NaCl)) ved 25*C er for nogle af de nye substrater anført i tabel IV i sammenligning med den for tetra-20 peptidsubstratet $-2222.

Af tabellen fremgår det, at de nye tri peptidsubstrater har en klart højere opløselighed i vand såvel som i pufferopløsning i forhold til den for tetrapeptidet S-2222.

25 30 35 DK 171845 B1 23

Tab?1 I

Substrat Km Kcat, Kcat/Km 5 Eks. nr. mrnol/l sek. 1 1/umol»sek.

S-2222 0,51 180 0,35 1 0,11 250 2,27 2 0,22 180 0,82 4 0,19 270 1,42 10 5 0,26 280 1,07 6 0,21 350 1,66 7 0,45 245 0,55 8 0,22 230 1,04 9 0,15 310 2,06 15 10 0,20 210 1,05 11 0,27 260 0,96 12 0,12 140 1,14 13 0,19 170 0,89 16 0,04 110 2,75 20 18 0,16 225 1,41 19 0,17 200 1,17 20 0,16 220 1,37 CBS 31.39 0,29 290 1,00

25 Tabel II

Substrat K_ V V /K

m max max' !/m

Eks. nr. ttmol/l itmol/l min. min."1 S-2222 1970 46 0,023 30 1 380 73 0,192 4 340 46 0,135 9 210 51 0,242 16 50 15 0,300 CBS 31.39 1060 61 0,057 35 DK 171845 B1 24

Tabel III

Substrat Km Kcat Kcat/Km Kcat/Km FXa bovin 5 Eks.no^ nnnoiZL ssSlL. l/mh&K κ Jk thrombin cat' m S-2222 0,71 13 0,018 19,4 1 0,13 13 0,100 22,7 4 0,41 23 0,056 25,4 10 9 0,073 11 0,151 13,6 16 0,16 17 0,106 25,9 CBS 31.39 0,23 72 0,313 3,2

Tabel IV 15

Substrat Relativ opløse!iqhed

Eks.no. Vand Tris-puffer S-2222 1 1 1 >7 >5 20 4 >7 >10 9 >3 >3 16 >5 >10 25 30 35

Claims (5)

1. Tripeptidderivater, kendetegnet ved, at de har den almene formel: 5 Rj - X - D-Arg - A - Arg - NH - R2 hvor Rj betegner hydrogen, en ar- eller Ø-naphthylrest, en lavere al kylrest, som kan være substitueret med en carboxyl gruppe, en usub-10 stitueret eller substitueret phenyl- eller phenyl al kyl rest, hvorhos alkylgruppen har 1 til 4 carbonatomer, substitutionen fortrinsvis er i paraposition i phenyl ringen, og substituenterne er lavere al kyl, lavere alkoxy, halogen eller en nitrogruppe; 15 0 0 0 N N M X betegner -0-C-, -C-, -S- eller en enkeltbinding på den betingelse, at H 0 2q når Rj er hydrogen, da, og kun da er X en enkeltbinding; A betegner Gly eller Sar; Rg betegner en aromatisk eller heterocyklisk rest, som sammen med 25 -NH-gruppen ved enzymatisk hydrolyse af tripeptidet giver forbindelsen Rg-Nt^, som kan bestemmes kvantitativt i kraft af sine kromogene, fluorogene eller elektrokemi ske egenskaber; eller di- og tri salte af uorganiske eller organiske syrer heraf. 30

2. Tripeptidderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A betegner Gly.

3. Tripeptidderivater Ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet 35 ved, at X en oxycarbonyl- eller sulfonylgruppe.

4. Tripeptidderivater ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at -NH-R2 er en kromogen eller fluorogen gruppe. s DK 171845 B1

5. Tri peptidderivater ifølge krav 4, kendetegnet ved, at NH2-R2 er p-nitroanilin, 7-amino-4-methylcoumarin eller 3-carboxy-4-hydroxyanilin.

6. Tripeptidderivater ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at Rj er ethyl, benzyl eller tert.butyl.

7. Tripeptidderivat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at det foreligger i form af et disalt. 10

8. Tripeptidderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er Na-benzylsulfonyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilid*2HCl.

9. Tripeptidderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ^ det er Na-4-methoxybenzyloxycarbonyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilid- •2HC1.

10. Tripeptidderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er Na-ethansulfonyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilid«2HCl. 20

11. Tripeptidderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er Na-benzyloxycarbonyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilid·2HC1.

12. Tripeptidderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ^ det er Na-t-butyloxycarbonyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilid-2HC1.

13. Fremgangsmåde til fremstilling af tripeptidderivater ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12, kendetegnet ved, at der udføres en trinvis syntese ved kobling til Arg, som har en 30 -NH-R2-gruppe eller en fjernelig carboxyl beskyttende gruppe, som derpå udskiftes med -NH-R2, eller ved kobling af R^-X-D-Arg-A til Arg-NH-R2.

14. Fremgangsmåde til bestemmelse af serinproteaser, navnlig faktor

35 X, kendetegnet ved, at der anvendes et peptidderivat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12.

15. Fremgangsmåde til bestemmelse af komponenter, der kan samvirke med serinproteaser eller zymogene former heraf, kende- DK 171845 B1 tegnet ved, at der anvendes et peptidderivat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 14 eller 15 til bestemmelse af FX,

5 FVII, FVII , FVIII:C, FVIII:Ca, FIX, FIX,, antithrombin III, blod- α α α pladefaktor 4, heparin, lavmolekylvægtige hepariner og heparinoider. 10 15 20 25 30 35