CN1809590A - 治疗高胆固醇血症的反向胆固醇转动的介质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供适合于增加哺乳动物中反向胆固醇转运的组合物。所述组合物适合于口服施用，并且在治疗和/或预防高胆固醇血症，动脉粥样硬化和相关心血管疾病中是有用的。

Description

治疗高胆固醇血症的反向胆固醇转运的介质
发明背景
发明领域
本发明涉及治疗高胆固醇血症和相关心血管疾病的反向胆固醇转运(RCT)的肽和小分子介质。
相关领域描述
目前充分确定的是升高的血清胆固醇(“高胆固醇血症”)是动脉粥样硬化发展的起因，所述动脉粥样硬化是胆固醇在动脉壁上的进行性积累。高胆固醇血症和动脉粥样硬化是心血管疾病的主要原因，所述心血管疾病包括高血压、冠状动脉疾病，心脏病发作和中风。只在美国，每年约有一百一十万个体遭遇心脏病发作，估计费用超过1170亿美元。尽管有许多降低血液中胆固醇水平的药物策略，它们中的许多具有不理想的副作用并且已增加了安全问题。而且，商购的药物疗法都没有充分的刺激反向胆固醇转运，一种去除体内胆固醇的重要代谢路径。
循环胆固醇通过血浆脂蛋白-转运血液中脂质的复合脂质和蛋白组合物的颗粒进行。低密度脂蛋白(LDL)，和高密度脂蛋白(HDL)是主要的胆固醇载体。认为LDL负责将胆固醇从肝(合成或从膳食来源获得其的地方)中传递胆固醇到体内的肝外组织中。术语“反相胆固醇转运”描述将胆固醇从肝外组织转运到肝中，它在肝中被代谢和清除。认为血浆HDL颗粒充当组织胆固醇的清除剂而在反向转运过程中具有主要作用。
有说服力的证据支持沉积在动脉粥样硬化损伤处的脂质主要来自血浆LDL的概念；因此，一般已将LDLs称为“坏”胆固醇。相反，血浆HDL水平与冠状心脏疾病呈反向相关-确实，将高血浆水平的HDL视为阴性风险因素。推测高水平的血浆HDL不仅对于冠状动脉疾病是保护性的，而且可以实际上诱导动脉粥样硬化斑块的退化(例如，见Badimon et al.1992，Circulation 86(Suppl.III)：86-94)。因此，通常已将HDLs称为“好”胆固醇。
释放自LDLs的胞内胆固醇的量控制细胞胆固醇代谢。来自LDLs的细胞胆固醇的积累控制三个过程：(1)其通过关闭HMG CoA还原酶的合成来减少细胞胆固醇合成，所述HMG CoA还原酶是一种在胆固醇生物合成途径中的关键酶；(2)通过活化LCAT，进入的LDL-来源的胆固醇促进胆固醇的贮存，所述LCAT是将胆固醇转变成沉积在储藏液滴中的胆固醇酯的细胞酶；和(3)胆固醇在细胞中的累积促进抑制新LDL受体的细胞合成的反馈机制。因此，细胞调节它们对LDL受体的补充从而带来足够的胆固醇以满足它们的代谢需求，而不过载。(关于综述，见Brown &Goldstein，In：The Pharmacological Basis Of Therapeutics，8th Ed.，Goodman& Gilman，Pergamon Press，NY，1990，Ch.36，pp.874-896)。
反向胆固醇转运(RCT)是一种途径，通过所述途径外周细胞胆固醇可以返回肝以再循环到肝外组织或作为胆汁分泌到肠。所述RCT途径代表从大多数肝外组织中清除胆固醇的仅有方式。RCT主要由三个步骤组成：(1)胆固醇流出，胆固醇从外周细胞中的最初去除；(2)通过卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LACT)作用的胆固醇酯化，其防止流出的胆固醇再入外周细胞；和(3)将HDL胆固醇酯吸收/传递到肝细胞。LCAT是RCT途径的关键酶并且主要产自肝中，并在与HDL级分关联的血浆中循环。LCAT将细胞来源的胆固醇转变成胆固醇酯，所述胆固醇酯汇集(sequester)在将要被清除的HDL中。RCT途径由HDLs所调节。
HDL是特征在于它们的高密度的脂蛋白颗粒的专业术语。HDL复合体的主要的脂质组分是各种磷脂，胆固醇(酯)和三酰甘油。最主要的载酯蛋白成分是决定HDL的功能特性的A-I和A-II。
每种HDL颗粒包含载脂蛋白A-1(ApoA-I)的至少一个拷贝(通常两个一四个拷贝)。ApoA-I由肝和小肠合成为前载脂蛋白原，所述前载脂蛋白原作为快速裂解以产生具有243个氨基酸残基的成熟多肽的proprotein分泌。ApoA-I主要包括由通常是脯氨酸的接头部分间隔的6-8个不同的22个氨基酸残基重复，并且在一些情况中包括由一些残基组成的一段序列。ApoA-I与脂质形成三种类型的稳定复合体：被称作pre-beta-1 HDL的小、少-脂质的复合体；被称作pre-beta-2 HDL的包含极性脂质(磷脂和胆固醇)的展平铁饼状颗粒；和被称作球形或成熟HDL(HDL3和HDL2)的包含极性和非极性脂质二者的球形颗粒。尽管大多数在循环中的HDL包含ApoA-I和ApoA-II二者，仅包含ApoA-I(AI-HDL)的HDL的级分似乎在RCT中更为有效。流行病学研究支持AI-HDL是抗-致动脉粥样硬化的假说(Parraet al.，1992，Arterioscler.Thromb.12：701-707；Decossin et al.，1997，Eur.J.Clin.Invest.27：299-307)。
基于体内获得的数据的一些系列的证据暗示HDL及其主要蛋白组分ApoA-I，在预防动脉粥样硬化损伤，和潜在地斑块的退化一使这些吸引人的目标进行治疗干预。首先在人血清ApoA-I(HDL)浓度和动脉粥样硬化形成之间存在逆相关(Gordon & Rifkind，1989，N.Eng.J.Med.321：1311-1316；Gordon et al.，1989，Circulation 79：8-15)。确实，HDL的特定亚群已经与人中动脉粥样硬化的减少的风险相关(Miller，1987，Amer.Heart 113：589-597；Cheung et al.，1991，Lipid Res.32：383-394)；Fruchart & Ailhaud，1992，Clin.Chem.38：79)。
第二，动物研究支持ApoA-I(HDL)的保护性作用。用ApoA-I或HDL治疗胆固醇喂养的兔减少了胆固醇-喂养兔的斑块(脂条)的发展和进展(Koizumi et al.，1988，J.Lipid Res.29：1405-1415；Badimon et al.，1989，Lab.Invest.60：455-461；Badimon et al.，1990，J.Clin.Invest.85：1234-1241)。但是效率取决于HDL的来源而变化(Beitz et al.，1992，Prostaglandins，Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47：149-152；Mezdour et al.，1995，Atherosclerosis 113：237-246)。
第三，ApoA-I作用的直接证据由包括转基因动物的实验获得。转移到小鼠中的人ApoA-I基因的表达保护所述小鼠免于主动脉的损伤的发展，所述小鼠在遗传上倾向饮食诱导的动脉粥样硬化(Rubin et al.，1991，Nature 353：265-267)。所述ApoA-I转基因还显示抑制在ApoE-缺陷小鼠中和在Apo(a)转基因小鼠中的动脉粥样硬化(Paszty et al.，1994，J.Clin.Invest.94：899-903；Plump et al.，1994，PNAS.USA 91：9607-9611；Liu et al.，1994，J.Lipid Res.35：2263-2266)。在表达人ApoA-I的转基因兔(Duverger，1996，Circulation 94：713-717；Duverger et al.，1996，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16：1424-1429)和在转基因大鼠(Burkey et al.，1992，Circulation，SupplementI，86：I-472，Abstract No.1876；Burkey et al.，1995，J.Lipid Res.36：1463-1473)中，观察到了相似的结果，在所述转基因大鼠中升高水平的人ApoA-I保护大鼠免于动脉粥样硬化并且在气囊血管成形术后抑制再狭窄。
目前对于高胆固醇血症和其它血脂异常的治疗
在大约过去20年里，将cholesterolemic化合物分离成HDL和LDL调节剂并认识到减少LDL血液水平的需求已导致了许多药物的开发。但是，这些药物中的许多具有不理想的副作用和/或在某些患者中处置不当，特别是当与其它药物结合施用时。这些药物和治疗策略包括
(1) 胆汁-酸-结合树脂，其中断胆汁酸从肠到肝的再循环[例如，考来烯胺(QUESTRAN LIGHT，Bristol-Myers Squibb)，和盐酸考来替泊(COLESTID，Pharmacia & Upjohn Company)]；
(2) 抑制素(statins)，其通过阻断HMG CoA-涉及胆固醇生物合成的关键酶抑制胆固醇的合成[例如，洛伐他汀(MEVACOR，Merck & Co.，Inc.)，来自曲霉属菌株的天然产物，普伐他汀(PRAVACHOL，Bristol-Myers SquibbCo.)，和阿托伐他汀(LIPITOR，Warner Lambert)]；
(3)烟酸是水溶性维生素B-复合物，其减少VLDL的产生并在降低LDL上是有效的；
(4)通过减少VLDL级分将fibrates用于降低血清中的三酰甘油并可在一些患者群中通过相同的机制引起血浆胆固醇的适度减少[例如，安妥明(ATROMID-S，Wyeth-Ayerst Laboratories)，和吉非他奇(LOPID，Parke-Davis)]；
(5) 雌激素替代疗法可降低更年期后妇女的胆固醇水平；
(6)已报道 长链α，ω-二羧酸降低血清三酰甘油和胆固醇(见，例如，Bisgaieret al.，1998，J.Lipid Res.39：17-30；WO 98/30530；美国专利号4,689,344；WO 99/00116；美国专利号5,756,344；美国专利号3,773,946；美国专利号4,689,344；美国专利号4,689,344；美国专利号4,689,344；和美国专利号3,930,024)；
(7)公开了降低血清三酰甘油和胆固醇水平的 其它化合物，包括醚(见，例如，美国专利号4,711,896；美国专利号5,756,544；美国专利号6,506,799)，和多萜醇的磷酸酯(美国专利号4,613,593)，和azolidinedione衍生物(美国专利号4,287,200)。
目前这些可获得的用于降低胆固醇的药物都没有安全地升高HDL水平和刺激RCT。确实，这些目前治疗策略中的大部分似乎作用在胆固醇转运途径上，调节饮食吸收，再循环，胆固醇的合成，和VLDL数量。
治疗高胆固醇血症的ApoA-I激动剂
由于HDL的潜在作用，即ApoA-I及其相关磷脂在抗动脉粥样硬化疾病中的保护，开始了利用重组产生的ApoA-I进行的人临床试验，通过UCBBelgium停止和显然再次开始(Pharmaprojects，Oct.27，1995；IMS R & DFocus，Jun.30，1997；Drug Status Update，1997，Atherosclerosis 2(6)：261-265；还见M.Eriksson at Congress，″The Role of HDL in Disease Prevention，″Nov.7-9，1996，Fort Worth；Lacko & Miller，1997，J.Lip.Res.38：1267-1273；和WO 94/13819)并通过Bio-Tech开始和停止(Pharmaprojects，Apr.7，1989)。使用ApoA-I还尝试进行试验以治疗败血症性休克(Opal，″ReconstitutedHDL as a Treatment Strategy for Sepsis，″IBC′s 7th International Conferenceon Sepsis，Apr.28-30，1997，Washington，D.C.；Gouni et al.，1993，J.LipidRes.94：139-146；Levine，WO 96/04916)。然而，有许多与ApoA-I的生产和使用相关的缺陷，使其作为药物不那么理想；例如ApoA-I是大的蛋白质，生产它是困难的和昂贵的；至于在贮存过程中的稳定性，活性产品的传递和体内的半衰期，必须克服明显的生产和再现性问题。
鉴于这些缺陷，已经尝试制备模拟ApoA-I的肽。由于ApoA-I的关键活性是由于在蛋白质中的独特的二级结构特征中的多个重复的存在-类别A两亲性α-螺旋(Segrest，1974，FEBS Lett.38：247-253；Segrest et al.，1990，PROTEINS：Structure，Function and Genetics 8：103-117)，大多数设计模拟ApoA-I活性的肽的努力已集中于设计形成种类A-类型的两亲性α-螺旋的肽(见，例如，在美国专利号6,376,464和6,506,799中的背景讨论；将其全文并入那里作为参考)。
在一项研究中，Fukushima等合成了全部由周期排列的谷氨酸、赖氨酸和亮氨酸残基组成的22个残基的肽从而形成具有等-亲水性和疏水性面的两亲性α-螺旋(″ELK肽″)(Fukushima et al.，1979，J.Amer.Chem.Soc.101(13)：3703-3704；Fukushima et al.，1980，J.Biol.Chem.255：10651-10657)。所述ELK肽与ApoA-I的198-219片段共享41％的序列同源性。显示所述ELK肽与磷脂有效关联并模仿ApoA-I的一些物理和化学特性(Kaiser etal.，1983，PNAS USA 80：1137-1140；Kaiser et al.，1984，Science 223：249-255；Fukushima et al.，1980，supra；Nakagawa et al.，1985，J.Am.Chem.Soc.107：7087-7092)。后来发现该22个残基肽的二聚体比单体更接近地模仿ApoA-I；基于这些结果，提示被螺旋中断者(breaker)(甘氨酸或脯氨酸)在中部打断的44-mer表示ApoA-I中的最小功能域(Nakagawa et al.，1985，supra)。
另一项研究包括被称作″LAP肽″的模型两亲性肽(Pownall et al.，1980，PNAS USA 77(6)：3154-3158；Sparrow et al.，1981，In：Peptides：Synthesis-Structure-Function，Roch and Gross，Eds.，Pierce Chem.Co.，Rockford，IL，253-256)。基于用天然载脂蛋白的片段的脂质结合研究，设计了一些名称为LAP-16，LAP-20和LAP-24的LAP肽(分别包含16，20和24个氨基酸残基)。这些模型两亲性肽与载脂蛋白没有序列同源性并被设计以具有亲水面，所述亲水面以与和载脂蛋白关联的类别A-类型两亲性螺旋结构域不同的方式构成(Segrest et al.，1992，J.Lipid Res.33：141-166)。从这些研究，作者认为20个残基的最小长度是将脂质结合特性赋予模型两亲性肽所必需的。
用在序列的不同位置包含脯氨酸残基的LAP20的突变体进行的研究显示在脂结合和LCAT活化之间存在直接关系，但是肽单独的螺旋潜能没有导致LCAT的活化(Ponsin et al.，1986，J.Biol.Chem.261(20)：9202-9205)。而且，接近肽中部的螺旋中断者(脯氨酸)的存在减少了其对于磷脂表面的亲和性及其活化LCAT的能力。尽管某些LAP肽显示结合磷脂(Sparrow etal.，supra)，存在关于在脂质存在时LAP肽螺旋的程度的争议(Buchko et al，1996，J.Biol.Chem.271(6)：3039-3045；Zhong et al.，1994，Peptide Research7(2)：99-106)。
Segrest等已经合成了由18-24个氨基酸残基组成的肽，所述肽与ApoA-I的螺旋没有序列同源性(Kannelis et al，1980，J.Biol.Chem.255(3)：11464-11472；Segrest et al.，1983，J.Biol.Chem.258：2290-2295)。对该序列进行具体设计以在疏水力矩(Eisenberg et al.，1982，Nature 299：371-374)和电荷分布(Segrest et al.，1990，Proteins 8：103-117；美国专利号4,643,988)方面模拟类A可交换的载脂蛋白的两亲性螺旋状结构域。将一个18残基的肽，“18A”肽设计为模型类别-Aα-螺旋(Segrest et al.，1990，supra)。用这些肽和其它具有反向电荷分布的肽，如“18R”肽进行的研究已经一致显示电荷分布对于活性是关键的；具有反向电荷分布的肽显示比18A类别A模拟物减少的脂质亲和性和在脂质存在时更低的螺旋含量(Kanellis etal.，1980，J.Biol.Chem：255：11464-11472；Anantharamaiah et al.，1985，J.Biol.Chem.260：10248-10255；Chung et al.，1985，J.Biol.Chem.260：10256-10262；Epand et al.，1987，J.Biol.Chem.262：9389-9396；Anantharamaiah et al.，1991，Adv.Exp.Med.Biol.285：131-140)。
还已经设计了一种基于人ApoA-I的螺旋的序列的包含22个氨基酸残基的“共有区”肽(Anantharamaiah et al.，1990，Arteriosclerosis 10(1)：95-105；Venkatachalapathi et al.，1991，Mol.Conformation and Biol.Interactions，Indian.Acad.Sci.B：585-596)。通过鉴定在人ApoA-I的推定螺旋的每个位置上的最普遍的残基来构建该序列。如上述肽，由该肽形成的螺旋具有集簇于亲水-疏水界面的正电荷氨基酸残基，集簇于亲水面中心的负电荷氨基酸残基和少于180°的疏水角。尽管该肽的二聚体在活化LCAT中稍稍有效，单体显示了较差的脂质结合特性(Venkatachalapathi et al.，1991，supra)。
主要基于关于上述肽的体外研究，已经出现了一组设计模拟ApoA-I的功能的肽的“规则”。显然，认为对于脂质亲和性和LCAT的活化，需要具有集簇于亲水-疏水界面的正电荷残基和集簇于亲水面中心的负电荷氨基酸残基的两亲性α-螺旋(Venkatachalapathi et al.，1991，supra)。Anantharamaiah等还已经指出在位于α-螺旋的疏水面中的共有区22-mer肽的13位置上的负电荷谷氨酸残基在LCAT的活化中具有重要作用(Anantharamaiah et al.，1991，supra)。另外，Brasseur已经指出少于180°的疏水角(pho角)是最佳脂质-载脂蛋白复合物的稳定性所需要的，并还解释在脂双层的边缘周围具有肽的饼状颗粒的形成(Brasseur，1991，J.Biol.Chem.66(24)：16120-16127)。Rosseneu等还强调少于180°的疏水角是LCAT活化所需要的(WO 93/25581)。
然而，尽管在阐明设计ApoA-I激动剂的“规则”中存在进展，到目前为止，报道的最好的ApoA-I激动剂具有少于40％的完整ApoA-I的活性。文献中描述的肽激动剂没有被证实作为药物是有用的。因此，需要开发模拟ApoA-I的活性并且相对简单和生产经济的稳定分子。优选地，候选分子将调节间接和直接的RCT。这些分子将比现存的肽激动剂更小，并具有更宽的功能范围。然而，尚没有充分阐明设计RCT有效介质的“规则”并且尚不知道设计具有ApoA-I功能的有机分子的原理。
发明简述
按照本发明一个优选的实施方案，公开了包括一种分子的反向胆固醇转运的介质，所述分子包含酸性区域，亲脂性或芳香族区域和碱性区域(“分子模型”)。在其最简单形式中的分子模型可以是含有具有亲脂性主链或支架的酸性区域和碱性区域的分子。所述分子具有适应于与HDL和/或LDL胆固醇络合的结构并由此增加反向胆固醇运输。
反向胆固醇运输的介质优选地具有3-10个之间氨基酸残基或包含具有亲脂性支架的碱性基团和酸性基团的其类似物或任何非肽化合物，并包含序列：X1-X2-X3，其中：X1是酸性氨基酸；X2是芳香族或亲脂性氨基酸；X3是碱性氨基酸；并且其中氨基端还包括第一保护基，羧基端还包括第二保护基。第一和第二保护基独立地选自由下列组成的组中：乙酰基，苯乙酰基，pivolyl，9-芴基甲氧基羰基，2-萘酸(napthylic acid)，烟酸，其中n范围从3-20的CH3-(CH2)n-CO-和乙酰基的酰胺、苯乙酰基、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、f-MOC、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。C-端被胺诸如RNH2加帽，其中R＝二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、f-MOC、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。序列：X1-X2-X3可以以所有可能方式的任一种被搅乱(scramble)从而提供保持分子模型的基本特征的化合物并可以由3-10个氨基酸残基组成。
在反向胆固醇转运的氨基酸衍生的介质的一个实施方案中，X1，X2或X3的一个或多个是D或其它修饰的合成氨基酸残基从而提供代谢上稳定的分子。这还可以通过peptidomimetic方法，即反转主链中的肽键或相似基团来完成。在一些优选的实施方案中，X2是双苯基丙氨酸。在特别优选的实施方案中，本发明的反向胆固醇转运的介质是SEQ ID NOS 1-176的任一个或可以选自表5所显示的化合物。在一些优选的实施方案中，反向胆固醇转运的介质包括序列EFR或RFE。
按照本发明的另一个优选方面，公开了一种增加动物中RCT的方法。该方法包括向动物施用有效量的氨基酸衍生的组合物，所述组合物包括序列：X1-X2-X3，其中X1是酸性氨基酸；X2是芳香族或亲脂性氨基酸；X3是碱性氨基酸；并且其中氨基端还包括第一保护基，羧基端还包括第二保护基，其中第一和第二保护基独立地选自由下列组成的组中：乙酰基、苯乙酰基、pivolyl、9-芴基甲氧基羰基、2-萘酸、烟酸、其中n范围从3-20的CH3-(CH2)n-CO-和二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、f-MOC、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。C-端被胺诸如RNH2加帽，其中R＝二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、f-MOC、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。序列：X1-X2-X3可以以所有可能方式的任一种被搅乱从而提供保持分子模型的基本特征的化合物并可以由3-10个氨基酸残基组成。
按照本发明的另一个方面，公开了基本纯的氨基酸衍生的物质以治疗和/或预防哺乳动物中高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化。所述物质具有氨基和羧基端，并包括酸性氨基酸残基或其修饰的合成氨基酸或衍生物的L或D的对映异构体，亲脂性氨基酸残基或其衍生物或修饰的合成氨基酸的L或D的对映异构体，和碱性氨基酸残基或其衍生物或修饰的合成氨基酸的L或D的对映异构体。氨基端还包括第一保护基，并且羧基端还包括第二保护基，其中所述第一和第二保护基独立地选自由下列组成的组中：乙酰基、苯乙酰基、pivolyl、9-芴基甲氧基羰基、2-萘酸、烟酸和二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、f-MOC、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。C-端被胺诸如RNH2加帽，其中R＝二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、f-MOC、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。序列：X1-X2-X3可以以所有可能方式的任一种被搅乱从而提供保持分子模型的基本特征的化合物并可以由3-10个氨基酸残基组成。
所述物质具有下列性能的至少一个：(1)其模拟ApoA-I与LDL和HDL的结合而结合于LDL和HDL，(2)其优先结合于肝，(3)其通过肝LDL-受体增加LDL的吸收，(4)其降低LDL，IDL，和VLDL胆固醇的水平，(5)其增加HDL胆固醇的水平和(6)其提高血浆脂蛋白的图谱。
按照本发明的另一个方面，公开了适合口服施用的组合物以改善或预防高胆固醇血症的症状。该组合物包括具有酸性区域，亲脂性区域和碱性区域的氨基酸衍生的分子。氨基酸衍生的分子还具有附着于氨基端的第一保护基和附着于羧基端的第二保护基。所述氨基酸衍生的分子可以任选地包括至少一个D氨基酸残基。
按照本发明的另一个方式，公开了RCT的肽介质。所述介质包括序列：Xa-Xb-X1-X2-X3-Xc-Xd，其中Xa是酰基化的氨基酸残基；Xb是任何0-10个氨基酸残基；X1-X2-X3独立地选自酸性氨基酸残基或其衍生物，亲脂性氨基酸残基或其衍生物，碱性氨基酸残基或其衍生物；Xc是任何0-10个氨基酸残基；且Xd是酰胺化的氨基酸残基。该肽介质优选地具有15个或更少的氨基酸残基并任选地可以包括至少一个D氨基酸残基或修饰的合成氨基酸。
按照本发明的另一个优选实施方案，公开了施用适合于口服施用的组合物以治疗和/或预防高胆固醇血症或动脉粥样硬化，所述组合物包括具有酸性区域、亲脂性区域和碱性区域的氨基酸衍生的分子。所述氨基酸衍生的分子还具有附着于氨基端的第一保护基和附着于羧基端的第二保护基。所述氨基酸衍生的分子可以任选地包括至少一个D氨基酸残基。
按照本发明的另一个实施方案，公开了RCT介质，所述RCT介质包括选自由表5的合成化合物1-96组成的组中的化合物。
按照本发明的另一个实施方案，公开了RCT介质，所述RCT介质包括选自由SEQ ID NOS：1和107-117组成的组中的化合物。
按照本发明的另一个实施方案，公开了RCT介质，所述RCT介质包括选自由SEQ ID NOS：1，26-36，42，45-47，56-58，68-70，72-74，76，80，81，83-90和92-95组成的组中的化合物。
按照本发明的另一个实施方案，公开了RCT介质，所述RCT介质包括选自由SEQ ID NO：1组成的组中的化合物。
按照本发明的另一个实施方案，公开了RCT介质，所述RCT介质包括选自由SEQ ID NO：113组成的组中的化合物。
按照本发明的另一个实施方案，公开了RCT介质，所述RCT介质包括选自由SEQ ID NO：34组成的组中的化合物。
按照本发明的另一个实施方案，公开了RCT介质，所述RCT介质包括选自由SEQ ID NO：86组成的组中的化合物。
按照本发明的另一个实施方案，公开了RCT介质，所述RCT介质包括选自由SEQ ID NO：91组成的组中的化合物。
按照本发明的另一个实施方案，公开了RCT介质，所述RCT介质包括选自由SEQ ID NO：96组成的组中的化合物。
按照本发明的另一个实施方案，公开了RCT介质，所述RCT介质包括选自由SEQ ID NO：145组成的组中的化合物。
按照本发明的另一个实施方案，公开了RCT介质，所述RCT介质包括选自由SEQ ID NO：146组成的组中的化合物。
按照本发明的另一个实施方案，公开了RCT介质，所述RCT介质包括选自由SEQ ID NO：118组成的组中的化合物。
按照本发明的另一个优选实施方案，公开了一种治疗或预防高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的方法。所述方法包括向需要其的哺乳动物施用大量选自SEQ ID NOS：1-176(表3)和合成化合物1-96(表5)的组合物，其中该量足够增加RCT和/或导致现存动脉粥样硬化损伤的退化或减少损伤的形成。更优选地，用于治疗或预防高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的组合物选自由SEQ ID NOS：1，113，34，86，91，96，145，146，和118组成的组中，其中该量足够增加RCT和/或导致现存动脉粥样硬化损伤的退化或减少损伤的形成。在该方法的一个变化中，通过口服途径完成施用步骤。在该方法的另一个变化中，施用的步骤与胆汁酸-结合树脂、烟酸、抑制素(statins)或其组合的施用结合。
按照本发明另一个优选实施方案，公开了一种鉴定可能增加体内反向胆固醇转运的测试化合物的体外筛选方法。所述方法包括：在测试化合物存在和缺乏时，体外测量肝细胞中胆固醇的累积；在测试化合物存在和缺乏时，体外测量AcLDL-负载巨噬细胞中的胆固醇累积和/或流出；和鉴定增加在肝细胞中胆固醇累积并减少巨噬细胞中胆固醇水平的测试化合物。
在筛选方法的一个变化中，在测试化合物存在和缺乏时，还体外测量在OxLDL-负载血管平滑肌细胞中的胆固醇水平。因此，鉴定测试化合物的步骤还包括鉴定增加肝细胞中胆固醇累积并减少巨噬细胞中胆固醇水平和/或减少在血管平滑肌细胞中的胆固醇水平的化合物。
在筛选方法的一个实施方案中，所述肝细胞是人HepG2肝细胞瘤细胞。在另一个实施方案中，巨噬细胞是人THP-1细胞。在另一个实施方案中，血管平滑肌细胞主要是主动脉平滑肌细胞。
在另一个变化中，体外筛选方法包括如下步骤：在测试化合物存在和缺乏时，体外测量肝细胞中的胆固醇累积；在测试化合物存在和缺乏时，体外测量在AcLDL-负载的血管平滑肌细胞中的胆固醇水平；和鉴定增加肝细胞中胆固醇累积和减少血管平滑肌细胞中的胆固醇水平的测试化合物。
附图简述
图1显示固相肽合成示意图。
图2举例说明本发明的氨基酸衍生的组合物与脂蛋白和白蛋白之间的关联。用LDLR-/-小鼠血浆于室温将放射性标记的化合物温育2小时。温育后，将所述混合物进行琼脂糖凝胶电泳。对在表示LDL、HDL和白蛋白的条带中的放射性进行定量。将脂蛋白和白蛋白结合的放射性表示为应用的放射性的百分比。
图3表示本发明的氨基酸衍生的组合物与ApoA1-/-雄性小鼠的肝结合。用12μg/小鼠的放射性标记的化合物注射ApoA1-/-雄性小鼠。36分钟收集肝，对放射性进行定量并按照每g的湿组织进行校准。将肝结合放射性表示为总cpm的％。每个条形框表示4只小鼠的平均值±SEM。
图4显示SEQ ID NO 1的器官分布和肝的优先吸收。用12μg/放射性标记的SEQ ID NO 1注射ApoA1-/-雄性小鼠。36分钟后收集器官，对放射性进行定量并按照每g的湿组织进行校准。每个条形框表示4只小鼠的平均值±SEM。
图5表示人125I-LDL与SEQ ID NO：1的络合提高了其与肝的结合。SEQ ID NO 1增加了LDL向肝的传递。将单独的125I-LDL或与SEQ ID NO：1络合的125I-LDL注射到如所示的缺陷基因型雄性小鼠中。36分钟后，收集肝并对放射性进行定量。将肝结合放射性表示为注射的放射性的％。每个条形框表示4只小鼠的平均值±SEM。
图6显示SEQ ID NO 1-LDL复合物与肝上的LDL受体结合。将单独的125I-LDL或与SEQ ID NO：1络合的125I-LDL与LDLR-/-小鼠的肝的结合从它们各自与A-I-/-小鼠的肝的结合中减去。减去的结果显示复合物与LDL-受体的结合大大增加。每个条形框表示4只小鼠的平均值±SEM。
图7显示SEQ ID NO 1对从ApoA-I-缺陷小鼠的血液中清除人LDL的影响。将单独的125I-LDL或与SEQ ID NO：1络合的125I-LDL注射到ApoA1-/-小鼠中。在指示的时间点，获得血浆，并测量10％TCA可沉淀放射性。100％等于注射10分钟后确定的血液放射性。每个值表示4只动物的平均值±SEM。
图8显示SEQ ID NO 1对在ApoA-I-缺陷型和LDL受体缺陷型小鼠中的LDL器官分布的影响。放射性，％＝(器官结合放射性/血液放射性)×100％。大约90％的总检测放射性(在36分钟的时间点)是血液放射性。
图9显示SEQ ID NO 1对血浆中VLDL胆固醇水平的影响。将小鼠分成两组(每组4只小鼠)。将SEQ ID NO：1或PBS各自静脉内注射到实验或对照小鼠中。在指示的时间点，获得血浆，在每组中合并并应用在Superose 6柱上。曲线上的每个时间点表示从＞或＝3个层析图谱中获得的平均值±SEM。
图10显示SEQ ID NO 1对血浆IDL/LDL胆固醇水平的影响。将小鼠分成两组(每组4只小鼠)。将SEQ ID NO：1或PBS各自静脉内注射到实验或对照小鼠中。在指示的时间点，获得血浆，在每组中合并并应用在Superose 6柱上。曲线上的每个时间点表示从＞或＝3个层析图谱中获得的平均值±SEM。
图11显示SEQ ID NO 1对血浆HDL水平的影响。将小鼠分成两组(每组4只小鼠)。将SEQ ID NO：1或PBS各自静脉内注射到实验或对照小鼠中。在指示的时间点，获得血浆，在每组中合并并应用在Superose 6柱上。曲线上的每个时间点表示从＞或＝3个层析图谱中获得的平均值±SEM。
图12显示SEQ ID NO 1对血浆VLDL胆固醇水平的影响的线性回归分析。
图13显示SEQ ID NO 1对血浆IDL/LDL胆固醇水平的影响的线性回归分析。
图14显示SEQ ID NO 1对血浆HDL胆固醇水平的影响的线性回归分析。
图15显示定时释放的SEQ ID NO 1对血浆脂蛋白图谱(profile)的影响。将包含SEQ ID NO：1或PBS的泵以外科手术方式插入管饲(canulatedChow fed)的小鼠中。泵的流动速率是8μl/小时，其每个小时提供图中所指示量的SEQ ID NO：1。手术后，立即向动物开放HFC饮食。20小时后，获得血浆，在每组(4-6只小鼠)中合并并进行FPLC和琼脂糖凝胶电泳以监测在不同脂蛋白类别中的胆固醇和磷脂分布(为了清楚，磷脂的数据没有显示)。将影响表示为与PBS对照比较的变化的％。
图16显示输注本发明的各种氨基酸衍生的组合物对血浆脂蛋白图谱的长期(20小时)影响。将包含SEQ ID NO：1或PBS的泵以外科手术方式插入管饲的小鼠中。泵的流动速率是8μl/小时，其每个小时提供30-40μg的肽。手术后，立即向动物开放HFC饮食。20小时后，获得血浆，在每组(4-6只小鼠)中合并并进行FPLC和琼脂糖凝胶电泳以监测在不同脂蛋白类别中的胆固醇和磷脂分布。将影响表示为与PBS对照比较的变化的％。
图17显示输注本发明的各种氨基酸衍生的组合物对血浆脂蛋白图谱的长期(160小时)影响。将包含SEQ ID NO：1或PBS的泵以外科手术方式插入管饲的小鼠中。泵的流动速率是1μl/小时，其每个小时提供表中所指示量的肽。手术后，立即向动物开放HFC饮食。160小时后，获得血浆，在每组(4-6只小鼠)中合并并进行FPLC和琼脂糖凝胶电泳以监测在不同脂蛋白类别中的胆固醇和磷脂分布(为了清楚，磷脂的数据没有显示)。将影响表示为与PBS对照比较变化的％。
图18显示本发明的各种肽(SEQ ID Nos：34，86，91，96，35和36)对PLTP酶活性的影响。SEQ ID Nos：34，86，91和96导致PLTP的活化。
图19显示SEQ ID NO：91的口服施用对血浆脂蛋白的图谱以及胆固醇在胆汁酸中的分泌的急性影响。
图20显示AVP-26249(SEQ ID NO：91)的ad lib施用(通过饮用水)对Chow fed ApoE-/-小鼠中的血浆脂蛋白图谱的影响。
图21显示AVP-26249(SEQ ID NO：91)，AVP-26451(SEQ ID NO：145)，AVP-26452(SEQ ID NO：146)和AVP-26355(SEQ ID NO：118)的adlib施用(通过饮用水)对被饲以高脂肪食物的ApoE-/-小鼠的血浆脂蛋白的图谱的影响。
图22显示AVP-26249(SEQ ID NO：91)，AVP-26451(SEQ ID NO：145)，AVP-26452(SEQ ID NO：146)和AVP-26355(SEQ ID NO：118)的adlib施用(通过饮用水)对被饲以高脂肪食物的ApoE-/-小鼠的胆固醇分泌量的影响。
图23是显示对可能体内增加RCT的测试化合物的体外细胞培养三角筛选方法的示意图。
图24显示AVP-26249(SEQ ID NO：91)和AVP-26452(SEQ ID NO：146)对LDL-介导的胆固醇在HepG2细胞中的累积。
图25显示AVP-26249(SEQ ID NO：91)对Ac-LDL-介导的胆固醇(TC)和胆固醇酯(CE)在人巨噬细胞中的累积的影响。
图26显示AVP-26249(SEQ ID NO：91)和AVP-26452(SEQ ID NO：146)对氧化的LDL(Ox-LDL)介导的胆固醇(TC)和胆固醇酯(CE)在人血管平滑肌细胞中的累积的影响。
图27显示AVP-26249(SEQ ID NO：91)和AVP-26452(SEQ ID NO：146)对从Ac-LDL预载的人巨噬细胞中的胆固醇流出量的影响。
图28显示AVP-26249(SEQ ID NO：91)对ApoE-/-小鼠中的主动脉中的动脉粥样硬化损伤的发展的影响。使ApoE-/-雄性小鼠维持Chow食物4周并维持HFD(1.25％的胆固醇)9.3周。小鼠通过饮用水以0，1.4和2.8mpk的浓度接受AVP-26249“ad lib”13.3周。在试验结束时，分离主动脉并评价动脉粥样硬化损伤的进展。
图29显示AVP-26452(SEQ ID NO：146)对ApoE-/-小鼠中的主动脉中的动脉粥样病变的发展的影响。使ApoE-/-雄性小鼠维持Chow饮食4周并维持HFD(1.25％的胆固醇)9.3周。小鼠通过饮用水以0，1.4和2.8mpk的浓度接受AVP-26452“ad lib”13.3周。在试验结束时，分离主动脉并评价动脉粥样病变的进展。
图30是显示胆固醇转运和代谢途径的示意图。缩写包括CE，胆固醇酯；PLTP，磷脂转运蛋白；TG，三酰甘油；LDL，低密度脂蛋白；HDL，高密度脂蛋白；IDL，中间密度脂蛋白；LCAT，卵磷脂：胆固醇脂酰转移酶。
优选实施方案详述
本发明的优选实施方案中的RCT的介质模拟ApoA-I的功能和活性。在广泛的方面，这些介质是包括三个区域：酸性区域、亲脂性(例如芳香族)区域、和碱性区域的分子。所述分子优选地包含正电荷区域，负电荷区域，和不带电荷的亲脂性区域。关于彼此的区域的定位可以在分子之间变化；因此，在一个优选的实施方案中，不管这三个区域在每个分子中的相对位置，所述分子介导RCT。而在一些优选的实施方案中，所述分子模板或模型包括以任何顺序连接的酸性氨基酸衍生的残基，亲脂性氨基酸衍生的残基，和碱性氨基酸衍生的残基，从而形成RCT的介质，在其它的优选实施方案中，所述分子模型可以通过具有酸性、亲脂性和碱性区域的单一残基，诸如，例如，氨基酸、苯丙氨酸(SEQ ID NO 127)来具体化。
在一些优选的实施方案中，RCT的分子介质包括天然D-或L-氨基酸，氨基酸类似物(合成或半合成)，和氨基酸衍生物的三聚体。例如，三聚体可以包括酸性氨基酸残基或其类似物，芳香族或亲脂性氨基酸残基或其类似物，和碱性氨基酸残基或其类似物，所述残基通过肽或酰胺键键合连接。例如，三聚体序列EFR包括酸性残基(谷氨酸)，芳香族残基(苯丙氨酸)和碱性氨基酸残基(精氨酸)。在本发明的其它优选方面中，所述分子介质可以是更大的基于氨基酸的化合物，其包括一个或多个氨基酸三聚体。例如，十肽，Y EFRDRMRTH，包括上述讨论的酸性-芳香族的-碱性三聚体序列，EFR或efr或rfe，即包含d-氨基酸残基或E-(4-苯基)-FR或修饰的或合成的或半合成的氨基酸残基。
尽管RCT的分子介质共享通过增加直接和/或间接RCT途径(即，增加胆固醇流出量)来减少血清胆固醇的共同方面，优选的介质可以特别显示一个或多个如下的特定功能特征：在脂质存在或缺乏时，形成两亲性螺旋结构或其亚-结构的能力，结合脂质的能力，形成类前-β或类HDL的复合物的能力，活化LCAT的能力，和增加血清HDL浓度的能力。
到目前为止，设计ApoA-I激动剂的尝试已集中在22-mer单位结构，例如，Anantharamaiah et al.，1990，Arteriosclerosis 10(1)：95-105；Venkatachalapathi et al.，1991，Mol.Conformation and Biol.Interactions，Indian Acad.Sci.B：585-596的“共有区22-mer”，其在存在脂质时能形成两亲性α-螺旋。(见例如，涉及衍生自共有区22-mer的修饰的肽模拟物的美国专利号6,376,464)。按照本发明的优选方面，合成了衍生自完整ApoA-I的多个α-螺旋结构域的任一个的相对短的(少于约10个氨基酸残基)两亲性α-螺旋亚-结构，并对其作为RCT的介质进行了测试。与更长的22-mer相比，使用这些相对短的肽具有一些优势。例如，RCT的更短的介质的生产更容易并且花费更少，它们在化学上和构象上更稳定，优选的构象保持相对的刚性，在肽链中很少或没有分子内相互作用，并且更短的肽显示更高程度的口服利用度。这些更短的肽的多个拷贝可与HDL或LDL结合，产生与更受限的大肽相同的效果。尽管ApoA-I的多功能可能基于其多个α-螺旋结构域的贡献，还可能的是甚至ApoA-I的单一功能，例如，LCAT活化可以以众多方式由不止一个的α-螺旋结构域所介导。因此，在本发明的一个优选方面中，ApoA-I的多个功能可以被涉及单一亚-结构域的公开的RCT的介质所模拟。
ApoA-I的三个功能特征被广泛接受为ApoA-I激动剂设计的主要标准：(1)与磷脂关联的能力；(2)激活LCAT的能力；和(3)促进胆固醇从细胞中流出的能力。一些胆固醇转运和代谢途径在图30中进行了举例说明。按照本发明一些方式的RCT的分子介质可以仅显示最后的功能特征-增加RCT的能力。然而，经常被忽视的相当多的ApoA-I的其它特征使ApoA-I成为治疗干涉的特别吸引人的靶向。例如，ApoA-I通过受体介导的过程来定向胆固醇流出到肝中和通过PLTP引发反应调节前-β-HDL(来自外周组织的胆固醇的主要受体)产生。然而，这些特征拓宽了ApoA-I模拟分子的潜在有效性。该观察ApoA-I模拟功能的完全的新方法，将使本文公开的肽或氨基酸衍生的小分子的应用促进直接RCT(通过HDL途径)以及间接的RCT(即，通过重新将它们的流出定向到肝中而从循环中截取和清除LDLs)；见，例如，图30。为了能够增加间接RCT，本发明的分子介质将优选地能够与磷脂关联并与肝结合(即，充当肝脂蛋白结合位点的配体)。
因此，导致本发明的研究尝试的目标是鉴定、设计和合成短(少于约10个氨基酸残基)、显示优先脂质结合构象的稳定的RCT肽介质，通过促进直接和/或间接反向胆固醇转运增加胆固醇向肝的流出，改善血浆脂蛋白图谱，并随后阻止动脉粥样硬化损伤或/和促进动脉粥样硬化损伤的消退。
我们的肽设计策略是：(1)确定在ApoA-I的两亲性α-螺旋结构域中的相对短(3-15个氨基酸残基)的相互作用的区域；(2)使我们首先产生的肽基于精确的ApoA-I序列；(3)按照研究ApoA-I的两亲性α-螺旋结构域出现的一般规则设计肽；(4)限定肽序列长度的下限，关键氨基酸残基，和在最短的可能肽中的精确的拓扑结构(topography)，其仍显示体外和体内的两亲性α-螺旋二级结构和ApoA-I活性；和(5)将定义的物理化学性质并入甚至更短的类小分子肽和/或发展成上述的分子模型的其它小分子的设计。
本发明的RCT的介质可以以稳定的体积或单位剂型，例如可以在体内使用前重构或重新配制的冻干产品，进行制备。本发明包括药物制剂和将这些制剂应用在治疗高脂血症、高胆固醇血症、冠心病、动脉粥样硬化和其它疾病诸如导致败血症性休克的内毒素血症。
本发明通过工作实施例进行举例说明，所述工作实施例证实了本发明的RCT介质与血浆的HDL和LDL成分关联，可以增加HDL和前-β-HDL颗粒的浓度，并降低LDL的血浆水平。因此，促进了直接和间接RCT。本发明的RCT的介质增加人LDL介导的胆固醇在人肝细胞(HepG2细胞)中的累积(如图24所示)。RCT的介质在活化PLTP并因此促进前-β-HDL颗粒形成中也是有效的。HDL胆固醇的增加充当LCAT涉及RCT的间接证据(LCAT活化没有直接显示(体外))。在动物模型中体内应用本发明的RCT介质导致血清HDL浓度的增加。
本发明将在下面分段更详细地进行阐明，其描述了RCT介质的组成和结构；结构和功能特征；制备批量(bulk)和单位剂型制剂的方法；和应用的方法。
肽结构和功能
本发明的RCT的介质通常是模拟ApoA-I活性的肽，或其类似物。RCT的介质由少于约10个氨基酸残基，或其类似物组成。在一些实施方案中，肽中至少一个酰胺键由取代的酰胺，酰胺的等排物(isostere)或酰胺的模拟物取代。另外，一个或多个酰胺键可以由不显著干扰肽的结构或活性的peptidomimetic或酰胺模拟部分所取代。合适的酰胺模拟部分，例如，在Olson et al.，1993，J.Med.Chem.36：3039-3049中有所描述。
优选的肽的特征是它们形成两亲性α-螺旋或亚结构的能力。至于两亲性，其指α-螺旋具有沿其长轴确定方向的相反的亲水和疏水面，即螺旋的一个面主要投射亲水性侧链而相反的面主要投射疏水侧链。
如将在下面结合肽的改变或突变形式更彻底讨论的，某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基所取代从而使肽形成的螺旋的亲水和疏水面各自可以不完全由亲水和疏水氨基酸组成。因此，将理解的是，当指由本发明肽形成的两亲性α-螺旋时，术语“亲水面”指具有全部的网状亲水特征的螺旋的面。术语“疏水面”指具有全部的网状疏水特征的螺旋的面。尽管不倾向于被任何具体理论所束缚，认为由肽形成的两亲性螺旋结构的某些结构和/或物理特性可以有利于它们的活性。这些特性包括两亲性、总疏水性、平均疏水性、疏水和亲水角、疏水力矩、平均疏水力矩和α-螺旋的净电荷的程度。两亲性的程度(疏水性不对称的程度)可以通过计算螺旋的疏水力矩(μH)来方便地进行定量。计算具体肽序列的μH的方法是本领域所众所周知的，并描述，例如在Eisenberg，1984，Ann，Rev.Biochem.53：595-623中。获得的具体肽的实际μH将取决于组成肽的氨基酸残基的总数。因此，通常，直接比较不同长度的肽的μH没有提供信息。
不同长度的肽的两亲性可以通过平均疏水力矩(<μH>)的方式直接进行比较。平均疏水力矩可以通过用螺旋中残基的数量除μH来获得(即<μH>＝μH/N)。通常，认为如使用Eisenberg(Eisenberg，1984，J.Mol.Biol.179：125-142)标准化的公认疏水性等级所确定的显示μH范围在0.45-0.65的优选的肽在本发明范围内，优选在0.50-0.60的<μH>。
可以通过取肽中每个氨基酸残基的疏水性的代数和来方便地计算肽的全部或总疏水性(Ho)：
Figure A20048001747700251
其中N是肽中氨基酸残基的数量并且Hi是第I个氨基酸残基的疏水性)。平均疏水性(<Ho>)是氨基酸残基的数量除疏水性(即，<Ho>＝Ho/N)。通常，认为如使用Eisenberg(Eisenberg，1984，J.Mol.Biol.179：125-142)标准化的公认疏水性等级所确定的显示平均疏水性范围在-0.050到-0.070的肽在本发明范围内，优选在-0.030至-0.055范围的平均疏水性。
两亲性螺旋的疏水面(Ho pho)的总疏水性可以通过取疏水氨基酸残基的疏水性的总和来获得，所述疏水氨基酸残基的疏水性落入如下定义的疏水角：
H o pho = &Sigma; i&alpha; 1 N H i *
其中Hi是以前所定义的并且NH是疏水面中的疏水氨基酸的总数)。疏水面的平均疏水性(<Ho pho>)是Ho pho/NH，其中NH如上定义。通常，认为如使用Eisenberg(Eisenberg，1984，supra；Eisenberg，1982，supra)的公认疏水性等级所确定的显示<Ho pho>在0.90到1.20范围内的肽在本发明范围内，优选在0.94至1.10范围的<Ho pho>。
当所述肽以Schiffer-Edmundson螺旋轴形式排列(即，在轴上的连续疏水残基的数目以20°增加)时，通常将疏水角(pho角)定义为被疏水氨基酸残基的最长的连续伸展序列所覆盖的角或的弧。亲水性角(phi角)在360°和pho角之间是不同的(即，360°-pho角)。本领域那些技术人员将意识到pho和phi角将部分取决于肽中的氨基酸残基的数目。
按照本发明的优选方面，预期具有酸性、芳香族和碱性区域的两亲性肽和分子介质通过将它们的疏水面指向脂质部分的烷基链而结合磷脂。认为对于本发明的肽，疏水簇将产生足够强的脂质结合亲和性。由于脂质结合对于LCAT的激活是先决条件，还认为疏水簇可以增加LCAT激活。此外，经常发现芳香族残基在将肽和蛋白锚定在脂质中是重要的(De Kruijff，1990，Biosci.Rep.10：127-130；O′Neil and De Grado，1990，Science250：645-651；Blondelle et al.，1993，Biochim.Biophys.Acta 1202：331-336)。
本发明的肽和脂质之间的相互作用导致形成肽-脂质复合物优选的实施方案。获得的复合物类型(comicelle、盘、囊泡或多层)将取决于脂质：肽摩尔比，并且通常在低脂质：肽摩尔比率时形成comicelles，在增加的脂质：肽摩尔比率时形成盘状和囊状或多层的复合物。已经描述了对于两亲性肽(Epand，The Amphipathic Helix，1993)和ApoA-I(Jones，1992，Structureand Function of Apolipoprotein，Chapter 8，pp.217-250)的这种特性。脂质：肽的摩尔比还确定所述复合物的大小和组成。
在ApoA-I的通常接受的结构模型中，两亲性α-螺旋在盘状HDL边缘周围被包装。在该模型中，假定螺旋与指向脂质酰基链的疏水面一起排列(align)(Brasseur et al.，1990，Biochim.Biophys.Acta 1043：245-252)。螺旋以反向平行的方式排列，并认为螺旋间的协同效应有助于盘状HDL复合物的稳定性(Brasseur et al.，supra)。尽管已经提议有助于HDL盘状复合物的稳定性一个因素是ApoA-I中的酸性和碱性残基间的离子相互作用的存在，所述离子相互作用导致在邻近反向平行的螺旋上的残基之间的分子间盐桥或氢键的形成，这种分子间相互作用对于分子介质的活性是不必需的。因此，RCT的介质中的一些的另外的特征是它们当以反向平行的方式与它们的指向相同方向的疏水面一起排列时，彼此之间形成分子间氢键的能力，诸如当介质与脂质结合时将是这种情况。
广泛支持各自在螺旋的i和i+3位置上的酸性和碱性残基之间形成的分子内氢键或盐桥稳定所述螺旋的结构(Marqusee et al.，1985，PNAS.USA84(24)：8898-8902)。然而，这些分子内相互作用在本发明的相对小的分子内是最小的。
用于本文时，遗传编码的L-对映体氨基酸的缩写是常规的并且如下：以小写字母指示D-氨基酸，例如，D-丙氨酸＝a，等。
表1
  氨基酸   单字母符号   常用缩写
  丙氨酸精氨酸天冬酰胺天冬氨酸半胱氨酸谷氨酰胺谷氨酸甘氨酸组氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸苯丙氨酸脯氨酸丝氨酸苏氨酸色氨酸酪氨酸缬氨酸   ARNDCQEGHILKFPSTWYV   AlaArgAsnAspCysGlnGluGlyHisIleLeuLysPheProSerThrTrpTyrVal
RCT的肽介质中的某些氨基酸残基可以被其它氨基酸残基所取代，而不会对所述肽的活性有显著不利影响，并在许多情况中甚至增加所述肽的活性。因此，本发明还预期RCT的肽介质的改变或突变形式，在所述改变或突变形式中，结构中的至少一个限定的氨基酸残基被另一个氨基酸残基或其衍生物和/或类似物所取代。因为影响本发明的肽的活性的特征之一是它们在存在脂质时形成显示上述的两亲性和其它特性的α-螺旋的能力，因此将认识到的是在本发明的优选实施方案中，氨基酸的取代是保守的，即，取代的氨基酸残基具有类似于被取代的氨基酸残基的物理和化学特性。
出于确定保守氨基酸残基取代的目的，可以将氨基酸方便地分成两个主要类别：主要基于氨基酸侧链的物理-化学特性的亲水的和疏水的。可将这两个主要类别进一步分成更清楚定义氨基酸侧链特征的亚类。例如，可以将亲水性氨基酸类别进一步细分成酸性、碱性和极性氨基酸。可以将疏水性氨基酸类别进一步细分成非极性和芳香族氨基酸。限定ApoA-I的各种氨基酸类别如下进行定义：
术语“亲水性氨基酸”指按照Eisenberg et al.，1984，J.Mol.Biol.179：125-142的标准化公认疏水性等级显示疏水性少于0的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸包括苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、赖氨酸(K)和精氨酸(R)。
术语“疏水性氨基酸”指按照Eisenberg et al.，1984，J.Mol.Biol.179：125-142的标准化公认疏水性等级显示疏水性大于0的氨基酸。遗传编码的疏水性氨基酸包括脯氨酸(P)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)。
术语“酸性氨基酸”指侧链pK值少于7的亲水性氨基酸。由于氢离子丢失，酸性氨基酸典型地在生理pH上具有带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)。
术语“碱性氨基酸”指侧链的pK值大于7的亲水性氨基酸。由于与水合氢离子相关，碱性氨基酸典型地在生理pH上具有带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括组氨酸(H)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)。
术语“极性氨基酸”指一种亲水性氨基酸，其在生理pH上具有不带电的侧链，但具有至少一个键，在所述键中被两个原子共享的一对电子被其中一个原子更紧密地拥有。遗传编码的极性氨基酸包括天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
术语“非极性氨基酸”指一种疏水性氨基酸，其在生理pH上具有不带电的侧链，并具有其中被两个原子共享的一对电子通常被两个原子的每个相同地拥有的键(即，侧链是非极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包括亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)。
术语“芳香族氨基酸”指具有带有至少一个芳香族或杂芳香族的环的侧链的疏水性氨基酸。芳香族或杂芳香族的环可以包含一个或多个取代基诸如-OH，-SH，-CN，-F，-Cl，-Br，-I，-NO2，-NO，-NH2，-NHR，-NRR，-C(O)R，-C(O)OH，-C(O)OR，-C(O)NH2，-C(O)NHR，-C(O)NRR等，其中每个R独立地是(C1-C6)烷基，取代的(C1-C6)烷基，(C1-C6)链烯基，取代的(C1-C6)链烯基，(C1-C6)炔基，取代的(C1-C6)炔基，(C5-C20)芳基，取代的(C5-C20)芳基，(C6-C26)烷芳基，取代的(C6-C26)烷芳基，5-20元的杂芳基，取代的5-20元的杂芳基，6-26元的alkheteroaryl或取代的6-26元alkheteroaryl。遗传编码的芳香族氨基酸包括苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。
术语“脂族氨基酸”指具有脂族烃侧链的疏水性氨基酸。遗传编码的脂族氨基酸包括丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)。
氨基酸残基半胱氨酸(C)是独特的，原因在于其可以与其它半胱氨酸(C)残基或其它含硫烷基的氨基酸形成二硫化物桥。半胱氨酸(C)残基(和其它具有含-SH的侧链的氨基酸)以还原的游离-SH或是氧化的二硫化物桥连形式存在于肽中的能力影响半胱氨酸(C)残基贡献给肽净疏水还是亲水特征。尽管按照Eisenberg(Eisenberg，1984，supra)的标准化公认疏水性等级，半胱氨酸(C)显示0.29的疏水性，要理解的是尽管上面详细说明了一般分类，出于本发明的目的，将半胱氨酸(C)归类为极性亲水氨基酸。
如本领域那些技术人员将理解的，上述类别不是彼此排斥的。因此可以将具有显示两个或更多物理-化学特性的侧链的氨基酸包括在多个类别中。例如，具有进一步被极性取代基取代的芳香族部分的氨基酸侧链，诸如酪氨酸(Y)，可以显示芳香族疏水特性和极性或亲水特性，因此可被包括在芳香族和极性类别中。任何氨基酸的合适分类对于那些本领域技术人员是显而易见的，特别是根据本文提供的详细说明书。
某些被称为“螺旋中断”氨基酸的氨基酸残基，当被包含在螺旋中的内部位置时具有中断α-螺旋结构的倾向。显示这种螺旋-中断特性的氨基酸残基在本领域是众所周知的(见，例如，Chou and Fasman，Ann.Rev.Biochem.47：251-276)并包括脯氨酸(P)，甘氨酸(G)和潜在地所有D-氨基酸(当被包含在L-肽中时；反过来，当被包含在D-肽中时，L-氨基酸中断螺旋结构)。尽管除甘氨酸(G)外，这些螺旋中断氨基酸残基属于上面定义的类别，这些残基通常不用于在螺旋中的内部位置上取代氨基酸残基-它们通常用于在肽的N-端和/或C-端取代1-3个氨基酸残基。
尽管上述定义的类别已经在遗传编码的氨基酸方面得到例证，氨基酸取代不需，并在某些实施方案中优选地不限定于遗传编码的氨基酸。确实，RCT的许多优选的肽介质包含遗传非编码的氨基酸。因此，除天然存在的遗传编码氨基酸外，RCT的肽介质中的氨基酸残基可以由天然存在的非编码氨基酸和合成氨基酸所取代。
提供RCT的肽介质的有用取代的某些常见氨基酸包括，但不限于β-丙氨酸(β-Ala)和其它ω-氨基酸诸如3-氨基丙酸，2，3-二氨基丙酸(Dpr)，4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；t-丁基丙氨酸(t-BuA)；t-丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；萘基丙氨酸(Nal)；4-苯基苯丙氨酸，4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Pbe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2，4-二氨基丁酸(Dbu)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；p-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)，高苯丙氨酸(hPhe)；和高丝氨酸(hSer)；羟脯氨酸(Hyp)，高脯氨酸(hPro)，N-甲基化的氨基酸和peptoids(N-取代的甘氨酸)。
可以将本文没有具体提及的其它氨基酸残基容易地基于它们根据本文提供的定义被观察到的物理和化学性质进行分类。
可以将按照上面定义的类别的遗传编码的氨基酸和常见的非编码氨基酸的分类总结于下面的表2中。要理解的是表2仅出于举例说明的目的而不是可用于取代本文所述的RCT的肽介质的氨基酸残基和衍生物的全部的列表。
表2常见氨基酸的分类
  分类   遗传编码的   非遗传编码的
  疏水性芳香族的非极性脂族亲水性酸性碱性极性螺旋-中断 F，Y，WL，V，I，M，G，A，PA，V，L，ID，EH，K，RC，Q，N，S，TP，G Phg，Nal，Thi，Tic，Phe(4-Cl)，Phe(2-F)，Phe(3-F)，Phe(4-F)，hPhet-BuA，t-BuG，MeIle，Nle，MeVal，Cha，McGly，Aibb-Ala，Dpr，Aib，Aha，MeGly，t-BuA，t-BuG，MeIle，Cha，Nle，MeValDpr，Orn，hArg，Phe(p-NH2)，Dbu，DabCit，AcLys，MSO，bAla，hSerD-Pro和其它D-氨基酸(在L-肽中)
可以将本文没有具体提及的其它氨基酸残基容易地基于它们根据本文提供的定义被观察到的物理和化学性质进行分类。
尽管在大多数情况中，RCT的肽介质的氨基酸将被L-对映体氨基酸所取代，取代不限于L-对映体氨基酸。因此，包括在“突变”或“改变”形式定义中的还有那些取代，其中L-氨基酸被相同的D-氨基酸所取代(例如，L-精氨酸→D-精氨酸)或被相同类或亚类的D-氨基酸所取代(L-精氨酸D-赖氨酸)，反之亦然。确实，在某些适合于向动物受试者进行口服施用的优选的实施方案中，肽可以有利地由至少一个D-对映体的氨基酸组成。认为与全部由L-氨基酸组成的肽相比，包含这些D-氨基酸的肽对于在口腔、肠或血清中的降解更稳定。
如上所注，当被包含在α-螺旋L肽的内部位置上时，D-氨基酸倾向于中断α-螺旋的结构。而且，已经观察到完全由D-氨基酸组成的RCT的肽介质的某些突变形式在本文所述的测定中显示了比完全由L-氨基酸组成的相同的肽明显更低的LCAT活化。结果，D-氨基酸通常不用于取代内部L-氨基酸；D-氨基酸取代通常限于在肽的N-端和/或C-端的1-3个氨基酸残基。因为多拷贝的肽可能与HDL或LDL相关，在小d-氨基酸肽的情况中，可能不能应用该规则从而获得RCT需要的构象。
如前面讨论，当被包含在肽的内部位置中时，氨基酸甘氨酸(G)通常充当螺旋中断残基。因此，尽管通常认为甘氨酸(G)是螺旋-中断残基，可将甘氨酸(G)用于取代在RCT的肽介质的内部位置上的氨基酸。优选地，仅有定位在肽中心的约±1的螺旋回转中的内部残基(特别对于由同等数目的氨基酸组成的肽)由甘氨酸(G)所取代。另外，优选在肽中仅有一个内部氨基酸残基被甘氨酸(G)所取代。
ApoA-I的天然结构包含8个螺旋单位，认为这与结合脂质的作用是相关的(Nakagawa et al.，1985，J.Am.Chem.Soc.107：7087-7092；Anantharamaiah et al.，1985，J.Biol.Chem.260：10248-10262；Vanloo et al.，1991，J.Lipid Res.32：1253-1264；Mendez et al.，1994，J.Clin.Invest.94：1698-1705；Palgunari et al.，1996，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16：328-338；Demoor et al.，1996，Eur.J.Biochem.239：74-84)。因此，还包括在本发明中的是RCT的介质，其由本文所述的螺旋结构域的二聚体、三聚体、四聚体和甚至更高级的聚合物(“多聚体”)组成。这些多聚体可以以串连重复、分枝网络或其组合物的形式存在。RCT的肽介质可以彼此直接相连，由一个或多个接头分隔，或以多聚体化学计量独立地用于与脂质的关联中(例如，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1，8∶1的介质：脂质，并可能更高的化学计量比率)。
包括多聚物的RCT的肽介质可包括ApoA-I的肽序列的区域、ApoA-I序列的类似物，ApoA-I的突变形式，ApoA-I的被截短或内部缺失的形式，ApoA-I的延长形式和/或其组合。RCT的肽介质的被截短形式通过从RCT的介质的N-和/或C-端缺失一个或多个氨基酸而获得。内部缺失形式通过从RCT的肽介质中的内部位置中缺失一个或多个氨基酸而获得。内部氨基酸残基缺失可以或不可以是连续的残基。本领域的那些技术人员将认识到从RCT的肽介质中缺失内部氨基酸残基可导致螺旋的亲水-疏水界面的平面在缺失点旋转。因为这些旋转可明显改变得到的螺旋的两亲性特性，在本发明的优选的实施方案中，氨基酸残基缺失从而基本保持亲水-疏水界面的平面沿螺旋的整个长轴排列。
接头
RCT的肽介质可以以头-尾方式(即，N-端到C-端)，头-头方式，(即N端-N端)、尾-尾方式(即，C端-C端)，或其组合进行连接或连结。接头LL可以是能够将两个肽彼此共价连接的任何双功能分子。因此，合适的接头是其中官能团能共价连接于肽的N和/或C-端的双功能分子。作为影响这种共价键形成的合适的化学原理(chemistries)，适合于附着肽的N-或C-端的官能团是本领域众所周知的。
取决于多聚体所需性质，接头可以是柔性、刚性或半刚性的。合适的接头包括，例如，氨基酸残基诸如脯氨酸或甘氨酸或包含约2-约5，10，15或20甚至更多氨基酸的肽部分，双功能有机化合物诸如其中n是从1-12的整数的H2N(CH2)COOH，等。这些接头的实例，以及制作这些接头的方法和结合这些接头的肽是本领域众所周知的(见，例如，Hunig et al.，1974，Chem.Ber.100：3039-3044；Basak et al.，1994，Bioconjug.Chem.5(4)：301-305)。
可以被选择性裂解的肽和寡核苷酸接头，以及裂解这些接头的方式是众所周知的并将容易地对于本领域那些技术人员是显而易见的。可以选择性被裂解的合适的有机化合物接头将对于本领域那些技术人员是显而易见的，并包括描述在，例如，WO 94/08051，以及本文所引用的参考文献中的那些。
足够长度和柔性的接头包括，但不限于，脯氨酸(P)，甘氨酸(G)，半胱氨酸-半胱氨酸，其中n是1-12，优选地是4-6的H2N-(CH2)n-COOH；H2N-芳基-COOH和碳水化合物。
或者，因为天然载脂蛋白容许反向平行螺旋部分间的协同结合，以一级序列对应于连接邻近的天然载脂蛋白的螺旋的肽的部分的肽接头可以方便地用于连接肽，所述天然载脂蛋白包括，例如，ApoA-I，ApoA-II，ApoA-IV，ApoC-I，ApoC-II，ApoC-III，ApoD，ApoE和ApoJ。这些序列是本领域众所周知的(见，例如，Rosseneu et al.，“Analysis of the Primaryand of the Secondary Structure of the Apolipoproteins，”In：Structure andFunction of Lipoproteins，Ch.6，159-183，CRC Press，Inc.，1992)。
容许反向平行的螺旋部分的串连重复之间的分子间氢键或盐桥的形成的其它接头包括肽转角诸如β-转角和γ-转角，以及模仿肽β-转角和/或γ-转角结构的有机分子。通常，转角是翻转多肽链的方向从而容许单一多肽链采取反向平行的β-折叠或反向平行的α螺旋结构的区域的肽的部分。β-转角通常由四个氨基酸残基组成而γ-转角通常由三个氨基酸残基组成。
或者，所述接头(LL)可以包括模仿肽β-转角或γ-转角的结构的有机分子或部分。这些β-转角和/或γ-转角模拟部分，以及合成包含这些部分的肽的方法是本领域众所周知的，并特别包括，描述在Giannis and Kolter，1993 Angew.Chem.Intl.Ed.Eng.32：1244-1267；Kahn et al.，1988，J.Molecular Recognition 1：75-79；和Kahn et al.，1987，Tetrahedron Lett.28：1623-1626中的那些。
与单一连接部分连接的螺旋部分不需要通过类末端连接。确实，在一些实施方案中，螺旋部分连接于单一连接部分从而以反向平行方式排列，即，一些螺旋通过它们的N-端，其它的通过它们的C-端连接。
如前所述，螺旋部分可直接与连接部分连接，或可通过一个或多个双功能接头(LL)的方式与接头部分隔开。
网络中的节的数目将通常取决于螺旋部分总的所需数目，并将典型地从约1至2。当然，将理解的是对于所需螺旋部分的给定数目，具有更高级连接部分的网络将具有更少的节。
所述网络可以是均一等级的，即，其中所有的节是，例如，三官能或四官能连接部分的网络，或可以是混和等级的，例如，其中的节是，例如，三官能和四官能连接部分的混合物的网络。当然，要理解的是甚至在均一等级网络中，连接部分不需是相同的。第三级网络可以应用，例如，两个、三个、四个或甚至更多不同的三官能连接部分。
如线性多聚体，包含分枝网络的螺旋部分可以，但不需要是相同的。
结构和功能分析
可对包括上述多聚体形式的本发明的RCT的介质的结构和功能进行测定从而选择活性化合物。例如，可以测定肽或肽类似物的形成α-螺旋、结合脂质、与脂质形成复合物、活化LCAT和促进胆固醇流出等的能力。
分析肽的结构和/或功能的方法和试验是本领域众所周知的。下文以工作实施例提供了优选的方法。例如，可以将下文的圆二色性(CD)和核磁共振(NMR)测定用于分析肽或肽类似物的结构一具体地，存在脂质时螺旋性的程度。使用下文所述的荧光光谱测定可以确定结合脂质的能力。可以使用下文所述的LCAT活化可容易地确定肽和/或肽类似物活化LCAT的能力。可以将下文所述的体外和体内测定用于评价半衰期、分布、胆固醇流出和对RCT的影响。
优选的实施方案
可以通过优选实施方案的方式进一步定义本发明的RCT的介质。
在一个优选实施方案中，有包括基于氨基酸的组合物的分子，所述组合物具有三个独立的区域：酸性区域、芳香区域或亲脂性区域，和碱性区域。因此，按照该优选实施方案的三聚肽，诸如EFR，或erf或fre包含酸性氨基酸残基，芳香族或亲脂性残基和碱性残基。关于彼此的区域的相对定位可以在分子介质之间变化；不管这三个区域在每个分子中的位置，所述分子介导RCT。在包括三聚肽，诸如EFR或efr的介质中，三聚体可以由天然D-或L-氨基酸、氨基酸类似物，和氨基酸衍生物组成。
在另一个优选实施方案中，三聚体的芳香族区域可以由具有酸性或碱性侧链的烟酸组成。
在另一个优选实施方案中，三聚体的芳香族区域可以由4-苯基苯丙氨酸组成。
在另一个优选变化中，包括基于氨基酸的三聚体结构的分子介质可任选地在任一端或两端被氨基或羧基端上的亲脂性基团加帽从而提高RCT的分子介质的物理化学特性，并利用脂肪或亲脂性物质的天然或主动转运(吸收)系统到体内。加帽的基团可以是D或L对映体或非-对映体的分子或基团。在优选的实施方案中，N-端加帽基团是选自由下列组成的组中的基团：乙酰基、苯乙酰基、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、f-MOC、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等。C-端优选地被胺诸如RNH2加帽，其中R＝二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、f-MOC、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基等
在一个优选的实施方案中，本发明的RCT的介质选自下面表3提出的肽和肽衍生物的组，其中所有的肽被N-端的酰基基团和C-端的酰胺基团加帽(除非另外具体指出)：
表3
SEO ID NO                序列
1                        YEFRDRMRTH
2                        PVAEEFRDRMRTHVDSLRTQLAP
3                        EEFRDRMRTHVDSLRTQLAP
4                            FRDRMRTHVDSLRTQLAP
5                            RDRMRTHVDSLRTQLAP
6                            RTHVDSLRTQLAP
7                            THVDSLRTQLAP
8                            DSLRTQLAP
9                            PVAEEFRDRMRTHV
10                           PVAEEFRDRMR
11                           PVAEEFRDRM
12                           PVAEEFRDR
13                           PVAEEF
14                           PVAEE
15                           MRTHVDSLRTQLAP
16                           PVAEEFRDRMRTHVDSLR
17                           WDKVKDF
18                           SGRDYVSQFES
19                           YLDEFQKKWKE
20                           TRDFWDNLEKETDW
21                           WDKVKDFANVYVDAVKD
22                           PhCH2CO-YEFRDRMRTH
23                           YEFRDRMRTH
24                           Piv-TEFRDRMRTH
25                           EFRDRMRTH
26                           EFRDRMR
27                           FRDRMRTH
28                           yFRDRMRTh
29                           eEFRDRMR
30                           FrDRFRDr
31                           EFRDRm
32                           EFRDR
33                           EFRD
34                           EFR
35                           rDRMRTh
36                           dRMRTH
37                           FrDRMRT
38                           FRDRMR
39                           FfRDRMr
40                           FRDRM
41                           YFRDRM
42                           YFRDr
43                           FRDRf
44                           EFRDRMRTF
45                           EFRDRf
46                           FrDrFF
47                           FrDrFY
48                           FfDRFRDRf
49                           mrDRFRDRm
50                           FRDRFRDRF
51                           FRDRMRDRM
52                           MRDRFRDRM
53                           RMRDRmr
54                           FRDRMRDRF
55                           EFRDRMRDRFE
56                           FRdR
57                           FRD
58                           YFRD
59                           frDRMRDRm
60                           MRDRM
61                           mRDRM
62                           FRDRF
63                           FRDRf
64                           RMRDRMR
65                           DRMRD
66                           dRMRd
67                           frDRMRDrF
68                           RFEEFR
69                           FRTRf
70                           FRMRf
71                           efRDRMRDRf
72                           DRMRDF
73                           yyyp-EFRDRMRTH
74                           Yyp-EFRDRMRt
75                           YyYpEFRDRMRt
76                           EFRDRMRy
77                           yyypEFRDRMR
78                           YEFRDRm
79                           yYYpEFRDRm
80                           EFRDRy
81                           EFRDy
82                           yYYp-EFRD
83                           efry
84                           yYP-EFR
85                           yYYp-EFRDr
86                           erf
87                           EEFRDR
88                           EYR
89                           E-(L-2-b-萘基丙氨酸)-R
90                           E-(L-1-b-萘基丙氨酸)-R
91                           E-BIP-R
92                           H-EFR-OH
93                           EFR-OH
94                           H-EFR
95                           RFE
96                           efr
97                           2-Nap-EFR
98                            yefr
99                            2-Nap-efry
100                           Piv-efry
101                           Fmoc-efry
102                           2-Nap-erf
103                           2-Nap-yefr
104                           Piv-EFR
105                           NA-EFR
106                           3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-E-(E-BIP-R-NH2)
107                           YWHVWQQDE
108                           YQWDKVKDF
109                           ENWDTLGSY
110                           SGRDYVSQFES
111                           VRQEMNKDLEEVKQKVY
112                           YQMRESLAQRLY
113                           TRDFWDNLEKETDWY
114                           DEFQKKWKEY
115                           WKEDVELYRQKV
116                           YSLAQRLAELKSY
117                           QESARQKLQELQY
118                           yerf
119                           rfe
120                           Fmoc-EFR-OH
121                           NA-yerf
122                           NA-E-BIP-R
123                           erfy
124                           NA-erfy
125                           2-Nap-E-BIP-R
126                           NA-efr
127                           H-F-OH(L or D)
128                           3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-E-BIP-R
129                           (1-萘基)-L-丙氨酸
130                           (1-萘基)-D-丙氨酸
131                           (2-萘基)-L-丙氨酸
132                           (2-萘基)-D-丙氨酸
133                           BIP-A
134                           BIP-a
135                           NA-fre
136                           1-Nap-erfy
137                           1-Nap-E-BIP-R
138                           NA-yfre
139                           yfre
140                           NA-erf
141                           2-Nap-efry-OH
142                           3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-frey
143                           NA-frey
144                           NA-fr
145                           e-BIP-r
146                           e-bip-r
147                           Isox-e-bip-r
148                           1-Nap-rfey
149                           1-Nap-frey
150                           E-BIP-R-OH
151                           3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-erf
152                           frey
153                           rfey
154                           3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-fer
155                           异噁唑-refy
156                           refy
157                           NA-refy
158                           3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-refy
159                           异噁唑-fer
160                           异噁唑-yref
161                           NA-yref
162                           3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-fery
163                           3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-fr
164                           异噁唑-fery
165                           3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-rfey
166                           fery
167                           3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-rf
168                           NA-yfer
169                           异噁唑-yfer
170                           NA-fer
171                           3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-yfer
172                           异噁唑-rfe
173                           1-Nap-yfer
174                           1-Nap-rfe
175                           NA-rfe
176                           E-F(4-I)-R
用于遗传编码的氨基酸的D-对映体的缩写是表1中所示的单字母符号的小写字母等价物。例如，“R”指L-精氨酸并且“r”指D-精氨酸。除非另外指出(例如“OH”)，N-端是乙酰化了的并且C-端是酰胺化的。
PhAc指苯基乙酰化了的。
Piv指新戊酰化的(pivolylated)。
1-Nap & 2-Nap指萘酸(naphthylic acid)加帽的。
Fmoc指用9-芴基甲氧基羰基修饰的N-端。
NA指烟酸。
BIP指双苯基丙氨酸
异噁唑指5-甲基-异噁唑-3-羧酸衍生物
氨基酸取代不需，并在某些实施方案中优选地不局限于遗传编码的氨基酸。因此，除了天然存在的遗传编码的氨基酸之外，RCT的肽介质中的氨基酸残基可以被天然存在的非编码氨基酸和合成氨基酸取代。
合成方法
可使用实际上的领域-已知的制备肽的任何技来制备本发明的肽。例如，可以使用常规分步溶液或固相肽合成，或重组DNA技术来制备肽。
使用常规的分步溶液或固相合成(见，例如Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins，Williams et al.，Eds.，1997，CRC Press，Boca Raton Fla.，和其中引用的参考文献；Solid Phase Peptide Synthesis：APractical Approach，Atherton & Sheppard，Eds.，1989，IRL Press，Oxford，England，和其中引用的参考文献)来制备RCT的肽介质。见图1。
在常规固相合成中，第一个氨基酸的连接在化学上需要使其羧基端(C-端)末端与衍生化的树脂反应从而形成寡肽的羧基-端末端。氨基酸的α-氨基末端典型地由t-丁氧基-羰基基团(t-Boc)或9-芴基甲基氧基羰基(F-Moc)基团封闭从而阻止能够另外反应的氨基基团参与偶联反应。氨基酸的侧链基团，如果是反应性的，也被各种醚、硫醚、酯和氨基甲酸酯形式的苄基衍生的保护基所封闭(或被保护)。
接下来的步骤和随后的重复循环包括对氨基-端(N-端)结合树脂的氨基酸(或肽链的末端残基)进行解封闭从而去除α-氨基封闭基团，随后化学添加(偶联)下面的封闭氨基酸。然而，该方法被重复很多个循环，所述循环对于合成完整目标肽链所需要的。在偶联和解封闭步骤的每个后，将树脂结合肽彻底洗去以在继续进行下面的(步骤)之前去除任何残余的反应物。固体支持颗粒在任何给定的步骤促进去除试剂，因为当被保持在具有多孔洞的柱或装置上时，可以容易地过滤和洗涤树脂和树脂-结合肽。
通过酸催化(典型地用氢氟酸或三氟乙酸)，合成肽可以从树脂上释放下来，所述酸催化将肽从树脂上裂解下来，将酰胺或羧基基团留在其C-端氨基酸上。酸解裂解还在肽的合成中用于从氨基酸的侧链上去除保护基。然后可以通过各种层析法的任何一个将得到的肽进行纯化。
按照一个优选的实施方案，用Na-Fmoc化学通过固相合成方法来合成RCT的肽和肽衍生物的介质。Na-Fmoc保护氨基酸和Rink酰胺MBHA树脂并且Wang树脂购自Novabiochem(San Diego，CA)或Chem-ImpexIntl(Wood Dale，IL)。其它的化学品和溶剂购自如下来源：三氟乙酸(TFA)、茴香醚、1，2-乙二硫醇(1，2-ethanedithiol)、苯硫基甲烷、哌啶、乙酸酐、2-萘酸和新戊酸(Pivaloic acid)(Aldrich，Milwaukee，WI)，HOBt和NMP(Chem-Impex Intl，Wood Dale，IL)，来自Fischer Scientific，Pittsburgh，PA的二氯甲烷、甲醇和HPLC级溶剂。通过LC/MS检查肽的纯度。使用在C18-结合的硅胶柱(Tosoh Biospec制备柱，ODS-80TM，Dim：21.5mm×30cm)上的制备HPLC系统(Agilent technologies，1100 Series)实现肽的纯化。使用梯度系统[50％-90％的B溶剂(具有0.1％的TFA的乙腈∶水60∶40)洗脱肽。
使用Rink酰胺MBHA树脂(0.5-0.66mmol/g)或wang树脂(1.2mmol/g)通过固相方法以分步方式合成所有的肽。侧链的保护基是精氨酸(Pbf)、谷氨酸(OtBu)和酪氨酸(tBu)。使用1.5-3倍过量的保护氨基酸，使每个Fmoc保护氨基酸与该树脂偶联。偶联试剂是N-羟基苯并三唑(HOBt)和二异丙基碳二亚胺(DIC)，并且通过水合茚三酮试验监测偶联。用在NMP中的20％哌啶30-60分钟处理去除Fmoc基团，然后用CH2Cl2、在CH2Cl2中的10％TEA、甲醇和CH2Cl2连续洗涤。偶联步骤后，进行乙酰化作用或如果需要使用其它的加帽基团。
使用TFA、苯硫基甲烷、乙二硫醇和茴香醚(90∶5∶3∶2，v/v)(4-5小时于室温)的混合物将肽从肽-树脂上裂解下来并去除所有的侧链保护基。将粗肽混和物从烧结的漏斗中过滤，用TFA洗涤它(2-3次)。将过滤物浓缩为厚浆，并加入到冷醚中。在冷藏箱中保持过夜并离心后，肽沉淀为白色固体。将溶液倾去并用醚彻底洗涤所述固体。将得到的粗肽溶解在缓冲液(具有0.1％TFA的乙腈∶水60∶40)中并进行干燥。使用具有50-90％B的梯度系统的制备C-18柱(反相)通过HPLC在40分钟内纯化粗肽[缓冲液A：包含0.1％(v/v)TFA的水，缓冲液B：包含0.1％(v/v)TFA的乙腈∶水(60∶40)]。在Speedvac上浓缩纯化级分。产量从5％变化到20％。
如上所述合成的加帽的肽显示在表4中。
                       表4
SEO ID NO                  序列
34                         Ac-E-F-R-NH2
83                         Ac-e-f-r-y-NH2
86                         Ac-e-r-f-NH2
91                         Ac-E-BIP-R-NH2
97                         2-Nap-E-F-R-NH2
98                         Ac-y-e-f-r-NH2
99                         2-Nap-e-f-r-yNH2
100                        Piv-e-f-r-y-NH2
101                        Fmoc-e-f-r-y-NH2
102                        2-Nap-e-r-f-NH2
103                        2-Nap-y-e-f-r-NH2
104                        Piv-E-F-R-NH2
105                        NA-E-F-R-NH2
106                        3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-E-(E-BIP-R-NH2)
118                        Ac-y-e-r-f-NH2
119                        Ac-r-f-e-NH2
120                        Fmoc-E-F-R-OH
121                        NA-y-e-r-f-NH2
122                        NA-E-BIP-R-NH2
123                        Ac-e-r-f-y-NH2
124                        NA-e-r-f-y-NH2
126                        NA-e-f-r-NH2
125                        2-Nap-E-BIP-R-NH2
Ac指乙酰化的。
Piv指新戊酰化的。
1-Nap & 2-Nap指萘酸加帽的。
Fmoc指用9-芴基甲氧基羰基修饰的N-端。
NA指烟酸。
BIP指双苯基丙氨酸。
异噁唑指5-甲基-异噁唑-3-羧酸衍生物。
或者，本发明的肽可以通过链段缩合的方式进行制备，即将小的组成肽链连接在一起形成更大的肽链，如，例如描述于Liu et al.，1996，Tetrahedron Lett.37(7)：933-936；Baca，et al.，1995，J.Am.Chem.Soc.117：1881-1887；Tam et al.，1995，Int.J.Peptide Protein Res.45：209-216；Schnolzer and Kent，1992，Science 256：221-225；Liu and Tam，1994，J.Am.Chem.Soc.116(10)：4149-4153；Liu and Tam，1994，PNAS USA 91：6584-6588；Yamashiro and Li，1988，Int.J.Peptide Protein Res.31：322-334；Nakagawa et al.，1985，J.Am Chem.Soc.107：7087-7083；Nokihara et al.，1989，Peptides 1988：166-168；Kneib-Cordonnier et al.，1990，Int.J.Pept.Protein Res.35：527-538；将其说明书全文全部内容并入此作为参考)中。其它用于合成本发明的肽的方法描述在Nakagawa et al.，1985，J.Am.Chem.Soc.107：7087-7092。
对于通过链段缩合制备的肽，缩合步骤的偶联效率可以通过增加偶联时间而明显增加。典型地，增加偶联时间导致产物外消旋作用的增加(Sieber et al，1970；Helv.Chim：Acta 53：2135-2150)。然而，由于甘氨酸缺乏手性中心，其没有经历外消旋作用(由于空间位阻，脯氨酸残基在长偶联时间中还经历极少或没有外消旋作用)。因此，包含内部甘氨酸残基的实施方案可以通过合成利用甘氨酸残基不经历外消旋作用这一事实的组成链段经过链段缩合以高产量批量进行合成。因此，包含内部甘氨酸残基的实施方案提供明显的合成优势以进行大规模批量制备。
使用有机化学的标准技术，可以对包含N-和/或C-端封闭基团的RCT的介质进行制备。例如，酰化肽的N-端或酰胺化或酯化肽的C-端的方法是本领域众所周知的。在N-和/或C-端进行其它修饰的方式将对于本领域那些技术人员是显而易见的，如保护任何侧链官能度可能对于连接末端封闭基团是必须的一样。
药用盐(抗衡离子)可以通过如本领域众所周知的离子-交换层析法或其它方法方便地进行制备。
可以通过在合成中的合适步骤中将接头添加到肽链中而方便地合成以串连多聚体形式存在的本发明的化合物。或者，可以合成螺旋部分并使每个部分与接头反应。当然，合成的实际方法将取决于接头的组成。合适的保护方案和化学原理是众所周知的，并将对于本领域技术人员是显而易见的。
使用三聚体和四聚体树脂和在Tam，1988，PNAS USA 85：5409-5413and Demoor et al.，1996，Eur.J.Biochem.239：74-84中描述的化学方便地合成以分枝网络形式存在的本发明的化合物。修饰合成树脂和策略以合成更高级或更低级的支链网络，或包含不同肽螺旋部分的组合，将充分在肽化学和/或有机化学领域那些技术人员的能力中。
如果需要，通常在温和氧化剂存在的情况下，进行二硫键的形成。可以使用化学氧化剂，或所述化合物可以简单地与大气的氧接触从而影响这些键。本领域已知的各种方法，包括那些由，例如Tam et al.，1979，Synthesis955-957；Stewart et al.，1984，Solid Phase Peptide Synthesis，2d Ed；PierceChemical Company Rockford，IL；Ahmed et al.，1975，J.Biol.Chem.250：8477-8482；and Pennington et al.，1991 Peptides 1990：164-166，Giralt andAndreu，Eds.，ESCOM Leiden，The Netherlands所描述的方法。另外的备选方案由Kamber et al.，1980，Helv.Chim.Acta 63：899-915描述。在固体支持物上进行的方法由Albericio，1985，Int.J.Peptide Protein Res.26：92-97描述。这些方法中的任一个可以用于形成本发明肽中的二硫键。另外的化学合成氨基酸衍生的化合物显示于下面的表5中。
                                            表5
  化合物#   序列   分子式   分子量
  1   Ac-E-F-R-NH2   C22H33N7O6   491.55
  2   Ac-e-r-f-NH2   C22H33N7O6   491.55
  3   Ac-E-BIP-R-NH2   C28H37N7O6   567.64
  4   Ac-e-f-r-y-NH2   C31H42N8O8   654.72
  5   2-Naph-E-F-R-NH2   C31H37N7O6   603.68
  6   Ac-y-e-f-r-NH2   C31H42N8O8   654.72
  7   2-Nap-e-f-r-y-NH2   C40H46N8O8   766.85
  8   Piv-e-f-r-y-NH2   C34H48N8O8   696.80
  9   Fmoc-e-f-r-y-NH2   C44H50N8O9   834.93
  10   2-Nap-e-r-f-NH2   C31H37N7O6   603.68
  11   2-Nap-y-e-f-r-NH2   C40H46N8O8   766.85
  12   Piv-E-F-R-NH2   C25H39N7O6   533.63
  13   NA-E-F-R-NH2   C26H34N8O6   554.61
  14   Ac-y-e-r-f-NH2   C31H42N8O8   654.72
  15   Ac-r-f-e-NH2   C22H33N7O6   491.55
  16   Fmoc-E-F-R-OH   C35H40N6O8   672.74
  17   NA-y-e-r-f-NH2   C35H43N9O8   717.78
  18   NA-E-BIP-R-NH2   C32H38N8O6   630.70
  19   NA-e-r-f-y-NH2   C35H43N9O8   717.78
  20   2-Nap-E-BIP-R-NH2   C37H41N7O6   679.77
  21   NA-e-f-r-NH2   C26H34N8O6   554.61
  22   3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-E-BIP-R-NH2   C41H55N7O7   757.93
  23   1-Nap-L-丙氨酸   C13H13NO2   215.25
  24   1-Nap-D-丙氨酸   C13H13NO2   215.25
  25   2-Nap-L-丙氨酸   C13H13NO2   215.25
  26   2-Nap-D-丙氨酸   C13H13NO2   215.25
  27   L-双苯基丙氨酸   C15H15NO2   241.3
  28   D-双苯基丙氨酸   C15H15NO2   241.3
  29   NA-f-r-e-NH2   C26H34N8O6   554.61
  30   1-Nap-e-r-f-y-NH2   C40H46N8O8   766.84
  31   1-Nap-E-BIP-R-NH2   C37H41N7O6   679.77
  32   NA-y-f-r-e-NH2   C35H43N9O8   717.78
  33   Ac-y-f-r-e-NH2   C31H42N8O8   654.72
  34   NA-e-r-f-NH2   C26H34N8O6   554.61
  35   2-Nap-e-f-r-y-OH   C40H45N7O9   767.84
  36   3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-f-r-e-y-NH2   C44H60N8O9   845.01
  37   NA-f-r-e-y-NH2   C35H43N98O8   717.78
  38   NA-f-r-NH2   C21H27N7O3   425.49
  39   Ac-e-BIP-r-NH2   C28H37N7O6   567.64
  40   Ac-e-bip-r-NH2   C28H37N7O6   567.64
  41   异噁唑-e-bip-r-NH2   C31H38N8O7   634.69
  42   1-Nap-r-f-e-y-NH2   C40H46N8O8   766.84
  43   1-Nap-f-r-e-y-NH2   C40H46N8O8   766.84
  44   Ac-E-BIP-R-OH   C32H38N8O6   568.63
  45   3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-e-r-f-NH2   C35H51N7O7   681.82
  46   Ac-f-r-e-y-NH2   C31H42N8O8   654.72
  47   Ac-r-f-e-y-NH2   C31H42N8O8   654.72
  48   3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-f-e-r-NH2   C35H51N7O7   681.82
  49   异噁唑-r-e-f-y-NH2   C34H43N9O9   721.77
  50   Ac-r-e-f-y-NH2   C31H42N8O8   654.72
  51   NA-r-e-f-y-NH2   C35H43N9O8   717.78
  52   3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-r-e-f-y-NH2   C44H60N8O9   845.01
  53   异噁唑-f-e-r-NH2   C35H51N7O7   558.59
  54   异噁唑-y-r-e-f-NH2   C34H43N9O9   721.77
  55   NA-y-r-e-f-NH2   C35H43N9O8   717.78
  56   3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-f-r-e-y-NH2   C44H60N8O9   845.01
  57   3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-f-r-NH2   C30H44N6O4   552.72
  58   异噁唑-f-e-r-y-NH2   C34H43N9O9   721.77
  59   3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-r-f-e-y-NH2   C44H60N8O9   845.01
  60   Ac-f-e-r-y-NH2   C31H42N8O8   654.72
  61   3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-f-r-NH2   C30H44N6O4   552.72
  62   NA-y-f-e-r-NH2   C35H43N9O8   717.78
  63   异噁唑-y-f-e-r-NH2   C34H43N9O9   721.77
  64   NA-f-e-r-NH2   C26H34N8O6   554.61
  65   3，5-二叔-丁基-4-羟基-PhCO-y-f-e-r-NH2   C44H60N8O9   845.01
  66   异噁唑-r-f-e-NH2   C35H51N7O7   558.59
  67   1-Nap-y-f-e-r-NH2   C40H46N8O8   766.84
  68   1-Nap-r-f-e-NH2   C31H37N7O6   603.68
  69   NA-r-f-e-NH2   C26H34N8O6   554.61
  70   Ac-E-F(4-I)-R-NH2   C22H32IN7O6   617.44
  71   NA-R-BIP-E-NH2   C32H38N8O6   630.70
  72   1-Nap-R-BIP-E-NH2   C37H41N7O6   679.77
  73   Ac-R-BIP-E-NH2   C28H37N7O6   567.64
  74   Ac-E-BIP-K-NH2   C28H37N5O6   539.63
  75   Ac-D-BIP-K-NH2   C27H35N5O6   525.60
  76   Ac-d-BIP-r-NH2   C27H37N5O6   553.62
  77   Ac-e-bip-k-NH2   C28H37N5O6   539.63
  78   Ac-d-bip-k-NH2   C27H35N5O6   525.60
  79   Ac-d-bip-r-NH2   C27H37N5O6   553.62
  80   Ac-E-R-BIP-NH2   C28H37N7O6   567.64
  81   2-吡嗪-CO-E-R-BIP-NH2   C31H37N9O6   631.60
  82   胡椒基-CO-E-R-BIP-NH2   C34H39N7O8   673.72
  83   Ac-E-bip-R-NH2   C28H37N7O6   567.64
  84   Ac-e-f(4-I)-r-NH2   C22H32IN7O6   617.44
  85   Glutaric-BIP-R-NH2   C26H34N6O5   510.59
  86   Glutaric-bip-r-NH2   C26H34N6O5   510.59
  87   Ac-E-BIP-胍基丁胺   C27H36N6O5   524.62
  88   Ac-e-bip-胍基丁胺   C27H36N6O5   524.62
  89   Ac-R-BIP-GABA   C27H36N6O5   524.62
  90   Ac-r-bip-GABA   C27H36N6O5   524.62
  91   胍基丁胺-BIP-E-NH2   C25H32N6O5   496.56
  92   胍基丁胺-bip-e-NH2   C25H32N6O5   496.56
  93   Ac-e-bip(4-tBu)-r-NH2   C32H45N7O6   673.75
  94   Ac-E-BIP(4-tBu)-R-NH2   C32H45N7O6   673.75
  95   Glutaric-BIP-K-NH2   C26H34N4O5   482.58
  96   Glutaric-bip-k-NH2   C26H34N4O5   482.58
用于遗传编码的氨基酸的D-对映体的缩写是表1中所示的单字母符号的小写字母等价物。例如，“R”指L-精氨酸并且“r”指D-精氨酸。
Ac指乙酰化的。
Piv指新戊酰化的。
1-Nap & 2-Nap指萘酸加帽的。
Fmoc指用9-芴基甲氧基羰基修饰的N-端。
NA指烟酸。
BIP指双苯基丙氨酸。
异噁唑指5-甲基-异噁唑-3-羧酸衍生物
如果肽完全由基因编码的氨基酸组成，或其部分这样组成，肽或相关的部分还可以使用常规重组遗传工程技术来进行合成。
对于重组制备，将编码肽的多核苷酸序列插入合适的表达载体，即包含插入的编码序列的转录和翻译的必需元件，或对于RNA病毒载体，复制和翻译的所必需元件的载体中。然后，将表达载体转染到合适的将表达肽的靶细胞中。取决于所用的表达系统，然后通过本领域已确定的方法分离表达的肽。重组蛋白和肽制备的方法是本领域众所周知的(见，例如，Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，N.Y.；and Ausubel et al.，1989，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.将其每个全部内容并入此作为参考)
为了增加制备的效率，可以对多核苷酸进行设计以编码通过酶促裂解位点分离的肽的多个单位-均聚物(重复肽单位)或杂聚物(不同的肽排列在一起)可以以这种方式进行工程改造。得到的多肽可以被裂解(例如，通过用合适的酶处理)从而重新获得肽单位。这可以增加由单一启动子引发的肽的产率。在一个优选的实施方案中，可以对多顺反子多核苷酸进行设计从而转录编码多个肽(即，均聚物或杂聚物)的单一mRNA，每个编码区与帽-不依赖性翻译控制序列操作性地连接；例如，内部核糖体进入位点(IRES)。当使用在合适的病毒表达系统中时，每个由mRNA编码的肽的翻译在转录中内部指导；例如通过IRES。因此，多顺反子构建物控制单一，大的多顺反子mRNA的转录，其依次控制多个，个体肽的翻译。该方法省略多蛋白质(polyprotein)的制备和酶促过程并可显著增加由单一启动子引发的肽的产率。
多种宿主表达载体系统可以用于表达本文描述的肽。这些包括但不限于微生物诸如用重组噬菌体DNA或包含合适编码序列的质粒DNA表达载体转化的细菌；用包含合适编码序列的重组酵母或真菌表达载体转化的酵母或丝状真菌；或用包含合适编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用包含合适编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒)感染或用包含合适编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
表达系统的表达元件在它们的强度和特异性上变化。取决于所用的宿主/载体系统，可以将包括组成性和诱导性启动子的许多合适的转录和翻译元件的任一个用在表达载体中。例如，当克隆在细菌系统中时，可以使用可诱导的启动子诸如噬菌体λ的pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac杂交启动子)等；当克隆在昆虫细胞系统中时，可以使用启动子诸如杆状病毒多角体启动子；当克隆在植物细胞系统中时，来自植物细胞的基因组的启动子(例如，热休克启动子；RUBISCO的小亚基的启动子；叶绿素a/b结合蛋白的启动子)或来自植物病毒的启动子(例如，CaMV的35S RNA启动子；TMV的包衣蛋白启动子)；当克隆在哺乳动物细胞系统中，可以使用来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)；当产生包含表达产物的多个拷贝的细胞系，可以与合适的可选择标记一起使用基于SV40-、BPV-和EBV-的载体。
在使用植物表达载体的情况中，编码本发明的肽的序列的表达可以由许多启动子的任一个所引发。例如，可以使用病毒启动子诸如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson et al.，1984，Nature 310：511-514)，或TMV的包衣蛋白启动子(Takamatsu et al.，1987，EMBO J.6：307-311)；或者，可以使用植物启动子诸如RUBISCO的小亚基(Coruzzi et al.，1984，EMBO J.3：1671-1680；Broglie et al.，1984，Science 224：838-843)或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E-或hsp17.3-B(Gurley-et al.，1986，Mol.Cell.Biol.6：559-565)。使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，显微注射，电穿孔等，可以将这些构建物引入植物细胞中。对于这些技术的综述见，例如，Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant MolecularBiology，Academic Press，NY，Section VIII，pp.421-463；和Grierson & Corey，1988，PlantMolecularBiology，2d Ed.，Blackie，London，Ch.7-9。
在一个用于产生本发明的肽的昆虫表达系统中，将苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。所述病毒生长在Spodoptera frugiperda细胞中。可以将编码序列克隆到病毒的非-必需区域(例如多角体基因)并置于AcNPV启动子(例如，多角体启动子)的控制下。编码序列的成功插入将导致多角体基因的失活和非包含体型重组病毒(即，缺乏由多角体基因编码的蛋白质包衣)的产生。然后将这些重组病毒用于感染表达插入基因的Spodoptera frugiperda细胞(例如，见，Smith et al.，1983，J.Virol.46：584；Smith，美国专利号4,215,051)。该表达系统的另一个实例可以见于Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，Ausubel et al.，eds.，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。在将腺病毒用作表达载体的情况中，可以将编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列连接。然后，通过体外或体内重组，将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)中的插入将导致重组病毒，所述重组病毒是有生活力的且能够在被感染宿主中表达肽。(例如，见Logan & Shenk，1984，PNAS USA 81：3655-3659)。或者，可以使用牛痘7.5K启动子(见，例如Mackett et al.，1982，PNAS USA 79：7415-7419；Mackett et al.，1984，J.Virol.49：857-864；Panicaliet al.，1982，PNAS USA 79：4927-4931)。
用于产生本发明的肽的其它表达系统将对于本领域那些技术人员是显而易见的。
肽的纯化
本发明的肽可以通过领域-已知的技术诸如反相高效液相色谱(例如，通过反向HPLC将用上述的Na-Fmoc化学通过固相合成方法合成的粗肽使用制备C-18柱进行纯化)，离子交换色谱法，凝胶电泳，亲和色谱法等进行纯化。用于纯化具体的肽的实际条件将部分取决于合成策略和因素诸如净电荷、疏水性、亲水性等，并将对于本领域技术人员而言是显而易见的。可以，例如通过离子交换或尺寸排阻色谱法来纯化多聚体支链肽。
对于亲和色谱法纯化，可以使用特异性结合肽的任何抗体。对于抗体的制备，可以通过用肽注射对包括，但不限于兔、小鼠、大鼠等的各种宿主动物进行免疫。可以将该肽通过侧链官能团或连接于侧链官能团的接头连接于合适的载体诸如BSA。取决于宿主种类，可以将包括但不限于Freund′s(完全和不完全)、矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、泊洛沙姆多羟基化合物、聚阴离子、肽、油性乳状液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在有用的人佐剂诸如BCG(结核菌(bacilliCalmette-Guerin))和Corynebacterium parvum的各种佐剂用于增加免疫应答。
使用通过在培养物中的连续细胞系提供抗体分子产生的任何技术可以制备肽的单克隆抗体。这些包括，但不限于，杂交瘤技术，其起初由Kohler and Milstein，1975，Nature 256：495-497，或Kaprowski，美国专利号4,376,110所描述，将其全部内容并入此作为参考；人B-细胞杂交瘤技术)Kosbor et al.，1983，Immunology Today 4：72；Cote et al.，1983，PNASUSA 80：2026-2030)；和EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，1985，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。此外，可以使用通过剪接来自合适的抗原特异性的小鼠抗体分子的基因以及来自合适生物学活性的人抗体分子的基因而开发产生“嵌合抗体”的技术Morrisonet al.，1984，PNAS USA 81：6851-6855；Neuberger et al.，1984，Nature 312：604-608；Takeda et al.，1985，Nature 314：452-454，Boss，美国专利号4,816,397；Cabilly，美国专利号4,816,567；将其并入作为参考)。或，可以制备“人源化抗体”(见，例如，Queen，美国专利号5,585,089，将其并入作为参考)。或者，可以将所述用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)适应于产生肽-特异性单链抗体。
可以通过已知技术产生包含特异性结合位点缺失的抗体片段。例如，这些片段包括，但不限于可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab′)2片段，和可通过还原F(ab′)2片段的二硫化物桥接产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库(Huse et al.，1989，Science 246：1275-1281)以容许快速和容易的鉴定具有所需的对于目标肽的特异性的单克隆Fab片段。
可以将特异于所需肽的抗体或抗体片段连接于，例如，琼脂糖，并将该抗体-琼脂糖复合物用在免疫层析中以纯化本发明的肽。见，Scopes，1984，Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag NewYork，Inc.，NY，Livingstone，1974，Methods In Enzymology：ImmunoaffinityChromatography of Proteins 34：723-731。
药剂剂型和治疗方法
可以将本发明的RCT介质用于治疗动物特别是包括人的哺乳动物中的任何疾病，对于所述动物降低血清胆固醇是有益的，所述疾病包括，但不限于其中增加血清HDL浓度、活化LCAT和促进胆固醇流出以及RCT是有利的疾病。这些疾病包括，但不限于高脂血，尤其是高胆固醇血症，和心血管疾病诸如动脉粥样硬化(包括动脉粥样硬化的治疗和预防)以及冠状动脉疾病；再狭窄(例如，预防或治疗作为医疗方法诸如气囊血管成形术的结果形成的动脉粥样斑块)；以及经常导致败血症性休克的其它疾病，诸如局部缺血，和内毒素血症。
可以将RCT的介质单独使用或用在与其它用于治疗前述疾病的药物的结合疗法中。这些疗法包括，但不限于，同时或顺序使用包括的药物。
例如，在治疗高胆固醇血症或动脉粥样硬化中，可以将RCT的分子介质的制剂与目前使用的任何一个或多个降低胆固醇疗法一起施用；例如，胆汁-酸树脂，烟酸和/或抑制素。这种结合治疗方案可以产生特别有利的治疗效应，因为每种药物作用在胆固醇合成和转运的不同目标上发挥作用；即，胆汁-酸树脂影响胆固醇再循环、乳糜微粒和LDL群体(poplulation)；烟酸主要影响VLDL和LDL群体；抑制素抑制胆固醇合成，减少LDL群体(也许增加LDL受体表达)；而RCT的介质影响RCT，增加HDL，增加LCAT活性并促进胆固醇的流出。
RCT的介质可与fibrates结合使用以治疗高脂血症、高胆固醇血症和/或心血管疾病诸如动脉粥样硬化。
本发明的RCT的介质可以与目前使用的抗菌剂和抗炎药结合使用以治疗内毒素诱导的败血症性休克。
可以将本发明的RCT的介质配制为基于肽的组合物或肽-脂质复合物，所述基于肽的组合物或肽-脂质复合物可以以多种方式，优选地通过口服施用，施用给受试者以将RCT的介质传递到循环中。下面描述示例性制剂和治疗方案。
在本发明的另一个优选的实施方案中，提供用于改善和/或预防高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的一个或多个症状的方法。所述方法优选地包括将本发明的肽(或这些肽的模拟物)的一个或多个施用给生物体，优选地，哺乳动物，更优选地人。如本文所述，可以按照许多标准方法的任一个施用所述肽，所述方法包括，但不限于注射剂、栓剂、鼻喷雾、定时释放植入物、透皮贴片等。在一个特别优选的实施方案中，将所述肽口服施用(例如，作为糖浆、胶囊或片剂)。
所述方法包括施用本发明的单一多肽或施用两个或更多不同的多肽。可以将多肽提供为单体或二聚的、低聚的或聚合的形式。在某些实施方案中，多聚体形式可以包括联合单体(例如离子或疏水性连接)而某些其它多聚体形式包括共价连接的单体(直接连接或通过接头)。
尽管对本发明进行的描述是关于在人中的使用，其还适合于动物，例如兽医的应用。因此，优选的生物体包括，但不限于，人，非-人灵长类、犬、马、猫、猪、有蹄类动物(ungulates)、largomorphs等。
本发明的方法不限于显示高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的一个或多个症状(例如，高血压、斑块形成和破裂，临床事件诸如心脏病发作(heartattack)的减少，绞痛，或中风，高水平的低密度脂蛋白，高水平的极低密度脂蛋白，或炎性蛋白质等)的人或非人动物，但在预防性情况下是有用的。因此，可以将本发明的肽(或其模拟物)施用给生物以预防高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的一个或多个症状的发作/发展。关于这点特别优选的受试者是显示动脉粥样硬化的一个或多个风险因子(例如，家族史，高血压，肥胖症，高醇消耗，吸烟，高血液胆固醇，高血液三酰甘油，升高的血液LDL、VLDL、IDL，或低HDL，糖尿病，或糖尿病的家族史，高血液脂质，心脏病发作，绞痛或中风等)的受试者。
在一个优选的实施方案中，使用在涉及RCT的介质的合成和纯化的前面部分中所述的任何技术，可以合成或制备RCT的肽介质。通过冷冻干燥肽-从而制备再形成的批量(bulk)或制备可以通过在施用给受试者之前，用灭菌水或合适的灭菌缓冲溶液通过再次水合而重构的个体等分试样或剂量单位，可以制备具有长保存限期的稳定制剂。
在另一个优选的实施方案中，可以在肽-脂质复合物中配制和施用RCT的介质。该方法具有一些优势，因为所述复合物在循环中应具有增加的半衰期，特别是当复合物具有与HDL，尤其是前-β-1或前-β-2HDL群体相似的大小和密度时。可以通过下面所述的许多方法的任一个方便地制备肽-脂质复合物。可以通过冷冻干燥-下面描述的作为优选方法的共冷冻干燥方法制备具有长保存期限的稳定制剂。可以将冻干的肽-脂质复合物用于制备药物再形成(pharmaceutical reformulation)的批量，或用于制备可以通过在施用给受试者前用灭菌水或合适的缓冲溶液通过再次水合而重构的个体等分试样或剂量单位。
可以将本领域技术人员众所周知的多种方法用于制备肽-脂质小泡或复合物。为此目的，可以使用许多制备脂质体或脂蛋白体可获得的技术。例如，可以用合适的脂质对肽进行共超声波(cosonicated)(使用水浴或探针超声波仪)从而形成复合物。或者，所述肽可以与预先形成的脂质小泡结合，导致肽-脂质复合物的自发形成。在另一个备选方法中，可以通过去污剂透析方法形成肽-脂质复合物；例如，将肽、脂质和去污剂的混合物进行透析从而去除去污剂并重构或形成肽-脂质复合物(例如，见Jonas et al.，1986，Methods in Enzymol.128：553-582)。
尽管前述方法是可能的，在费用、产量、再现性和安全性方面，每种方法有其自己特殊的生产问题。按照一种优选的方法，将肽和脂质在一种溶剂系统中进行结合，所述溶剂系统共溶解每种成分并可通过冷冻干燥彻底去除。为此目的，应仔细选择溶剂对以确保两亲性肽和脂质的共溶解。在一个实施方案中，可以将结合到颗粒中的蛋白质、肽或其衍生物/类似物溶解在水性或有机溶剂或溶剂(溶剂1)的混合物中。将(磷)脂成分溶解在水性或有机溶剂或可与溶剂1混溶的溶剂(溶剂2)的混合物中，并将两种溶液混和。或者，可以将肽和脂质结合在共溶剂系统中；即可混溶的溶剂的混合物。肽(蛋白质)与脂质的合适比例首先根据经验确定从而使得到的复合物具有合适的物理和化学特性；即通常(但不是必需)在大小上与HDL相似。将得到的混合物冷冻并冻干以进行干燥。有时，必须将另外的溶剂加入混合物中以促进冷冻干燥。该冻干产物可以储存长时间并将保持稳定。
可以将冻干的产物重构从而获得肽-脂质复合物的溶液或混悬液。为此目的，可以用水溶液将冻干的粉末再水合到合适的体积(经常是方便于静脉内注射的5mgs肽/ml)。在一个优选的实施方案中，用磷酸盐缓冲溶液或生理盐水溶液将冻干的粉末进行再水合。必须将所述混合物进行搅拌或涡流以促进再水合，并在大多数情况中，应在等于或大于复合物的脂质成分的相变温度的温度下进行重构步骤。在数分钟内，得到重构的脂质-蛋白质复合物的清澈(clear)制剂。
可以对得到的重构制剂的等分试样进行特征鉴定从而证实制剂中的复合物具有所需的大小分布；例如，HDL的大小分布。可以将凝胶过滤层析用于此目的。例如，可以使用Pharmacia Superose 6 FPLC凝胶过滤层析系统。所用的缓冲液包含在50mM，pH7.4的磷酸缓冲液中的150mMNaCl。典型样品体积是20-200微升的包含5mgs肽/ml的复合物。柱的流动速度是0.5mls/min。将一系列已知分子量和Stokes直径的蛋白质以及人HDL优选地用作校准柱的标准。通过波长254或280nm的吸光度或光散射来监测蛋白质和脂蛋白复合物。
本发明的RCT的介质可以与多种脂质复合，所述脂质包括饱和、不饱和、天然和合成脂质和/或磷脂。合适的脂质包括，但不限于，小烷基链磷脂，例如，卵磷脂酰胆碱，大豆磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱，1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱，1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱二油酰磷脂酰乙醇胺，二月桂酰磷脂酰甘油磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，神经鞘磷脂，神经鞘脂类，磷脂酰甘油，二磷脂酰甘油，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，二棕榈酰磷脂酰甘油，二硬脂酰磷脂酰甘油，二油酰磷脂酰甘油，二肉豆蔻酰磷脂酸，二棕榈酰磷脂酸，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸，二棕榈酰磷脂酰丝氨酸，脑磷脂酰丝氨酸，脑神经鞘磷脂，二棕榈酰神经鞘磷脂，二硬脂酰神经鞘磷脂，磷脂酸，半乳糖脑苷脂，神经节苷脂，脑苷脂，二月桂基磷脂酰胆碱，(1，3)-D-mannosyl-(1，3)甘油二酯，氨基苯基糖苷，3-胆甾烯基-6′-(糖基硫代)己基醚糖脂，和胆固醇及其衍生物。
本发明的药物制剂在适合于体内施用及传递的药用载体中包含作为活性组分的RCT的肽介质或肽-脂复合物。因为所述肽可能包含酸性和/或碱性末端和/或侧链，可以将所述肽包括在以游离酸或碱形式，或以药用盐形式存在的制剂中。
可注射的制剂包括在水性或油性赋形剂中的活性组分的无菌混悬液、溶液或乳状液。所述组合物还可以包含配方剂(formulating agents)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于注射的制剂可以以单位剂型，例如以安瓿或多剂量容器形式存在，并可以包含另外的防腐剂。
或者，可注射的制剂可以以在使用前用合适的赋形剂进行重构的粉末形式进行提供，所述赋形剂包括，但不限于无菌的无热原的水，缓冲液，葡萄糖溶液等。为此目的，可以冻干RCT的介质，或可以制备共-冻干的肽-脂质复合物。可以以单位剂型的形式提供贮存的制剂并在体内使用前进行重构。
对于延长的传递，可以将活性组分配制为通过植入进行施用的长效制剂；例如，皮下、皮内或肌内注射。因此，例如，可以将活性组分与合适的聚合或疏水性材料一起进行配制(例如，作为在可接受的油中的乳状液)或与离子交换树脂一起进行配制，或配制为少量可溶的衍生物；例如。作为RCT的介质的少量可溶的盐形式。
或者，可以使用被生产为缓慢释放活性组分以进行经皮吸收的粘着盘或贴片的透皮传递系统。为此目的，可以使用渗透增强物以促进活性组分的透皮渗透。可以通过将本发明的RCT的介质或肽-脂质复合物结合到硝化甘油贴片中以使用在患有局部缺血性心脏疾病和高胆固醇血症的患者中以获得特别的益处。
对于口服施用，药物组合物可以采取通过传统方式用药用赋形剂诸如粘合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)进行制备的片剂或胶囊形式。所述片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。进行口服施用的液体制剂可以采用，例如溶液、糖浆或混悬液的形式，或它们可作为在使用前用水或其它合适的赋形剂构成的干燥产品存在。这些液体制剂可以通过常规方法用药用添加剂诸如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性赋形剂(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分级分离的植物油)；和防腐剂(例如，甲基或丙基-对-羟基苯甲酸酯或山梨酸)进行制备。所述制剂还可包含合适的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。可以将口服施用的制剂合适地配制成控释的活性化合物。
对于颊含施用，所述组合物可以采取以常规方法配制的片剂或锭剂的形式。对于直肠和阴道施用路径，可以将活性组分配制为溶液(对于滞留型灌肠剂)栓剂或软膏剂。
对于通过吸入进行施用，使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，以来自压缩包装或喷雾器的气溶胶喷雾剂形式来方便地传递活性组分。在压缩的气溶胶情形中，可以通过提供阀以传递计量来确定剂量单位。可以配制用在吸气器或吸入器中的例如，明胶的胶囊和药筒，其包含化合物的粉末混合物和合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉。
如果需要，所述组合物可以存在于包装或分配器装置中，其可以包含一个或多个单位剂型，所述剂型包含活性组分。所述包装可以例如，包含金属或塑料箔，诸如泡眼包装。所述包装或分配器可配有施用的说明书。
可以通过确保在循环中的生物利用度的任何合适的路径来施用本发明的RCT的肽介质和/或肽-脂质复合物。这可以通过包括静脉内(IV)、肌内(IM)、皮内、皮下(SC)和腹膜内(IP)注射的施用的肠胃外路径来完成。然而，可以使用其它施用途径。例如，如果将合适的制剂(例如，肠溶包衣)用于避免或最小化活性组分在，例如口腔粘膜、胃和/或小肠的苛刻环境中的降解，经过胃肠道的吸收可以通过施用的口服路径(包括但不限于摄取、颊含和舌下路径)来完成。口服施用具有易于应用和因此提高顺应性的优势。或者，可以将经过粘膜组织的施用诸如阴道和直肠施用方式用于避免或最小化在胃肠道中的降解。在另一个备选方法中，可以将本发明的制剂经过皮肤地(例如，透皮地)，或通过吸入进行施用。将理解的是优选的路径可以随受者的疾病、年龄和顺应性而变化。
所用的RCT的肽介质或肽-脂质复合物的实际剂量将随施用的路径而变化，并应被调整以获得1.0mg/l-2g/l的循环血浆浓度。本文所述的在动物模型系统中获得的数据显示本发明的ApoA-I激动剂与HDL成分相关，并在人中具有约5天的预计的半衰期。因此，在一个实施方案中，可以通过以介于0.5mg/kg-100mg/kg之间的剂量，一星期一次的注射施用RCT的介质。在另一个实施方案中，理想的血清水平可通过持续的输注或通过提供约0.1mg/kg/小时-100mg/kg/小时的间歇输注来维持。
使用在细胞培养物或实验动物中确定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)的标准药学方法来确定各种RCT的介质的毒性和治疗效率。毒性和治疗效应之间的剂量比率是治疗指数并且可将其表示为比率LD50/ED50。优选显示大的治疗指数的ApoA-I肽激动剂。
其它应用
可将本发明的RCT激动剂的介质用在体外测定中以测量血清HDL，例如用于诊断目的。因为RCT的介质与血清的HDL和LDL成分相关，可以将激动剂用作HDL和LDL群体的“标记”。而且，可以将激动剂用作在RCT中有效的HDL的亚群的标记。为此目的，可将激动剂加入患者的血清样品中或与其混合；在合适的温育时间后，通过检测结合的RCT的介质可以测定HDL的成分。这可以通过使用标记的激动剂(例如，放射性标记，荧光标记，酶标记，染料等)，或使用特异于激动剂的抗体(或抗体片段)的免疫测定来完成。
或者，可以将标记的激动剂用在成像方法(例如，CAT扫描，MRI扫描)中以显现循环系统，或监测RCT，或显现HDL在脂条、动脉粥样硬化损伤等中的聚集。(其中HDL应在胆固醇流出中是有活性的)。
反向胆固醇转运的介质的分析的测定
LCAT活性测定
可通过各种体外测定，例如，通过它们在体外活化LCAT的能力来评价按照本发明的优选的实施方案的RCT的介质的潜在临床效率。在LCAT测定中，用等量的肽或ApoA-I(分离自人血浆)对由卵磷脂酰胆碱(EPC)或l-棕榈酰-2-油基-磷脂酰-胆碱(POPC)与放射性标记的胆固醇组成的底物小泡(小的单层小泡或“SUVs”)进行预温育。通过LCAT的添加(纯化自人血浆)来起始反应。被用作阳性对照的天然ApoA-I，表现了100％的活化活性。可将分子介质的“比活”(即活性的单位(LCAT活化)/质量单位)计算为获得最大LCAT活化的介质的浓度。例如，可对一系列浓度的肽(例如，有限稀释)进行测定以确定肽的“比活”--分析中在特定时间点(例如1小时)获得最大LCAT活化(即，胆固醇向胆固醇酯的百分比转变)的浓度。当使用针对肽的浓度在例如1小时时的胆固醇的标绘百分比转变时，可将“比活”确定为在标绘曲线上获得平稳期的肽的浓度。
底物小泡的制备
用在LCAT测定中的小泡是由摩尔比为20∶1的卵卵磷脂(EPC)或1-棕榈酰-2-油基-磷脂酰胆碱(POPC)与胆固醇组成的SUVs。为了制备足够40次测定的小泡贮存溶液，将7.7mg EPC(或7.6mg POPC；10μmol)，78μg(0.2μmol)4-14C-胆固醇，116μg胆固醇(0.3μmol)溶解于5ml的二甲苯中并进行冻干。其后，将4ml的测定缓冲液加入干燥粉末中并在氮气氛下于4℃超声处理。超声处理条件：Branson 250超声波仪，10mm尖(tip)，6×5分钟；测定缓冲液：10mM Tris，0.14M NaCl，1mM EDTA，pH7.4。将超声处理的混合物在14,000rpm(16,000×g)离心6次，每次5分钟以去除钛颗粒。将得到的澄清溶液用于酶测定。
LCAT的纯化
对于LCAT的纯化，将葡聚糖硫酸酯/Mg2+处理的人血浆用于获得缺乏脂蛋白的血清(LPDS)，将其在Phenylsepharose、Affigelblue、ConcanavalinA sepharose和抗-ApoA-I亲和层析法上顺序进行色谱分析。
制备LPDS
为了制备LPDS，将500ml的血浆加入50ml葡聚糖硫酸酯(分子量500,000)溶液。搅拌20分钟。在3000rpm(16,000×g)于4℃离心30分钟。应用上清液(LPDS)进行进一步纯化(ca.500ml)。
苯基琼脂糖(Phenylsepharose)层析法
将下列材料和条件用于苯基琼脂糖层析法。固相：苯基琼脂糖快速流动，高subst。级，Pharmaciacolumn：XK26/40，凝胶床高度：33cm，V＝ca，175ml流动速度：200ml/小时(样品)洗涤：200ml/小时(缓冲液)洗脱：80ml/小时(蒸馏水)缓冲液：10mM Tris，140mM NaCl，1mM EDTA pH7.4，0.01％叠氮化钠。
在Tris-缓冲液中平衡柱，将29g NaCl加入500ml的LPDS中并应用到柱上，用数体积的Tris缓冲液洗涤直到在280nm波长的吸收大约处于基线，然后用蒸馏水开始洗脱。合并包含蛋白质的级分(合并大小：180ml)并将其用于Affigelblue层析法。
Affigelblue层析法
将苯基琼脂糖合并物对着20mM Tris-HCl，pH7.4，0.01％叠氮化钠于4℃透析过夜。通过超滤(Amicon YM30)，将合并的体积减少到50-60ml，并装载到Affigelblue柱上。固相：Affigelblue，Biorad，153-7301柱，XK26/20，凝胶床高度ca.13em；柱体积：约70ml。流动速度：装载：15ml/小时 洗涤：50ml/小时。在Tris-缓冲液中平衡柱。将苯基琼脂糖合并物应用到柱上。平行开始以收集级分。用Tris-缓冲液进行洗涤。将合并的级分(170ml)用于ConA层析法。
ConA层析法
通过Amicon(YM30)将Affigelblue合并物减少到30-40ml并对着ConA起始缓冲液(1mM Tris HCl pH7.4；1mM MgCl2，1mM MnCl2，1mMCaCl2，0.01％叠氮化钠)在4℃透析过夜。固相：ConA sepharose(Pharmacia)柱：XK26/20，凝胶床高度：14cm(75ml)。流动速度：装载40ml/小时，洗涤(用起始缓冲液)90ml/小时，洗脱：50ml/小时，在1mM Tris，pH7.4中的0.2M甲基-α-D-甘露糖苷。收集甘露糖苷洗脱液的蛋白质级分(110ml)，并通过超滤(YM30)将体积减少到44ml。将ConA合并物分成贮存于-20℃的2ml的等分试样。
抗-ApoA-I亲和层析法
在已经与抗-ApoA-I abs共价偶联的Affigel-Hz材料(Biorad)上进行抗-ApoA-I亲和层析法。柱：XK16/20，V＝16ml。用pH7.4的PBS平衡柱。在装载到柱上之前，将2ml的ConA合并物向着PBS进行透析2小时。流动速度：装载：15ml/小时 洗涤(PBS)40ml/小时。将合并的蛋白质级分(V＝14ml)用于LCAT测定。用0.1M的柠檬酸缓冲液(pH4.5)更新柱以洗脱结合的A-I(100ml)，并在该方法后立即用PBS再次平衡。
RCT的介质的药物代谢动力学
可以将随后的实验流程用于证实RCT的介质在循环中是稳定的并与血浆的HDL成分相关。
肽激动剂的合成和/或放射性标记
通过达到500-900cpm/ng的比活的一氯化碘方法来制备125I-标记的LDL(Goldstein and Brown 1974 J.Biol.Chem.249：5153-5162)。如所述(Goldstein and Brown 1974 J.Biol.Chem.249：5153-5162)在500-900cpm/ng的终比活上，确定培养的人成纤维细胞的低密度脂蛋白的结合和降解。在每种情形中，通过用10％(wt/vol)的三氯乙酸(TCA)于4℃温育脂蛋白，＞99％的放射性是可沉淀的。将酪氨酸残基与每种肽的N-末端连接以使其能被放射性碘标记。使用Iodo-Beads(Pierce Chemicals)，并按照生产商的手册，用Na125I(ICN)将肽放射性碘标记到800-1000cpm/ng的比活。透析后，肽的可沉淀的放射性(10％TCA)一直是＞97％。
或者，可以通过将14C-标记的Fmoc-脯氨酸偶联为N-末端氨基酸来合成放射性标记的肽。可以将L-[U-14C]X，比活9.25GBq/mmol用于合成包含X的标记的激动剂。可以按照Lapatsanis，Synthesis，1983，671-173进行合成。简而言之，将250μM(29.6mg)未标记的L-X溶解于225μl的9％Na2CO3溶液并加入9.25MBq(250μM)14C-标记的L-X的溶液(9％Na2CO3)中。将液体冷却至0℃，与在0.75ml DMF中的600μM(202mg)的9-芴基甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(Fmoc-OSu)混合，并于室温摇动4小时。其后，用二乙醚(2×5ml)和氯仿(1×5ml)抽提所述混合物，用30％HCl酸化剩余的水相并用氯仿(5×8ml)抽提。在Na2SO4上干燥有机相，将其过滤除去并将体积在氮流动下减到5ml。通过用UV检测的TLC(CHCl3∶MeOH∶Hac，9∶1∶0.1v/v/v，固定相HPTLC硅胶60，Merck，Germany)估计纯度，例如放射化学纯度：线性分析器，Berthold，Germany；反应产量可以是约90％(如通过LSC所确定)。
将包含14C-肽X的氯仿溶液直接用于肽的合成。如上所述，可以自动合成包含氨基酸2-22的肽树脂并将其用于合成。通过Edman降解来确定肽的序列。偶联的进行如前面所述，除了优选使用取代TBTU的HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基uroniumhexafluorophosphate)。手动进行用未标记的Fmoc-L-X进行的第二次偶联。
小鼠中的药物代谢动力学
在每个实验中，可将300-500μg/kg(0.3-0.5mg/kg)[或更多诸如2.5mg/kg]放射性标记的肽腹膜内注射到小鼠中，用正常小鼠食物(Chow)或导致动脉粥样硬化的Thomas-Harcroft改进的食物(导致VLDL和IDL胆固醇的剧烈升高)对所述小鼠进行喂养。在多个时间间隔取血液样品以进行血浆中放射性的评价。
在人血清中的稳定性
可将100μg标记的肽可与2ml新鲜人血浆(于37℃)混和，并被立即去脂质化(delipidated)(对照样品)或在于37℃温育8天后被去脂质化(测试样品)。通过用等体积的2∶1(v/v)氯仿∶甲醇抽提脂质来进行去脂质化。将样品装载到反相C18HPLC柱上并用线性梯度(在33分钟内25-58％)的乙腈(包含0.1％w的TFA)进行洗脱。洗脱图谱根据吸光度(220nm)和放射性绘制。
前-β样颗粒的形成
可通过在密度d＝1.21g/ml处的KBr密度超离心来分离人HDL以获得上层级分，随后通过Superose 6凝胶过滤层析法来从其它脂蛋白中分离HDL。基于Bradford蛋白测定所确定的蛋白质含量，用生理盐水将分离的HDL调整为1.0mg/ml的终浓度。从分离的HDL制备物中移出300μl的等分试样，并用100μl标记的肽(0.2-1.0μg/l)于37℃温育2小时。分析多个单独的温育物，包括包含100μl的生理盐水的空白和四个稀释度的标记的肽。例如：(i)0.20μg/μl的肽∶HDL比率＝1∶15；(ii)0.30μg/μl肽∶HDL比率＝1∶10；(iii)0.60μg/μl肽∶HDL比率＝1∶5；和(iv)1.00μg/μl肽∶HDL比率＝1∶3。2小时温育后，将200μl的样品的等分试样(总体积=400μl)装载到Superose 6凝胶过滤柱上以进行脂蛋白分离和分析并将100μl用于确定总的装载的放射性。
介质与人脂蛋白的关联
可通过与每个脂蛋白类别(HDL、LDL和VLDL)和不同脂蛋白类别的混合物一起温育标记的肽来确定肽介质与人脂蛋白级分之间的关联。通过在d＝1.21g/ml的KBr密度梯度超离心来分离HDL、LDL和VLDL，并通过在Superose 6B柱大小排阻柱上的FPLC进行纯化(用0.7ml/min的流速和1mM Tris(pH8)，115mM NaCl，2mM EDTA和0.0％NaN3的运行缓冲液进行层析法)。标记的肽与HDL，LDL和VLDL一起在1∶5的肽∶磷脂比率(质量比率)上于37℃温育2小时。所需量的脂蛋白(基于产生1000μg所需的量的体积)与0.2ml的肽贮存液(1mg/ml)混和并使用0.9％NaCl使溶液达到2.2ml。
于37℃温育2小时后，移出等分试样(0.1ml)以确定总放射性(例如，取决于标记的同位素通过液体闪烁计数或γ计数)，用KBr将剩余的温育混合物的密度调整到1.21g/ml，并使用Beckman台式超速离心机在TLA100.3转子中将所述样品在100,000rpm(300,000g)于4℃离心24小时。通过从每个样品的上层移出0.3ml的等分试样将得到的上清液进行分级分离，共5个级分，并将0.05ml的每个级分用于计数。上两个级分包含漂浮脂蛋白，其它的级分(3-5)对应于溶液中的蛋白质/肽。
与HDL脂质的选择性结合
将人血浆(2ml)与20、40、60、80，和100μg的标记的肽一起于37℃温育2小时。通过将密度调整为1.21g/ml并在TLA 100.3转子中于100,000rpm(300,000g)，4℃离心36小时分离脂蛋白。取上层900μl(在300μl级分中)进行分析。计算来自每300μl级分的50μl的放射性并通过FPLC(Superose 6/Superose 12结合柱)分析来自每个级分的200μl。
将反向胆固醇转运的介质应用在动物模型系统中
可在兔或其它合适的动物模型中证实本发明的RCT的介质的效率。
制备磷脂/肽复合物
按照胆酸盐(cholate)透析方法制备由磷脂(DPPC)和肽组成的小的盘状颗粒。将磷脂溶解于氯仿并在氮气流下干燥。将肽以1-2mg/ml的浓度溶解在缓冲液(盐水)中。将脂质薄膜再溶解(43℃)于包含胆酸盐的缓冲液中并以3∶1的磷脂/肽重量比率将肽溶液加入。于43℃过夜温育所述混合物并于43℃(24小时)、室温(24小时)和4℃(24小时)进行透析，在温度点缓冲液(大体积)变化3次。将所述复合物过滤除菌(0.22μm)以进行注射并贮存于4℃。
肽/磷脂颗粒的分离和表征
将所述颗粒在凝胶过滤柱上(Superose 6 HR)进行分离。通过在每个级分中测量磷脂浓度来鉴定包含所述颗粒的峰的位置。从洗脱体积，可确定斯托克斯半径(Stokes radius)。通过在16小时酸水解后测量苯丙氨酸的含量(通过HPLC)来确定复合物中肽的浓度。
兔的注射
用在不超过10-15ml的单一丸剂注射剂中的磷脂/肽复合物的剂量(5或10mg/kg体重，表示为肽)对雄性新西兰白兔(2.5-3kg)进行静脉内注射。操作之前，给动物少量服用镇静剂。在注射之前和之后5、15、30、60、240和1440分钟取血液样品(在EDTA上收集)。确定每个样品的血细胞比容(Hct)。在分析前将样品等分，并存于-20℃。
兔血清的分析
使用商购分析，例如按照生产商的手册(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany and Biomerieux，69280，Marcy-L′etoile，France)酶促测定总血浆胆固醇，血浆三酰甘油和血浆磷脂。
可通过在蔗糖密度梯度中旋转来确定在血浆分离成其脂蛋白级分后所获得的级分的血浆脂蛋白图谱。例如，收集级分并通过常规酶促分析在对应于VLDL、ILDL、LDL和HDL脂蛋白密度的级分中测量磷脂和胆固醇的水平。
工作实施例
短期目标是鉴定ApoA-I的化合物模拟物，其功能是将HDL-介导的胆固醇转运到肝脏中。长期目标是修饰所述化合物使它们可与脂蛋白的亚类相互作用，靶向它们到肝脏中并增加富含胆固醇的脂蛋白的代谢(反向胆固醇转运)的速率。不象调节胆固醇转运到外周组织的目前的处理(树脂、抑制素、fibrates)，本文采用的方法包括通过增加HDL胆固醇(HDL-C)水平和富含胆固醇的低密度脂蛋白的代谢来增加RCT的速度。该方法的合理性在于长期公认的RCT的速度和心血管风险之间的反向关系。
脂蛋白分离-从通过血浆取出法获自正常供体的新鲜空腹血浆中分离人血浆脂蛋白。使用调整密度的KBr通过连续超离心，在严格无菌，无内毒素条件下分离LDL(d＝1.019-1.063g/ml)。其对着包含0.3mM EDTA和丙丁酚的0.15mM NaCl，pH7.4进行透析，过滤除菌并贮存于4℃。
放射性碘标记-通过一氯化碘方法在终比活为约500-900cpm/ng制备125I-标记的LDL(Goldstein and Brown 1974 J.Biol.Chem.249：5153-5162)。培养的人成纤维细胞的低密度脂蛋白的结合和降解在终比活为约500-900cpm/ng处进行(Goldstein and Brown 1974 J.Biol.Chem.249：5153-5162)。在每种情形中，通过在4℃与10％(wt/vol)三氯乙酸(TCA)一起温育脂蛋白，＞99％放射性是可沉淀的。将酪氨酸残基与每种肽的N-末端连接以使其能被放射性碘标记。使用Iodo-Beads(Pierce Chemicals)，并按照生产商的手册，用Na125I(ICN)将肽放射性碘标记到800-1000cpm/ng的比活。透析后，肽的可沉淀的放射性(10％TCA)一直是＞97％。
肽的血浆稳定性和脂蛋白分布-用于这些研究的LDLR-/-小鼠是雄性，2月龄并用食物喂养的。将从非空腹小鼠中抽取的血液置于肝素包被的试管中，并于4℃进行低速离心以获得血浆。为了测量血浆稳定性，将5-6μg的放射性碘标记的肽加入0.25ml的血浆中。于37℃温育后，将等分试样移出并用10％TCA进行沉淀。为了研究ApoA-I肽与血浆中的脂蛋白和/或其它蛋白质的关联，将6-8μg的放射性碘标记的肽与0.12ml的小鼠血浆于37℃一起进行温育2小时。温育后，按照生产商的说明书，在1％琼脂糖凝胶(Paragon system，Beckman Coulter)上分离所述混合物，并在表示LDL，HDL，和白蛋白的带中对放射性进行定量。
肽的组织分布-在甲氧氟烷(metofane)麻醉下，将12μg放射性碘标记的肽静脉注射到apo A-I缺陷型小鼠的尾静脉中。注射40分钟后，将小鼠处死，并通过将冷PBS经过插管灌注到左心室中将血液去除。40分钟后，将通过眶后(retroorbital)取血到肝素化的试管中对小鼠进行取血。
介质-LDL复合物-通过将过量放射性标记的肽(SEQ ID NO：1)与以25∶1的摩尔比稀释到PBS中的人血浆LDL一起于25℃温育2小时来形成肽/脂蛋白复合物。将所述复合物对着包含20μM的丁基化的羟基甲苯(BHT)的PBS于4℃进行彻底透析以去除游离的肽，直到在透析的溶液中计算的放射性少于400-600cpm/ml至少2小时。立即使用形成的复合物。
SEQ ID NO：1-LDL复合物的血浆清除和组织分布-将125I-LDL(0.2nmol)单独在PBS中于37℃进行温育，或用4nmol的SEQ ID NO：1进行温育。2小时后，将所述混合物对着包含20mM BHT的PBS进行透析。在甲氧氟烷麻醉下，将单独的125I-LDL或SEQ ID NO：1/125I-LDL复合物静脉内注射到非空腹的小鼠的尾静脉中。注射后，在一定时间点通过眶后取血将小鼠血液采集到肝素化的试管中。将血液进行低速离心(1800g，4℃)并测量血浆的10％TCA的可沉淀的放射性。注射后40分钟，将小鼠处死，并通过将冷PBS经过插管灌注到左心室中来去除血液和非特异性结合的放射性。在内腔静脉制造切口以清除灌注液。在15分钟内，移去肝、肾、脾和心脏，并对其进行清洁、称重和对125I放射性进行计数。对完整的器官进行计数，除了以部分进行计数的肝之外。将每器官或每1g湿组织检测的放射性表示为作为可沉淀的TCA的起始总注射的放射性的百分比。
肽的单一丸剂注射对血浆脂蛋白图谱的影响-为了监测肽对血浆胆固醇水平及其在不同脂蛋白类别中的分布的影响，将非放射性碘标记的游离肽(在100μl PBS中的100μg)静脉内注射到非空腹的C57BL/6J野生型小鼠的尾静脉中，在实验前已将所述小鼠置于包含高胆酸盐的饮食4天。为了控制外部和/或内部非特异性因素(操作的压力、麻醉、血液抽取)对血浆脂蛋白图谱的影响，仅用PBS注射相似组的小鼠。在注射前和注射后的不同时间处死不同组的小鼠，通过眶后穿刺抽取血液并于4℃进行低速离心以获得血浆。血浆样品在每个组(4只小鼠)中获得，合并，并在Superose 6(HR 10/30柱，FPLC)上进行凝胶过滤层析法以监测胆固醇脂蛋白分布，进行琼脂糖凝胶电泳(Paragon Systems)以监测磷脂脂蛋白分布。
定时释放的肽对血浆脂蛋白图谱的影响-为了确定SEQ ID NO：1及其衍生物对血浆脂蛋白图谱的相对长期的影响，将包含各种肽或PBS的AlzetMini-渗透性泵(220μl)通过外科手术插入管饲的C57BL/6J小鼠中。将具有流速等于8μl/小时的泵用于肽的20小时的连续输注。将具有流速等于1μl/小时的泵用于肽的160小时的连续输注。在终点(泵插入后的20或160小时)，将小鼠处死，并通过眶后穿刺抽取血液，于4℃进行低速离心以获得血浆。使用胰岛素注射器立即从胆囊中去除胆汁并贮存于冰上直到使用。
样品分析-按照生产商的说明书，仅将建议的37℃温育时间从10分钟变化到15分钟，使用无限酶显色定量方法(infinitycolorimetric-enzymatic method)(Sigma 401-25P)来确定总血清胆固醇和HDL胆固醇。为了确定HDL胆固醇，按照生产商的说明书(BoehringerMannheim 543004)，仅将试剂：水的比率从4∶1修改到4∶2，使用改进的Burstein-Samaille方法来将低密度脂蛋白从血浆中沉淀出来。用去离子水将来自胆囊的胆汁稀释两次，使用无限试剂(infinity reagent)确定胆固醇。使用酶显色定量方法(Sigma 450)来对3α-羟基胆汁酸进行定量。
为了监测在不同脂蛋白类别中的胆固醇分布，在每组(通常是每组4-6只小鼠)中合并血浆样品，并使用等度10mM Tris/150mMNaCl/1mM EDTA缓冲系统在Superose 6(HR 10/30柱，Amersham-Pharmacia)以0.15ml/min的流速进行FPLC大小-排阻层析法。将级分(0.15ml)收集到包含0.055ml的0.5％Triton X-100和20mM胆酸钠1∶1的混合物的96孔板中。通过使用W.Gamble，等的荧光方法(Gamble et al.，1978，Journal Lipid Res.，16：1068-1070)来确定血浆级分中的总的胆固醇和游离的胆固醇。96孔板在双重-扫描微量培养板荧光分光光度计Gemini XS(Molecular Devices)上进行读数。使用Unicorn软件(Version 3.21.02)对在脂蛋白峰下的面积进行定量。通过将游离胆固醇从总胆固醇中减去来对酯化的胆固醇进行定量。
为了监测磷脂在脂蛋白类别中的分布，将血浆样品在每组中(通常是每组4-6只小鼠)合并，并按照生产商的说明书，使用Paragon系统(BeckmanCoulter)进行琼脂糖凝胶电泳，随后用Paragon Lipo染色剂(BeckmanCoulter 655910)进行染色。一旦干燥，将凝胶在Personal Densitometer SI(Molecular Dynamics)上进行扫描并使用Image Quanttm软件(Verssion 5.2)进行定量。
肽对PLTP活性的影响-使用荧光试剂盒(Cardiovascular Targets，Inc.，P7700)来测量PLTP的活性。PLTP的来源是获自C57BL/6J雄性2月龄小鼠的血清，将所述小鼠用Chow饲养或维持在包含高脂肪胆酸盐的食物上达4天。用PBS或0.4、2、5、和10μg肽于室温预温育1X小鼠血清达30分钟。预温育后，将所述混合物稀释10次，并立即将10μl(0.8υl巢血清(nest serum))混和到包含分析系统(Cardiovascular Targets，Inc.，P7700)的预冷的96孔板的反应孔中。在SpectraMax 190(Molecular Devices)中于37℃读数微量培养板，30分钟。
LDL介导的胆固醇在人HepG2细胞中的累积-将HepG2细胞于37℃培养在补充了10％FBS的DMEM中。实验开始前24小时，将细胞以于无血清培养基(用1％Nutridoma-HU补充的500μl RPMI，Roche，903454321)中2.5×105/孔的密度接种在24孔板中以容许LDL-受体的上调。在实验当天，用PBS洗涤细胞两次，并将25μg的用PBS或肽于室温预温育1小时的分离的人LDL(Academy Bio-Medical Co.，20P-L101)加入在500μl的SFM中的细胞中，随后于37℃温育6小时。温育后，去除培养基，用室温PBS洗涤细胞两次，通过己烷-异丙醇混合物(3∶2)来提取总胆固醇，并在氮气气体下进行干燥。将干燥的样品溶解在包含0.1％Triton X-100和4mM的胆酸钠的160μl的TE缓冲液(10mM Tris-HCL，150mMNaCl，1mM EDTA)中。使用W.Gamble，et al.的荧光方法对样品中的总的胆固醇和游离的胆固醇进行定量(Gamble et al.，1978，Journal LipidRes.，16：1068-1070)。通过将游离的胆固醇从总胆固醇中减去来评估酯化的胆固醇的量。将结果显示于图24中。
Ac-LDL介导的胆固醇在人巨噬细胞中的累积-将THP-1细胞于37℃培养在用10％FBS补充的RPMI中。在加样实验前48小时，在5×10-8M PMA存在情况下，将细胞以在无血清培养基(用1％Nutridoma-HU补充的500μl RPMI，Roche，Lot #：903454321)中1×106/孔的密度接种于24孔板中。在实验当天，将PBS或用PBS或肽于室温预温育1小时的人乙酰化了的LDL，(Biomedical technologies Inc.BT-906)加入细胞中。将被处理的细胞于37℃在湿润5％CO2培养器中培养24小时。培养后，去除培养基，用37℃PBS洗涤细胞两次，并将己烷-异丙醇(3∶2)混合物加入细胞中以提取胆固醇。30分钟后，将样品转移到玻璃试管中并在氮气下干燥。将形成的沉淀溶解于包含0.1％TritonX-100& 4mM胆酸钠的160μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA)中。通过使用W.Gamble，et al(Gamble et al，1978，Journal Lipid Res.，16：1068-1070)的荧光方法对总的胆固醇和游离的胆固醇进行定量。通过从总胆固醇中减去游离胆固醇来评估酯化的胆固醇的量。将结果显示于图25中。
氧化的-LDL介导的胆固醇在人血管平滑肌细胞中的累积-将血管平滑肌细胞于37℃培养在补充了5％FBS的SmGm-2(Cambrex，cc-3182)中。实验前24小时，将细胞以在500μl无血清测定培养基(用1％Nutridoma-HU补充的SmGM-2，Roche，Lot #：903454321)中85,000/孔的密度接种于24孔培养板中。在实验当天，用PBS洗涤细胞两次，并将用PBS或肽于室温预温育1小时的25μg的氧化的人LDL(Biomedical technologies Inc.BT-906)加入在500μl的无血清测定培养基(SFM)中的细胞中。将被处理的细胞于37℃在湿润的5％CO2的培养器中培养24小时。培养后，去除培养基，用37℃PBS洗涤细胞两次，用己烷-异丙醇(3∶2)混合物提取胆固醇。在氮气下干燥所述样品。将干燥的样品溶解于包含0.1％Triton X-100和4mM胆酸钠的160μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mMEDTA)中。使用在W.Gamble，et al(Gamble et al，1978，Journal Lipid Res.，16：1068-1070)中所述的荧光方法对样品中总的胆固醇和游离的胆固醇进行定量。通过将游离胆固醇从总胆固醇中减去来评估酯化的胆固醇的量。结果显示于图26中。
自Ac-LDL预载的人巨噬细胞的胆固醇流出-将THP-1细胞于37℃培养在用10％FBS补充的RPMI中。在加样实验前48小时，在5×10-8M PMA存在情况下，将细胞以在500μl的无血清培养基(用1％Nutridoma-HU补充的RPMI，Roche，Lot#：903454321)中1×106/孔的密度接种于24孔板中。在实验当天，在5×10-8M PMA存在情况下，将PBS或50μg人乙酰化了的LDL，(Biomedical technologies Inc.BT-906)加入在无血清的培养基中的细胞中。将被处理的细胞于37℃在湿润5％CO2培养器中培养24小时。培养后，去除培养基，用无血清培养基洗涤细胞，并将PBS或化合物加入500μl的无血清培养基(无PMA)的细胞中。将处理的细胞于37℃在湿润的5％CO2培养器中再培养48小时。每24小时更新化合物。培养后，去除培养基，用37℃PBS洗涤细胞2次，并将己烷-异丙醇(3∶2)混合物加入细胞中以提取胆固醇。30分钟后，将样品转移到玻璃试管中并在氮气下干燥。将形成的沉淀溶解于包含0.1％TritonX-100& 4mM胆酸钠的160μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA)中。通过使用W.Gamble，et al(Gamble et al，1978，Journal Lipid Res.，16：1068-1070)的荧光方法对总的胆固醇和游离的胆固醇进行定量。通过从总胆固醇中减去游离胆固醇来评估酯化的胆固醇的量。结果显示于图27中。
我们分析了ApoA-I一级、二级和三级结构以设计系列化合物。影响脂蛋白代谢的潜在前导化合物优选地，显示结合脂蛋白的能力和结合肝脂蛋白结合位点的能力。因此，对所有的化合物进行放射性标记并对它们的体内(小鼠)组织分布和体外结合小鼠血浆脂蛋白的能力进行筛选。
RCT的肽介质在体外的表征-将12个化合物进行放射性碘标记并用来自LDL-受体缺陷型(LDLR-/-)的小鼠的血浆进行温育。这些小鼠具有类似于在人中的脂蛋白图谱。于37℃温育2小时后，将所述混合物在琼脂糖凝胶上进行分离并在表示LDL、HDL和白蛋白的条带中对放射性进行定量。将结果归纳于图2。基于这些结果，将显示与脂蛋白具有明显关联的化合物在体内进行进一步特征鉴定。
RCT的肽介质在体内的表征-将放射性标记的化合物静脉内注射到小鼠中。结束时，对小鼠进行放血，并大量灌注以去除循环(非特异性)放射性。收集全血和潜在靶向器官并对其进行计数。计算小鼠的收集的器官和全部血液体积的总放射性-将器官结合的放射性表示为总放射性的百分比。化合物注射后的器官结合放射性的结果显示于图3中。基于这些数据，选择SEQ ID NO：1进行进一步体内特征鉴定。
体内SEQ ID NO：1的进一步表征-图4举例说明了SEQ ID NO：1的器官分布。因为与其它器官和肽相比，该化合物与肝优选地结合至极大程度，我们选择集中努力于该化合物。
为了确定SEQ ID NO：1是否能与人LDL具有关联，我们尝试与分离的人LDL一起形成125I-SEQ ID NO：1的复合物。已经证实SEQ ID NO：1形成稳定的[LDL-125I-SEQ ID NO：1]复合物，其中每个LDL颗粒与约6-8个拷贝的[125I-SEQ ID NO：1]结合。为了确定SEQ ID NO：1是否影响脂蛋白向肝的转运，我们将单独的125I-LDL或与SEQ ID NO：1一起的复合物注射到具有功能性肝LDL-受体的LDLR-/-小鼠(无LDL-受体)和A-I-/-小鼠中。评价与肝关联的放射性，并将结果显示于图5中。在两种小鼠基因型中，在注射前将[125I-LDL]与SEQ ID NO：1复合导致了在肝-结合[125I-LDL]中的明显增加。这些数据显示增加(与[125I-LDL]比较)的肝结合[125I-LDL-SEQ ID NO：1]复合物由：(a)尚不知道的肝脂蛋白结合位点；(b)LDL-受体所介导。为了评价单独的LDL-受体的作用，将[125I-LDL]和[125I-LDL-SEQ ID NO：1]与LDLR-/-小鼠的肝的结合从它们各自与A-I-/-小鼠的肝的结合中减去，并将数据标准化为每克湿组织。将该减少的结果显示于图6中并显示与单独的[125I-LDL]相比，在与LDL-受体的复合结合中的大幅度增加。与单独的125I-LDL相比，这些数据显示当被注射到ApoA1-/-小鼠(图7)中时，与增加的125I-LDL-SEQ ID NO：1复合物的血浆清除的良好一致性。SEQ ID NO：1对125I-LDL与肾、脾、肺、心脏、睾丸、肾上腺和前列腺结合的影响显示于图8中。值得注意的是，没有观察到125I-LDL-SEQ ID NO：1复合物与心脏的结合的增加。
SEQ ID NO：1对脂蛋白代谢的影响(单一丸剂注射)-我们检查了在SEQ ID NO：1对轻度高脂血症野生型C57BL/6J小鼠中的胆固醇代谢的影响，用包含胆酸盐的高脂肪食物(HFC)饲养所述C57BL/6J小鼠。将小鼠分成两组-对照和实验。每组包含4只小鼠。用SEQ ID NO：1(在100μl PBS中的100μg)对实验小鼠进行静脉内注射，其中对照组用100μl PBS进行注射。在注射后0分钟(没有注射)、30、60、90、120和180分钟时对不同组的小鼠进行取血，获得血浆，在每组中合并，并进行FPLC分析。对在不同脂蛋白类别中的胆固醇分布进行评价并将数据表示为分别在VLDL、IDL/LDL和HDL峰下的胆固醇含量(Act*ml)或面积。将该结果显示于图9、10和11中。尽管，在整个时间过程中，SEQ ID NO：1对VLDL水平没有明显影响，与PBS对照相比，肝反应的动力学显著不同(图9)。SEQ ID NO：1注射后，在90、120和180分钟时，观察到IDL/LDL(proatherogenic脂蛋白和致动脉硬化的脂蛋白)的明显降低(图10)。SEQ ID NO：1的影响一直持续到180分钟时，并在240分钟时间点彻底消失。这些数据与约2-3小时的125I-SEQ ID NO：1体内半衰期数据一致。在SEQ ID NO：1的单一丸剂注射后观察到HDL-C水平的轻微但明显的增加(图11)，显示HDL清除的可能增加。单一丸剂注射的的线性回归分析的数据显示于图12-14中，并显示SEQ ID NO：1对pro-和致动脉硬化脂蛋白(IDL和LDL)的血浆水平的明显影响。
“移码”衍生的肽对脂蛋白代谢的影响(单一丸剂注射)-我们对衍生SEQ ID NO：1的小鼠载脂蛋白A1的整个区域(螺旋6、Pro 166-Pro 188、前体蛋白质)进行功能移码。在两个方向上都进行移码(从N-C并从C-N末端)。设计、合成16个肽并测试其对在轻度高脂血症C57BL/6J小鼠中的胆固醇代谢的可能影响，用所述包含胆酸盐的高脂肪饮食(HFC)饲养所述C57BL/6J小鼠。将小鼠分成两组-对照和实验。每组包含4只小鼠。用每种肽(在100μl PBS中的100μg)对实验小鼠进行静脉内注射，而对照组-用100μl的PBS。在注射后0分钟(没有注射)、90和180分钟对不同组的小鼠进行取血，获得血浆，在每组中进行合并，进行FPLC分析。对在不同脂蛋白类别中的胆固醇分布进行评价，并对在VLDL、IDL/LDL和HDL峰下的胆固醇含量(Act*ml)或面积进行定量。将数据表示为实验小鼠中的VLDL，IDL/LDL，和HDL类别的总胆固醇(TC)含量相对于对照(PBS注射)小鼠的变化的百分比。将该结果显示于表6和7中。在表6和7中可见，与其它序列相比，属于螺旋6的N-端部分的SEQ ID NO：1对低密度脂蛋白的血浆水平具有最强的影响，而属于螺旋6的C-端部分的SEQ ID NO：7显示HDL-C的显著的升高特性。
在单一丸剂注射(SBI)后90分钟，移码衍生的肽对血浆脂蛋白图谱的影响
  #   AVP#   序列   M.W.   VLDL   IDL/LDL   HDL
  1   606   YEFRDRMRTH   1451.8   -34   -26   -5.3
  2   13577   PVAEEFRDRMRTHVDSLRTQLAP   2766.5   0   -12.4   -1.6
  3   13578      EEFRDRMRTHVDSLRTQLAP   2499.1   38.4   12.2   -15.1
  4   13579        FRDRMRTHVDSLRTQLAP   2240.8   -4   -3   19.5
  5   13580         RDRMRTHVDSLRTQLAP   2093.4   -3.5   12.6   11.1
  6   13590            MRTHVDSLRTQLAP   1665.9   -1.6   -2.1   -6.3
  7   13581             RTHVDSLRTQLAP   1534.7   -6.5   5.2   9.1
  8   13582              THVDSLRTQLAP   1376.6   26   2.3   31
  9   13583                 DSLRTQLAP   1041.2   9.3   10.4   8.3
10 13600 PVAEEFRDRMRTHVDSLR 2255.4 47 23.5 16.1
  11   13584   PVAEEFRDRMRTHV   1783.9   0   9.7   -22.3
  12   13585   PVAEEFRDRMR   1446.3   -4   6.6   5
  13   13586   PVAEEFRDRM   1290.2   -21   2.1   13.5
  14   13587   PVAEEFRDR   1159.3   -10   8.5   11.4
  15   13588   PVAEEF   731.6   30.7   0   20
  16   13589   PVAEE   584.6   4.4   4.6   16.5
表6.将小鼠分成两组(每组4只小鼠)。将肽或PBS分别静脉内注射到实验或对照小鼠中。在SBI后90分钟时，获得血浆，在每组中合并，并应用在Superose 6柱上。将数据表示为与PBS对照相比，在VLDL、IDL/LDL和HDL峰下的TC|Area(ACT*ml)或面积的变化的％。
在单一丸剂注射(SBI)后180分钟，移码衍生的肽对血浆脂蛋白图谱的影响
  #     AVP#  序列   M.W.     VLDL     DL/LDL    HDL
  1     606  YEFRDRMRTH   1451.8     -29.31    -34.11   -10
  2     13577  PVAEEFRDRMRTHVDSLRTQLAP   2766.5     19.5    3.1   4.3
  3     13578     EEFRDRMRTHVDSLRTQLAP   2499.1     -18.8    -8.3   -15.7
  4     13579       FRDRMRTHVDSLRTQLAP   2240.8     -5    -7.1   -9.5
  5     13580        RDRMRTHVDSLRTQLAP   2093.4     -21.5    -7.6   4.9
  6     13590           MRTHVDSLRTQLAP   1885.9     -2.8    -15.3   0
  7     13581            RTHVDSLRTQLAP   1534.7     -17.6    0   -14.8
  8     13582             THVDSLRTQLAP   1376.6     26.7    -11.1   29.4
  9     13583                DSLRTQLAP   1041.2     10.8    12.9   -10.1
  10     13600 PVAEEFRDRMRTHVDSLR   2255.4     0    6.2   8.4
  11     13584 PVAEEFRDRMRTHV   1783.8     -20.7    -4.3   -24.1
  12     13585 PVAEEFRDRMR   1446.3     -17    -3.2   -4.5
  13     13586 PVAEEFRDRMR   1290.2     23.3    18.8   4.5
  14     13587 PVAEEFRDR   1159.3     -33.7    5.1   0
  15     13588 PVAEEF   731.6     51    14.6   6.8
  16     13589 PVAEE   584.6     9.7    7.5   7.2
表7.将小鼠分成两组(每组4只小鼠)。将肽或PBS分别静脉内注射到实验或对照小鼠中。在SBI后180分钟时，获得血浆，在每组中合并，并应用在Superose 6柱上。将数据表示为与PBS对照相比，在VLDL、IDL/LDL和HDL峰下的TC|Area(ACT*ml)或面积的变化的％。
SEQ ID NO：1的化学修饰的衍生物和衍生自其它小鼠apoA1区域的肽对小鼠血浆脂蛋白模式的影响(单一丸剂注射)-为了增加SEQ ID NO：1的疏水性，将苯乙酰基或新戊酸连接于SEQ ID NO：1的N-端酪氨酸残基，或将酪氨酸残基从N-末端去除。测试这些肽对轻度高脂血症C57BL/6J小鼠中的胆固醇代谢的可能影响，用所述包含胆酸盐的高脂肪饮食(HFC)饲养所述C57BL/6J小鼠。将小鼠分成两组-对照和实验。每组包含4只小鼠。用每种肽(在100μlPBS中的100μg)对实验小鼠进行静脉内注射，而对照组-用100μl的PBS。在注射后0分钟(没有注射)、90和180分钟对不同组的小鼠进行取血，获得血浆，在每组中进行合并，进行FPLC分析。对在不同脂蛋白类别中的胆固醇分布进行评价，并对在VLDL、IDL/LDL和HDL峰下的胆固醇含量(Act*ml)或面积进行定量。将数据表示为实验小鼠中的VLDL，IDL/LDL，和HDL类别的总胆固醇(TC)含量相对于对照(PBS注射)小鼠的变化的百分比。将该结果显示于表8中。在表中可见，所有上述修饰没有导致SEQ ID NO：1效能的增加。还在该模型中检验了属于小鼠载脂蛋白A1中的其它区域的极少量肽，其没有显示任何显著的活性(表8)。
AVP#606的化学修饰的衍生物和来自其它小鼠apoA1区域的肽对小鼠血浆脂蛋白图谱的影响。单一丸剂注射
  #     AVP#   序列     M.W.     VLDL      IDL/LDL     HDL
                                                    SBI后96分钟
  1     13635   Ph  YEFRDRMRTH     1527.7     31.7     3.1     -4.5
  2     25740   Ply YEFRDRMRTH     1494     11     -1.3     5.7
  3     25984   EFRDRMRTH     1288.3     4.4     0     -11.2
  4     13608   WDWVKDF     978.1     -17.4     -16.1     -12.4
  5     13609   SGRDYVSQFES     1315.4     21.4     8.2     0
  6     13610   YLDEFQKKWKE     1554.8     9.5     11.7     19.5
  7     13811   TRDFWDNLEKETDW     1896.1     32.6     11.7     9.5
  8     13616   WDKVKDFANYVYDAVKD     2053.3     -2.6     9     0
                                          SBI后180分钟
  1     13625   Ph  YEFRDRMRTH     1527.7     -17.1     -31.2     -21.5
  2     25740   Ply YEFRDRMRTH     1494     -14.9     -10.7     -7.4
  3     25984   EFRDRMRTH     1288.3     8.9     -11     -3
  4     13608   WDKVKDF     978.1     -15.8     15.6     -11.7
  5     13609   SGRDYVSQFES     1315.4     18.4     0     0
  6     13610   YLDEFQKKWKE     1554.8     -10.6     -3.5     -20
  7     13611   TRDFWDNLEKETDW     1896.1     -2     0     -16.1
  8     13616   WDKVKDFANVYVDAVKD     2053.3     19.4     19.9     18.1
表8.将小鼠分成两组(每组4只小鼠)。将肽或PBS分别静脉内注射到实验或对照小鼠中。在SBI后90和180分钟时，获得血浆，在每组中合并，并应用在Superose 6柱上。将数据表示为与PBS对照相比，在VLDL、IDL/LDL和HDL峰下的TC|Area(ACT*ml)或面积的变化的％。
SEQ ID NO：1对脂蛋白代谢的影响(20小时泵)-为了确定SEQ IDNO：1对血浆脂蛋白图谱的相对长期影响，将包含SEQ ID NO：1或PBS的Alzet Mini-Osmotic泵以外科手术插入管饲的C57BL/6J小鼠中。泵的流动速率等于8μl/小时，其每个小时提供图9中所指示的递送量的SEQ IDNO：1。手术后，立即向动物开放HFC饮食。20小时后，获得血浆样品，在每组(4-6只小鼠)中合并，进行FPLC分析和琼脂糖凝胶电泳以评价在脂蛋白类别中的胆固醇和磷脂分布。结果在图15中表示并显示在接受SEQID NO：1的小鼠血浆中的低密度脂蛋白水平中的极大降低，而在这些小鼠中的血浆HDL胆固醇水平升高。LDL降低效应随SEQ ID NO：1浓度的增加而削弱。该现象可通过SEQ ID NO：1的游离和LDL-结合形式对于肝脂蛋白结合位点之间的自我竞争来解释。相反，HDL胆固醇水平与SEQ IDNO：1浓度呈正相关。血浆HDL-C的增加显示LCAT(卵磷脂：胆固醇脂酰转移酶)的可能的活化或ApoA-I产生的增加，而升高的HDL磷脂的血浆水平(数据没有显示)显示PLTP(磷脂转移蛋白质)涉及SEQ ID NO：1作用的机制。因此，获得的数据显示SEQ ID NO：1多-官能度并提示其涉及在HDL和LDL途径中。
SEQ ID NO：1结构衍生物(3-13个氨基酸残基)对脂蛋白代谢的影响(20小时泵)-为了确定对血浆脂蛋白图谱的相对长期影响，将包含SEQ IDNO：1衍生物或PBS的Alzet Mini-Osmotic泵以外科手术插入管饲的C57BL/6J小鼠中。泵的流动速率等于8μl/小时，其每个小时提供30-40μg的肽的传递。手术后，立即向动物开放HFC饮食。20小时后，获得血浆样品，在每组(4-6只小鼠)中合并，进行FPLC分析和琼脂糖凝胶电泳以评价在脂蛋白类别中的胆固醇和磷脂分布。HDL-C的数据表示在图16中并证实低密度脂蛋白在被肽处理小鼠中的血浆水平的显著减少，而在这些小鼠中的血浆HDL胆固醇水平升高。但是，少量肽(诸如SEQ ID NOs：35和87)导致相反效果，即，低密度脂蛋白的血浆水平的增加和高密度脂蛋白胆固醇和磷脂的减少。根据这些“清除阻塞”肽与“清除增加”肽之间的紧密结构关系，该反向作用是对于SAR目的有价值的信息。在血浆HDL-C中的适度增加可能显示LCAT(卵磷脂：胆固醇脂酰转移酶)的可能活化或ApoA-I产生的增加，而HDL磷脂的血浆水平的升高提示PLTP(磷脂转运蛋白质)涉及肽作用机制。因此，获得的数据提示SEQ ID NO：1衍生物涉及HDL和LDL途径。
SEQ ID NO：34(“模板”，3个氨基酸残基肽)及其修饰的衍生物(SEQ IDNO：8和91)对脂蛋白代谢的长期影响(7天泵)-为了确定这些肽对血浆脂蛋白图谱的长期影响，将包含肽或PBS的Alzet Mini-Osmotic泵以外科手术插入管饲的C57BL/6J小鼠中。泵的流动速率等于1μl/小时，其每个小时提供如图17所示的量的每种肽的传递。手术后，立即向动物开放HFC饮食。160小时后，将小鼠处死，并获得血浆样品，在每组(4-6只小鼠)中合并，并进行FPLC分析和琼脂糖凝胶电泳以评价在脂蛋白类别中的胆固醇和磷脂分布。立即将胆汁从胆囊中去除并如所述方法中确定总胆固醇/胆汁酸的含量。将数据表示在图17中并证实在被肽处理的小鼠中的低密度脂蛋白的血浆水平的显著减少，血浆HDL胆固醇(和HDL磷脂-数据没有显示)的升高，和胆囊总胆固醇及胆汁酸量的极大增加。在血浆HDL-C中的适度增加可能显示LCAT(卵磷脂：胆固醇脂酰转移酶)的可能活化或ApoA-I产生的增加，而HDL磷脂的血浆水平的升高提示PLTP(磷脂转移蛋白质)的活化，已知其涉及维持血浆HDL水平和产生初生HDL颗粒(初级胆固醇受体)。在图17中可见将SEQ ID Nos：34，86和91施用到小鼠中导致了磷脂在HDL区中的量的增加，其通常伴随从胆囊中回收的总胆固醇和胆汁酸的增加。胆囊中胆固醇/胆汁酸量的增加，以及血浆低密度脂蛋白水平(VLDL、IDL、LDL)的减少和HDL水平的增加，指示增加的“血浆＞肝＞胆囊”的胆固醇流出，即如图17中所举例说明的按照本发明的优选方面的肽存在时，反向胆固醇的转运。
肽对PLTP活性的影响-在图18中可见与SEQ ID Nos：34、86、91和96一起温育小鼠血浆导致PLTP的活化。将获自Chow饲养的小鼠和用包含高脂肪胆汁盐的食物饲养4天的小鼠的小鼠血浆(酶源)与PBS或SEQ IDNos：34、86、91和96的肽(0.4、2、5、和10μg)一起与室温温育30分钟。通过添加0.3μl的血浆/PBS或血浆/SEQ ID NO混合物到100μl的包含荧光底物的测定溶液中来起始反应。于37℃在分光光度计上监测PLTP的活性达20分钟。每个条形框表示获自3个独立实验的平均值±SEM。这些数据与研究这些肽对小鼠血浆HDL水平的长期影响(例如，显示于图17中的以7天泵获得的结果)的结果具有良好一致性，并提供支持PLTP涉及肽作用的体内机制的有力证据。对应于SEQ ID Nos：35和36的肽对PLTP活性没有任何显著影响。值得注意的是在输注到小鼠中20小时后，这两个肽也没有显示明显的活性(见图16)。
SEQ ID NO 91(AVP-26249)的急性口服施用对小鼠血浆脂蛋白图谱和胆汁中的胆汁酸/胆固醇的影响-参见图19，显示2.5和20μg的条形框表示2个独立的实验的平均值±SEM，显示5和10μg的条形框表示用HFD饲养的C57BL/6J进行的3个独立实验的平均值±SEM。无误差棒-单个实验。将影响表示为相对于PBS对照(0％)的变化的％。
SEQ ID NO：91(A VP-26249)的Ad Lib对Chow饲养的ApoE-/-小鼠的口服施用对血浆TC(总胆固醇)的影响-关于图20，用Chow食物饲养两月龄ApoE-/-的雄性小鼠。在实验当天，在T0(时间0)，对小鼠进行取血(50μl)，确定血浆TC，并将小鼠分成具有相似T0组平均胆固醇值的组(每组4只小鼠)。对照小鼠接受饮用水，而实验小鼠接受化合物的水溶液。每72-96小时对小鼠进行取血，并对血浆胆固醇进行定量。每个条形框表示4只动物的平均值±SEM，并且代表双周进行的15次测定。将SEQ ID NO：91的量表示为每24小时消耗的mg/kg(mpk)。
SEQ ID NOS：91、145、146和118(AVP-26249、26451、26452、和26355，各自地)对用高脂肪食物饲养的ApoE-/-雄性小鼠的血浆胆固醇水平的影响-参见图21，使3月龄的ApoE-/-雄性小鼠维持在Chow食物上。在第0天，对小鼠进行取血，确定血浆TC，并将小鼠分成具有相似组平均胆固醇和重量值的组(每组4只小鼠)。对照小鼠接受饮用水，而实验小鼠接受化合物的水溶液。4周后，对小鼠开放高脂肪食物。在第10天对小鼠取血1次，并对总血浆胆固醇进行定量。每个条形框表示4只动物的平均值±SEM并代表7次测定。将SEQ ID NO的量表示为每24小时消耗的mg/kg(mpk)。
SEQ ID NOS：91、145、146和118(AVP-26249、26451、26452和26355，各自地)对由用高脂肪食物饲养的ApoE-/-雄性小鼠分泌的胆固醇的量的影响-参见图22，将8个组的5月龄ApoE-/-雄性小鼠(每组4只小鼠)维持在高脂肪食物上。对照小鼠接受饮用水，而实验小鼠接受化合物“Ad Lib”的水溶液。将小鼠置于代谢笼中过夜。次日，收集粪便，干燥72小时，进行称重，并提取总胆固醇进行定量。每个条形框表示用高脂肪食物饲养小鼠后的2.4周和3.4周进行的两次独立“代谢笼”实验的平均值±SEM。将SEQ ID NO的量表示为每24小时消耗的mg/kg(mpk)。
总之，归纳于图2-22和表6-8中的结果证实了通过静脉内或口服传递路径被施用按照本发明的分子模型设计的RCT的肽介质的高脂血症的小鼠，显示了血浆脂蛋白图谱的实质提高，这是由于增加了低密度(致动脉粥样硬化的)脂蛋白的清除和升高了抗致动脉粥样硬化的高密度脂蛋白的血浆水平。
参见图23，示意图显示用在鉴定测试化合物的筛选方法中的体外三角方法可能在体内增加RCT。将培养的巨噬细胞用于评价测试的RCT介质化合物对ac-LDL胆固醇的累积和从预载的巨噬细胞(累积胆固醇的巨噬细胞有助于泡沫细胞(foam cell)形成和动脉粥样斑块形成)中的胆固醇流出的影响。因此，这种三角区室用于评价测试化合物对RCT以及动脉粥样硬化的发病机理的效力。培养的原初(primary)平滑肌细胞用于评价测试的RCT介质化合物对血管壁中的ox-LDL的累积的影响，其还可与泡沫细胞的形成以及动脉粥样硬化的进展有关。将培养的肝细胞用于评价测试的RCT介质化合物对肝的胆固醇吸收的影响。外周细胞(与肝细胞结合的巨噬细胞和/或平滑肌细胞)的应用有利地提供对RCT-减少的胆固醇累积和增加的自外周细胞的胆固醇的流出，以及由肝进行的吸收的监测(代谢和分泌的)。
SEQ ID NOS：91和146(AVP-26249和AVP-26452，分别地)对LDL介导的总胆固醇在HepG2细胞中的累积的影响。参见图24，将人HepG2细胞以于无血清(无脂蛋白)测定培养基中2.5×105/孔的密度接种在24孔板中。48小时后，将25μg的与PBS或化合物一起于室温预温育1小时的人LDL加入500μl的无血清培养基中的细胞中。将被处理的细胞于37℃在湿润的5％CO2培养器中培养24小时。每个条形框表示2-3个独立实验的平均值±SEM。
SEQ ID NO：91(AVP-26249)对Ac-LDL介导的总胆固醇和胆固醇酯在巨噬细胞中累积的影响。参见图25，在5×10-8M的PMA存在时，将人THP-1细胞以1×106/孔的密度接种于在24孔板中的测定培养基中。48小时后，将与PBS(对照)，或AVP-26249一起在室温预温育1小时的50μg人AcLDL加入在500μl的测定培养基中的细胞中。将被处理的细胞于37℃在湿润的5％CO2培养器中培养24小时。每个条形框表示3-9个重复的平均值±SEM。
SEQ ID NOS：91和146(AVP-26249和26452，分别地)对Ox-LDL介导的总胆固醇和胆固醇酯在血管平滑肌细胞中的累积的影响。参见图26，将人血管平滑肌细胞以在无血清测定培养基中9×104/孔的密度接种于24孔板中。24小时后，将仅PBS或与PBS，或与化合物一起于室温预温育1小时的人氧化的LDL加入在500μl的测定培养基中的细胞中。将被处理的细胞于37℃在湿润的5％CO2培养器中培养24小时。每个条形框表示4-7个独立实验的平均值±SEM。
SEQ ID NOS：91和146(AVP-26249和AVP-26452，分别地)对来自AcLDL-负载的巨噬细胞中的胆固醇流出的影响。参见图27，在5×10-8M的PMA存在时，将人THP-1细胞以1×106/孔的密度接种于24孔板中的测定培养基中。48小时后，将50μg的人乙酰化了的LDL或PBS加入在500μl的含PMA的测定培养基中的细胞中。24小时后，洗涤细胞，并将PBS或化合物加入在500μl的测定培养基中的细胞中。在每次处理之前和之后，将细胞于37℃培养在湿润的5％CO2的培养器中。每个条形框表示5-6个独立的实验的平均值±SEM。
一个目标是将胆固醇从巨噬细胞和主动脉细胞移到肝中以进行胆固醇清除(见图30)。测试化合物诸如显示在表3-5中的那些其中之一影响RCT的能力可基于如上述图24-27所显示进行的测定来预测。即，这三种细胞类型提供在生物中的胆固醇状况的快速观察。给定化合物减少胆固醇和CE在巨噬细胞诸如THP-1细胞和血管平滑肌细胞中水平而增加在肝细胞诸如(HepG2细胞)中的胆固醇水平的能力预测其在体内的有效性。因此，本发明的一个实施方案包括一种筛选方法，其中使用巨噬细胞、平滑肌细胞和肝细胞系诸如公开的那些进行体外测定测试化合物以提供体内RCT的指示。
SEQ ID NO：91(AVP-26249)对在用高脂肪食物饲养的ApoE-/-小鼠的主动脉中的动脉粥样硬化损伤的进展的影响参见图28，将ApoE-/-雄性小鼠维持在Chow食物上4周，并维持在HFD(1.25％的胆固醇)上9.3周。小鼠通过饮用水接受SEQ ID NO：91(AVP-26249)“ad lib”13.3周。SEQ ID NO：91的浓度是0(左行)，1.4μg/kg(中行)和2.8μg/kg(右行)。安乐死时，用PBS，随后用缩甲醛-蔗糖(formal-sucrose)(在PBS中的4％多聚甲醛和5％蔗糖，pH7.4)灌注动物。通过使用解剖显微镜，将完整的小鼠主动脉从最接近的升主动脉解剖到髂动脉的分叉。去除外膜脂肪并将动脉纵向打开，将平面钉在黑色的解剖蜡上。用苏丹IV染色，并在固定的放大倍率进行拍照。将照片数字化并显示数字图像。通过使用Adope Photoshop 7.0和NIH Scion图像软件(数据没有显示)计算总主动脉面积和主动脉病变面积。
SEQ ID NO：146(AVP-26452)对用高脂肪食物饲养的ApoE-/-小鼠的主动脉中的动脉粥样硬化损伤进展的影响参见图29，将ApoE-/-雄性小鼠维持在Chow食物上4周，并维持在HFD(1.25％的胆固醇)上9.3周。小鼠通过饮用水接受SEQ ID NO：146(AVP-26452)“ad lib”13.3周。SEQ ID NO：146的浓度是0(左行)，1.4μg/kg(中行)和2.8μg/kg(右行)。
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                           序列表
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     杰加迪斯·西尔卡
     卡希纳萨姆·阿利萨拉
     伊戈尔·尼库林
<120>治疗高胆固醇血症的反向胆固醇转运的介质
<130>AVANIR.096VPC
<150>60/464,667
<151>2003-04-22
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<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(10)...(10)
<223>化学合成的肽
<400>1
Tyr Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His
 1               5                  10
<210>2
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(23)...(23)
<223>化学合成的肽
<400>2
Pro Val Ala Glu Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His Val Asp Ser
 1               5                  10                  15
Leu Arg Thr Gln Leu Ala Pro
             20
<210>3
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(20)...(20)
<223>化学合成的肽
<400>3
Glu Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His Val Asn Ser Leu Arg Thr
 1               5                  10                  15
Gln Leu Ala Pro
            20
<210>4
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(18)...(18)
<223>化学合成的肽
<400>4
Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His Val Asp Ser Leu Arg Thr Gln Leu
 1               5                  10                  15
Ala Pro
<210>5
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(17)...(17)
<223>化学合成的肽
<400>5
Arg Asp Arg Met Arg Thr His Val Asp Ser Leu Arg Thr Gln Leu Ala
 1               5                  10                  15
Pro
<210>6
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(13)...(13)
<223>化学合成的肽
<400>6
Arg Thr His Val Asp Ser Leu Arg Thr Gln Leu Ala Pro
 1               5                  10
<210>7
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(12)...(12)
<223>化学合成的肽
<400>7
Thr His Val Asp Ser Leu Arg Thr Gln Leu Ala Pro
 1               5                  10
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<223>化学合成的肽
<400>8
Asp Ser Leu Arg Thr Gln Leu Ala Pro
 1               5
<210>9
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(14)...(14)
<223>化学合成的肽
<400>9
Pro Val Ala Glu Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His Val
 1               5                  10
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(11)...(11)
<223>化学合成的肽
<400>10
Pro Val Ala Glu Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg
 1               5                  10
<210>11
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(10)...(10)
<223>化学合成的肽
<400>11
Pro Val Ala Glu Glu Phe Arg Asp Arg Met
 1               5                  10
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<223>化学合成的肽
<400>12
Pro Val Ala Glu Glu Phe Arg Asp Arg
 1               5
<210>13
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(6)...(6)
<223>化学合成的肽
<400>13
Pro Val Ala Glu Glu Phe
 1               5
<210>14
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<223>化学合成的肽
<400>14
Pro Val Ala Glu Glu
 1               5
<210>15
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(14)...(14)
<223>化学合成的肽
<400>15
Met Arg Thr His Val Asp Ser Leu Arg Thr Gln Leu Ala Pro
 1               5                  10
<210>16
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(18)...(18)
<223>化学合成的肽
<400>16
Pro Val Ala Glu Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His Val Asp Ser
 1               5                  10                  15
Leu Arg
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(7)...(7)
<223>化学合成的肽
<400>17
Trp Asp Lys Val Lys Asp Phe
 1               5
<210>18
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(11)...(11)
<223>化学合成的肽
<400>18
Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Ser
 1               5                  10
<210>19
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(11)...(11)
<223>化学合成的肽
<400>19
Tyr Leu Asp Glu Phe Gln Lys Lys Trp Lys Glu
 1               5                  10
<210>20
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(14)...(14)
<223>化学合成的肽
<400>20
Thr Arg Asp Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Asp Trp
 1               5                10
<210>21
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(17)...(17)
<223>化学合成的肽
<400>21
Trp Asp Lys Val Lys Asp Phe Ala Asn Val Tyr Val Asp Ala Val Lys
 1               5                  10                  15
Asp
<210>22
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)...(1)
<223>N末端被苯乙酰化
<221>酰胺化
<222>(10)...(10)
<223>化学合成的肽
<400>22
Tyr Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His
 1               5                  10
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(10)...(10)
<223>化学合成的肽
<400>23
Tyr Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His
 1               5                  10
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(1)
<223>N-末端被新戊酰化
<221>酰胺化
<222>(10)...(10)
<400>24
Tyr Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His
 1               5                  10
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<400>25
Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His
 1               5
<210>26
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(7)...(7)
<400>26
Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg
 1               5
<210>27
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(8)...(8)
<400>27
Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His
 1               5
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<221>SITE
<222>(9)...(9)
<223>D-氨基酸
<400>28
Tyr Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His
 1               5
<210>29
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(8)...(8)
<400>29
Glu Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg
 1               5
<210>30
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(2)...(2)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(8)...(8)
<221>SITE
<222>(8)...(8)
<223>D-氨基酸
<400>30
Phe Arg Asp Arg Phe Arg Asp Arg
 1               5
<210>31
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(6)...(6)
<221>SITE
<222>(6)...(6)
<223>D-氨基酸
<400>31
Glu Phe Arg Asp Arg Met
 1               5
<210>32
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<400>32
Glu Phe Arg Asp Arg
 1               5
<210>33
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(4)...(4)
<400>33
Glu Phe Arg Asp
 1
<210>34
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(3)...(3)
<400>34
Glu Phe Arg
 1
<210>35
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(7)...(7)
<221>SITE
<222>(7)...(7)
<223>D-氨基酸
<400>35
Arg Asp Arg Met Arg Thr His
 1               5
<210>36
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(6)...(6)
<400>36
Asp Arg Met Arg Thr His
 1               5
<210>37
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(2)...(2)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(7)...(7)
<400>37
Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr
 1               5
<210>38
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(6)...(6)
<400>38
Phe Arg ASp Arg Met Arg
 1               5
<210>39
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(2)...(2)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(7)...(7)
<221>SITE
<222>(7)...(7)
<223>D-氨基酸
<400>39
Phe Phe Arg Asp Arg Met Arg
 1               5
<210>40
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<400>40
Phe Arg Asp Arg Met
 1               5
<210>41
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(6)...(6)
<400>41
Tyr Phe Arg Asp Arg Met
 1               5
<210>42
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<221>SITE
<222>(5)...(5)
<223>D-氨基酸
<400>42
Tyr Phe Arg Asp Arg
 1               5
<210>43
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<221>SITE
<222>(0)...(0)
<223>D-氨基酸
<400>43
Phe Arg Asp Arg Phe
 1               5
<210>44
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<400>44
Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr Phe
 1               5
<210>45
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(6)...(6)
<221>SITE
<222>(6)...(6)
<223>D-氨基酸
<400>45
Glu Phe Arg Asp Arg Phe
 1               5
<210>46
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(2)...(2)
<223>D-氨基酸
<221>SITE
<222>(4)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(6)...(6)
<400>46
Phe Arg Asp Arg Phe Phe
 1               5
<210>47
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(2)...(2)
<223>D-氨基酸
<221>SITE
<222>(4)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(6)...(6)
<400>47
Phe Arg Asp Arg Phe Tyr
 1               5
<210>48
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(2)...(2)
<223>D-氨基酸
<221>SITE
<222>(9)...(9)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<400>48
Phe Phe Asp Arg Phe Arg Asp Arg Phe
 1               5
<210>49
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>D-氨基酸
<221>SITE
<222>(9)...(9)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<400>49
Met Arg Asp Arg Phe Arg Asp Arg Met
 1               5
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<400>50
Phe Arg Asp Arg Phe Arg Asp Arg Phe
 1               5
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<400>51
Phe Arg Asp Arg Met Arg Asp Arg Met
 1               5
<210>52
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<400>52
Met Arg Asp Arg Phe Arg Asp Arg Met
 1               5
<210>53
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(6)...(7)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(7)...(7)
<400>53
Arg Met Arg Asp Arg Met Arg
 1               5
<210>54
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<400>54
Phe Arg Asp Arg Met Arg Asp Arg Phe
 1               5
<210>55
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(11)...(11)
<400>55
Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Asp Arg Phe Glu
 1               5                  10
<210>56
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(3)...(3)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(4)
<400>56
Phe Arg Asp Arg
 1
<210>57
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(3)...(3)
<400>57
Phe Arg Asp
 1
<210>58
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(4)...(4)
<400>58
Tyr Phe Arg Asp
 1
<210>59
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(2)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<221>SITE
<222>(9)...(9)
<223>D-氨基酸
<400>59
Phe Arg Asp Arg Met Arg Asp Arg Met
 1               5
<210>60
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<400>60
Met Arg Asp Arg Met
 1               5
<210>61
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>D-氨基酸
<400>61
Met Arg Asp Arg Met
 1               5
<210>62
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<400>62
Phe Arg Asp Arg Phe
 1               5
<210>63
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<221>SITE
<222>(5)...(5)
<223>D-氨基酸
<400>63
Phe Arg Asp Arg Phe
 1               5
<210>64
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(7)...(7)
<400>64
Arg Met Arg Asp Arg Met Arg
 1               5
<210>65
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<400>65
Asp Arg Met Arg Asp
 1               5
<210>66
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>D-氨基酸
<221>SITE
<222>(5)...(5)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<400>66
Asp Arg Met Arg Asp
 1               5
<210>67
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(2)
<223>D-amino acids
<221>SITE
<222>(8)...(8)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(9)...(9)
<400>67
Phe Arg Asp Arg Met Arg Asp Arg Phe
 1               5
<210>68
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(6)...(6)
<400>68
Arg Phe Glu Glu Phe Arg
 1               5
<210>69
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<221>SITE
<222>(5)...(5)
<223>D-氨基酸
<400>69
Phe Arg Thr Arg Phe
 1               5
<210>70
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<221>SITE
<222>(5)...(5)
<223>D-氨基酸
<400>70
Phe Arg Met Arg Phe
 1               5
<210>71
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(2)
<223>D-氨基酸
<221>SITE
<222>(10)...(10)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(10)...(10)
<400>71
Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Asp Arg Phe
 1               5                  10
<210>72
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(6)...(6)
<400>72
Asp Arg Met Arg Asp Phe
 1               5
<210>73
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(13)...(13)
<400>73
Tyr Tyr Tyr Pro Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr His
 1               5                  10
<210>74
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(2)...(3)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(11)...(11)
<221>SITE
<222>(11)...(11)
<223>D-氨基酸
<400>74
Tyr Tyr Pro Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr
 1               5                  10
<210>75
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(2)...(2)
<223>D-氨基酸
<221>SITE
<222>(4)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(12)...(12)
<221>SITE
<222>(12)...(12)
<223>D-氨基酸
<400>75
Tyr Tyr Tyr Pro Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Thr
 1               5                  10
<210>76
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(8)...(8)
<221>SITE
<222>(8)...(8)
<223>D-氨基酸
<400>76
Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg Tyr
 1               5
<210>77
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(11)...(11)
<400>77
Tyr Tyr Tyr Pro Glu Phe Arg Asp Arg Met Arg
 1               5                  10
<210>78
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(7)...(7)
<221>SITE
<222>(7)...(7)
<223>D-氨基酸
<400>78
Tyr Glu Phe Arg Asp Arg Met
 1               5
<210>79
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>D-氨基酸
<221>SITE
<222>(4)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(10)...(10)
<221>SITE
<222>(10)...(10)
<223>D-氨基酸
<400>79
Tyr Tyr Tyr Pro Glu Phe Arg Asp Arg Met
 1               5                  10
<210>80
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(6)...(6)
<221>SITE
<222>(6)...(6)
<223>D-氨基酸
<400>80
Glu Phe Arg Asp Arg Tyr
 1               5
<210>81
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<221>SITE
<222>(5)...(5)
<223>D-氨基酸
<400>81
Glu Phe Arg Asp Tyr
 1               5
<210>82
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>D-氨基酸
<221>SITE
<222>(4)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(8)...(8)
<400>82
Tyr Tyr Tyr Pro Glu Phe Arg Asp
 1               5
<210>83
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<22l>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(4)
<400>83
Glu Phe Arg Tyr
 1
<210>84
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(6)...(6)
<400>84
Tyr Tyr Pro Glu Phe Arg
 1               5
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>1，4，9
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>9
<400>85
Tyr Tyr Tyr Pro Glu Phe Arg Asp Arg
 1               5
<210>86
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(3)
<400>86
Glu Arg Phe
 1
<210>87
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>6
<400>87
Glu Glu Phe Arg Asp Arg
 1               5
<210>88
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>1
<221>酰胺化
<222>3
<400>88
Glu Tyr Arg
 1
<210>89
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>1
<221>MOD_RES
<222>2
<223>修饰的苯丙氨酸：2-萘基-甲基甘氨酸
<221>酰胺化
<222>3
<400>89
Glu Phe Arg
 1
<210>90
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>1
<221>MOD_RES
<222>2
<223>苯丙氨酸＝L-1-b-萘基丙氨酸
<221>酰胺化
<222>3
<400>90
Glu Phe Arg
 1
<210>91
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>1
<221>MOD_RES
<222>2
<223>苯丙氨酸＝双苯基丙氨酸
<221>酰胺化
<222>3
<400>91
Glu Phe Arg
 1
<210>92
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<400>92
Glu Phe Arg
 1
<210>93
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>1
<400>93
Glu Phe Arg
 1
<210>94
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>酰胺化
<222>3
<400>94
Glu Phe Arg
 1
<210>95
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>1
<221>酰胺化
<222>3
<400>95
Arg Phe Glu
 1
<210>96
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>1
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>3
<400>96
Glu Phe Arg
 1
<210>97
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>1
<223>2-萘酸加帽
<221>酰胺化
<222>3
<400>97
Glu Phe Arg
 1
<210>98
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>1
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>4
<400>98
Tyr Glu Phe Arg
 1
<210>99
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>1
<223>2-萘酸加帽
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>4
<400>99
Glu Phe Arg Tyr
 1
<210>100
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>1
<223>N-末端被新戊酰化
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>4
<400>100
Glu Phe Arg Tyr
 1
<210>101
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>1
<223>用9-芴基甲氧基羰基修饰的N-末端
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>4
<400>101
Glu Phe Arg Tyr
 1
<210>102
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>1
<223>2-萘酸加帽
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>3
<400>102
Glu Arg Phe
 1
<210>103
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>1
<223>2-萘酸加帽
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>4
<400>103
Tyr Glu Phe Arg
 1
<210>104
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>1
<223>N-末端被新戊酰化
<221>酰胺化
<222>3
<400>104
Glu Phe Arg
 1
<210>105
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>1
<223>用烟酸修饰的N-末端
<221>酰胺化
<222>3
<400>105
Glu Phe Arg
 1
<210>106
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>二-叔丁基-4-羟基-苯内氨酸
<221>MOD_RES
<222>(4)...(4)
<223>苯丙氨酸＝双苯基丙氨酸
<221>酰胺化
<222>(5)...(5)
<400>106
Phe Glu Glu Phe Arg
 1               5
<210>107
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>酰胺化
<222>(9)...(0)
<400>107
Tyr Trp His Val Trp Gln Gln Asp Glu
 1               5
<210>108
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>酰胺化
<222>(9)...(0)
<400>108
Tyr Gln Trp Asp Lys Val Lys Asp Phe
 1               5
<210>109
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>酰胺化
<222>(9)...(0)
<400>109
Glu Asn Trp Asp Thr Leu Gly Ser Tyr
 1               5
<210>110
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>酰胺化
<222>(11)...(0)
<400>110
Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Ser
 1               5                  10
<210>111
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>酰胺化
<222>(17)...(0)
<400>111
Val Arg Gln Glu Met Asn Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Gln Lys Val
 1               5                  10                  15
Tyr
<210>112
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>酰胺化
<222>(12)...(0)
<400>112
Tyr Gln Met Arg Glu ser Leu Ala Gln Arg Leu Tyr
 1               5                  10
<210>113
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>酰胺化
<222>(15)...(0)
<400>113
Thr Arg Asp Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Asp Trp Tyr
 1               5                  10                  15
<210>114
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>酰胺化
<222>(10)...(0)
<400>114
Asp Glu Phe Gln Lys Lys Trp Lys Glu Tyr
 1               5                  10
<210>115
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>酰胺化
<222>(12)...(0)
<400>115
Trp Lys Glu Asp Val Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val
 1               5                  10
<210>116
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>酰胺化
<222>(13)...(0)
<400>116
Tyr Ser Leu Ala Gln Arg Leu Ala Glu Leu Lys Ser Tyr
 1               5                  10
<210>117
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>酰胺化
<222>(13)...(0)
<400>117
Gln Glu Ser Ala Arg Gln Lys Leu Gln Glu Leu Gln Tyr
 1               5                  10
<210>118
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(4)...(4)
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<400>118
Tyr Glu Arg Phe
 1
<210>119
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(1)
<221>酰胺化
<222>(3)...(3)
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
<400>119
Arg Phe Glu
 1
<210>120
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(1)
<223>用9-芴基甲氧基羰基修饰的N-末端
<400>120
Glu Phe Arg
 1
<210>121
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(1)
<223>用烟酸修饰的N-末端
<221>酰胺化
<222>(4)...(4)
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<400>121
Tyr Glu Arg Phe
 1
<210>122
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(1)
<223>用烟酸修饰的N-末端
<221>MOD_RES
<222>(2)...(2)
<223>苯丙氨酸＝双苯基丙氨酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(3)
<400>122
Glu Phe Arg
 1
<210>123
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>酰胺化
<222>(4)...(4)
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<400>123
Glu Arg Phe Tyr
 1
<210>124
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>用烟酸修饰的N-末端
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(4)
<400>124
Glu Arg Phe Tyr
 1
<210>125
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>2-萘酸加帽
<221>MOD_RES
<222>(2)...(2)
<223>苯丙氨酸＝双苯基丙氨酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(3)
<400>125
Glu Phe Arg
 1
<210>126
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>用烟酸修饰的N-末端
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(3)
<400>126
Glu Phe Arg
 1
<210>127
<211>1
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<400>127
Phe
 1
<210>128
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>谷氨酸＝二-叔-丁基-谷氨酸
<221>MOD_RES
<222>(2)...(2)
<223>苯丙氨酸＝双苯基丙氨酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(3)
<400>128
Glu Phe Arg
 1
<210>129
<211>1
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>3-(1-萘基)-L-丙氨酸
<400>129
Ala
  1
<210>130
<211>1
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>3-(1-萘基)-D-丙氨酸
<400>130
Ala
 1
<210>131
<211>1
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>3-(2-萘基)-L-丙氨酸
<400>131
Ala
 1
<210>132
<211>1
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>3-(2-萘基)-D-丙氨酸
<400>132
Ala
 1
<210>133
<211>2
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>苯丙氨酸＝4，4′-双苯基丙氨酸
<221>酰胺化
<222>(2)...(0)
<400>133
Phe Ala
 1
<210>134
<211>2
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>苯丙氨酸＝4，4′-双苯基丙氨酸
<221>SITE
<222>(2)...(0)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(2)...(0)
<400>134
Phe Ala
 1
<210>135
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>用烟酸修饰的N-末端
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(0)
<400>135
Phe Arg Glu
 1
<210>136
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>1-萘二甲酸加帽的
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>乙酰化
<222>(4)...(0)
<400>136
Glu Arg Phe Tyr
 1
<210>137
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>1-萘酸加帽的
<221>MOD_RES
<222>(2)...(0)
<223>苯丙氨酸＝双苯基丙氨酸
<221>乙酰化
<222>(3)...(0)
<400>137
Glu Phe Arg
 1
<210>138
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>用烟酸修饰的N-末端
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>乙酰化
<222>(4)...(0)
<400>138
Tyr Phe Arg Glu
 1
<210>139
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(0)
<400>139
Tyr Phe Arg Glu
 1
<210>140
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>用烟酸修饰的N-末端
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(0)
<400>140
Glu Arg Phe
 1
<210>141
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>2-萘酸加帽
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<400>141
Glu Phe Arg Tyr
 1
<210>142
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>苯丙氨酸＝3，5-二-叔-丁基-苯丙氨酸
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(0)...(0)
<400>142
Phe Arg Glu Tyr
 1
<210>143
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>用烟酸修饰的N-末端
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(0)
<400>143
Phe Arg Glu Tyr
 1
<210>144
<211>2
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>用烟酸修饰的N-末端
<221>SITE
<222>(1)...(2)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(2)...(0)
<400>144
Phe Arg
 1
<210>145
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>MOD_RES
<222>(2)...(0)
<223>苯丙氨酸＝双苯基丙氨酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(0)
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>D-氨基酸
<221>SITE
<222>(3)...(3)
<223>D-氨基酸
<400>145
Glu Phe Arg
 1
<210>146
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>MOD_RES
<222>(2)...(0)
<223>苯丙氨酸＝双苯基丙氨酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(0)
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
<400>146
Glu Phe Arg
 1
<210>147
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>异噁唑-谷氨酸
<221>MOD_RES
<222>(2)...(0)
<223>苯丙氨酸＝双苯基丙氨酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(0)
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
<400>147
Glu Phe Arg
 1
<210>148
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>1-萘酸加帽的
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(0)
<400>148
Arg Phe Glu Tyr
 1
<210>149
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>1-萘酸加帽的
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(0)
<400>149
Phe Arg Glu Tyr
 1
<210>150
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>MOD_RES
<222>(2)...(0)
<223>苯丙氨酸＝双苯基丙氨酸
<400>150
Glu Phe Arg
 1
<210>151
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>3，5-二-叔-丁基谷氨酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(0)
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
<400>151
Glu Arg Phe
 1
<210>152
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(0)
<400>152
Phe Arg Glu Tyr
 1
<210>153
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(0)
<400>153
Arg Phe Glu Tyr
 1
<210>154
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>3，5-二-叔-丁基-苯丙氨酸
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(0)
<400>154
Phe Glu Arg
 1
<210>155
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>异噁唑-精氨酸
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(0)
<400>155
Arg Glu Phe Tyr
 1
<210>156
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
<222>(1)...(0)
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(0)
<400>156
Arg Glu Phe Tyr
 1
<210>157
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>用烟酸修饰的N-末端
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(0)
<400>157
Arg Glu Phe Tyr
 1
<210>158
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>3，5-二-叔-丁基-精氨酸
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(0)
<400>158
Arg Glu Phe Tyr
 1
<210>159
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>异噁唑-苯丙氨酸
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(3)...(0)
<400>159
Phe Glu Arg
 1
<210>160
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的肽
<221>MOD_RES
<222>(1)...(0)
<223>异噁唑-酪氨酸
<221>SITE
<222>(1)...(4)
<223>D-氨基酸
<221>酰胺化
<222>(4)...(0)
<400>160
Tyr Arg Glu Phe
 1
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 1
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<223>3，5-二-叔-丁基-酪氨酸
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<400>171
Tyr Phe Glu Arg
 1
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<213>人工序列
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<223>化学合成的肽
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<223>异噁唑-精氨酸
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<400>172
Arg Phe Glu
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<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>化学合成的肽
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<222>(1)...(0)
<223>1-萘酸加帽的
<221>SITE
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<223>D-氨基酸
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Tyr Phe Glu Arg
 1
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<213>人工序列
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<223>化学合成的肽
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<223>1-萘酸加帽的
<221>SITE
<222>(1)...(3)
<223>D-氨基酸
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Arg Phe Glu
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<223>化学合成的肽
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<223>用烟酸修饰的N-末端
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 1
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<223>化学合成的肽
<221>乙酰化
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<223>4-1-苯丙氨酸
<221>酰胺化
<222>(0)...(0)
<400>176
Glu Phe Arg
 1

Claims (30)

1.一种反向胆固醇转运的介质，其包括一种分子，所述分子包含酸性区域、亲脂性区域或芳香族区域和碱性区域，所述分子具有适合于与HDL和/或低密度脂蛋白-胆固醇(LDL)复合并由此增加反向胆固醇转运的结构。
2.权利要求1的反向胆固醇转运的介质，其中所述分子具有3-10个氨基酸残基或其类似物，并包括如下序列：
X1-X2-X3，其中X1是酸性氨基酸；X2是亲脂性或芳香族氨基酸；X3是碱性氨基酸；并且其中X1，X2和X3可以任何顺序排列；
其中氨基端还包括第一保护基，所述第一保护基选自由下列组成的组中：乙酰基、苯乙酰基、pivolyl、9-芴基甲氧基羰基、2-萘酸、烟酸、其中n范围从3-20的CH3-(CH2)n-CO-、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、f-MOC、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、和取代的饱和的杂芳基；和
其中羧基端还包括第二保护基，所述第二保护基选自由胺，诸如RNH2，其中R＝H、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、f-MOC、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基组成的组中。
3.权利要求2的反向胆固醇转运的介质，其中X1、X2或X3的一个或多个是D氨基酸残基。
4.权利要求2的反向胆固醇转运的介质，其中X1、X2或X3的一个或多个是修饰的合成性或半合成性氨基酸。
5.权利要求4的反向胆固醇转运的介质，其中修饰的合成性或半合成性氨基酸是双苯基丙氨酸。
6.一种治疗和/或预防哺乳动物中高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的基本纯的氨基酸衍生的物质，所述物质具有氨基和羧基端，并包括酸性氨基酸残基或其衍生物的L或D对映体，亲脂性或芳香族氨基酸残基或其衍生物的L或D对映体，和碱性氨基酸残基或其衍生物的L或D对映体，
其中氨基端还包括第一保护基，所述第一个保护基选自由下列组成的组中：乙酰基、苯乙酰基、pivolyl、9-芴基甲氧基羰基、2-萘酸、烟酸、其中n范围从3-20的CH3-(CH2)n-CO-、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、f-MOC、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基，等；
其中羧基端还包括第二保护基，所述第二保护基选自由胺，诸如RNH2，其中R＝H、二-叔-丁基-4-羟基-苯基、萘基、取代的萘基、f-MOC、联苯基、取代的苯基、取代的杂环基、烷基、芳基、取代的芳基、环烷基、稠合的环烷基、饱和的杂芳基、取代的饱和的杂芳基，等组成的组中；和
其中所述物质具有下列性质的至少一个：(1)其模拟ApoA-I与LDL和HDL的结合，(2)其优选与肝结合，(3)其通过肝LDL-受体增加LDL的吸收，(4)其降低LDL、IDL、和VLDL胆固醇的水平，(5)其增加HDL胆固醇的水平，和(6)其增加血浆脂蛋白图谱。
7.一种改善或预防高胆固醇血症的症状的适合于口服施用的组合物，其中所述组合物包括具有酸性区域、亲脂性或芳香族区域和碱性区域的氨基酸衍生的分子，并且其中所述氨基酸衍生的分子具有与氨基端连接的第一保护基，以及与羧基端连接的第二保护基，并且其中所述氨基酸衍生的分子任选地包括至少一个D氨基酸残基。
8.权利要求7的组合物，其包括至少一个D氨基酸残基。
9.一种RCT的肽介质，其包括如下序列：
      Xa-Xb-(X1-X2-X3)-Xc-Xd，
其中：
Xa是酰化的氨基酸残基；
Xb是任何0-10个氨基酸残基；
X1-X2-X3是氨基酸残基或其衍生物，其独立地选自酸性氨基酸残基，亲脂性氨基酸残基，碱性氨基酸残基或其衍生物，但须所述X1、X2或X3其中之一是酸性残基，所述X1、X2或X3的其中之一是亲脂性残基且所述X1、X2或X3其中之一是碱性残基；
Xc是任何0-10个氨基酸残基；
Xd是酰胺化的氨基酸残基；和
其中所述肽介质具有15个或更少的氨基酸残基并任选地包括至少一个D氨基酸残基。
10.一种RCT介质，其包括选自由表5的合成性化合物1-96组成的组中的化合物。
11.一种RCT介质，其包括选自由SEQ ID NOS：1和107-117组成的组中的化合物。
12.一种RCT介质，其包括选自由SEQ ID NOS：1、26-36、42、45-47、56-58、68-70、72-74、76、80、81、83-90和92-95组成的组中的化合物。
13.一种药物组合物，其包括SEQ ID NO：1。
14.一种药物组合物，其包括SEQ ID NO：113。
15.一种药物组合物，其包括SEQ ID NO：34。
16.一种药物组合物，其包括SEQ ID NO：86。
17.一种药物组合物，其包括SEQ ID NO：91。
18.一种药物组合物，其包括SEQ ID NO：96。
19.一种药物组合物，其包括SEQ ID NO：145。
20.一种药物组合物，其包括SEQ ID NO：146。
21.一种药物组合物，其包括SEQ ID NO：118。
22.权利要求1-21任一项的组合物，其用于制备适合于施用以治疗高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化的药物。
23.权利要求22的组合物，其中所述药物适合于口服施用。
24.权利要求22的组合物，其中所述药物与胆汁酸-结合树脂、烟酸、抑制素，或其组合结合。
25.一种鉴定可能增加体内反向胆固醇转运的测试化合物的体外筛选方法，所述方法包括：
在所述测试化合物存在和缺乏时，体外测量胆固醇在肝细胞中的累积；
在所述测试化合物存在和缺乏时，体外测量胆固醇在AcLDL-负荷的巨噬细胞中的累积和/或流出；和
鉴定增加在肝细胞的胆固醇累积和减少胆固醇在巨噬细胞中的水平的测试化合物。
26.权利要求25的体外筛选方法，其还包括在测试化合物存在和缺乏时体外测量在OxLDL-负荷的血管平滑肌细胞中的胆固醇水平，并且其中鉴定测试化合物的步骤还包括鉴定增加胆固醇在肝细胞中的累积和减少胆固醇在巨噬细胞中的水平和/或减少胆固醇在血管平滑肌细胞中的水平的化合物。
27.权利要求25的体外筛选方法，其中所述肝细胞是人HepG2肝细胞瘤细胞。
28.权利要求25的体外筛选方法，其中所述巨噬细胞是人THP-1细胞。
29.权利要求26的体外筛选方法，其中所述血管平滑肌细胞是原主动脉平滑肌细胞。
30.一种鉴定可能增加体内反向胆固醇转运的测试化合物的体外筛选方法，所述方法包括：
在所述测试化合物存在和缺乏时，体外测量胆固醇在肝细胞中的累积；
在所述测试化合物存在和缺乏时，体外测量胆固醇在AcLDL-负荷的血管平滑肌细胞中的水平；和
鉴定增加在肝细胞中的胆固醇累积和减少胆固醇在血管平滑肌细胞中的水平的测试化合物。
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