MXJL06000069A - Derivados heterociclicos para el tratamiento de hiperlipidemia y enfermedades relacionadas. - Google Patents

Derivados heterociclicos para el tratamiento de hiperlipidemia y enfermedades relacionadas.

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Abstract

Composiciones adaptadas para mejorar el transporte inverso de colesterol en mamiferos. Las composiciones son adecuadas para una administracion oral y de utilidad en el tratamiento y/o prevencion de hipercolesterolemia, aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares asociadas.

Description

"DERIVADOS HETEROCICLICOS PARA EL TRATAMIENTO DE HIPERLIPIDEMIA Y ENFERMEDADES RELACIONADAS" ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención La ¡nvención se relaciona con pequeños mediadores moleculares del transporte inverso de colesterol (RCT) para el tratamiento de hipercolesterolemia y enfermedades cardiovasculares asociadas y otras enfermedades. Descripción del arte relacionado Ya es un hecho bien establecido que el nivel elevado de colesterol sérico ("hipercolesterolemia") es un factor causal del desarrollo de aterosclerosis, una acumulación progresiva de colesterol sobre las paredes de las arterias. La hipercolesterolemia y la aterosclerosis son las principales causas de las enfermedades cardiovasculares, incluyendo hipertensión, enfermedad de las arterias coronarias, ataque cardíaco y accidente cerebrovascular. Aproximadamente 1 ,1 millones de individuos sufren de ataques cardíacos cada año solamente en los EE.UU., cuyos costos se estiman en más de 117 mil millones de dólares estadounidenses. Si bien existen numerosas estrategias farmacéuticas para disminuir los niveles de colesterol en sangre, muchas de ellas tienen efectos secundarios indeseados e importantes temas referidas a la seguridad. Más aún, ninguna de las terapias con drogas comerciales estimulan adecuadamente el transporte inverso del colesterol, una vía metabólica importante que elimina el colesterol del cuerpo. El colesterol en circulación es transportado por lipoproteínas plasmáticas que son partículas compuestas por complejos de lípidos y proteínas que transportan a los lípidos en la sangre. Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las lipoproteínas de alta densidad (HDL) son los principales transportadores del colesterol. Se considera que las LDL son responsables de la distribución de colesterol desde el hígado (donde es sintetizado u obtenido de la dieta) hasta los tejidos extrahepáticos en el cuerpo. El término "transporte inverso de colesterol" describe el transporte de colesterol desde los tejidos extrahepáticos hacia el hígado donde es catabolizado y eliminado. Se cree que las partículas de HDL en plasma cumplen un rol importante en el proceso de transporte inverso, por actuar como secuestrantes del colesterol tisular. Existe una gran evidencia que sustenta el concepto que los lípidos depositados en las lesiones ateroscleróticas derivan primariamente de LDL plasmática; por consiguiente, las LDL se conocen popularmente como colesterol "malo". Por el contrario, los niveles plasmáticos de HDL se correlacionan inversamente con la enfermedad cardíaca de las arterias coronarias, aún más, se considera que los niveles plasmáticos altos de HDL constituye un factor de riesgo negativo. Se ha propuesto la hipótesis que los niveles altos de plasma HDL no sólo son protectores contra la enfermedad de las arterias coronarias, sino que además puede inducir la regresión de las placas ateroscleróticas (véase, por ejemplo, Badimon er al., 1992, Circulation 86 (Supl. lll):86-94). Por lo tanto, las HDL se han conocen popularmente como colesterol "bueno". La cantidad de colesterol intracelular liberado de las LDL controla el metabolismo celular del colesterol. La acumulación del colesterol celular derivado del LDL controla tres procesos: (1 ) reduce la síntesis del colesterol celular desactivando la síntesis de la HMGCoA reductasa, una enzima clave en la vía de biosíntesis del colesterol; (2) el colesterol derivado de LDL entrante promueve el almacenamiento del colesterol por activación de LCAT, la enzima celular que convierte al colesterol en esteres de colesterilo que se depositan como gotas de almacenamiento; y (3) la acumulación del colesterol dentro de la célula dirige un mecanismo de retroalimentación que inhibe la síntesis celular de nuevos receptores de LDL. Por ello las células ajustan su complemento de receptores de LDL para contar con suficiente colesterol como para cumplir con sus necesidades metabólicas, sin una sobrecarga. (Por una revisión, véase Brown & Goldstein, en: The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8a Ed., Goodman & Gilman, Pergamon Press, NY, 1990, Cap. 36, págs. 874-896). El transporte inverso de colesterol (RCT) es la vía por la cual el colesterol celular periférico es devuelto al hígado para su reciclaje hacia los tejidos extrahepáticos o su excreción hacia el intestino como bilis. La vía del RCT representa el único medio de eliminación de colesterol desde la mayor parte de los tejidos extrahepáticos. El RCT consiste principalmente de tres pasos: (1 ) eflujo de colesterol, la eliminación inicial del colesterol de las células periféricas; (2) esterificación del colesterol por acción de la lecitina:colesterol aciltransferasa (LCAT), que impide el reingreso del eflujo de colesterol en las células periféricas; y (3) captación/distribución del éster de HDL colesterilo en células hepáticas. La LCAT es la enzima clave en la vía del RCT y es producida principalmente en el hígado y circula en el plasma asociado con la fracción HDL. La LCAT convierte el colesterol derivado de células en esteres de colesterilo que son secuestrados en la HDL para su eliminación. La vía del RCT está mediada por las HDL. La HDL es un término genérico para partículas lipoproteicas caracterizadas por su alta densidad. Los principales constituyentes lipidíeos de los complejos HDL son diversos fosfolípidos, colesterol (éster) y triglicéridos. Los componentes más importantes de la apolipoproteína son A-l y A-ll que determinan las características funcionales de la HDL. Cada partícula de HDL contiene al menos una copia (y habitualmente dos a cuatro copias) de apolipoproteína A-1 (ApoA-l). La ApoA-l es sintetizada por el hígado e intestino delgado como una preproapolipoproteína que es secretada como una proproteína que es olivada rápidamente para generar un polipéptido maduro de 243 residuos de aminoácidos. La ApoA-l consiste principalmente de 6 a 8 repeticiones diferentes de 22 aminoácidos separados por un grupo ligador que a menudo es prolina, y en algunos casos consiste de una extensión formada por numerosos residuos. La ApoA-l forma tres tipos de complejos estables con lípidos: lípidos denominados HDL pre-beta-1 ; partículas discoidales aplanadas que contienen lípidos polares (fosfolípidos y colesterol) denominadas HDL pre-beta-2; y partículas esféricas que contienen lípidos tanto polares como no polares, denominadas HDL esférico o maduro (HDL3 y HDL2). Aunque la mayor parte de la HDL en circulación contiene tanto ApoA-l como ApoA-ll, la fracción de HDL que solamente contiene ApoA-l (AI-HDL) parece ser la más eficaz en el RCT. Estudios epidemiológicos sustentan la hipótesis que la AI-HDL es anti-aterogénico. (Parra et al., 1992, Arterioscler. Thromb. 12:701-707; Decossin et al., 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307). Hay varias líneas de evidencia basadas en datos obtenidos in vivo que comprometen a la HDL y su principal componente proteico, la ApoA-l, en la prevención de las lesiones ateroscleróticas y, potencialmente, la regresión de las placas, lo cual las convierte en blancos atractivos para una intervención terapéutica. Primero, existe una correlación inversa entre la concentración sérica de ApoA-l (HDL) y la aterogénesis en el hombre (Gordon & Rifkind, 1989, N. Eng. J. Med. 321 :1311-1316; Gordon er al., 1989, Circulation 79:8-15). Aún más, se han asociado subpoblaciones específicas de HDL con un riesgo reducido de aterosclerosis en seres humanos (Miller, 1987, Amer. Heart 113:589-597; Cheung et al., 1991 , Lipid Res. 32:383-394); Fruchart & Ailhaud, 1992, Clin. Chem. 38:79). Segundo, estudios en animales sustentan el rol protector de la ApoA-l (HDL). El tratamiento con ApoA-l o HDL de conejos alimentados con colesterol redujo el desarrollo y progreso de las placas (estrías lipídicas) en conejos alimentados con colesterol (Koizumi et al., 1988, J. Lipid Res. 29:1405-1415; Badimon eí al., 1989, Lab. Invest. 60:455-461 ; Badimon eí al., 1990, J. Clin. Invest. 85:1234-1241 ). Sin embargo, la eficacia varió según la fuente de HDL (Beitz eí al., 1992, Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47:149-152; Mezdour eí al., 1995, Aterosclerosis 113:237-246). Tercero, se obtuvo evidencia directa del rol de la ApoA-l de experimentos que comprendían animales transgénicos. La expresión del gen humano de la ApoA-l transferido a ratones con predisposición genética a aterosclerosis inducida por la dieta pudo protegerlos contra el desarrollo de lesiones aórticas (Rubin eí al., 1991 , Nature 353:265-267). También se demostró que el transgen ApoA-l suprimía la aterosclerosis en ratones deficientes en ApoE y en ratones transgénicos para Apo(a) (Paszty eí al., 1994, J. Clin. Invest. 94:899-903; Plump et al., 1994, PNAS. EE.UU. 91 :9607-9611 ; Liu et al., 1994, J. Lipid Res. 35:2263-2266). Se observaron resultados similares en conejos transgénicos que expresaban ApoA-l humana (Duverger, 1996, Circulation 94:713-717; Duverger eí al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:1424-1429), y en ratas transgénicas, donde los niveles elevados de la ApoA-l humana las protegió contra aterosclerosis e inhibió la restenosis después de una angioplastia de balón (Burkey eí al., 1992, Circulation, Suplemento I, 86:1-472, N° Resumen 1876; Burkey eí al., 1995, J. Lipid Res. 36:1463-1473). Tratamientos actuales de la hipercolesterolemia v otras dislipidemias En las últimas dos décadas aproximadamente, la segregación de los compuestos colesterolémicos en reguladores de HDL y LDL y el reconocimiento de la conveniencia de disminuir los niveles en sangre de LDL han conducido al desarrollo de numerosas drogas. Sin embargo, muchas de estas drogas presentan efectos secundarios no deseados y/o están contraindicadas en determinados pacientes, en particular cuando son administrados en combinación con otras drogas. Estas drogas y las estrategias terapéuticas incluyen: (1 ) resinas que se unen a ácidos biliares, que interrumpen el reciclaje de los ácidos biliares desde el intestino hacia el hígado [por ejemplo, colestiramina (QUESTRAN LIGHT, Bristol-Myers Squibb) y clorhidrato de colestipol (COLESTID, Pharmacia & Upjohn Company)]; (2) estatinas, que inhiben la síntesis de colesterol por bloqueo de HMGCoA:la enzima clave comprometida en la biosíntesis de colesterol [por ejemplo, lovastatina (MEVACOR, Merck & Co., Inc.), un producto natural derivado de una cepa de Aspergillus, pravastatina (PRAVACHOL, Bristol- Myers Squibb Co.) y atorvastatina (LIPITOR, Warner Lambert)]; (3) la niacina es un complejo de vitaminas B soluble en agua que disminuye la producción de VLDL y es eficaz para disminuir la LDL; (4) los fibratos se usan para disminuir los triglicéridos séricos por reducción de la fracción VLDL y en algunas poblaciones de pacientes conduce a reducciones modestas del colesterol plasmático por el mismo mecanismo [por ejemplo, clofibrato (ATROMID-S, Wyeth-Ayerst Laboratories) y gemfibrozilo (LOPID, Parke-Davis)]; (5) la terapia de reemplazo de estrógenos puede disminuir los niveles de colesterol en mujeres postmenopáusicas; (6) se ha informado que los ácidos alfa.omeqa-dicarboxílicos de cadena larga disminuyen los niveles séricos de triglicéridos y colesterol (Véase, por ejemplo, Bisgaier et al., 1998, J. Lipid Res. 39:17-30; WO 98/30530; Patente de EE.UU. N°:4.689.344; WO 99/00116; Patente de EE.UU. N°:5.756.344; Patente de EE.UU. N°:3.773.946; Patente de EE.UU. N°:4.689.344; Patente de EE.UU. N°:4.689.344; Patente de EE.UU.
N°:4.689.344; y Patente de EE.UU. N°:3.930.024); (7) también se describieron otros compuestos, incluyendo éteres (Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°:4.711.896; Patente de EE.UU. N°:5.756.544; Patente de EE.UU. N°:6.506.799), fosfatos de dolicol (Patente de EE.UU. N°:4.613.593), y derivados de azolidindiona (Patente de EE.UU. N°:4.287.200), para disminuir los niveles séricos de triglicéridos y colesterol.
Ninguna de estas drogas disponibles en la actualidad para disminuir el colesterol, elevar con seguridad los niveles de HDL y estimular el RCT. Aún más, la mayoría de estas estrategias de tratamiento actuales parecen funcionar con la vía de transporte del colesterol, modular el ingreso debido la dieta, reciclaje, síntesis de colesterol y la población de la VLDL. Agonistas de ApoA-l para el tratamiento de hipercolesterolemia En vista del rol potencial de la HDL, es decir, tanto la ApoA-l como su fosfolípido asociado, en la protección contra la enfermedad aterosclerótica, se iniciaron pruebas clínicas con seres humanos utilizando una ApoA-l producida de forma recombinante, se discontinuaron y aparentemente se reiniciaron por UCB Belgium (Pharmaprojects, Oct. 27, 1995; IMS R&D Focus, Junio 30, 1997; Drug Status Update, 1997, Aterosclerosis 2(6):261-265); véase también M. Eriksson en el Congreso, "The Role of HDL en Disease Prevention," Nov. 7-9, 1996, Fort - 1 - Worth; Lacko & Miller, 1997, J. Lip. Res. 38:1267-1273; y WO 94/13819) y luego también fueron iniciados y discontinuados por Bio-Tech (Pharmaprojects, Abril 7, 1989). También se efectuaron pruebas usando ApoA-l para tratar el shock séptico (Opal, "Reconstituted HDL as a Treatment Strategy for Sepsis," 7a Conferencia Internacional de IBC sobre Sepsis, Abril 28-30, 1997, Washington, D.C.; Gouni eí al., 1993, J. Lipid Res. 94:139-146; Levine, WO 96/04916). Sin embargo, hay muchos problemas asociados con la producción y el uso de ApoA-l, volviéndola menos que ideal como droga; por ejemplo, la ApoA-l es una proteína grande que es difícil y costosa de producir; es necesario superar una serie de problemas significativos de elaboración y reproducibilidad con respecto a la estabilidad al almacenamiento, distribución de un producto activo y vida media in vivo. En vista de estas desventajas, se ha intentado preparar péptidos capaces de imitar la ApoA-l. Dado que las actividades clave de ApoA-l han sido atribuidas a la presencia de múltiples repeticiones de una característica estructural secundaria única en la proteína, una clase de a-hélice anfipática A (Segrest, 1974, FEBS Lett. 38:247-253; Segrest eí al., 1990, PROTEINS: Structure, Function and Genetics 8:103-117), la mayor parte de los esfuerzos para diseñar péptidos que imitaran la actividad de ApoA-l se han centrado en el diseño de péptidos que forman la clase de a-hélices anfipáticas de tipo A (Véase, por ejemplo, en las descripciones de antecedentes en las Patentes de EE.UU. N°: 6.376.464 y 6.506.799; incorporadas por completo en este documento a modo de referencia).
En un estudio, Fukushima eí al. sintetizaron un péptido de 22 residuos compuesto por completo de residuos de Glu, Lys y Leu dispuestos de forma periódica como para formar una a-hélice anfipática con faces hidrofílicas e hidrofóbicas iguales ("péptido ELK") (Fukushima eí al., 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101(13):3703-3704; Fukushima et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:10651-10657). El péptido ELK comparte un 41% de homología de secuencia con el fragmento 198-219 de la ApoA-l. Se demostró que el péptido ELK se asociaba eficazmente con fosfolípidos y que imita algunas de las propiedades físicas y químicas de ApoA-l (Kaiser eí al., 1983, PNAS EE.UU. 80:1137-1140; Kaiser eí al., 1984, Science 223:249-255; Fukushima et al., 1980, supra; Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092). Posteriormente se encontró un dímero de este péptido de 22 residuos que imitaba más estrechamente la ApoA-l que el monómero; sobre la base de estos resultados, se sugirió que el 44-mero, que está perforado en la mitad por un interruptor de hélices (ya sea Gly o Pro), representaba el dominio funcional mínimo en la ApoA-l (Nakagawa eí al., 1985, supra). Otro estudio comprendía modelos de péptidos anfipáticos denominados "péptidos LAP" (Pownall eí al., 1980, PNAS EE.UU. 77(6):3154-3158; Sparrow eí al., 1981 , En: Peptides: Synthesis-Structure-Function, Roch y Gross, Eds., Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 253-256). Se diseñaron varios péptidos LAP sobre la base de estudios de unión de lípidos con fragmentos de las apolipoproteínas nativas, denominados LAP-16, LAP-20 y LAP-24 (que contenían 16, 20 y 24 residuos de aminoácidos, respectivamente). Estos modelos de péptidos anfipáticos no comparten homología de secuencia con las apolipoproteínas y fueron diseñados para contar con caras hidrofílicas organizadas de una manera diferente de los dominios helicoidales anfipáticos de tipo clase A asociados con las apolipoproteínas (Segrest eí al., 1992, J. Lipid Res. 33:141-166). A partir de estos estudios, los autores concluyeron que es necesaria una longitud mínima de 20 residuos para conferir las propiedades de unión a lípidos a los modelos de péptidos anfipáticos. Los estudios con mutantes de LAP20 que contenían un residuo de prolina en diferentes posiciones en la secuencia indicaron que existe una relación directa entre la unión a lípidos y la activación de LCAT, pero que el potencial helicoidal de un péptido solamente no conduce a una activación de LCAT (Ponsin eí al., 1986, J. Biol. Chem. 261(20):9202-9205). Más aún, la presencia de este interruptor de hélices (Pro) cerca del a mitad del péptido redujo su afinidad por las superficies de fosfolípidos así como su capacidad para activar LCAT. En tanto se demostró que algunos de los péptidos LAP se unen a fosfolípidos (Sparrow eí al., supra), existe cierta controversia con respecto al grado con que los péptidos LAP sean helicoidales en presencia de lípidos (Buchko eí al., 1996, J. Biol. Chem. 271(6):3039-3045; Zhong eí al., 1994, Peptide Research 7(2):99-106). Segrest eí al. han sintetizado péptidos compuestos de 18 a 24 residuos de aminoácidos que no comparten homología de secuencia con las hélices de ApoA-l (Kannelis eí al., 1980, J. Biol. Chem. 255(3):11464-11472; Segrest eí al., 1983, J. Biol. Chem. 258:2290-2295). Las secuencias fueron diseñadas específicamente para imitar los dominios helicoidales anfipáticos de las apolipoproteínas intercambiables de clase A en términos del momento hidrofóbico (Eisenberg eí al., 1982, Nature 299:371-374) y de la distribución de carga (Segrest eí al., 1990, Proteins 8:103-117; Patente de EE.UU. N°: 4.643.988). Se diseñó un péptido de 18 residuos, el péptido "18A", como modelo de a-hélice de clase A (Segrest eí al., 1990, supra). Los estudios con estos péptidos y otros péptidos que poseen una distribución de cargas invertida, como el péptido "18R", han demostrado consistentemente que la distribución de cargas es crítica para la actividad; los péptidos con una distribución de cargas inversa exhiben una mayor afinidad por lípidos con relación a los mímicos de clase A 18A y un menor contenido helicoidal en presencia de lípidos (Kanellis eí al., 1980, J. Biol. Chem. 255:11464-11472; Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:10248-10255; Chung et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:10256-10262; Epand eí al., 1987, J. Biol. Chem. 262:9389-9396; Anantharamaiah et al., 1991 , >4oV. Exp. Med. Biol. 285:131-140). También se ha diseñado un péptido "consenso" con 22 residuos de aminoácidos basado en las secuencias de las hélices de ApoA-l humana (Anantharamaiah eí ai, 1990, Arteriosclerosis 10(1 ):95-105; Venkatachalapathi eí al., 1991 , Mol. Conformation and Biol. Interactions, indian Acad. Sci. B:585-596). La secuencia se construyó luego de identificar el residuo más predominante en cada posición de las hélices propuestas de la ApoA-l humana. Al igual que los péptidos descriptos previamente, la hélice formada por este péptido tiene residuos de aminoácidos de carga positiva agrupadas en la interfase hidrofílica-hidrofóbica, residuos de aminoácidos de carga negativa agrupadas en el centro de la fase hidrofílica y un ángulo hidrofóbico menor que 180°. En tanto el dímero de este péptido es ciertamente eficaz para activar LCAT, el monómero exhibió propiedades de unión a lípido pobres (Venkatachalapathi eí al., 1991 , supra). Basado primariamente en estudios in vitro con los péptidos descritos precedentemente, ha surgido un conjunto de "reglas" para el diseño de péptidos que imitan la función de ApoA-l. Significativamente, se cree que la a-hélice anfipática que posee residuos de carga positiva agrupados en la interfase hidrofílica-hidrofóbica y residuos de aminoácidos de carga negativa agrupados en el centro de la fase hidrofílica es necesaria para la afinidad por lípidos y la activación de LCAT (Venkatachalapathi eí al., 1991 , supra). Anantharamaiah eí al. también han indicado que el residuo Glu de carga negativa en la posición 13 del péptido consenso de 22-mer, ubicado dentro de la fase hidrofóbica de la a-hélice, cumple una función importante en la activación de LCAT (Anantharamaiah eí al., 1991 , supra). Aún más, Brasseur ha indicado que se necesita un ángulo hidrofóbico (ángulo pho) menor que 180° para lograr una estabilidad óptima del complejo lípido-apolipoproteína y también es responsable de la formación de partículas discoides que contienen péptidos alrededor del borde de la bicapa de lípidos (Brasseur, 1991 , J. Biol. Chem. 66(24): 16120-16127). Rosseneu eí al. también han insistido que se requiere un ángulo hidrofóbico menor que 180° para la activación de LCAT (WO 93/25581 ). Sin embargo, a pesar del progreso en la elucidación de "reglas" para diseñar agonistas de ApoA-l, hasta la fecha los mejores agonistas de ApoA-l que se conocen presentan menos que un 40% de la actividad de la ApoA-l intacta. No se ha demostrado que alguno de los agonistas de los péptidos descriptos en la literatura sea de utilidad como drogas. Por consiguiente, persiste la necesidad de desarrollar una molécula estable que imite la actividad de la ApoA-l y que su producción sea relativamente simple y efectiva en cuanto al costo. Preferentemente, las moléculas candidato intervienen en el RCT indirecto y directo. Dichas moléculas serían menores que los agonistas peptídicos existentes y presentan un espectro funcional más amplio. Sin embargo, las "reglas" para diseñar mediadores del RCT eficaces no han sido elucidadas por completo y se desconocen aún los principios para diseñar moléculas orgánicas con la función de Apo A-l. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se describe un mediador del transporte inverso de colesterol que comprende la siguiente estructura: donde A, B y C pueden estar en cualquier orden, y donde A comprende un aminoácido o un análogo del mismo, que comprende un grupo ácido o un bioisostero del mismo; B comprende un grupo aromático o lipofílico que comprende un inhibidor de la HMG CoA reductasa o un análogo del mismo; y C comprende un aminoácido o un análogo del mismo, que comprende un grupo básico o un bioisostero del mismo; donde al menos uno de los grupos alfa-amino o alfa-carboxilo han sido eliminados de sus respectivos aminoácidos amino o carboxilo terminales o análogos de los mismos. Si no fue eliminado, el grupo alfa-amino puede ser protegido con un grupo protector seleccionado del grupo formado por acetilo, fenilacetilo, benzoílo, pivolilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo, ácido 2-naftílico, ácido nicotínico, un grupo CH3 — (CH2)n — CO — donde el valor de n varía en un rango entre 3 y 20, di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, Fmoc, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado y heteroarilo saturado sustituido. Si no fue eliminado, el grupo alfa-carboxilo puede ser protegido con un grupo protector seleccionado del grupo formado por una amina, tal como RNH donde R = H, di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, Fmoc, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado y heteroarilo saturado sustituido. Los bioisosteros del grupo ácido se pueden seleccionar del grupo formado por: Los bioisosteros del grupo básico se pueden seleccionar del grupo formado por: -CN NH -NO, j-Ac N-C02Et NH NH NH ^NH2 N NH2 ^N^NH2 ^N^NH2 ^N^NH2 ^N^ 2 "N X N X NH2 H NH H H Se describen los siguientes mediadores acordes con las modalidades preferidas: DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA DE LA INVENCIÓN Los mediadores del RCT de las modalidades preferidas de la invención imitan la función y actividad de ApoA-l. En un aspecto general, estos mediadores son moléculas que comprenden tres regiones, una región acida, una región lipofílica (por ejemplo, aromática) y una región básica. Las moléculas contienen preferentemente una región de carga positiva, una región de carga negativa y una región lipofílica sin carga. Las ubicaciones de las regiones entre sí pueden variar según las moléculas; por consiguiente, en una modalidad preferida, las moléculas intervienen en el RCT independientemente de las posiciones relativas de las tres regiones dentro de cada molécula. En tanto en algunas modalidades preferidas, el templado o modelo molecular comprende un residuo derivado de aminoácidos ácidos, un residuo derivado de aminoácidos lipofílicos y un residuo derivado de aminoácidos básicos, ligados en cualquier orden para formar el mediador del RCT, en otras modalidades preferidas, el modelo molecular puede comprender un solo residuo con regiones acidas, lipofílicas y básicas, tal como por ejemplo, el aminoácido, fenilalanina. En algunas modalidades preferidas, los mediadores moleculares del RCT comprenden trímeros de aminoácidos D o L naturales, de aminoácidos análogos (sintéticos o semisintéticos) y derivados de aminoácidos. Por ejemplo, un trímero puede incluir un residuo de aminoácido ácido o un análogo del mismo, un residuo de aminoácido aromático o lipofílico o un análogo del mismo y un residuo de aminoácido básico o un análogo del mismo, donde los residuos están unidos entre sí por enlaces peptídicos o de amida. Por ejemplo, el trímero de secuencia EFR comprende un residuo ácido (ácido glutámico), un residuo aromático (fenilalanina) y un residuo de aminoácido básico (arginina). Los mediadores moleculares del RCT comparten el aspecto común de reducir el colesterol en suero aumentando directa y/o indirectamente las vías del RCT (es decir, incrementando el eflujo de colesterol), la capacidad para activar la LCAT y la capacidad para incrementar la concentración sérica de HDL. El mediador del transporte inverso de colesterol posee preferentemente hasta 3 residuos de aminoácidos o análogos o cualquier compuesto no peptídico que contenga un grupo básico y un grupo ácido con un soporte lipofílico, de los mismo, y comprende la secuencia: X1-X2-X3, X1-X2-Y3, Y1-X2-X3 o Y1-X2-Y3 donde: X1 es un aminoácido ácido o un bioisostero del mismo; X2 es un aminoácido aromático o lipofílico; X3 es un aminoácido básico o un bioisostero del mismo; Y1 es un aminoácido o un bioisostero del mismo residuo sin el grupo protector amina; e Y3 es un aminoácido básico o un bioisostero del mismo sin el carboxilo terminal. Cuando el amino terminal está presente comprende además un primer grupo protector y cuando el carboxilo terminal está presente comprende además un segundo grupo protector. Dichos primer y segundo grupos protectores se seleccionan independientemente del grupo formado por un acetilo, fenilacetilo, pivolilo, ácido 2-naftílico, ácido nicotínico, un grupo CH3 — (CH2)n — CO — donde el valor de n varía en un rango entre 3 y 20, y una amida de acetilo, fenilacetilo, di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, Fmoc, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado, heteroarilo saturado sustituido y semejantes. El C-terminal se puede proteger con una amina tal como RNH2, donde R = di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, f-MOC, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado, heteroarilo saturado sustituido y semejantes. En una modalidad del mediador del transporte inverso de colesterol derivado de aminoácidos, uno o más de X1 , X2 o X3 son D u otro residuo de aminoácido sintético modificado para proveer moléculas metabólicamente estables. Esto también se puede lograr mediante un enfoque peptidomimético es decir invirtiendo los enlaces peptídicos en el esqueleto o grupos similares. En algunas modalidades preferidas, X2 es un soporte inhibidor de la HMG CoA reductasa. En otra modalidad, el mediador puede ser incorporado en una entidad más grande, tal como un péptido o una molécula de 1 a 10 aminoácidos aproximadamente.
Un soporte es un farmacóforo que constituye un modelo para simplificar el proceso de interacción entre un ligando (molécula de droga candidato) y una proteína. Un soporte puede poseer determinadas características de la molécula nativa fija en un sitio activo de la proteína. Se puede suponer que estas características interactúan con algunas características complementarias en la cavidad de la proteína. Las variaciones pueden ser derivadas por grupos funcionales unidas al soporte. Preferentemente, se define un soporte con el siguiente heurístico: Un soporte es una imitación de una porción de un inhibidor de la HMG CoA reductasa que es lipofílico o aromático. Los términos "bioisostero", "sustitución bioisostérica", "bioisosterismo" y términos estrechamente relacionados utilizados aquí tienen el mismo significado que el reconocido en general en el arte. Los bioisosteros son átomos, iones o moléculas en los cuales las capas periféricas de electrones pueden considerarse idénticas. El término un bioisostero se utiliza habitualmente para hacer referencia a una porción de una molécula general, en oposición a la propia molécula entera, sustitución bioisostérica comprende el uso de un bioisostero para sustituir a otro con la esperanza de conservar o modificar ligeramente la actividad biológica del primer bioisostero. En este caso, los bioisosteros son entonces átomos o grupos de átomos de tamaño, forma y densidad electrónica similares. El bioisosterismo surge de una esperanza razonable que un determinado sustitución bioisostérica dará como resultado la conservación de propiedades biológicas similares. Dicha esperanza razonable se puede basar solamente en la similitud estructural. Esto es realmente así en aquellos casos donde se conoce una cantidad de detalles referidos a los dominios característicos del receptor, etc. particular comprometido, a los cuales se unen los bioisosteros o que trabajan de alguna manera sobre dichos bioisosteros.
Tal como se utiliza en la presente, el término "aminoácido" también puede hacer referencia a una molécula de la fórmula general NH2-CHR-COOH o al residuo contenido en un péptido que lleva al aminoácido principal, donde "R" es uno entre numerosas cadenas laterales diferentes. "R" puede ser un sustituyente que se refiera a uno de los veinte aminoácidos codificados genéticamente. "R" también puede ser un sustituyente que se refiera a uno que no sea uno de los veinte aminoácidos codificados genéticamente. Tal como se utiliza en la presente, el término "residuo de aminoácido" se refiere a la porción del aminoácido que permanece después de la pérdida de una molécula de agua cuando está unido a otro aminoácido. Tal como se utiliza en la presente, el término "análogo de aminoácido" se refiere a un derivado estructural de un compuesto de aminoácidos relacionado que a menudo difiere del mismo en un sólo elemento. El término "aminoácido modificado" se refiere a un aminoácido que contiene un sustituyente "R" que no corresponde a uno de los veinte aminoácidos codificados genéticamente. Los grupos protectores para el amino terminal y el carboxilo terminal se seleccionan independientemente del grupo formado por un acetilo, fenilacetilo, pivolilo, ácido 2-naftílico, ácido nicotínico, un grupo CH3 — (CH2)n — CO — donde el valor de n varía en un rango entre 3 y 20, y una amida de acetilo, fenilacetilo, di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, Fmoc, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado, heteroarilo saturado sustituido y semejantes. El C-terminal se puede proteger con una amina tal como RNH2, donde R = di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, f-MOC, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado, heteroarilo saturado sustituido y semejantes.
Tal como se utiliza en la presente, el término "completamente protegido" se refiere a una modalidad preferida en la cual ambos extremos amino terminal y carboxilo terminal comprenden grupos protectores. Tal como se utiliza en la presente, el término "semiprotegido" se refiere a una modalidad preferida en la cual uno de los extremos amino terminal o carboxilo terminal comprende un grupo protector o se ha eliminado uno de los grupos protectores del amino o del carboxilo. Tal como se utiliza en la presente, el término "desprotegido" o "completamente desprotegido" se refiere a una modalidad preferida en la cual ninguno de los extremos amino terminal y carboxilo terminal comprenden grupos protectores o se ha eliminado el grupo amino protegido y el grupo carboxilo protegido. Inhibición de la HMG-CoA reductasa Tal como se definió antes, un soporte es, preferentemente, una imitación de una porción de un Inhibidor de la HMG CoA reductasa que es lipofílico o aromático. Los inhibidores de la HMG CoA reductasa comparten un grupo hidrofóbico, rígido, que está ligado a un grupo tipo HMG. Los inhibidores de la HMG CoA reductasa son inhibidores competitivos de HMGR con respecto a la unión del sustrato HMG CoA. Los grupos hidrofóbicos rígidos, estructuralmente diversos, de los inhibidores de la HMG CoA reductasa está ubicados en un surco no polar poco profundo de HMGR. La inhibición de HMGR constituye un método eficaz y seguro en una terapia para disminuir el colesterol. Los inhibidores de la HMG CoA reductasa tienen otros efectos además del de disminuir el colesterol. Estos incluyen promoción mediada por óxido nítrico del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, estimulación de la formación ósea, protección contra una modificación oxidativa de la lipoproteína de baja densidad, efectos anti-inflamatorios y reducción en los niveles de la proteína C reactiva. Mediación del RCT Hasta la fecha, todo el esfuerzo para diseñar agonistas de ApoA-l se ha centrado en estructuras unitarias de 22-mer, por ejemplo, la "22-mer consenso" de Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis 10(1 ): 95-105; Venkatachalapathi eí al., 1991 , Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B: 585-596, que tienen la capacidad de formar á-hélices anfipáticas en presencia de lípidos. (Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: 6.376.464 referida a péptido miméticos derivados de modificaciones de la estructura 22-mer consenso). Existen numerosas ventajas con el uso de dichos péptidos relativamente cortos en comparación con 22-mers más largos. Por ejemplo, los mediadores más cortos del RCT son más fáciles y menos costosos de producir, son más estables desde un punto de vista químico y de conformación, las conformaciones preferidas permanecen relativamente rígidas, hay pocas, o ninguna, interacciones intramoleculares dentro de la cadena del péptido y los péptidos más cortos exhiben un mayor grado de disponibilidad oral. Se podrían unir múltiples copias de estos péptidos más cortos a HDL o LDL produciendo el mismo efecto que un péptido grande más restringido. Si bien la multifuncionalidad de la ApoA-l se puede basar en las contribuciones de sus múltiples dominios á-helicoidales, también es posible que aunque sea una sola función de la ApoA-l, por ejemplo activación de LCAT, sea mediada de manera redundante por más de uno de los dominios á-helicoidales. Por consiguiente, en un aspecto preferido de las modalidades, es posible imitar múltiples funciones de la ApoA-l con los mediadores del RCT descritos que están dirigidos a un solo subdominio.
Hay tres características funcionales de la ApoA-l que son ampliamente aceptadas como criterios importantes para diseñar agonistas de ApoA-l: (1 ) capacidad para asociarse con fosfolípidos; (2) capacidad para activar LCAT; y (3) capacidad para promover el eflujo de colesterol de las células. Los mediadores moleculares del RCT de acuerdo con algunas formas de las modalidades preferidas puede exhibir solamente ela última característica funcional: la capacidad para incrementar el RCT. Sin embargo, algunas otras pocas propiedades de la ApoA-l, que a menudo se pasan por alto, convierten a la ApoA-l en un blanco particularmente atractivo para una intervención terapéutica. Por ejemplo, la ApoA-l dirige al flujo de colesterol hacia el hígado a través de un proceso mediado por receptores y modula la producción de HDL pre-ß (aceptor primario de colesterol de los tejidos periféricos) a través de una reacción dirigida por PLTP. Sin embargo, estas características permiten ampliar la utilidad potencial de las moléculas ApoA-l +miméticas. Este enfoque completamente nuevo de considerar la función ApoA-l mimética, permitirá usar las pequeñas moléculas derivadas de péptidos o aminoácidos, que se describen en la presente, para facilitar el RCT directo (por la vía HDL) así como el RCT indirecto (es decir, para interceptar y quitar los LDL de la circulación, por redireccionamiento de su flujo hacia el hígado). Para poder de mejorar el RCT indirecto, los mediadores moleculares de las modalidades preferidas podrán, preferentemente, asociarse con fosfolípidos y unirse en el hígado (es decir, para funcionar como ligando para los sitios de unión a lipoproteínas en hígado). Por consiguiente, una meta de la investigación que condujo a las modalidades preferidas fue la de identificar, diseñar y sintetizar los mediadores peptídicos cortos estables del RCT que exhiben una conformación preferencial de unión a lípidos, incrementar el flujo de colesterol hacia el hígado facilitando el transporte inverso de colesterol directo y/o indirecto, mejorar el perfil plasmático de lipoproteínas y posteriormente prevenir el avance o/y aún promover la regresión de las lesiones ateroscleróticas. Los mediadores del RCT de las modalidades preferidas se pueden preparar en formas de dosificación a granel o unitarias estables, por ejemplo, productos liofilizados, que pueden reconstituirse antes de su uso in vivo o reformularse. Las modalidades preferidas de la invención incluyen formulaciones farmacéuticas y el uso de dichas preparaciones en el tratamiento de hiperlipidemia, hipercolesterolemia, enfermedad cardíaca coronaria, aterosclerosis, diabetes, obesidad, mal de Alzheimer, esclerosis múltiple, afecciones relacionadas con hiperlipidemia, tal como inflamación, y otras afecciones tal como una endotoxemia causante de shock séptico. Las modalidades preferidas se ilustran mediante ejemplos de trabajo que demuestran que los mediadores del RCT de las modalidades preferidas se asocian con los componentes HDL y LDL del plasma, y pueden incrementar la concentración de HDL y partículas HDL pre-ß y disminuir los niveles plasmáticos de LDL. Por consiguiente promueven el RCT directo e indirecto. Los mediadores del RCT incrementan la acumulación de colesterol mediada por LDL humana en hepatocitos humanos (células HepG2). Los mediadores del RCT también son eficaces para activar PLTP y por consiguiente promueven la formación de partículas pre-ß-HDL. El incremento de colesterol HDL sirvió como una evidencia indirecta del compromiso de LCAT (no se demostró directamente la activación de LCAT (in vitro)) en el RCT. El uso de los mediadores del RCT de las modalidades preferidas in vivo en modelos animales da como resultado un incremento en la concentración sérica de HDL. Las modalidades preferidas se describen con mayor detalle más adelante en las subsecciones, que detallan la composición y estructura de los mediadores del RCT, incluyendo soportes que pueden actuar como inhibidores de la HMG CoA reductasa, incluyendo versiones protegidas, versiones semiprotegidas y versiones desprotegidas de los mismos; caracterización estructural y funcional; métodos de preparación de formulaciones de dosificación a granel y unitarias; y métodos de uso. Estructura y función de los péptidos En algunas modalidades preferidas, los mediadores del RCT son en general péptidos, o análogos de los mismos, que imitan la actividad de ApoA-l. En algunas modalidades, al menos un enlace amida en el péptido está sustituido por una amida sustituida, un isostero de una amida o una amida mimética. Además, es posible reemplazar uno o más enlaces amida por grupos peptidomiméticos o amida miméticos que no interfieran significativamente con la estructura o actividad de los péptidos. Los grupos amida miméticos adecuados se describen, por ejemplo, en Olson eí al., 1993, J. Med. Chem. 36: Tal como se usan en la presente, las abreviaturas de los aminoácidos L- enantioméricos genéticamente codificados son las convencionales y son como se detalla a continuación: Los D-aminoácidos están indicados con letras minúsculas, por ejemplo D-alanina = a, etc. Tabla 1 Aminoácidos Símbolo de una letra Abreviatura común Alanina A Ala Arginina R Arg Asparagina N Asn Ácido aspártico D Asp Cisteína C Cys Aminoácidos Símbolo de una letra Abreviatura común Glutamina Q Gln Ácido glutámico E Glu Glicina G Gly histidina H His Isoleucina 1 He Leucina L Leu Lisina K Lys Fenilalanina F Phe Prolina P Pro Serina S Ser Treonina T Thr Triptofano w Trp Tirosina Y Tyr Valina V Val Hay determinados residuos de aminoácidos en los mediadores peptídicos del RCT que pueden ser reemplazados por otros residuos de aminoácidos sin afectar significativamente, y en muchos casos aún mejorando, la actividad de los péptidos. Por consiguiente, las modalidades preferidas también contemplan las formas alteradas o mutadas de los mediadores peptídicos del RCT, donde al menos un residuo de aminoácido definido en la estructura está sustituido por otro residuo de aminoácido o un derivado y/o un análogo del mismo. Se debe tener en cuenta que en modalidades preferidas, las sustituciones de aminoácidos son conservadoras, es decir, el residuo de aminoácido sustituyente tiene propiedades físicas y químicas que son similares a las del residuo de aminoácido que está siendo sustituido.
A los efectos de determinar las sustituciones de aminoácidos conservadoras, los aminoácidos se pueden clasificar convenientemente en dos grandes categorías: hidrofílica- e hidrofóbica, dependiendo primariamente de las características físicas-químicas de la cadena lateral del aminoácido. Estas dos grandes categorías se pueden clasificar además en subcategorías que permiten definir con más precisión las características de las cadenas laterales del aminoácido. Por ejemplo, la clase de aminoácidos hidrofílicas se puede subdividir además en aminoácidos ácidos, básicos y polares. La clase de los aminoácidos hidrofóbicos se puede subdividir además en aminoácidos no polares y aromáticos. Las definiciones de las distintas categorías de aminoácidos que definen la ApoA-l son: El término "aminoácido hidrofílico" se refiere a un aminoácido que exhibe una hidrofobicidad menor que cero de acuerdo con la escala de hidrofobicidad normalizada consenso de Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142. Los aminoácidos hidrofílicos codificados genéticamente incluyen Thr (T), Ser (S), His (H), Glu (E), Asn (N), Gln (Q), Asp (D), Lys (K) y Arg (R). El término "aminoácido hidrofóbico" se refiere a un aminoácido que exhibe una hidrofobicidad mayor que cero de acuerdo con la escala normalizada de hidrofobicidad consenso de Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:1.25-142 Los aminoácidos hidrofóbicos codificados genéticamente incluyen Pro (P), He (I), Phe (F), Val (V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G) y Tyr (Y). El término "aminoácido ácido" se refiere a un aminoácido hidrofílico que posee un valor de pK de la cadena lateral menor que 7. Los aminoácidos ácidos poseen típicamente cadenas laterales de carga negativa a pH fisiológico debido a la pérdida de un ion hidrógeno. Los aminoácidos ácidos codificados genéticamente incluyen Glu (E) y Asp (D).
El término "aminoácido básico" se refiere a un aminoácido hidrofílico que posee un valor de pK de la cadena lateral mayor que 7. Los aminoácidos básicos poseen típicamente cadenas laterales de carga positiva a pH fisiológico debido a la asociación con el ion hidronio. Los aminoácidos básicos codificados genéticamente incluyen His (H), Arg (R) y Lys (K). El término "aminoácido polar" se refiere a un aminoácido hidrofílico que posee una cadena lateral sin carga a pH fisiológico, pero que posee al menos un enlace en el cual el par de electrones compartidos por dos átomos es más estrecho para uno de dichos átomos. Los aminoácidos polares codificados genéticamente incluyen Asn (N), Gln (Q) Ser (S) y Thr (T). El término "aminoácido no polar" se refiere a un aminoácido hidrofóbico que posee una cadena lateral sin carga a pH fisiológico y que posee enlaces en los cuales el par de electrones compartidos en común por dos átomos generalmente son iguales para cada uno de los dos átomos (es decir, la cadena lateral es no polar). Los aminoácidos no polares codificados genéticamente incluyen Leu (L), Val (V), He (I), Met (M), Gly (G) y Ala (A). El término "aminoácido aromático" se refiere a un aminoácido hidrofóbico con una cadena lateral que posee al menos un anillo aromático o heteroaromático. El anillo aromático o heteroaromático puede contener uno o más sustituyentes, tales como —OH, — SH, — CN, — F, — Cl, — Br, —I, — NO2, — NO, — NH2, —NHR, —NRR, — C(O)R, — C(O)OH, — C(O)O, — C(O)NH2, — C(O)NHR, — C(O)NRR y semejantes, donde cada R es independientemente (Ci -Cß) alquilo, (Ci - Ce) alquilo sustituido, (C-i - Ce) alquenilo, (Ci - Ce) alquenilo sustituido, (Ci - Ce) alquinilo, (Ci - Cß) alquinilo sustituido, (C5 - C20) arilo, (C5 -C20) arilo sustituido, (Cß - C26) alcarilo, (Cß - C26) alcarilo sustituido, heteroarilo de 5-20 miembros, heteroarilo de 5-20 miembros sustituido, alquilheteroarilo de 6-26 miembros o alquilheteroarilo de 6-26 miembros sustituido. Los aminoácidos aromáticos codificados genéticamente incluyen Phe (F), Tyr (Y) y Trp (W). El término "aminoácido alifático" se refiere a un aminoácido hidrofóbico que posee una cadena lateral de hidrocarburos alifáticos. Los aminoácidos alifáticos codificados genéticamente incluyen Ala (A), Val (V), Leu (L) y lie (I). El residuo de aminoácido Cys (C) es poco común por cuanto puede formar puentes disulfuro con otros residuos Cys (C) u otros aminoácidos que contienen sulfanilo. La capacidad de los residuos Cys (C) (y otros aminoácidos con cadenas laterales que contienen — SH) para existir en un péptido ya sea en la forma reducida libre — SH o en la forma de puente disulfuro oxidada afecta el hecho de si los residuos Cys (C) contribuyen en el carácter hidrofóbico o hidrofílico neto de un péptido. Aunque Cys (C) exhibe una hidrofobicidad de 0,29 de acuerdo con la escala normalizada consenso de Eisenberg (Eisenberg, 1984, supra), se debe tener en cuenta que al efecto de las modalidades preferidas Cys (C) se clasifica como un aminoácido hidrofílico polar, a pesar de la clasificación general descrita precedentemente. Como comprenderán los especialistas en el arte, las categorías definidas precedentemente no son mutuamente exclusivas. Por consiguiente, los aminoácidos que poseen cadenas laterales que exhiben dos o más propiedades físicas-químicas pueden ser incluidas en múltiples categorías. Por ejemplo, las cadenas laterales de aminoácidos que poseen grupos aromáticos que además están sustituidos con sustituyentes polares, tal como Tyr (Y), pueden exhibir tanto propiedades hidrofóbicas aromáticas como propiedades polares o hidrofílicas y por ello se pueden incluir en ambas categorías aromática y polar. La clasificación apropiada de cualquier aminoácido resultará evidente para los especialistas en el arte, en especial a la luz de la descripción detallada provista en la presente.
En tanto se ofrecieron ejemplos de aminoácidos codificados genéticamente de las categorías definidas precedentemente, no es necesario restringir las sustituciones de aminoácidos, y en determinadas modalidades preferentemente no se restringen, a los aminoácidos codificados genéticamente. Aún más, muchos de los mediadores peptídicos preferidos del RCT contienen aminoácidos que no están codificados genéticamente. Por consiguiente, además de los aminoácidos naturales codificados genéticamente, se pueden sustituir residuos de aminoácidos en los mediadores peptídicos del RCT con aminoácidos no codificados naturales y aminoácidos sintéticos. Determinados aminoácidos comunes que proveen sustituciones útiles para los mediadores peptídicos del RCT incluyen, a modo de ejemplo, ß-alanina (ß-Ala) y otros omega-aminoácidos tal como ácido 3-aminopropiónico, ácido 2,3-diaminopropiónico (Dpr), ácido 4-aminobutírico y así sucesivamente; ácido a-aminoisobutírico (Aib); ácido e-aminohexanoico (Aha); ácido d-aminovalérico (Ava); N-metilglicina o sarcosina (MeGly); ornitina (Orn); citrulina (Cit); t-butilalanina (t-BuA); t-butilglicina (t-BuG); N-metilisoleucina (Melle); fenilglicina (Phg); ciclohexilalanina (Cha); norleucina (Nle); naftilalanina (Nal); 4-fenilfenilalanina, 4-clorofenilalanina (Phe(4-CI)); 2-fluorofenilalanina (Phe(2-F)); 3-fluorofenilalanina (Phe(3-F)); 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)); penicilamina (Pen); ácido 1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (Tic); ß-2-tienilalanina (Thi); sulfóxido de metionina (MSO); homoarginina (hArg); N-acetil lisina (AcLys); ácido 2,4-diaminobutírico (Dbu); ácido 2,3-diaminobutírico (Dab); p-aminofenilalanina (Phe (pNH2)); N-metil valina (MeVal); homocisteína (hCys), homofenilalanina (hPhe) y homoserina (hSer); hidroxiprolina (Hyp), homoprolina (hPro), aminoácidos N-metilados y peptoides (glicinas N-sustituidas). Es posible clasificar rápidamente otros residuos de aminoácidos que no se mencionan específicamente en la presente basado en las propiedades físicas y químicas observadas a la luz de las definiciones provistas aquí. La clasificación de los aminoácidos codificados genéticamente y los aminoácidos comunes no codificados acordes con las categorías definidas precedentemente se resumen en la siguiente Tabla 2. Se debe tener en cuenta que la siguiente Tabla 2 solamente se muestra a efectos ilustrativos y no pretende abarcar un listado exhaustivo de los residuos de aminoácidos y derivados que se pueden usar para las sustituciones en los mediadores peptídicos del RCT descritos en la presente. Tabla 2. CLASIFICACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS MÁS COMUNES Clasificación Codificados No codificados genéticamente genéticamente Hidrofóbicos Aromáticos F, Y, W Phg, Nal, Thi, Tic, Phe (4-Cl), Phe (2-F), Phe (3-F), Phe (4-F), hPhe No polares No polar L, V, 1, M, G, A, P t-BuA, t-BuG, Melle, Nle, MeVal, Cha, McGly, Aib Alifáticos A, V, L, 1 b-Ala, Dpr, Aib, Aha, MeGly, t-BuA, t-BuG, Melle, Cha, Nle, MeVal Hidrofílicos Ácidos D, E Básicos H, K, R Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH2), Dbu, Dab Polares C, Q, N, S. T Cit, AcLys, MSO, bAla, hSer Ruptura de P, G D-Pro y otros D-aminoácidos (en L-péptidos) hélices Es posible clasificar rápidamente otros residuos de aminoácidos que no se mencionan específicamente en la presente basado en las propiedades físicas y químicas observadas a la luz de las definiciones provistas aquí. Aunque en la mayoría de los casos, los aminoácidos de los mediadores peptídicos del RCT serán sustituidos con aminoácidos D-enantioméricos, las sustituciones no se limitan a los aminoácidos D-enantioméricos. Por consiguiente, en la definición de formas "mutadas" o "alteradas" también se incluyen aquellas situaciones donde un D-aminoácido es sustituido por un L-aminoácido idéntico (por ejemplo, D-Arg?L-Arg) o por un L-aminoácido de la misma categoría o subcategoría (por ejemplo, D-Arg D-Lys), y viceversa. Los péptidos pueden comprender ventajosamente al menos un aminoácido D-enantiomérico. Se cree que los péptidos que contienen dichos D-aminoácidos son más estables frente a la degradación en la cavidad oral, intestino o suero que los péptidos compuestos exclusivamente de L-aminoácidos. Ligadores Los mediadores peptídicos del RCT se pueden conectar o ligar en una manera de cabeza-a-cola (es decir, N-terminal con C-terminal), cabeza-a-cabeza (es decir, N-terminal con N-terminal), cola-a-cola (es decir, C-terminal con C-terminal) o combinaciones de las mismas. El ligador LL puede ser cualquier molécula bifuncional capaz de ligar covalentemente dos péptidos entre sí. Por consiguiente, los ligadores adecuados son moléculas bifuncionales en las cuales los grupos funcionales se pueden unir de forma covalente al extremo N- y/o C-terminal de un péptido. Los grupos funcionales adecuados para unir los extremos N- o C-terminales de los péptidos son bien conocidos en el arte, como lo es la química adecuada para lograr la formación de dichos enlaces covalentes. Los ligadores de suficiente longitud y flexibilidad incluyen, a modo de ejemplo, Pro (P), Gly (G), Cys-Cys,Gly-Gly, H2N— (CH2)n— COOH donde n es 1 a 12, preferentemente 4 a 6; H2N-aril-COOH y carbohidratos. Versiones protegidas, semiproteqidas v desproteaidas En una modalidad, se describe una molécula que comprende una composición basada en aminoácidos que contienen tres regiones independiente: una región acida, una región aromática o lipofílica y una región básica. Las ubicaciones relativas de las regiones entre sí puede variar entre los distintos mediadores moleculares; las moléculas intervienen en el RCT sin tener en cuenta la posición de las tres regiones dentro de cada molécula. La región trimérica del péptido puede consistir de D- o L- aminoácidos naturales, análogos de aminoácidos y derivados de aminoácidos. En otra variación preferida, los mediadores moleculares que comprenden una estructura trimérica basada en aminoácidos pueden estar protegidos con uno o más grupos lipofílicos en el amino o carboxilo terminal en cualquiera de los extremos para mejorar las propiedades fisicoquímicas de los mediadores moleculares del RCT y aprovechar el sistema de transporte (absorción) natural o activo de materiales grasos o lipofílicos en el cuerpo. Los grupos protectores pueden ser D o L enantiómeros o moléculas o grupos no enantioméricos. En modalidades preferidas, los grupos protectores N-terminales se seleccionan del grupo formado por acetilo, fenilacetilo, di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, f-MOC, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado, heteroarilo saturado sustituido y semejantes. El C-terminal se protege preferentemente con una amina, tal como RNH2 donde R = di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, f-MOC, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado, heteroarilo saturado sustituido y semejantes.
Versión protegida Una versión completamente protegida se refiere a una modalidad preferida en la cual tanto el amino terminal como el carboxilo terminal comprenden grupos protectores. En una modalidad, el mediador del transporte inverso de colesterol posee preferentemente hasta 3 residuos de aminoácidos o análogos o cualquier compuesto no peptídico que contenga un grupo básico y un grupo ácido con un soporte lipofílico, del mismo, y comprende la secuencia: X1-X2-X3, donde: X1 es un aminoácido ácido; X2 es un aminoácido aromático o lipofílico; y X3 es un aminoácido básico; donde, cuando el amino terminal está presente, comprende además un primer grupo protector, y donde, cuando el carboxilo terminal está presente, comprende además un segundo grupo protector. Dichos primer y segundo grupos protectores se seleccionan independientemente del grupo formado por un acetilo, fenilacetilo, pivolilo, ácido 2-naftílico, ácido nicotínico, un grupo CH3 — (CH2)n — CO — donde el valor de n varía en un rango entre 3 y 20, y una amida de acetilo, fenilacetilo, di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, Fmoc, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado, heteroarilo saturado sustituido y semejantes. El C-terminal se puede proteger con una amina tal como RNH2, donde R = di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, f-MOC, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado, heteroarilo saturado sustituido y semejantes. La secuencia se puede armar de cualquiera y todas las maneras posibles para proveer compuestos que retengan las características básicas del Modelo Molecular y podría comprender hasta 3 aminoácidos.
Versión semiprotegida En otra modalidad, el mediador del transporte inverso de colesterol posee preferentemente hasta 3 residuos de aminoácidos o análogos o cualquier compuesto no peptídico que contenga un grupo básico y un grupo ácido con un soporte lipofílico, del mismo, y comprende la secuencia: X1-X2-Y3 o Y1-X2-X3, donde: X1 es un aminoácido ácido; X2 es un aminoácido aromático o lipofílico; X3 es un aminoácido básico; Y1 es un aminoácido residuo sin el grupo protector amina; e Y3 es un aminoácido básico sin el carboxilo terminal. Cuando el amino terminal está presente comprende además un primer grupo protector, y cuando el carboxilo terminal está presente comprende además un segundo grupo protector. La secuencia: X1-X2-Y3 o Y1-X2-X3 se puede armar de cualquiera y todas las maneras posibles para proveer compuestos que retengan las características básicas del Modelo Molecular y podría comprender 3 residuos ácidos. Los grupos protectores del amino terminal y del carboxilo terminal se seleccionan independientemente del grupo formado por un acetilo, fenilacetilo, pivolilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo, ácido 2-naftílico, ácido nicotínico, un grupo CH3 — (CH2)n — CO — donde el valor de n varía en un rango entre 3 y 20, y una amida de acetilo, fenilacetilo, di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, f-MOC, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado, heteroarilo saturado sustituido y semejantes. El C-terminal se puede proteger con una amina tal como RNH2, donde R = di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, f-MOC, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado, heteroarilo saturado sustituido y semejantes. Versión desprotegida En otra variación preferida, los mediadores moleculares comprenden una estructura trimérica basada en aminoácidos sin un grupo protector de uno o más grupos lipofílicos en los extremos amino y carboxilo terminales. En otra modalidad, el mediador del transporte inverso de colesterol posee preferentemente 3 residuos de aminoácidos o análogos o cualquier compuesto no peptídico que contenga un grupo básico y un grupo ácido con un soporte lipofílico, del mismo, y comprende la secuencia: Y1-X2-Y3 donde: Y1 es un aminoácido ácido sin un grupo protector amina; X2 es una región aromática o lipofílica; Y3 es un aminoácido básico donde el amino terminal no comprende un grupo protector carboxilo. La secuencia: Y1-X2-Y3 se puede armar de cualquiera y todas las maneras posibles para proveer compuestos que retengan las características básicas del Modelo Molecular y podría comprender 3 residuos de aminoácidos. Los inhibidores del soporte de la HMG CoA reductasa El mediador del transporte inverso de colesterol posee preferentemente hasta 3 residuos de aminoácidos o análogos o cualquier compuesto no peptídico que contenga un grupo básico y un grupo ácido con un soporte lipofílico, de los mismo, y comprende la secuencia: X1-X2-X3, X1-X2-Y3, Y1-X2-X3 o Y1-X2-Y3 donde: X1 es un aminoácido ácido o un bioisostero del mismo; X2 es un aminoácido aromático o lipofílico; X3 es un aminoácido básico o un bioisostero del mismo; Y1 es un aminoácido o un bioisostero del mismo residuo sin el grupo protector amina; e Y3 es un aminoácido básico o un bioisostero del mismo sin el carboxilo terminal. Cuando el amino terminal está presente comprende además un primer grupo protector, y cuando el carboxilo terminal está presente comprende además un segundo grupo protector. Dichos primer y segundo grupos protectores se seleccionan independientemente del grupo formado por un acetilo, fenilacetilo, pivolilo, ácido 2-naftílico, ácido nicotínico, un grupo CH3 — (CH2)n — CO — donde el valor de n varía en un rango entre 3 y 20, y una amida de acetilo, fenilacetilo, di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, Fmoc, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado, heteroarilo saturado sustituido y semejantes. El C-terminal se puede proteger con una amina tal como RNH2, donde R = di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, f-MOC, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado, heteroarilo saturado sustituido y semejantes. En una modalidad del mediador del transporte inverso de colesterol derivado de aminoácidos, uno o más de X1 , X2 o X3 son D u otro residuo de aminoácido sintético modificado para proveer moléculas metabólicamente estables. Esto también se puede lograr mediante un enfoque peptidomimético es decir invirtiendo los enlaces peptídicos en el esqueleto o grupos similares. En algunas modalidades preferidas, X2 es un soporte inhibidor de la HMG CoA reductasa. Preferentemente, el soporte hidrofóbico o aromático es un colesterol mimético y se puede basar en un inhibidor de la HMG CoA reductasa. Los ejemplos de inhibidores de la HMG CoA reductasa se muestran a continuación: Zocord™ inhibidores de la HMG CoA reductasa inhibidores de la HMG CoA reductasa inhibidores de la HMG CoA reductasa inhibidores de la HMG CoA reductasa Los agentes hipolipidémicos de fibratos activan PPARa Clofibrate (PPARa) Por consiguiente, los ejemplos de soportes lipofílicos o aromáticos basados en los inhibidores de la HMG CoA reductasa se muestran a continuación junto con el inhibidor principal de la HMG CoA reductasa: Inhibidores de la HMG CoA reductasa Nisvastatin Ribaro™ Fluvastatin Lescol™ Los ejemplos de mediadores del RCT que emplean un soporte basado en un inhibidor de la HMG CoA reductasa, tal como nisvastatina, se muestran a continuación.
AcE-Quin-RNH, Ace-Qu?n-rNH2 AcR-Qu?n-ENH2 Tal como se definió antes, un soporte es, preferentemente, un mimético de una porción de un inhibidor de la HMG CoA reductasa que es lipofílico o aromático. Los inhibidores de la HMG CoA reductasa comparten un grupo hidrofóbico, rígido, que está ligado a un grupo de tipo HMG. Los inhibidores de la HMG CoA reductasa son inhibidores competitivos de HMGR con respecto a la unión del sustrato HMG CoA. Los grupos hidrofóbicos rígidos, estructuralmente diversos de los inhibidores de la HMG CoA reductasa están ubicados en un surco no polar poco profundo de HMGR. Los derivados de alanina sustituida del soporte del inhibidor de la HMG CoA reductasa son sustituciones del aminoácido central (X2) en el tripepéptido X1X2X3, X1X2Y3, Y1X2X3 o Y1X2Y3. Los derivados de aminoácidos se pueden preparar a partir de los correspondientes arilaldehídos (J-CHO, donde J es cualquiera de los soportes de color), como se muestra más adelante. Los derivados de aminoácidos se pueden preparar en formas enantioméricamente pura (D o L, dependiendo del catalizador quiral) o racémicas. Esquema: Síntesis general de derivados de alanina con soportes de estatina cautivos Los arilaldehídos mencionados previamente (Jn-CHO, n = 1-4) se pueden preparar de acuerdo con los siguientes esquemas. Esquema: Síntesis del aldehido de soporte de fluvastatina Esquema: Síntesis del aldehido de soporte de la atorvastatina (donde R es un grupo alquilo o alquilsulfonilo) Esquema: Síntesis del aldehido de soporte de rosuvastatina (donde X es hidrógeno o halógeno) Esquema: Síntesis del aldehido de soporte de nisvastatina (donde X es hidróg Estos derivados alanina sustituidas de estatina se pueden acoplar luego con otros derivados de aminoácidos (por ejemplo, Glu o Arg). Además, estos derivados pueden ser desprotegidos parcial o completamente, como se describe para el case de EFR o efr. Una modalidad de los mediadores del RCT que emplea un soporte de HMG CoA reductasa se basa en atorvastatina.
Atorvastatln (Lipitor) Se pueden sintetizar derivados de D- y L-aminoácidos basados en atorvastatina. Estos derivados además pueden estar desprotegidos parcial o completamente. La sustitución bioisostérica se puede efectuar por uno de los residuos de aminoácido o por ambos. El grupo del ácido glutámico puede ser sustituido, por ejemplo, por ácido 3-aminobenzoico o PABA. Estos derivados se muestran en los siguientes gráficos y esquemas.
B: A partir de ácido2-amino-pirrol-3-carboxílico 13a e-pir r 14a E-DIG R 15a 13b e-pir r 14b E-pjr R 15b D: A partir de ácido 4-amino-pirazol-3-carboxílico E: A partir de ácido 3-amino-pirrol-2-carboxílico (anillo piridina por fenilo) F: A partir de ácido 3-amino-pirrol-2-carboxílico (Bioisosteros) G: A partir de ácido 2-amino-pirrol-3-carboxílico (Bioisosteros) 31 32 33 H: A partir de ácido 4-amino-pirrol-3-carboxílico (Bioisosteros) 34 35 36 I: A partir de ácido 4-amino-pirazol-3-carboxílico (bioisosteros) J: Misceláneo 42 e-o,r -r 45 e-pir r 43 E-Dlr R 46 E-p?r R K: Misceláneo (bioisosteros) Esquema-1 : Ruta general para la síntesis en fase de solución R, R' = CH2CH2C02R1, CH2CH2CH2NHC(=NH)NHR2 La ruta general para la síntesis de péptidos en fase de solución con aminoácidos protegidos con N-Boc se muestra en el Esquema 1. Primero, el ácido se hace reaccionar con la amina bajo condiciones estándar (por ejemplo, EDCl, HOBt, Et3N) y el producto resultante es desprotegido (TFA) en la correspondiente amina. Ésta última se acopla con otro aminoácido apropiadamente protegido bajo las condiciones estándar. Se elimina el N-Boc (TFA) y se protege con cloruro ácido (por ejemplo AcCI) y los demás grupos protectores son eliminados para obtener el producto deseado. Esquema-2: Ruta general para la síntesis en fase sólida Resina Rink amida n R, R' = CH2CH2C02R1, CH2CH2CH2NHC(=NH)NHR2 La ruta general para la síntesis de péptidos en fase sólida con aminoácidos protegidos con N-Boc se muestra en el Esquema 2. Primero, se desprotege N-Fmoc de la resina (Rink) (piperidina, DMF) y luego se acopla con un aminoácido protegido con N-Fmoc bajo condiciones estándar (por ejemplo, DIC, HOBt, Et3N) y el producto resultante es desprotegido igual que antes en la amido-amina unida a la resina. Ésta última se acopla con otro aminoácido apropiadamente protegido bajo las condiciones estándar y se repite una vez más. El N-Fmoc es eliminado (piperidina, DMF) y protegido con cloruro ácido (por ejemplo AcCI) y los demás grupos protectores son eliminados para obtener el producto deseado. Los intermediarios del soporte: Las sustituciones del soporte se mostraron precedentemente. Aunque no se muestran los derivados N-Fmoc y N-Cbz, también fueron preparados. Las síntesis de éstos últimos intermediarios no se muestran en los esquemas, pero se prepararon de manera similar (usando FmocCI) como sus derivados N-Boc. Los siguientes esquemas describen la síntesis de estos valiosos intermediarios. La síntesis de los derivados del ácido 2-amino-pirrol-3-carboxílico se muestra en el Esquema 3. Se hace reaccionar benzoína con SOCI2 en el correspondiente cloruro y luego se hace reaccionar con la amina de la alfa-ceto amina. Como alternativa, ésta última se prepara directamente a partir de benzoína, cuando se calienta la amina en presencia de un ácido más débil (por ejemplo AcOH) en un solvente de alcohol. La amina no es de naturaleza monomérica, en su lugar, es oligomérica (a partir de NMR de masa y protón). La alfa-ceto amina se hace reaccionar con acetilendicarboxilato de dimetilo (DMAD) en MeOH para obtener el producto pirrol con un buen rendimiento. El éster en la posición 2 es hidrolizado selectivamente con 1 equivalente de NaOH acuoso en MeOH y se acidifica con HCl diluido. El ácido resultante es sometido a reordenameinto de Curtius [difenil fosforil azida (DPPA), fer-BuOH, calor). El éster protegido con N-Boc es hidrolizado (NaOH acuoso, calor, luego HCl diluido) en el ácido correspondiente.
Como alternativa, la alfa-ceto amina se hace reaccionar con cianoacetato de etilo para obtener 2-amino-pirrol (Esquema 3) y éste último es hidrolizado y protegido con N-Boc bajo condiciones estándar. Esquema-3: Síntesis del derivado del ácido 2-amino-pirrol-3-carboxílico NC 02Et 1 DPPA, 'BuOH 2 NaOH ac R Las síntesis de los derivados del ácido 3-amino-pirrol-2-carboxílico se muestran en el Esquema 4 y el Esquema 5. La amina se hace reaccionar con ácido alfa-bromo-fenilacético, seguido de tratamiento con cloruro ácido. La amida-ácido resultante es tratada con un dipolarófilo (aril-acetileno) en anhídrido acético para obtener el pirrol. Ésta última es nitrada (HNO3 o sal de nitronio), reducida (níquel Raney, H2, EtOH/THF), hidrolizada (NaOH ac, calor) y protegida en la N (Boc2O, dioxano) sucesivamente para obtener el producto deseado (Esquema 4).
En el esquema 5 se muestra la síntesis del núcleo pirrol cautivo con heteroarilo. La amida-ácida se prepara de manera similar a lo que mostró precedentemente (Esquema 4). El núcleo de pirrol es nitrado (HNO3 de sal de nitronio). Ésta última es entonces reducida, hidrolizada, protegida con N-Boc como se muestra en el Esquema 5. Esguema-5: Síntesis del derivado del ácido 4-(2-piridil)-3-amino-pirrol-2-carboxílico Para la síntesis de los derivados del ácido 4-amino-pirrol-3-carbo?ílico, se ofrecen dos rutas posibles, como se muestra en el Esquema 5 y en el Esquema 6. El alfa-aminoácido se hace reaccionar con un cloruro ácido en piridina para obtener el compuesto N-acilo, que luego se calienta con acetilendicarboxilato de dimetilo (DMAD) en anhídrido acético para obtener el pirrol simétrico esperado. El diácido es hidrolizado selectivamente (1 ,0 equivalentes de NaOH ac; HCl diluido) en el monoácido. Éste último es tratado con difenilfosforilazida (DPPA) [benceno, ter-BuOH, calor] e NaOH ac. [calor; HCl diluido) para obtener el compuesto deseado (Esquema 6). Como alternativa, la amida-ácida se hace reaccionar con propargil éster en anhídrido acético, seguido de nitración en el nitro-ácido (Esquema 6). El grupo nitro es reducido (níquel Raney, H2, EtOH/THF) en la amina, el éster es hidrolizado (NaOH ac.) y la amina es protegida (Boc2O, dioxano) de acuerdo con el Esquema 4. Esguema-6: Síntesis del derivado del ácido 4-amino-pirrol-3-carboxílico heteroarilo En el Esquema 7 se indica un enfoque completamente diferente para la síntesis de los derivados del ácido 4-amino-pirrol-3-carboxílico. Primero, se alquila un beta-ceto éster en la posición alfa y el diceto éster resultante es tratado con una amina para obtener el pirrol-3-carboxilato. Éste último es convertido para obtener el producto deseado como se muestra en el Esquema 6. Esguema-7: Síntesis de ácido 4-amino-pirrol-3-carboxíl¡co (continuación) R = Alquilo, arilo, R'= arilo, alquilo La síntesis del núcleo pirazol se muestra en el Esquema 8. En presencia de una base, se hace reaccionar aril cetona con éster oxalato, seguido de acidificación en el compuesto 1 ,3-diceto. Éste último se hace reaccionar con una hidrazina sustituida para obtener el derivado pirazol-3-carboxilato. La subsiguiente nitración (HNO3 o sal de nitronio), reducción (Níquel Raney, H2), hidrólisis del éster (NaOH ac.) y protección de la amina (Boc2O) permite obtener el compuesto deseado. Esguema-8: Síntesis del derivado del ácido 4-amino-pirazol-3-carboxílico R = Alquilo, arilo, heteroaplo Otra modalidad de los mediadores del RCT usando un soporte de HMG CoA reductasa se basa en nisvastatina, como se muestra más adelante. También se muestra un esquema general para la síntesis de estos compuestos.
AcE-Quin-RNH2 Ace-Quin-rNH2 Acr-Quin-eNH2 AcR-Quin-ENH2 Soporte de HMG-CoA reductasa ApoAl mim?tico 30% para tres pasos 1,56 gramos Bioisosteros usados en las estructuras de los mediadores del RCT Los ejemplos de bioisosteros preferidos que se pueden usar en los mediadores del RCT preferidos se muestran a continuación. Los bioisosteros que contienen un grupo guanidio o amidino sirven para sustituir arginina. Los bioisosteros que contienen un ácido carboxílico sirven para sustituir glutamato. Se contempla cualquier otro un bioisostero que pueda servir para sustituir los aminoácidos básicos, arginina, lisina o histidina, y los aminoácidos ácidos, glutamato y aspartato. Los círculos representan estructuras cíclicas, incluyendo estructuras no aromáticas y aromáticas.
Los siguientes esquemas de síntesis muestran ejemplos de métodos que se pueden usar para sintetizar los mediadores del RCT que contienen bioisosteros. El término "AA" puede representar un soporte lipofílico en los esquemas. Esquema 4 H BOC-N-AA- H2N — AA — Esquema 5 Esquema 6 Análisis de estructura v función La estructura y función de los mediadores del RCT de las modalidades preferidas, incluyendo las formas multiméricas descritas precedentemente, pueden ser evaluadas con el fin de seleccionar compuestos activos. Por ejemplo, los mediadores pueden ser evaluados por su capacidad para formar a-hélices, para unirse a lípidos, para formar complejos con lípidos, para activar LCAT y para promover el eflujo de colesterol, etc. Los métodos y ensayos para analizar la estructura y/o función de los péptidos son bien conocidos en el arte. Los métodos preferidos se proveen en los ejemplos de trabajo, infra. Por ejemplo, los ensayos de dicroismo circular (CD) y de resonancia magnética nuclear (NMR) descritos más adelante se pueden usar para analizar la estructura de los mediadores, en particular el grado de helicidad en presencia de lípidos. La capacidad de unirse a lípidos se puede determinar usando el ensayo de espectroscopia por fluorescencia que se describe, infra. La capacidad de los mediadores para activar LCAT se puede determinar fácilmente usando la activación de LCAT como se describe, infra. Los ensayos in vitro e in vivo que se describen, infra, se pueden usar para evaluar la vida media, distribución, eflujo de colesterol y efectos sobre el RCT. Métodos de síntesis Las modalidades preferidas se pueden preparar usando prácticamente cualquier técnica conocida en el arte para la preparación de péptidos. Por ejemplo, los péptidos se pueden preparar usando síntesis de péptidos convencionales por pasos en solución o en fase sólida. Los mediadores peptídicos semiprotegidos del RCT se pueden preparar usando una síntesis convencional por pasos en solución o en fase sólida (véase, por ejemplo, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., 1997, CRC Press, Boca Ratón Fia., y las referencias citadas en dicha publicación; Sólido Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., 1989, IRL Press, Oxford, Inglaterra, y las referencias citadas en la misma). En la síntesis convencional en fase sólida, la unión del primer aminoácido conlleva la reacción química de su extremo carboxilo-terminal (C-terminal) con una resina derivatizada para formar el extremo carboxilo-terminal del oligopéptido. El extremo alfa-amino del aminoácido se bloquea típicamente con un grupo t-butoxicarbonilo (Boc) o con un grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) para impedir que reaccione el grupo amino que de lo contrario reaccionaría participando en la reacción de acoplamiento. Los grupos de la cadena lateral de los aminoácidos, si son reactivos, también se bloquean (o protegen) con diversos grupos protectores derivados de bencilo en la forma de éteres, tioéteres, esteres y carbamatos. El siguiente paso y los posteriores ciclos repetitivos comprenden el desbloqueo del amino-terminal (N-terminal) de aminoácido unida a la resina (o el residuo terminal de la cadena de péptidos) para eliminar el grupo de bloqueo alfa-amino, seguido de adición química (acoplamiento) del siguiente aminoácido bloqueado. Este proceso se repite por la cantidad de ciclos que sean necesarios para sintetizar toda la cadena peptídica de interés. Después de cada uno de los pasos de acoplamiento y desbloqueo, el péptido unido a la resina se lava cuidadosamente para eliminar todo reactivo residual antes de avanzar hacia el siguiente paso. Las partículas de soporte sólido facilitan la eliminación de reactivos en cualquier paso dado ya que es posible filtrar y lavar rápidamente la resina y el péptido unido a la resina sostenidos en una columna o dispositivo con aberturas tipo poros. Los péptidos sintetizados pueden ser liberados de la resina mediante catálisis acida (típicamente con ácido fluorhídrico o ácido trifluoroacético), que diva al péptido de la resina dejando un grupo amida o carboxilo sobre el aminoácido C-terminal. El clivaje acidolítico también sirve para eliminar a los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos en el péptido sintetizado. Los péptidos terminados se pueden purificar luego utilizando cualquiera de los diversos métodos de cromatografía.
De acuerdo con una modalidad preferida, los mediadores peptídicos y derivados de péptido del RCT fueron sintetizados utilizando métodos de síntesis en fase sólida con química Na-Fmoc. Los aminoácidos protegidos con Na-Fmoc y la resina MBHA amida Rink y la resina Wang se obtuvieron de Novabiochem (San Diego, CA) o Chem-lmpex Intl (Wood Dale, IL). Las demás sustancias químicas y solventes se obtuvieron de las siguientes fuentes: ácido trifluoroacético (TFA), anisol, 1 ,2-etanditiol, tioanisol, piperidina, anhídrido acético, ácido 2-naftoico y ácido pivaloico (Aldrich, Milwaukee, Wl), HOBt y NMP (Chem-lmpex Intl, Wood Dale, IL), diclorometano, metanol y solventes de grado HPLC de Fischer Scientific, Pittsburgh, PA. La pureza de los péptidos se verificó por LC/MS. La purificación de los péptidos se efectuó usando un sistema de HPLC preparativa (Agilent Technologies, Serie 1100) con una columna de sílice unido a Cía (columna preparativa Tosoh Biospec, ODS-80TM, Dim: 21 ,5 mm x 30 cm). Los péptidos se eluyeron con un sistema de gradiente [50% a 90% de solvente B (acetonitrilo:agua 60:40 con TFA 0,1%)]. Todos los péptidos fueron sintetizados por pasos utilizando el método de fase sólida, con una resina MBHA amida Rink (0,5-0,66 mmol/g) o una resina Wang (1 ,2 mmol/g). Los grupos protectores de la cadena lateral eran Arg (Pbf), Glu (OtBu) y Asp (OtBu). Cada aminoácido protegido con Fmoc fue acoplado a esta resina usan un exceso de 1 ,5 a 3 veces de aminoácidos protegidos. Los reactivos de acoplamiento fueron N-hidroxibenzotriazol (HOBt) y diisopropil carbodiimida (DIC), y el acoplamiento se monitoreó con la prueba de ninhidrina. El grupo Fmoc se eliminó mediante tratamiento con piperidina 20% en NMP durante 30-60 minutos y luego sucesivos lavados con CH2CI2, TEA 10% en CH2CI2, metanol y CH2CI2. Los pasos de acoplamiento eran seguidos de acetilación o con otros grupos protectores según necesidad.
Se usó una mezcla de TFA, tioanisol, etanditiol y anisol (90: 2, v/v) (4-5 horas a temperatura ambiente) para clivar al péptido del complejo péptido-resina y eliminar todos los grupos protectores de las de LAS cadenas laterales. La mezcla cruda de péptidos se filtró con un embudo sinterizado, que se lavó con TFA (2-3 veces). El filtrado se concentró hasta obtener un jarabe espeso y se agregó éter frío. El péptido precipitó como un sólido blanco después de mantenerlo durante la noche en el congelador y posterior centrifugación. La solución se decantó y el sólido se lavó cuidadosamente con éter. El péptido crudo resultante se disolvió en solución amortiguadora (acetonitrilo: agua 60: 40 con TFA 0,1 %) y se secó. El péptido crudo se purificó por HPLC usando una columna preparativa C-18 (fase reversa) con un sistema de gradiente de 50 - 90% B en 40 minutos [solución amortiguadora A: agua que contenía TFA 0,1% (v/v), solución amortiguadora B: acetonitrilo: agua (60: 40) que contenía TFA 0,1% (v/v)]. Las fracciones puras se concentraron sobre un Speedvac. Los rendimientos variaron entre 5% y 20%. Ac indica acetilado. BIP indica bifenilalanina. Como alternativa, los péptidos de las modalidades preferidas se pueden preparar mediante una condensación segmentada, es decir, la unión de pequeñas cadenas peptídicas constitutivas para formar una cadena peptídica más grande, como se describe, por ejemplo, en Liu et al., 1996, Tetrahedron Lett. 37: 933-936; Baca, et al., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117: 1881-1887; Tam et al., 1995, Int. J. Peptide Protein Res. 45; 209-216; Schnolzer y Kent, 1992, Science 256: 221-225; Liu y Tam, 1994, J. Am. Chem. Soc. 116(10): 4149-4153; Liu y Tam, 1994, PNAS. EE.UU. 91 ;6584-6588; Yamashiro y Li, 1988, Int. J. Peptide Protein Res. 31 :322-334; Nakagawa et al., 1985, J. Am Chem. Soc. 107: 7087-7083; Nokihara et al., 1989, Peptides 1988: 166-168; Kneib-Cordonnier et al., 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35;527-538; cuyos contenidos se incorporan por completo en este documento a modo de referencia). Otros métodos que son útiles en la síntesis de los péptidos de las modalidades preferidas se pueden consultar en Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:7087-7092. Cuando los péptidos son producidos mediante condensación de segmentos, es posible aumentar significativamente la eficacia de acoplamiento del paso de condensación incrementando el tiempo de acoplamiento. Típicamente, el incremento del tiempo de acoplamiento da como resultado una mayor racemización del producto (Sieber et al., 1970, Helv. Chim. Acta 53:2135-2150) Los mediadores del RCT que contienen grupos que bloquean los extremos N- y/o C-terminales se pueden preparar usando técnicas estándar de química orgánica. Por ejemplo, los métodos de acetilación del extremo N-terminal de un péptido o de amidación o esterificación del extremo C-terminal de un péptido son bien conocidos en el arte. Las maneras de efectuar otras modificaciones por los extremos N- y/o C-terminales resultarán evidentes para los especialistas en el arte, así como las maneras para proteger cualquier funcionalidad de las cadenas laterales, como puede ser necesario para unir grupos bloqueantes terminales. Asimismo, por ejemplo, los métodos para desproteger un grupo protector del extremo N-terminal de un péptido o del extremo C-terminal de un péptido son bien conocidos en el arte. Los modos para efectuar otras modificaciones por el extremo N y/o C-terminal resultarán evidentes para los especialistas en el arte, así como los modos para desproteger cualquier funcionalidad en las cadenas laterales que pudieran ser necesarias para eliminar los grupos bloqueantes terminales. Las sales aceptables para uso farmacéutico (contraiones) se pueden preparar convenientemente por cromatografía de intercambio iónico u otros métodos que son bien conocidas en el arte. Formulaciones farmacéuticas v métodos de tratamiento Los mediadores del RCT de las modalidades preferidas se pueden usar para tratar cualquier trastorno en animales, en especial mamíferos incluyendo humanos, para los cuales una disminución del colesterol en suero resulta beneficiosa incluyendo, a modo de ejemplo, las afecciones donde un incremento en la concentración sérica de HDL, una activación de la LCAT y la promoción del eflujo de colesterol y el RCT sean beneficiosas. Dichas afecciones incluyen, por ejemplo, hiperlipidemia, y, en especial, hipercolesterolemia, y enfermedades cardiovasculares, tal como aterosclerosis (incluyendo el tratamiento y la prevención de aterosclerosis) y enfermedades de las arterias coronarias; restenosis (por ejemplo, prevención o tratamiento de las placas ateroscleróticas que se desarrollan como consecuencia de procedimientos médicos, tal como angioplastia de balón); y otros trastornos, tal como isquemia y endotoxemia, que a menudo da como resultado un shock séptico. Los mediadores del RCT se pueden usar solos o en terapias combinadas con otras drogas usadas para tratar las afecciones mencionadas. Dichas terapias incluyen, por ejemplo, administración simultánea o consecutiva de las drogas comprometidas. Por ejemplo, en el tratamiento de hipercolesterolemia o aterosclerosis, las formulaciones de mediadores moleculares del RCT pueden ser administradas junto con cualquiera de una o varias de las terapias para disminuir colesterol que actualmente están en uso; por ejemplo, resinas-ácidos biliares, niacina y/o estatinas. Dicho régimen de tratamiento combinado puede producir efectos terapéuticos particularmente benéficos dado que cada droga actúa sobre un blanco diferente en la síntesis y el transporte del colesterol; es decir, las resinas-ácidos biliares afectan el reciclaje de colesterol, el quilomicrón y la población de LDL; la niacina afecta primariamente la población de VLDL y de LDL; las estatinas inhiben la síntesis de colesterol, disminuyendo la población de LDL (y tal vez incrementando la expresión de receptores de LDL); en tanto los mediadores del RCT afecta el RCT, incrementan la HDL, incrementan la actividad LCAT y promueven el eflujo de colesterol. Los mediadores del RCT se pueden usar junto con fibratos para tratar hiperlipidemia, hipercolesterolemia y/o enfermedades cardiovasculares tal como aterosclerosis. Los mediadores del RCT se pueden usar en combinación con los agentes antimicrobianos y anti-inflamatorios utilizados actualmente para tratar el shock séptico inducido por endotoxinas. Los mediadores del RCT se pueden formular como composiciones basadas en mediadores o como complejos de mediador-lípidos que pueden ser administrados a los sujetos de diversas maneras, preferentemente mediante administración por vía oral, para distribuir los mediadores del RCT en la circulación. Los ejemplos de formulaciones y regímenes de tratamiento se describirán más adelante. En otra modalidad preferida, se proveen métodos para aliviar y/o prevenir uno o más síntomas de hipercolesterolemia y/o aterosclerosis. Los métodos comprenden preferentemente la administración a un organismo, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano, de uno o más de los mediadores de las modalidades preferidas (o miméticos de dichos mediadores). El o los péptidos pueden ser administrados, según se describe aquí, de acuerdo con cualquiera de los numerosos métodos estándar incluyendo, por ejemplo inyección, supositorio, aerosol nasal, implante de liberación en el tiempo, parche transdérmico y semejantes. En una modalidad particularmente preferida, el o los péptidos se administran por vía oral (por ejemplo, como un jarabe, cápsula o tableta). Los métodos comprenden la administración de un solo mediador de las modalidades preferidas o la administración de dos o más mediadores diferentes. Los mediadores se pueden proveer como formas monoméricas o diméricas, oligoméricas o poliméricas. En determinadas modalidades, las formas multiméricas pueden comprender monómeros asociados (por ejemplo ligados iónicamente o hidrofóbicamente), en tanto otras formas multiméricas comprenden monómeros ligados de forma covalente (ligados directamente o a través de un ligador). En tanto las modalidades preferidas se describen con respecto al uso en humanos, también son adecuados para animales, por ejemplo para uso veterinario. Por consiguiente, los organismos preferidos incluyen, por ejemplo seres humanos, primates no humanos, caninos, equinos, felinos, porcinos, ungulados, lagomorfos y semejantes. Los métodos de las modalidades preferidas no se limitan a los animales humanos o no humanos que presentan uno o más síntomas de hipercolesterolemia y/o aterosclerosis (por ejemplo, hipertensión, formación y ruptura de placas, reducción en eventos clínicos tal como un ataque cardíaco, angina o un accidente cerebrovascular, niveles altos de la lipoproteína de baja densidad, niveles altos de la lipoproteína de muy baja densidad o proteínas inflamatorias, etc.), sino que son de utilidad en un contexto profiláctico. Por consiguiente, los péptidos de las modalidades preferidas (o miméticos de los mismos) pueden administrarse a los organismos para prevenir el inicio/desarrollo de uno o más síntomas de hipercolesterolemia y/o aterosclerosis. Los sujetos particularmente preferidos en este contexto son sujetos que presentan uno o más factores de riesgo de aterosclerosis (por ejemplo, antecedentes familiares, hipertensión, obesidad, alto consumo de alcohol, tabaquismo, nivel alto de colesterol en sangre, nivel alto de triglicéridos en sangre, niveles elevados de LDL, VLDL, IDL o bajos de HDL en sangre, diabetes o antecedentes familiares de diabetes, niveles altos de lípidos en sangre, ataque cardíaco, angina o accidente cerebrovascular, etc.). Las modalidades preferidas incluyen las formulaciones farmacéuticas y el uso de dichas preparaciones en el tratamiento de hiperlipidemia, hipercolesterolemia, enfermedad cardíaca coronaria, aterosclerosis, diabetes, obesidad, mal de Alzheimer, esclerosis múltiple, afecciones relacionadas con la hiperlipidemia tal como inflamación y otras afecciones tal como una endotoxemia causante de shock séptico. En una modalidad preferida, los mediadores peptídicos del RCT se pueden sintetizar o elaborar usando cualquiera de las técnicas descriptas en las secciones anteriores referidas a síntesis y purificación de mediadores del RCT. Se pueden elaborar preparaciones estables con una prolongada vida en estante por liofilización de los péptidos, ya sea para preparar volúmenes para su reformulación o para preparar alícuotas o unidades de dosificación individuales que pueden ser reconstituidos por rehidratación con agua estéril o una solución amortiguadora estéril apropiado antes de su administración a un sujeto. En otra modalidad preferida, los mediadores del RCT se pueden formular y administrar como un complejo de mediador-lípido. Este enfoque presenta algunas ventajas dado que el complejo debería tener una mayor vida media en circulación, particularmente cuando el complejo es de tamaño y densidad similares a la HDL, y en especial las poblaciones pre-ß-1 o pre-ß-2 HDL. Los complejos de mediador-lípido se pueden preparar convenientemente mediante cualquiera de los numerosos métodos que se describen más adelante. Las preparaciones estables que tienen una prolongada vida en estante se pueden obtener por liofilización, el procedimiento de co-liofilización que se describirá más adelante constituye el enfoque preferido. Los complejos de péptidos-lípidos liofilizados se pueden usar para preparar volúmenes para una reformulación farmacéutica o para preparar alícuotas o unidades de dosificación individuales que pueden ser reconstituidos por rehidratación con agua estéril o una solución amortiguada apropiada antes de su administración a un sujeto. Se puede emplear cualquiera de los diversos métodos bien conocidos por los especialistas en el arte para preparar las vesículas o complejos de mediador-lípido. Para tal fin, se puede usar cualquiera de las numerosas técnicas disponibles para preparar liposomas o proteoliposomas. Por ejemplo, el mediador se puede cosonicar (usando una sonda o baño sonicador) con los lípidos apropiados para formar complejos. Como alternativa, el mediador se puede combinar con vesículas de lípidos preformados, dando como resultado la formación espontánea de los complejos de mediador-lípido. En aún otra alternativa, los complejos de mediador-lípido se pueden formar con un método de diálisis con detergente; por ejemplo, se dializa una mezcla de mediador, lípido y detergente para eliminar el detergente y reconstituir o formar los complejos de mediador-lípido (por ejemplo, véase Joñas et al., 1986, Methods in Enzymol. 128:553-582). Aunque los enfoques anteriores son factibles, cada método presenta sus propios problemas peculiares de producción en términos de costo, rendimiento, reproducibilidad y seguridad. De acuerdo con un método preferido, el péptido y lípido se combinan en un sistema de solventes que co-solubiliza cada ingrediente y que puede ser eliminado por completo mediante liofilización. Para tal fin, se deben seleccionar cuidadosamente pares de solventes para asegurar la co- solubilidad de ambos el mediador anfipático y el lípido. En una modalidad, el o los mediadores o derivados/análogos de los mismos, a incorporar en las partículas se pueden disolver en un solvente acuoso u orgánico o una mezcla de solventes (solvente 1 ). El componente (fosfo)lípido se disuelve en un solvente acuoso u orgánico o en una mezcla de solventes (solvente 2) que sea miscible con el solvente 1 , y se mezclan las dos soluciones. Como alternativa, el péptido y lípido se pueden incorporar en un sistema de co-solventes; es decir, una mezcla de los solventes miscibles. Primero se determina empíricamente la proporción adecuada de mediador a lípidos para que los complejos resultantes posean las propiedades físicas y químicas apropiadas; es decir, habitualmente (pero no necesariamente) similares en cuanto a tamaño a HDL. La mezcla resultante se congela y se liofiliza hasta sequedad. A veces se debe agregar un solvente adicional a la mezcla para facilitar la liofilización. Este producto liofilizado se puede guardar por períodos prolongados y permanecerá estable. El producto liofilizado puede ser reconstituido con el fin de obtener una solución o suspensión del complejo de mediador-lípido. Para tal fin, el polvo liofilizado se puede rehidratar con una solución acuosa hasta un volumen adecuado (a menudo 5 mg de péptido/ml que es conveniente para una inyección intravenosa). En una modalidad preferida, el polvo liofilizado es rehidratado con solución amortiguadora fosfato salina o solución salina fisiológica. Posiblemente sea necesario agitar o vortexear la mezcla para facilitar la rehidratación, y en la mayoría de los casos, el paso de reconstitución se deberá llevar a cabo a una temperatura igual o mayor que la temperatura de transición de fases del componente lípido de los complejos. En el transcurso de unos minutos, se obtiene una preparación clara de complejos de lípido-proteína reconstituidos. Se puede caracterizar una alícuota de la preparación reconstituida resultante para confirmar que los complejos de la preparación tengan la distribución de tamaño deseada; por ejemplo, la distribución de tamaño de la HDL. Para tal fin se puede usar cromatografía por filtración sobre gel. Por ejemplo, se puede usar un sistema de cromatografía por filtración sobre gel Superóse 6 FPLC de Pharmacia. La solución amortiguadora usada contiene NaCI 150 mM en solución amortiguadora de fosfato 50 mM, pH 7,4. El volumen de muestra típico comprende entre 20 y 200 mícrolítros de complejos que contienen 5 mg de mediador/ml. La velocidad de flujo de la columna es de 0,5 ml/min. Preferentemente se usa una serie de proteínas de peso molecular y diámetro de Stokes conocido, así como HDL humana como estándares para calibrar la columna. Los complejos de proteínas y lipoproteína se monitorean por absorbancia o dispersión de luz de longitud de onda de 254 ó 280 nm. Los mediadores del RCT de las modalidades preferidas pueden formar complejos con diversos lípidos, incluyendo lípidos y/o fosfolípidos saturados, insaturados, naturales y sintéticos. Los lípidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfolípidos de cadena de alquilo pequeña, fosfatidilcolina de huevo, fosfatidilcolina de soja, dipalmitoílfosfatidilcolina, dimiristoílfosfatidilcolina, diestearoílfosfatidilcolina 1 -miristoíl-2-palmitoílfosfatidilcolina, 1 -palmitoíl-2-miristoílfosfatidilcolina, 1 -palmitoíl-2-estearoílfosfatidilcolina, 1 -estearoíl-2-palmitoílfosfatidilcolina, dioleoílfosfatidilcolina dioleoílfosfatidiletanolamina, dilauroílfosfatidilglicerol fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, esfingomielina, esfingolípidos, fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol, dimiristoílfosfatidilglicerol, dipalmitoílfosfatidilglicerol, diestearoílfosfatidilglicerol, dioleoílfosfatidilglicerol, ácido dimiristoílfosfatídico, ácido dipalmitoílfosfatídico, dimiristoílfosfatidiletanolamina, dipalmitoílfosfatidiletanolamina, dimiristoílfosfatidilserina, dipalmitoílfosfatidilserina, fosfatidilserina de cerebro, esfingomielina de cerebro, dipalmitoílesfingomielina, diestearoílesfingomielina, ácido fosfatídico, galactocerebrósido, gangliósidos, cerebrósidos, dilaurilfosfatidilcolina, (1 ,3)-D-manosil-(1 ,3)diglicérido, aminofenilglicósido, glicolípidos de 3-colesteril-6'-(glicosiltio)hexil éter y colesterol y derivados de los mismos. La formulación farmacéutica de las modalidades preferidas contienen a los mediadores del RCT o al complejo de mediador-lípido como ingrediente activo en un vehículo aceptable para uso farmacéutico adecuado para una administración y distribución in vivo. Como los mediadores pueden contener extremos terminales y/o cadenas laterales ácidos y/o básicos, los mediadores se pueden incluir en las formulaciones ya sea en la forma de ácidos o bases libres, o en la forma de sales aceptables para uso farmacéutico. Las preparaciones inyectables incluyen suspensiones, soluciones o emulsiones estéril del ingrediente activo en vehículos acuoso u oleosos. Las composiciones también pueden contener agentes de formulación, tal como agentes de suspensión, estabilizadores y/o de dispersión. Las formulaciones para inyecciones se pueden presentar en formas de dosificación unitarias, por ejemplo, en ampollas o en contenedores de múltiples dosis, y pueden contener conservantes. Como alternativa, la formulación inyectable se puede proveer en polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado incluyendo, a modo de ejemplo, agua libre de pirógenos estéril, solución amortiguadora, solución de dextrosa, etc., en el momento del uso. Para tal fin, los mediadores del RCT pueden ser liofilizados o se puede preparar un complejo de mediador-lípido co-liofilizado. Las preparaciones guardadas se pueden suministrar en formas de dosificación unitarias y reconstituirlas antes de su uso in vivo.
Para una administración prolongada, el ingrediente activo se puede formular como una preparación depot, para su administración por implantes; por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular. Por consiguiente, por ejemplo, el ingrediente activo se puede formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o con resinas de intercambio iónico o como derivados escasamente solubles; por ejemplo, como una forma salina escasamente soluble de los mediadores del RCT. Como alternativa, se pueden usar sistemas de administración transdérmicos elaborados como un disco o parte adhesivo que lentamente libera el ingrediente activo para su absorción percutánea. Para tal fin, se pueden usar mejoradores de la permeación para facilitar la penetración transdérmica del ingrediente activo. Se puede obtener un beneficio particular incorporando los mediadores del RCT de las modalidades preferidas o el complejo de péptidos-lípidos en un parche de nitroglicerina para su uso en pacientes con enfermedad cardíaca isquémica e hipercolesterolemia. Para la administración por vía oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas utilizando medios convencionales con excipientes aceptables para uso farmacéutico, tal como agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); rellenos (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o glicolato sódico de almidón); o humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Las tabletas se pueden recubrir utilizando métodos bien conocidos en el arte. Las preparaciones líquidas para una administración por vía oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas se pueden preparar utilizando medios convencionales con aditivos aceptables para uso farmacéutico, tal como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas hidrogenadas comestibles); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, esteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales amortiguadoras, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes, según corresponda. Las preparaciones para una administración por vía oral se pueden formular adecuadamente para obtener una liberación controlada del compuesto activo. Para una administración por vía bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o grageas formuladas de manera convencional. Para las rutas de administración rectal y vaginal, el ingrediente activo se puede formular como soluciones (para enemas de retención), supositorios o ungüentos. Para una administración por inhalación, el ingrediente activo se puede administrar convenientemente en la forma de un aerosol presentado en envases presurizados o para nebulizar, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede ser determinada con una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador se pueden formular para que contengan una mezcla de polvos del compuesto y una base adecuada para el polvo, tal como lactosa o almidón.
Las composiciones se pueden presentar, si se deseara, como un envase o dispositivo dosificador que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen al ingrediente activo. El envase puede comprender, por ejemplo, papel metálico o plástico, tal como un envase de blisteres. Junto con el envase o dispositivo dosificador se puede adjuntar las instrucciones de administración. Los mediadores del RCT y/o los complejos de mediador-lípido de las modalidades preferidas se pueden administrar por cualquier ruta adecuada que asegura su biodisponibilidad en la circulación. Esto se puede lograr con las rutas de administración parenterales, incluyendo inyección intravenosa (IV), intramuscular (IM), intradérmica, subcutánea (SC) e intraperitoneal (IP). Sin embargo, se pueden usar otras rutas de administración. Por ejemplo, la absorción a través del tracto gastrointestinal se puede lograr con las rutas de administración orales (incluyendo, por ejemplo, las rutas de ingestión, bucal y sublingual) siempre que se utilicen las formulaciones apropiadas (por ejemplo, recubrimientos entéricos) para evitar o minimizar la degradación del ingrediente activo, por ejemplo, en los ambientes severos de la mucosa oral, estómago y/o intestino delgado. La administración oral tiene la ventaja de ser fácil de usar y por ello mejora el cumplimiento. Como alternativa, se puede usar la administración por el tejido mucoso, tal como los modos de administración vaginal y rectal, con el fin de evitar o minimizar la degradación en el tracto gastrointestinal. En aún otra alternativa, las formulaciones de las modalidades preferidas pueden ser transmitidas por vía transcutánea (por ejemplo, transdérmica) o por inhalación. Se considera que la ruta preferida puede variar según la afección, edad y cumplimiento del receptor. La dosis real de los mediadores peptídicos del RCT o del complejo de péptidos-lípidos empleada varía según la ruta de administración y debe ajustarse para obtener concentraciones circulantes en plasma entre 1 ,0 mg/l y 2 g/l. Los datos obtenidos en los sistemas de modelos en animales descritos en la presente muestran que los agonistas de la ApoA-l de las modalidades preferidas se asocian con el componente HDL y tienen una vida media proyectada en humanos de cinco días aproximadamente. Por consiguiente, en una modalidad, los mediadores del RCT pueden ser administrados por inyección a dosis entre 0,5 mg/kg y 100 mg/kg una vez por semana. En otra modalidad, se pueden mantener los niveles séricos deseados por infusión continua o por infusión intermitente que provee aproximadamente entre 0,1 mg/kg/hs y 100 mg/kg/hs. La toxicidad y eficacia terapéutica de los diversos mediadores del RCT pueden ser determinados usando los procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales experimentales para determinar la LD50 (dosis letal para un 50% de la población) y la ED5o (dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar con la relación LD50 /ED50. Se prefieren los agonistas de ApoA-l que exhiban grandes índices terapéuticos. Otros usos Los agonistas de los mediadores del RCT de las modalidades preferidas se pueden usar en ensayos in vitro para medir la HDL sérica, por ejemplo, con fines de diagnóstico. Dado que los mediadores del RCT se asocian con el componente HDL y LDL del suero, los agonistas se pueden usar como "marcadores" de la población de HDL y LDL. Más aún, los agonistas se pueden usar como marcadores de la subpopulación de HDL que es eficaz en el RCT. Para tal fin, es posible agregar o mezclar el agonista con el suero de una muestra de suero del paciente; después de un tiempo de incubación apropiado, se puede evaluar el componente HDL detectando los mediadores del RCT incorporados. Esto se puede llevar a cabo usando agonistas marcados (por ejemplo, marcas radioactivas, marcas fluorescentes, marcas enzimáticas, colorantes, etc.) o con ¡nmunoensayos usando anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo) específicos del agonista. Como alternativa, se pueden usar agonistas marcados en procedimientos de generación de imágenes (por ejemplo, barridos CAT, barridos MRI) para visualizar el sistema circulatorios o para monitorear el RCT o para visualizar la acumulación de HDL en depósitos de grasas, lesiones ateroscleróticas, etc. (donde el HDL deberá ser activo en el eflujo de colesterol). Ensayos para el análisis de mediadores del transporte inverso de colesterol Ensayo de activación de LCAT Los mediadores del RCT de acuerdo con modalidades preferidas pueden ser evaluados por su eficacia clínica potencial empleando diversos ensayos in vitro, por ejemplo, por su capacidad para activar LCAT in vitro. En el ensayo LCAT, se preincubaron vesículas de sustrato (pequeñas vesículas unilamelares o "SUV") compuestas de fosfatidilcolina de huevo (EPC) o 1 -palmitoíl-2-oleíl-fosfatidil-colina (POPC) y colesterol marcado radioactivamente con masas equivalentes de péptido o de ApoA-l (aislada de plasma humano). La reacción se inició con la adición de LCAT (purificada a partir de plasma humano). La ApoA-l nativa, que se utilizó como control positivo, representa un 100% de actividad de activación. La "actividad específica" (es decir, unidades de actividad (activación LCAT)/unidad de masa) de los mediadores moleculares se puede calcular como la concentración de mediador que permite alcanzar la activación máxima de LCAT. Por ejemplo, se puede evaluar una serie de concentraciones de péptido (por ejemplo, una dilución limitante) para determinar la "actividad específica" del péptido: la concentración a la cual alcanza la activación máxima de LCAT (es decir, porcentaje de conversión de colesterol en éster de colesterol) en un momento específico en el ensayo (por ejemplo, 1 hs). Cuando se gráfica el porcentaje de conversión de colesterol, por ejemplo, a 1 hs, contra la concentración de péptido usada, la "actividad específica" se puede identificar como la concentración de péptido que permite alcanzar un plateau en la curva trazada. Preparación de vesículas de sustrato Las vesículas usadas en el ensayo LCAT son SUV compuestas de fosfatidilcolina de huevo (EPC) o 1-palmitoíl-2-oleíl-fosfatidilcolina (POPC) y colesterol con una relación molar de 20:1. Para preparar una solución madre de vesículas suficiente para 40 ensayos, se disuelven 7,7 mg de EPC (o 7,6 mg de POPC; 10 µmol), 78 µg (0,2 µmol) de 4-14C-colesterol, 116 µg de colesterol (0,3 µmol) en 5 ml de xileno y se liofilizan. A continuación, se agregan 4 ml de solución amortiguadora de ensayo al polvo seco y se sónica bajo atmósfera de nitrógeno a 4 °C. Condiciones de sonicación: sonicador Branson 250, punta de 10 mm, 6?5 minutos; solución amortiguadora de ensayo: Tris 10 mM, NaCI 0,14 M, EDTA 1 mM, pH 7,4. La mezcla sonicada es centrifugada 6 veces durante 5 minutos por vez a 14.000 rpm (16.000?g) para eliminar las partículas de titanio. La solución clara resultante se usa en el ensayo enzimático. Purificación de LCAT Para la purificación de LCAT, se usa el tratamiento de plasma humano con sulfato de dextrano/Mg2+ para obtener suero deficiente en lipoproteínas (LPDS), que luego es sometido a cromatografía con Fenilsefarosa, Affigelblue, Concanavalina A sefarosa y cromatografía de afinidad anti-ApoA-l. Preparación de LPDS Para preparar LPDS, agregar 500 ml de plasma a 50 ml de una solución de sulfato de dextrano (PM = 500.000). Agitar durante 20 minutos. Centrifugar durante 30 minutos a 3000 rpm (16.000?g) a 4 °C. Usar el sobrenadante (LPDS) para una purificación adicional (aproximadamente 500 ml). Cromatografía con fenilsefarosa Se usaron los siguientes materiales y condiciones para la cromatografía con fenilsefarosa. Fase sólida: fenilsefarosa de flujo rápido, de grado sust. alto, columna Pharmacia: XK26/40, altura del lecho de gel: 33 cm, V = aproximadamente 175 ml; velocidades de flujo: 200 ml/hs (muestra); de lavado: 200 ml/hs; elución (solución amortiguadora): 80 ml/hs; solución amortiguadora (agua destilada): Tris 10 mM, NaCI 140 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, azida sódica 0,01 %. La columna se equilibró con solución amortiguadora-Tris, se agregaron 29 g de NaCI a 500 ml de LPDS y se aplicaron a la columna. Se lavó con varios volúmenes de solución amortiguadora Tris hasta que la absorción a 280 nm de longitud de onda se encuentra aproximadamente a nivel basal, luego se inició la elución con agua destilada. Se agruparon las fracciones que contenían proteína (tamaño de agrupación: 180 ml) y se usaron para la cromatografía con Affigelblue.
Cromatografía con Affigelblue La agrupación de fenilsefarosa se dializó durante la noche a 4 °C contra Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, azida sódica 0,01 %. El volumen de la agrupación se redujo por ultrafiltración (Amicon YM30) a 50-60 ml y se cargó en una columna Affigelblue. Fase sólida: Affigelblue, Biorad, columna 153-7301 , XK26/20, altura del lecho de gel: 13 cm aproximadamente; volumen de columna: aproximadamente 70 ml. Velocidades de flujo: carga: 15 ml/hs, lavado: 50 ml/hs. La columna se equilibró con solución amortiguadora Tris. Se aplicó la agrupación de fenilsefarosa a la columna. Se comenzó en paralelo para recolectar las fracciones. Se lavó con solución amortiguadora Tris. Las fracciones agrupadas (170 ml) se usaron para la cromatografía con ConA. Cromatografía con ConA La agrupación de Affigelblue se redujo con Amicon (YM30) a 30-40 ml y se dializó contra solución amortiguadora iniciadora ConA (Tris HCl 1 mM, pH 7,4; MgCI2 1 mM, MnCb 1 mM, CaCI2 1 mM, azida sódica 0,01 %) durante la noche a 4 °C. Fase sólida: columna de ConA sefarosa (Pharmacia): XK26/20, altura del lecho de gel: 14 cm (75 ml). Velocidades de flujo: carga 40 ml/hs, lavado (con solución amortiguadora iniciadora): 90 ml/hs; elución: 50 ml/h, metil-D-D-manósido 0,2 M en Tris 1 mM, pH 7,4. Se recolectaron las fracciones de proteínas de las eluciones de manósido (110 ml) y se redujo el volumen por ultrafiltración (YM30) a 44 ml. La agrupación de ConA se dividió en alícuotas de 2 ml, gue se guardaron a -20 °C. Cromatografía de afinidad anti-ApoA-l La cromatografía de afinidad anti-ApoA-l se efectuó con material Affigel-Hz (Biorad), al cual se habían acoplado covalentemente los abs anti-ApoA-l. Columna: XK16/20, V = 16 ml. Las columna se equilibró con PBS, pH 7,4. Se dializaron dos ml de la agrupación ConA durante 2 horas contra PBS antes de cargarla en la columna. Velocidades de flujo: carga: 15 ml/hora, lavado (PBS) 40 ml/hora. Las fracciones proteicas agrupadas (V = 14 ml) se usaron en los ensayos de LCAT. La columna se regeneró con solución amortiguadora de citrato 0,1 M. (pH 4,5) para eluir la A-l unida (100 ml) e inmediatamente después de este procedimiento se volvió a equilibrar con PBS. Farmacocinética de los mediadores del RCT Se pueden usar los siguientes protocolos experimentales para demostrar que los mediadores del RCT son estables en la circulación y que se asocian con el componente HDL del plasma. Síntesis v/o marcación radioactiva de agonistas de los péptidos Se preparó LDL marcado con 125l con el procedimiento de monocloruro de iodo hasta una actividad específica de 500-900 cpm/ng (Goldstein y Brown 1974 J. Biol. Chem. 249:5153-5162). Se determinó la unión y degradación de lipoproteínas de baja densidad en fibroblastos humanos cultivados a valores de actividad específica final de 500-900 cpm/ng como se describe en la literatura (Goldstein y Brown 1974 J. Biol. Chem. 249: En cada caso, >99% de radioactividad era precipitable por incubación de las lipoproteínas a 4 °C con ácido tricloroacético (TCA) 10% (p/vol). El residuo Tyr se unión al extremo N-terminal de cada péptido para permitir la radioiodación del mismo. Los péptidos fueron radioiodados con Na125l (ICN), usando esferas de yodo (Pierce Chemicals) y utilizando el protocolo del proveedor, hasta una actividad específica de 800-1000 cpm/ng. Después de la diálisis, la radioactividad precipitable (10% TCA) de los péptidos siempre era >97%. Como alternativa, los péptidos marcados radioactivamente se podrían sintetizar por acoplamiento de Fmoc-Pro marcado con 14C como aminoácido N-terminal. Se puede usar L-[U-14 C]X, actividad específica 9,25 GBq/mmol, para la síntesis de los agonistas marcados que contienen X. La síntesis se puede llevar a cabo de acuerdo con Lapatsanis, Synthesis, 1983, 671-173. Brevemente, se disolvió L-X 250 µM (29,6 mg) sin marcar en 225 µl de una solución de CO3Na2 9% y se agregó a la solución (9% Na2CO3) de 9,25 MBq (250 µM) de L-X marcado con 14C. El líquido se enfrió hasta 0 °C, se mezcló con N-succinimidilcarbonato de 9-fluorenilmetilo (Fmoc-OSu) 600 µM (202 mg) en 0,75 ml de DMF y se agitó a temperatura ambiente durante 4 hs. A continuación, la mezcla se extrajo con dietiléter (2?5 ml) y cloroformo (1 5 ml), la fase acuosa restante se acidificó con HCl 30% y se extrajo con cloroformo (5?8 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2S04, se separó por filtración y se redujo el volumen bajo flujo de nitrógeno a 5 ml. La pureza se estimó por TLC (CHCI3: MeOH: Hac, 9: 0,1 v/v/v, fase estacionaria HPTLC gel de sílice 60, Merck, Alemania) con detección por UV, por ejemplo, pureza radioquímica: analizador lineal, Berthold, Alemania; los rendimientos de la reacción son aproximadamente del 90% (determinado por LSC). La solución de cloroformo que contiene el 14C-péptido X se usó directamente en la síntesis de los péptidos. Se puede sintetizar automáticamente una resina-péptido que contiene los aminoácidos 2-22, como se describió previamente, y usarla en la síntesis. La secuencia del péptido se determinó por degradación de Edman. El acoplamiento se llevó a cabo como se describió previamente excepto que se usa preferentemente HATU (hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)1 ,1 ,3,3-tetrametiluronio) en lugar de TBTU. Se llevó a cabo manualmente un segundo acoplamiento con Fmoc-L-X no marcado. Farmacocinética en ratones En cada experimento, se puede inyectar 300 - 500 Dg/kg (0,3 - 0,5 mg/kg) [o más, tal como 2,5 mg/kg] de péptido marcado radioactivamente por vía intraperitoneal en ratones que recibían alimento balanceado normal de ratón o la dieta aterogénica modificada de Thomas-Harcroft (que da como resultado valores severamente elevadas de colesterol VLDL e IDL). Se tomaron muestras de sangre a múltiples intervalos de tiempo para evaluar la radioactividad en plasma. Estabilidad en suero humano Se pueden mezclar 100 µg de péptido marcado con 2 ml de plasma humano fresco (a 37 °C) y se puede deslipidar ya sea inmediatamente (muestra control) o después de 8 días de incubación a 37 °C (muestra de prueba). La deslipidación se llevó a cabo extrayendo los lípidos con un volumen igual de 2: 1 (v/v) cloroformo: metanol. Las muestras se cargaron sobre una columna de HPLC C-ia de fase reversa y se eluyó con un gradiente lineal (25-58% sobre un período de 33 min) de acetonitrilo (que contenía TFA 0,1% p). Después de determinar los perfiles de elución se midió la absorbancia (220 nm) y la radioactividad. Formación de partículas tipo pre-ß La HDL humana se puede aislar utilizando ultracentrifugación con gradiente de densidad de KBr a una densidad d = 1 ,21 g/ml para obtener la fracción superior, seguido de cromatografía por filtración sobre gel Superóse 6 para separar la HDL de las otras lipoproteínas. La HDL aislada se ajustó hasta una concentración final de 1 ,0 mg/ml con salina fisiológica basado en el contenido proteico determinado con el ensayo de proteínas de Bradford. Se separó una alícuota de 300 µl de la preparación de HDL aislada y se incubó con 100 µl de péptido marcado (0,2-1 ,0 µg/µl) durante dos horas a 37 °C. Se analizaron múltiples incubaciones separadas incluyendo un blanco que contenía 100 µl de salina fisiológica y cuatro diluciones de péptido marcado. Por ejemplo: (i) péptido 0,20 µg/µl: relación HDL = 1 : 15; (ii) péptido 0,30 µg/µl: relación HDL = 1 : 10; (iii) péptido 0,60 µg/µl: relación HDL = 1 : 5; y (iv) péptido 1 ,00 µg/µl: relación HDL = 1 :3. Después de las dos horas de incubación, se cargó una alícuota de 200 µl de la muestra (volumen total = 400 µl) sobre una columna para filtración por gel Superóse 6 para la separación y análisis de las lipoproteínas y se usaron 100 µl para determinar la radioactividad total cargada. Asociación de mediadores con lipoproteínas humanas La asociación de los mediadores peptídicos con fracciones de lipoproteína humana se puede determinar incubando péptido marcado con cada clase de lipoproteína (HDL, LDL y VLDL) y una mezcla de las diferentes clases de lipoproteínas. Las HDL, LDL y VLDL se aislaron por ultracentrifugación con gradiente de densidad de KBr a d = 1 ,21 g/ml y se purificaron por FPLC con una columna Superóse 6B de exclusión de tamaño (la cromatografía se llevó a cabo con una velocidad de flujo de 0,7 ml/min y una solución amortiguadora de corrida de Tris 1 mM (pH 8), NaCI 115 mM, EDTA 2 mM y NaN3 0,0%). El péptido marcado se incubó con HDL, LDL y VLDL con una relación de péptido: fosfolípido de 1 : 5 (relación ponderal) durante 2 hs a 37 °C. Se mezcló la cantidad requerida de lipoproteína (volúmenes basados en la cantidad necesaria para obtener 1000 µg) con 0,2 ml de solución madre de péptidos (1 mg/ml) y la solución se llevó a 2,2 ml usando 0,9% de NaCl. Después de incubar durante 2 hs a 37 °C, se separó una alícuota (0,1 ml) para determinar la radioactividad total (por ejemplo, por recuento de centelleo líquido o recuento gamma dependiendo del isótopo usado en la marcación), la densidad de la mezcla de incubación restante se ajustó en 1 ,21 g/ml con KBr y las muestras se centrifugaron a 100.000 rpm (300.000 g) durante 24 horas a 4 °C en un rotor TLA 100.3 usando una ultracentrífuga de mesada Beckman. El sobrenadante resultante se fraccionó tomando alícuotas de 0,3 ml de la parte superior de cada muestra para un total de 5 fracciones y se usaron 0,05 ml de cada fracción para el recuento. Las dos fracciones superiores contenían las lipoproteínas, las otras fracciones (3-5) corresponden a proteínas/péptidos en solución. Unión selectiva a lípidos HDL Se incubó plasma humano (2 ml) con 20, 40, 60, 80 y 100 µg de péptido marcado durante 2 hs a 37 °C. Las lipoproteínas se separaron ajustando la densidad en 1 ,21 g/ml y por centrifugación con un rotor TLA 100.3 a 100.000 rpm (300.000 g) durante 36 hs a 4 °C. Se tomaron los 900 µl superiores (en fracciones de 300 µl) para el análisis. Se efectuó un recuento de la radioactividad en 50 µl de cada fracción de 300 µl y luego se analizaron 200 µl de cada fracción por FPLC (columna combinada Superóse 6/Superose 12). Uso de los mediadores del transporte inverso de colesterol en sistemas de modelos con animales La eficacia de los mediadores del RCT de las modalidades preferidas se puede demostrar en conejos u otros modelos de animales adecuados. Preparación de los complejos de fosfolípido/péptido Se prepararon pequeñas partículas discoides que consistían de fosfolípido (DPPC) y péptido utilizando el método de diálisis con colato. El fosfolípido se disolvió en cloroformo y se secó bajo un flujo de nitrógeno. El péptido se disolvió en solución amortiguadora (salina) a una concentración de 1-2 mg/ml. La película de lípido se volvió a disolver en solución amortiguadora que contenía colato (43 °C) y se agregó solución de péptido a una relación ponderal de fosfolípido/péptido 3: La mezcla se incubó durante la noche a 43° C y se dializó a 43 °C (24 hs), temperatura ambiente (24 hs) y 4 °C (24 hs), con tres cambios de solución amortiguadora (volúmenes grandes) a puntos de temperatura. Los complejos se pueden esterilizar con filtración (0,22 µm) para inyectables y almacenar a 4 °C. Aislamiento y caracterización de las partículas de péptido/fosfolípido Las partículas se pueden separar con una columna de filtración de gel (Superóse 6 HR). Se identificó la posición del pico que contenía las partículas midiendo la concentración de fosfolípido en cada fracción. El radio de Stokes se puede determinar a partir del volumen de elución. La concentración de péptido en el complejo se determinó midiendo el contenido de fenilalanina (por HPLC) después de 16 hs de hidrólisis acida. Inyección en conejos Invección en conejos Se inyectó por vía intravenosa una dosis de conejo de fosfolípido/péptido (5 ó 10 mg/kg de peso corporal, expresado como péptido) en una sola inyección de bolo que no excedía 10-15 ml en conejos macho New Zealand Blanco (2,5-3 kg). Los animales fueron ligeramente sedados antes de las manipulaciones. Se tomaron muestras de sangre (recolectadas sobre EDTA) antes y 5, 15, 30, 60, 240 y 1440 minutos después de la inyección. Se determinó el hematocrito (Het) para cada muestra. Las muestras se dividieron en alícuotas y se guardaron a -20 °C antes del análisis. Análisis de los sueros de conejo Se determinaron enzimáticamente los valores de colesterol plasmático total, triglicéridos plasmáticos y fosfolípidos plasmático usando ensayos comerciales, por ejemplo, de acuerdo con los protocolos del proveedor (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania y Biomerieux, 69280, Marcy-L'etoile, Francia). Se pueden determinar los perfiles de las lipoproteínas plasmáticas de las fracciones obtenidas después de la separación del plasma en sus respectivas fracciones lipoproteicas por centrifugación con un gradiente de densidad de sacarosa. Por ejemplo, se pueden recolectar las fracciones y medir los niveles de fosfolípido y colesterol utilizando análisis enzimático convencional en las fracciones correspondientes a las densidades de las lipoproteínas VLDL, ILDL, LDL y HDL. Ejemplos de trabajo Síntesis de mediadores del RCT gue contienen aminoácidos modificados Síntesis de una secuencia peptídica modificada con un grupo lipofílico basado en atorvastatina Esquema 2-(isopropilamino)-1,2-diféniletanona (2): A una solución de benzoína (8,0 g, 37,7 mmol) en EtOH (150 ml) se agregó isopropilamina (2,45 g, 41 ,5 mmol), seguido de AcOH glacial (pocas gotas). La reacción se calentó a 45 °C durante 5 d. Los materiales volátiles se eliminaron en un evaporador rotatorio y se secaron bajo vacío. El material crudo se usó en la siguiente reacción. 1-isopropil-4,5-difenil-1H-pirrol-2,3-dicarboxilato de dimetilo (3): Se agregó acetilendicarboxilato de dimetilo (DMAD, 7,0 g, 57 mmol) a la amina anterior 2 (8,0 g, 32 mmol) en MeOH (100 ml) y la reacción se calentó a reflujo durante la noche bajo argón. La mezcla de reacción se enfrió en baño de hielo y se filtró. Los sólidos se lavaron con MeOH frío (20 ml) y se secaron para obtener el pirrol 3 como un polvo blanco (9,8 g, 82 %). Ácido 3-(metoxicarbonil)-1 -isopropil-4,5-difenil-1 H-pirrol-2 -carboxílico (4): Al diéster 2 (6,12 g, 16,1 mmol) se agregó MeOH (100 ml) y NaOH 1 M (ac, 17,05 ml). La mezcla se calentó a reflujo durante 18 h. Los volátiles se eliminaron en un evaporador rotatorio. El residuo se tomó en agua (100 ml) y se extrajo con éter (2 x 50 ml) y se mantuvo a un lado para obtener el material inicial sin reaccionar. La fase acuosa se acidificó con HCl 4 M en pH ~3 y se extrajo con éter (3 x 60 ml), se lavó con agua (50 ml) y se secó (Na2SO4). Después de evaporación y secado, se obtuvo el monoácido 4 (5,02 g, 85 %) como un sólido blanco. 3-(metoxicarbonil)-1 -isopropil-4,5-difenil-1 H-pirrol-2-ilcarbanr?ato de bencilo (5): A una solución del monoácido 4 anterior (0,1 g, 0,27 mmol) en benceno (3 ml), se agregó trietilamina (45 DI, 0,33 mmol) y difenilfosforilazida (DPPA, 0,091 g, 0,33 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. A continuación, se agregó alcohol bencílico (35 DI, 33 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 15 h. La reacción se dejó enfriar hasta temperatura ambiente y se agregó NaHCO3 5 % (5 ml) y se extrajo con éter (2 x 10 ml). Después de su concentración, se obtuvo el carbamato 5. 2-(4-(N,N'-di(Boc)guanid¡nil)butilcarbamoíl)-1-isopropil-4,5-difenil-1H-pirrol-3-carboxilato de metilo (6):A una solución del ácido 4 (0,1 g, 0,27 mmol) en CH2CI2 (3 ml), se agregó EDCl (0,053 g, 0,27 mmol), HOBt (0,037 g, 0,27 mmol), Et3N (38 DI, 0,27 mmol) y la amina 11 (0,086 g, 0,26 mol) en ese orden y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se diluyó con CH2CI2 (10 ml) y se lavó con NaHCO3 sat. (5 ml), solución salina (5 ml) y se secó (Na2SO4) para obtener la amida 6 (0,165 g, 88,8 %) como un sólido blanco. Acido 2-(4-(N(Boc)guanidinil)butilcarbamoíl)-1 -isopropil-4,5-difenil-1 H-pirrol-3-carboxílico (7): Al éster 6 (0,16 g, 0,237 mmol) se agregó MeOH (10 ml) y NaOH 1 M (ac, 1 ,0 ml). La mezcla se calentó a reflujo durante 18 h. Los volátiles se eliminaron en un evaporador rotatorio. El residuo se tomó en agua (10 ml) se acidificó con HCl 4 M a pH ~3 y se extrajo con éter (3 x 10 ml), se lavó con agua (10 ml) y se secó (Na2SO ). Después de su evaporación y secado, se obtuvo el ácido 7 (0,121 g, 91 %). Ácido 2-(4-(guanidinil)butilcarbamoíl)-1 -isopropil-4,5-difenil-1 H-pirrol- 3-carboxílico.TFA (8): A una solución del compuesto 7 protegido con Boc anterior (0,10 g, 0,178 mmol) en CH2CI2 (3 ml) se agregó ácido trifluoroacético (3 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Los volátiles se eliminaron en un evaporador rotatorio. La cromatografía de fase reversa (CH3CN-H2O/0, TFA 1%) del producto crudo permitió obtener el producto deseado 8 (0,075 g, 91 %) como la sal del ácido trifluoroacético. (S)-(4-(N3-(1-carbamoíl-3-carbodebencilooxipropil)-1-isopropil-4,5-difenil-1 H-pirrol-2,3-dicarboxamido)butil)-N-(Boc)guanidina (9):A una solución del ácido 7 (0,132 g, 0,23 mmol) en CH2CI2 (10 ml), se agregó EDCl (0,051 g, 0,23 mmol), HOBt (0,032 g, 0,23 mmol), Et3N (65 Di, 0,23 mmol) y la amina 12 (0,061 g, 0,22 mol) en ese orden y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se diluyó con CH2CI2 (10 ml) y se lavó con NaHCO3 sat. (5 ml), solución salina (5 ml) y se secó (Na2SO4) para obtener la amida 6 como un sólido blanco (0,127 g, 69 %). (S)-(4-(N3-(1 -carbamoíl-3-carboxipropil)-1 -isopropil-4,5-difeni¡°1 H-pirrol-2,3-dicarboxamido)butil)guanidina.TFA (10): A una solución del benciléster 9 (0,02 g, 0,025 mmol) en EtOH (10 ml), se agregó ácido acético (0,1 ml) y 10 % Pd(OH)2/C (0,01 g) y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno (globo). Después de agitar durante la noche, la reacción se filtró, se lavó con EtOH y se evaporó para obtener el producto crudo, que se tomó en TFA (2 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Después de evaporación y purificación por cromatografía de fase reversa (CH3CN-H2O/0,1 % TFA) el producto deseado se obtuvo como la sal del ácido trifluoroacético.
Síntesis de la secuencia peptídica modificada con un grupo lipofílico basado en nisvastatina 3-carbetoxi-4-hidroxiquinolina (3). Se mezcló la anilina (1)(23 mmol, 2,15 g, 2,1 ml) y malonato de dietiletoximetileno (2) (23 mmol, 5 g, 4.64 mmol) puros y se calentaron a 110 °C durante 2 h y a continuación se dejó enfriar. El enfriamiento produjo la cristalización de la mezcla. Los cristales se fundieron y la solución se agregó a Dowtherm A bajo reflujo (>250 °C, 70 ml) y se calentó a reflujo durante 20 min. La mezcla se enfrió en baño de hielo y se diluyó con hexanos (2 eq v/v) y el sólido se recolectó por filtración, se lavó con hexanos y se recristalizó a partir de EtOH para obtener el producto como un sólido blanco (1 ,58 g, 7,3 mmol) de pureza suficiente para su uso en los pasos subsiguientes. 3-carbetoxi-4-cloroquinolina (4). Se disolvió 3-carbetoxi-4-hidroxiquinolina (3) (1 ,5 g, 7 mmol) en POCI3 (2,2 g, 1 ,32 ml, 14 mmol, 2 eq) y la mezcla se calentó a 110 °C durante 20 min. La mezcla se vertió en una mezcla de NH3 acuoso (6 ml) y hielo (24 ml) y se agitó hasta que estaba completamente granulado. La mezcla se extrajo con éter (3 X 25 ml) y las capas orgánicas se combinaron, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron para obtener 1 ,44 g de aceite que cristalizó con el enfriamiento. El producto se usó tal como estaba en los pasos subsiguientes. 4-(4-aminobutilamino)quinolin-3-carboxilato de etilo (6). A una solución de 3-carbetoxi-4-cloroquinolina (4) (0,5 g, 2 mmol) en tolueno (10 ml) se agregó 1 ,4-diaminobutano (5) (10 eq, 21 mmol, 1 ,85 g) y la mezcla se calentó a 110 °C durante 1 ,5 h. La solución caliente se filtró para eliminar el sólido en suspensión y a continuación se concentró bajo presión reducida. El aceite se diluyó con H2O y se extrajo con DCM. La capa orgánica se secó (MgSO ) y se concentró para obtener un aceite que cristalizó después de 30 min bajo vacío alto con una pureza suficiente para utilizarlo en el paso siguiente (4767 mg, 1 ,66 mmol, 79%). 4-(3-(etoxicarbonil)quinolin-4-ilamino)butilcarbamato de ter-butilo (7).A una solución de 4-(4-aminobutilamino)quinolin-3-carboxilato de etilo (6) (2,5 g, 8,7 mmol) en DCM seco (60 ml) se agregó (Boc)2 (1 eq, 8,7 mmol, 1 ,9 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 h.La solución se lavó con Na2CO32 M, H2O, NaCI sat., se secó (MgSO4) y se concentró para obtener el producto como un aceite amarillo (4 g, 10,5 mmol) de pureza suficiente para su uso en los pasos siguientes. Ácido 4-(4-ter-butoxicarbonilamino-butilamino)-quinolin-3-carboxílico (8). sSeq calentó una solución de 4-(3-(etoxicarbonil)quinolin-4-ilamino)butilcarbamato de ter-butilo (7) en KOH 5% (100 ml en EtOH anhid.) a reflujo durante 2 h. La solución se concentró y el residuo se disolvió en H2O y se acidificó hasta pH ~7 con HCl (acuoso 20%) y el sólido se recolectó por filtración y se secó para obtener el producto como un sólido en polvo blanco (2,76 g, 7.6 mmol) que se usó en los pasos siguientes. Ácido 4-{[4-{4-amino-butilamino}-quinolin-3-carbonil]-arn¡no}-4-carbamoíl-butírico (9). Se introdujo D-Glu(OtBu) unido a la resina Rink Amida MBHA (2 g, 1 ,32 mmol), ácido 4-(4-ter-butoxicarbonilam¡no-butilamino)-quinolin-3-carboxílico (8) (2 eq, 2,64 mmol, 950 mg) y PyBop (2,64 mmol, 1 ,37 g), todos secos, en un balón y se disolvieron en NMP (25 ml). La solución se agitó durante 18 h y a continuación se filtró. El sólido se lavó con DCM y a continuación con MeOH (3X alternando cada uno). El sólido se suspendió en TFA (9,8 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La resina se eliminó por filtración y el filtrado se concentró hasta obtener un aceite. El aceite se trituró con éter y el éter se decantó para obtener un sólido blanco que se purificó por HPLC (de fase reversa, C18, H2O, acetonitrilo, TFA como eluyentes) para obtener el producto como un sólido blanco como la sal TFA después de liofilización (0,5 mmol, 38%, 326 mg) P.f.: 108 °C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d 8,96 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 8,72 (bs, 1 H), 8,58 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,94 (m, 2H), 7,71 (m, 4H), 7,63 (s, 1 H), 7,18 (s, 1 H). 4,35 (m, 1 H), 2,22 (bs, 2H), 2,37(m, 2H), 1 ,99 (m, 2H), 1 ,75 (m, 2H), 1 ,61 (m, 2H) EIMS m/z M+1 388,7. Anal. (C, H, N + 2TFA ) Se pueden efectuar muchas modificaciones y variaciones de las modalidades descritas en la presente sin apartarse del alcance, como resultará evidente para el especialista en el arte. Las modalidades específicas descritas en la presente solamente se ofrecen a modo de ejemplo. Tal como se utiliza en la presente, el término "completamente protegido" se refiere a una modalidad preferida en la cual el amino terminal y el carboxilo terminal comprenden grupos protectores. Tal como se utiliza en la presente, el término "semiprotegido" se refiere a una modalidad preferida en la cual uno entre el amino terminal o carboxilo terminal comprende un grupo protector o se ha eliminado uno entre un grupo amino protegido o un grupo carboxilo protegido. Por ejemplo, en un análogo de aminoácido semiprotegido sin un grupo protector de amina, falta el grupo amino en la estructura de aminoácido tradicional. Asimismo, en un análogo de aminoácido semiprotegido sin el carboxilo terminal, falta el carboxilo terminal en la estructura de aminoácido tradicional. Tal como se utiliza en la presente, el término "desprotegido" o "completamente desprotegido" se refiere a una modalidad preferida en la cual ninguno entre el amino terminal y el carboxilo terminal comprenden grupos protectores o fueron eliminados ambos grupo amino protegido y grupo carboxilo protegido. Por ejemplo, en un análogo de aminoácido desprotegido sin un grupo protector de amina y carboxilo terminal, falta el grupo amino y carboxilo terminales en la estructura de aminoácido tradicional. Un análogo de aminoácido es un derivado estructural de un aminoácido que difiere del mismo en al menos un solo elemento. Como tales las versiones "semiprotegida" y "desprotegida" pueden ser análogos de aminoácidos dado que estas versiones varían de la estructura tradicional de aminoácido porque les falta al menos un elemento, tal como un grupo amino o carboxilo terminal. Los ejemplos de bioisosteros de ácido carboxílico de acuerdo con modalidades preferidas de la presente invención incluyen: Carboxylic Acid Bioisosteres (R = H/aikyi) Los ejemplos de bioisosteros de grupos básicos (por ejemplo, guanidina de arginina) de acuerdo con modalidades preferidas de la presente invención incluyen: Síntesis de mediadores del RCT gue contienen aminoácidos modificados Síntesis de secuencias peptídicas modificadas con un grupo lipofílico basado en atorvastatina Esquema 12 Scheme 12 2-(lsopropilam¡no)-1 ,2-difeniletanona (2) A una solución de benzoína (8,0 g, 37,7 mmol) en EtOH (150 ml) se agregó isopropilamina (2,45 g, 41 ,5 mmol), seguido de AcOH glacial (pocas gotas). La reacción se calentó a 45 °C durante 5 d. Los materiales volátiles se eliminaron en un evaporador rotatorio y se secaron bajo vacío. El material crudo se usó en la siguiente reacción. 1-isopropil-4,5-difenil-1 H-pirrol-2,3-dicarboxilato de dimetilo (3) Se agregó acetilendicarboxilato de dimetilo (DMAD, 7,0 g, 57 mmol) a la amina anterior 2 (8,0 g, 32 mmol) en MeOH (100 ml) y la reacción se calentó a reflujo durante la noche bajo argón. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de hielo y se filtró. Los sólidos se lavaron con MeOH frío (20 ml) y se secaron para obtener el pirrol 3 como un polvo blanco (9,8 g, 82%). Ácido 3-(metox¡carbonil)-1-isopropil-4,5-difenil-1 H-pirrol-2-carboxílico (4) Al diéster 2 (6,12 g, 16,1 mmol) se agregó MeOH (100 ml) y NaOH 1 M (ac, 17,05 ml). La mezcla se calentó a reflujo durante 18 h. Los volátiles se eliminaron en un evaporador rotatorio. El residuo se tomó en agua (100 ml) y se extrajo con éter (2 x 50 ml) y se mantuvo a un lado para obtener material inicial sin reaccionar. La fase acuosa se acidificó con HCl 4 M hasta un pH ~3 y se extrajo con éter (3 x 60 ml), se lavó con agua (50 ml) y se secó (Na2SO4). Después de evaporación y secado, se obtuvo el monoácido 4 (5,02 g, 85%) como un sólido blanco. 3-(metoxicarbonil)-1-isopropil-4,5-difenil-1 H-pirrol-2-ilcarbamato de bencilo Í5] A una solución del monoácido anterior 4 (0,1 g, 0,27 mmol) en benceno (3 ml), se agregó trietilamina (45 DI, 0,33 mmol) y difenilfosforilazida (DPPA, 0,091 g, 0,33 mmol) y se agitó a rt durante 4 h. Después se agregó alcohol bencílico (35 DI, 33 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 15 h. Se dejó que la reacción se enfriara hasta rt y se agregó NaHCO3 5% (5 ml) y se extrajo con éter (2 x 10 ml). Después de una concentración, se obtuvo el carbamato 5. 2-(4-(N,N'-d¡(Boc)guanid¡n¡l)butilcarbamoíl)-1-isopropil-4.5-d¡fenil-1 H-p¡rrol-3-carboxilato de metilo (6) A una solución del ácido 4 (0,1 g, 0,27 mmol) en CH2CI2 (3 ml), se agregó EDCl (0,053 g, 0,27 mmol), HOBt (0,037 g, 0,27 mmol), Et3N (38 Di, 0,27 mmol) y la amina 11 (0,086 g, 0,26 mol) en ese orden y se agitó a rt durante la noche. La reacción se diluyó con CH2CI2 (10 ml) y se lavó con NaHCO3 saturado (5 ml), solución salina (5 ml) y se secó (Na2SO4) para obtener la amida 6 (0,165 g, 88,8%) como un sólido blanco. Ácido 2-(4-(N(Boc)guanid¡nil)butilcarbamoíl)-1 -isopropil-4.5-difenil-1 H-pirrol- 3-carboxílico (7) Al éster 6 (0,16 g, 0,237 mmol) se agregó MeOH (10 ml) y NaOH 1 M (ac, 1 ,0 ml). La mezcla se calentó a reflujo durante 18 h. Los volátiles se eliminaron en un evaporador rotatorio. El residuo se tomó en agua (10 ml), se acidificó con HCl 4 M hasta un pH -3 y se extrajo con éter (3 x 10 ml), se lavó con agua (10 ml) y se secó (Na2SO4). Después de evaporación y secado, se obtuvo el ácido 7 (0,121 g, 91 %). Ácido 2-(4-(guan¡dinil)butilcarbamoíl)-1-isopropil-4,5-difenil-1 H-pirrol-3-carboxílico.TFA (8) A una solución del compuesto protegido con Boc 7 anterior (0,10 g, 0,178 mmol) en CH2CI2 (3 ml) se agregó ácido trifluoroacético (3 ml) y se agitó a rt durante 4 h. Los volátiles se eliminaron en un evaporador rotatorio. La cromatografía de fase reversa (CH3CN-H2O/TFA 0,1%) del crudo permitió obtener el producto deseado 8 (0,075 g, 91%) como una sal de ácido trifluoroacético. (S)-(4-(N3-(1-carbamoíl-3-carbobenciloxipropil)-1-isopropil-4.5-difenil-1 H-pirrol-2.3-dicarboxamido)butil)-N-(Boc)guanidina (9) A una solución del ácido 7 (0,132 g, 0,23 mmol) en CH2CI2 (10 ml), se agregó EDCl (0,051 g, 0,23 mmol), HOBt (0,032 g, 0,23 mmol), Et3N (65 DI, 0,23 mmol) y la amina 12 (0,061 g, 0,22 mol) en ese orden y se agitó a rt durante la noche. La reacción se diluyó con CH2CI2 (10 ml) y se lavó con NaHCO3 saturado (5 ml), solución salina (5 ml) y se secó (Na2SO4) para obtener la amida 6 como un sólido blanco (0,127 g, 69%). (S)- (4-(N3-(1-carbamoíl-3-carboxiprop¡l)-1-isopropil-4,5-difenil-1 H-pirrol-2,3-dicarboxamido)butil)guanidina.TFA (10) A una solución del bencil éster 9 (0,02 g, 0,025 mmol) en EtOH (10 ml), se agregó acético ácido (0,1 ml) y 10% Pd(OH) /C (0,01 g) y se agitó a rt bajo hidrógeno (globo). Después de agitar durante la noche, la reacción se filtró, se lavó con EtOH y se evaporó para obtener el crudo, que se tomó en TFA (2 ml) y se agitó a rt durante 4 h. Después de evaporación y purificación por cromatografía de fase reversa (CH3CN-H2O/TFA 0,1 %) el producto deseado se obtuvo como una sal de ácido trifluoroacético. Síntesis de secuencias peptídicas modificadas con un grupo lipofílico Basado en nisvastatina Esquema A Esquema A 4-hidroxiguinolin-3-carboxilato de etilo (A1) Se mezclaron anilina (2,15 g, 23 mmol) y etoximetilenmalonato de dietilo (5 g, 23 mmol) puros y la mezcla se calentó a 110 °C durante 2 h, luego se enfrió y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 15 h. Durante este tiempo la mezcla de reacción cristalizó. Se calentó Dowtherm A (70 ml) a 255 °C y se agregaron los cristales fundidos y la mezcla se calentó a 255 °C durante 20 min. La mezcla se vertió luego en un contenedor de acero inoxidable enfriado a 0 °C con un baño de hielo.
Se agregaron hexanos a la solución fría para precipitar el producto que se recolectó por filtración y se lavó con otra porción de hexanos. El producto se recristalizó a partir de EtOH para obtener el producto como un sólido blanco. (1 ,6 g, 7,3 mmol, 32%, P.F. 309C) que se usó sin purificación adicional en el paso siguiente. 4-cloroguinolin-3-carboxilato de etilo (A2) Al 4-hidroxiquinolin-3-carboxilato de etilo (A1 ) sólido (1 ,5 g, 7 mmol) se agregó POCI3 (2,2 g, 1 ,3 ml, 14 mmol) y la mezcla se calentó a 110 °C durante 20 min. La mezcla se vertió en NH3 (ac, 28-30%) y hielo y luego se agitó hasta que se volvió granulado. La mezcla de hielo fundido se extrajo con éter (3 x 40 ml) y las capas orgánicas combinadas se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron para obtener el producto como un aceite que cristalizó con el reposo (1 ,44 g, 6 mmol, 87%) que se usó tal como estaba sin purificación adicional. 4-(4-am¡nobutilamino)guinolin-3-carbox¡lato de etilo (A3) A una solución de 4-cloroquinolin-3-carboxilato de etilo (A2) (0,5 g, 2,1 mmol) en tolueno (10 ml) se agregó diaminobutano (10x, 1 ,85 g, 21 mmol) y la mezcla se calentó a 110 °C durante 1 ,5 h. Durante este tiempo se formó una sal que se eliminó por filtración en caliente y el filtrado se concentró bajo presión reducida para obtener un aceite. Se agregó agua y la mezcla se extrajo con DCM (2 x 25 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron para obtener un aceite que cristalizó con el reposo (476 mg, 1 ,66 mmol, 79%) que se usó en los pasos siguientes sin purificación adicional. 4-(3-(etoxicarbonil)guinolin-4-ilamino)butilcarbamato de ter-butilo (A4) A una solución de 4-(4-aminobutilamino)quinolin-3-carboxilato de etilo (A3) en DCM (60 ml) se agregó dicarbonato di-ter-butilo y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 h. La mezcla se lavó con Na2CO3 2 M (20 ml), agua (20 ml), NaCI sat. (20 ml), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró para obtener el producto como un aceite amarillo (4 g) que se usó tal como estaba en el paso siguiente. Ácido 4-(4-ter-butoxicarbon¡lamin-butilamino)-guinolin-3-carboxílico (A5) Una solución de 4-(3-(etoxicarbonil)quinolin-4-ilamino)butilcarbamato de terbutilo (A4) en KOH etanólico (5%, 100 ml) fue sometida a reflujo durante 2 h y luego se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió en agua (25 ml) y se usó HCl (20%) para ajustar la mezcla resultante a un pH 8. Apareció un sólido y se recolectó por filtración y la torta resultante se lavó con agua y se secó bajo vacío para obtener el producto como un polvo blanco (2,763 g) que se usó en el paso siguiente. Ácido 4-([4-(4-aminobutilamino)-guinolin-3-carbon¡n-am¡no}-4-carbamoíl-butírico (A6) Se introdujo ter-butil éster de ácido D-glutámico unido a la resina Rink amida MBHA (2 g, 1 ,32 mmol), ácido 4-(4-ter-butoxicarbonilamin-butilamino)-quinolin-3-carboxílico (A5) (2 eq, 950 mg, 2,64 mmol) y PyBop (1 ,4 g, 2,64 mmol) en un balón de 50 ml secado a la llama. Se agregó NMP (25 ml) y la solución se agitó durante 18 h a temperatura ambiente. La mezcla se filtró y se lavó sucesivamente con DCM, MeOH alternando 3x de cada uno y se secó al aire. Las esferas resultantes se suspendieron en TFA (10 ml) y se agregó anisol (0,2 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. El sólido se separó por filtración y el filtrado se concentró bajo presión reducida para obtener un aceite. La purificación por HPLC de fase reversa usando ACN/H2O/TFA 0,1% (gradiente de 5% a 95% de ACN) permitió obtener el producto como un sólido blanco después de una liofilización (127 mg, 0,33 mmol, 13%). P.f. 108 °C, 1HNMR (400 MHz) d 8,96 (d, J = 7,6Hz, 1 H), 8,72 (br s, 1 H), 8,58 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,94 (m, 2H), 7,71 (m, 4H), 7,63 (s, 1 H), 7,18 (s, 1 H), 4,35 (m, 1 H), 2,81 (br s, 2H), 2,37 (m, 2H), 2,07-2,00 (serie de m, 2H), 1 ,75 (m, 2H), 1 ,60 (m, 2H) EIMS m/z M+1 388,7. Anal.
Esquema B Esguema B Etil éster del ácido 4-(4-bis-boc-guan¡d¡n-butilamina)-guinolin-3-carboxílico (B2) A una solución de 1 ,3-di-boc-2-(trifluorometilsulfonil)guanidina (391 mg, 1 mmol) en DCM seco (4 ml) se agregó 4-(4-aminobutilamino)quinolin-3-carboxilato de etilo (A3) (0,3 g, 1 ,05 mmol) puro y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 h. La mezcla se diluyó con DCM y se lavó con NaHSO4 2 M (20 ml), NaHCO3 sat. (20 ml), NaCI sat. (20 ml), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró para obtener el producto como una espuma blanca (225 mg) que se usó tal como estaba en el paso siguiente. Ácido 4-(4-guanidin-butilamina)-guinolin-3-carboxílico (B3) A una solución de etil éster del ácido 4-(4-bis-boc-guanidin-butilamina)-quinolin-3-carboxílico (B2) (255 mg, 0,43 mmol) en DME (2 ml) se agregó NaOH 1 M (2 ml) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 6h. A esta solución se agregaron 2 gotas de solución de KOH 20% y se continuó agitando durante 15 h. La solución se concentró a 1/3 del volumen y el pH se ajustó en pH-6 con HCl 1 M y el precipitado blanco resultante se recolectó por filtración y se secó para obtener el producto como un sólido blanco. (0,132 g, 0,26 mmol, 61%) A una solución del sólido blanco (152 mg, 0,27 mmol) en DCM (2 ml) se agregó TFA (2 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se concentró bajo presión reducida y el residuo resultante se purificó por HPLC de fase reversa, H2O/ACN/TFA 0,1 % (ACN 5%-95%) y las fracciones resultantes se concentraron por liofilización para obtener el producto como un sólido blanco (43 mg, 0,1 mmol, 34%). P.f. -98 °C, 1HNMR (400 MHz) d 8,82 (s, 1 H), 8,49 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 8,08 (s, 1 H), 7,86 (m, 2H), 7,56 (t, J = 7,6, 7,2Hz, 4H), 7,31 (br s, 4H), 3,98 (s, 2H), 3,20 (d, J = 5,6Hz, 3H), 1 ,75 (dd, J = 6,4,36,4 Hz, EIMS m/z M+1 302,3. Anal. C?5H19N5?2 + 1 TFA +2 H2O Esquema C Scheme C Esquema C Bencil éster del ácido 4-([4-(4-ter-butoxicarbonilamin-butilamino)-guinolin-3-carbonip-aminoj-butírico (C3) A una suspensión de ácido 4-(4-ter-butoxicarbonilamin-butilamino)-quinolin-3-carboxílico (A5) (0,5 g, 1 ,4 mmol) en DCM (20 ml) se agregó TBTU (1 ,1 eq, 1 ,53 mmol, 482 mg) y la solución se agitó y 8 h después se agregó DMF (20 ml). Después de 28 h de agitación continua la solución se volvió clara y se agregó TEA (155 mg, 0,213 ml, 1 ,53 mmol) seguido de 4-aminobutanoato de bencilo (C2) (1 ,1 eq, 0,559 g, 1 ,53 mmol) y la mezcla se agitó durante 15 h. El DCM se eliminó bajo presión reducida y el resto se diluyó con agua. Esta solución acuosa se extrajo con éter (3 x 50 ml) y luego DCM (3 x 50 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó por cromatografía instantánea sobre sílice usando DCM/MeOH (9:1 ) para obtener el producto como un aceite (0,484 g) de suficiente pureza para su uso en los pasos siguientes. Bencil éster del ácido 4-(f4-(4-am¡n-butilamino)-quinolin-3-carbonip-amino)-butírico (C4) A una solución de bencil éster del ácido 4{[4-(4-ter-butoxicarbonilamin-butilamino)-quinolin-3-carbonil]-amino}-butírico (C3) (0,454 mg, 0,9 mmol) en DCM (10 ml) se agregó TFA (4 ml) y la mezcla se agitó durante 1 h. La solución se concentró, se neutralizó con NaHCO3 saturado y se extrajo con DCM. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para obtener el producto como un aceite claro (227 mg, 0,52 mmol). Bencil éster del ácido 4-{[4-(4-b¡s-Boc-guanidin-butilamino)-guinolin-3-carbonip-aminol-butírico (C5) A una solución de bencil éster del ácido 4{[4-(4-amin-butilamino)-guinolin-3-carbonil]-amino}-butírico (C4) (227 mg, 0,52 mmol) en DCM (7 ml) se agregó TEA (53 mg, 0,72 ml) seguido de 1 ,3-di-boc-2-(trifluorometilsulfonil)guanidina (204 mg, 0,52 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 h. La solución orgánica se diluyó con más DCM, se lavó con NaHSO4 2 M (25 ml), NaHCO3 (25 ml), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró bajo presión reducida para obtener el producto como una espuma blanca (305 mg) que se usó tal como estaba. Ácido 4-{[4-(4-guanidin-but¡lamino)-guinolin-3-carbon¡l1-amino)-butírico (C6) A una solución de bencil éster del ácido 4-{[4-(4-bis-Boc-guanidin-butilamino)-quinolin-3-carbonil]-amino}-butírico (C5) (305 mg) en MeOH (10 ml) se agregó Pd/C (10% en peso, 10% p/p, 30 mg) y la mezcla se purgó bajo vacío 5x con H2 gaseoso y se agitó bajo H2 durante 18 h. El Pd/C se eliminó por filtración a través de celite y el filtrado se concentró bajo presión reducida para obtener un residuo como una espuma blanca. El residuo anterior se disolvió en DCM (5 ml) y se agregó TFA (5 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Se eliminaron los solventes bajo presión reducida y el residuo se trituró con éter. El aceite resultante se purificó por HPLC de fase reversa usando ACN/H2O/TFA (0,1%) como eluyente (gradiente de 5%-95% de ACN) para obtener el producto como un sólido blanco higroscópico (70 mg, 0,018 mmol). P.f.-no determinado, 1H NMR (400 MHz) d 9,86 (br s, 1 H), 8,92 (t, J = 5,2, 5,6Hz, 1 H), 8,56 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 7,91 (m, 2H), 7,76 (t, J = 5,6, 5,6Hz, 1 H), 7,68 (m, 1 H), 7,37-7,06 (br m, 4H), 3,29 (m, 6H), 3,12 (q, J = 6,4, 12,8 Hz), 2,33 (t, J = 7,2, 7,2Hz, 2H), 1 ,76 (m, 4H), 1 ,54 (m, 2). EIMS m/z M+1 387,5. Anal. No determinado.
Esquema D Esguema D 2-metil-4-fenilguinolin-3-carboxilato de etilo (D1) A una solución de 2-aminobenzofenona (10 g, 51 mmol) y acetoacetato de etilo (5,3 g, 63,8 mmol, 8 ml) en tolueno (100 ml) se agregó PTSA (0,3 g) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo usando un aparato Dean Stark durante 1 ,5 h cuando ya no había más evidencia de agua. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo se recristalizó a partir de EtOH para obtener el producto como cristales de color amarillo claro. (8,14 g, 28 mmol) (2-metil-4-fenilguinolin-3-íl)metanol (D2) A una solución de 2-metil-4-fenilquinolin-3-carboxilato de etilo (D1 ) (5 g, 17,2 mmol) en DCM (50 ml) a -78 °C se agregó Dibal-H 1 M (2,5 eq, 43 mmol, 43 ml) en DCM por gotas y se continuó agitando a esta temperatura durante 1 ,5 h.
Se agregó cuidadosamente una solución de Na2SO4 (6,1 g, 43 mmol) en agua (10 ml) a -78 °C y se dejó que la mezcla alcanzara temperatura ambiente y se agitó durante 1 h. El sólido se separó por filtración y se lavó con EtOAc caliente. Los filtrados se combinaron y se concentraron bajo presión reducida para obtener el producto como un residuo sólido amarillo (3,62 g, 14,5 mmol) 3-(clorometil)-2-metil-4-fenilguinolina (D3) A una solución de (2-metil-4-fenilguinolin-3-il)metanol (D2) en DCM (50 ml) se agregó SOCI2 (10,4 ml, 17 g, 140 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla se concentró bajo presión reducida para obtener la sal HCl del cloruro como un sólido amarillo (2,266 g. El producto se guardó como la sal HCl y se convirtió en la base libre mediante tratamiento con NaHCO3 saturado y extracción con éter. 1 ,1-di(etoxicarbonil)-2-(2-metil-4-fenilguinolin-3-il)etilcarbamato de ter-butilo ÍP4) A una solución de 3-(clorometil)-2-metil-4-fenilquinolina (D3) (0,958 g, 3,6 mmol) como la base libre en DMF (12 ml) se agregó una solución en DMF (40 ml) de di(etoxicarbonil)metilcarbamato de ter-butilo (4,32 mmol, 1 ,19 g) que se había desprotonado mediante tratamiento con NaH (4,32 mmol, 104 mg) durante 15 min. Esta mezcla se agitó durante la noche y luego se concentró bajo presión reducida, se disolvió en H2O y la solución se extrajo con éter (3 x 50 ml). Los extractos se combinaron, se secaron (MgSO4), se filtraron, se concentraron bajo presión reducida para obtener el producto como un aceite marrón que se usó tal como estaba. Ácido 2-ter-butoxicarbonilam¡no-3-(2-metil-4-fenil-guinol¡n-3-il)-propiónico ÍD5) A una solución de 1 ,1-di(etoxicarbonil)-2-(2-metil-4-fenilquinolin-3- ¡l)etilcarbamato de ter-butilo (D4) (0,85 g, 1 ,7 mmol) en MeOH (10 ml) se agregó NaOH 2 M (2,1 eq, 1 ,8 ml) y la mezcla se calentó a 90 °C durante 7 h. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo se diluyó con agua. La mezcla resultante se ajustó en pH-5,5 usando HCl acuoso 20% y la solución lechosa blanca se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró para obtener el producto como una espuma sólida marrón (0,404 g, 1 mmol) que se usó tal como estaba. Fenil éster del ácido (3-f2-ter-butoxicarbonilamin-3-(2-met¡l-4-fenil-guinolin-3-il)-propionilamino1-propil}-carbámico (D6) A una solución de ácido 2-ter-butoxicarbonilamino-3-(2-metil-4-fenil-quinolin-3-il)-propiónico (D5) (200 mg, 0,5 mmol) en DCM (15 ml) se agregó TBTU (1 ,1 eq, 174 mg, 0,54 mmol) y TEA (2 eq, 1 ,08 mmol, 110 mg, 150 µl) y la mezcla se dejó bajo agitación a temperatura ambiente durante 10 min. A esta mezcla se agregó 4-aminobutilcarbamato de fenilo (1 ,1 eq, 0,54 mmol, 140 mg) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Se agregó agua y la capa orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró para obtener un residuo amarillo. El residuo se purificó sobre sílice usando primero 2% DCM/MeOH, luego 4% DCM/MeOH, después 8% DCM/MeOH, 250 ml de cada uno para obtener el producto como un aceite amarillo (228 mg). Fenil éster del ácido (3-f-amino-3-(2-metil-4-fenil-guinolin-3-il)-propionilaminol-butiD-carbámico (D7). A una solución de fenil éster del ácido {3-[2-ter-butoxicarbonilamin-3-(2-metil-4-fenil-quinolin-3-il)-propionilamino]-propil}-carbámico (D6) (220 mg, 0,36 mmol) en DCM (5 ml) y se agregó una mezcla de TFA/DCM (3,5 ml/5 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo se tomó en EtOAc (50 ml) y se lavó con NaHCO3 saturado (35 ml), agua (2 x 25 ml), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró para obtener el producto como un aceite amarillo claro (161 mg, 0,32 mmol, 88%). Ácido 4-f2-(2-metil-4-fenil-guinolin-3-¡0-1-(4-fenoxicarbonil-amino-butil-carbamoíl)-etil-carbamoíl1-butírico (D8) A una solución de fenil éster del ácido {3-[-amino-3-(2-metil-4-fenil-quinolin- 3-il)-propionilamino]-butil}-carbámico (D7) (161 mg, 0,32 mmol) en THF se agregó anhídrido glutárico (1 ,5 eq, 0,5 mmol, 57 mg) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo se tomó en EtOAc (25 ml) y se lavó con agua, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró para obtener el producto como un aceite anaranjado claro que solidificó lentamente (213 mg) y se usó tal como estaba sin caracterización adicional. Ácido 4-í1-(4-am¡no-butilcarbamoíl)-2-(2-metil-4-fenil-guinolin-3-il)-etil-carbamoíll-butírico (D9) A una solución de ácido 4-[2-(2-metil-4-fenil-quinolin-3-il)-1-(4-fenoxicarbonil amino-butilo carbamoíl)-etil-carbamoíl]-butírico (D8) (213 mg, 0,34 mmol) en MeOH (10 ml) y THF (5 ml) se agregó Pd/C y se colocó sobre un agitador Parr a 80 psi de H2 gaseoso durante 5 h. El Pd/C se eliminó por filtración a través de celite y se concentró la solución. El residuo resultante se purificó mediante HPLC de fase reversa usando H2O/ACN (ACN 5%-95%) con lo cual se obtuvo el producto como un sólido blanco después de una liofilización (13,3 mg). P.f. 129 °C, 1HNMR (400 MHz) 57,91 (m, 2H), 7,64 (m, 2H), 7,54 (m, 4H), 7,36 (m, 2H), 7,26 (d, J = 6,4 Hz, 1 H), 7,08 (d, J = 8 Hz, 1 H), 4,352 (m, 1 H), 3,1-2,6 (serie de m, 8H), 2,03 (m, 4H), 1 ,55 (m, 2H), 1 ,22 (m, 4H). EIMS m/z M+1 491 ,7. Anal.
C28H34N4O4 + 3H2O Esquema E R= Boc, CBz Pirimidinas Pyrimidines Esguema E Etil éster del ácido 4-(5-bencilox¡carbonilamino-pentilamino)-guinolin-3-carboxílico (E2, n = 4) A una solución de 4-cloroquinolin-3-carboxilato de etilo (A2) (1 g, 4,26 mmol) en DMA (20 ml) se agregó N-CBz-diaminopentano (1 ,4 g, 5,1 mmol) y DABCO (1 ,4 g, 13 mmol) y la solución se calentó a 115 °C durante 2,5 h. La DMA se eliminó bajo presión reducida y el residuo se suspendió en agua y se extrajo con éter (3 x 25 ml), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró para obtener el producto como un aceite marrón claro (1 ,88 g, 4,3 mmol) que se usó tal como estaba. Etil éster del ácido 4-(5-amino-pentilamino)-quinolin-3-carboxílico (E3, n = 4) A una solución de etil éster del ácido 4-(5-benciloxicarbonilamino-pentilamino)-quinolin-3-carboxílico (E2, n = 4) (1 ,88 g, 4,3 mmol) en EtOH (30 ml) se agregó Pd/C (180 mg, Pd 10% p/p) y la mezcla se agitó bajo H2 gaseoso durante 3 d rellenando el globo según necesidad. El catalizador se eliminó por filtración a través de celite y se concentró para obtener el producto como aceite de color miel (1 ,3 g, 4,2 mmol) que se usó sin purificación adicional. Etil éster del ácido 4-(5-bis-Boc-quanidin-pent¡lamino)-quinolin-3-carboxílico (E4, n = 4) A una solución de etil éster del ácido 4-(5-amino-pentilamino)-quinolin-3-carboxílico (E3, n = 4) (0,64 g, 2,1 mmol) en DCM seco (10 ml) se agregó TEA (322 µl, 233 mg) y 1 ,3-di-boc-2-(trifluorometilsulfonil)guanidina (1 ,1 eq, 0,9 g, 2,31 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 h. La solución se diluyó con más DCM y se lavó con NaHSO3 2 M (20 ml), NaHCO3 saturado (20 ml), NaCI saturado, se secó (Na2S04), se filtró y se concentró para obtener el producto como una espuma blanca (1 ,2 g, 2,1 mmol) que se usó tal como estaba. Ácido 4-(5-guanidin-pentilamino)-quinolin-3-carboxílico (E5, n = 4) A una solución de 4-(5-bis-Boc-guanidin-pentilamino)-quinolin-3-carboxílico etil éster del ácido (E4, n = 4) (1 ,2 g, 2,1 mmol) en DME (20 ml) se agregó NaOH 1 M (15 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 d. La mezcla se concentró para eliminar el DME y la mezcla acuosa restante se ajustó en pH -5-6 con HCl (acuoso 20%). El sólido resultante se recolectó por filtración y se secó al aire. El sólido crudo se suspendió en DCM (15 ml) y se agregó TFA (3,5 ml) a la mezcla a temperatura ambiente durante 2,5 h. Se agregó más TFA y la solución se agitó durante 3,5 h y luego se concentró. El residuo se suspendió en agua y se agregó Na2CO3 2 M para ajustar el pH en -7-8 y el sólido resultante se recolectó por filtración y se secó en bajo vacío. El crudo se purificó por HPLC de fase reversa sobre C18 usando H2O/ACN/TFA 0,5% para obtener el compuesto como un sólido blanco después de una liofilización (40 mg, 0,09 mmol) como la sal mono TFA. P.f. 72 °C, 1HNMR (400 MHz) d 8,79 (s, 1 H), 8,48 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 7,86 (m, 2H), 7,78 (m, 1 H), 7,55 (m, 1 H), 7,24 (br s, 4H), 3,94 (m, 3H), 3,14 (d, J = 6,4, 6,8 Hz, 2H), 1 ,77 (m, 2H), 1 ,55 (m, 4H) EIMS m/z M+1 316,3. Anal. C?6H21N5O2 + 2H2O + 1TFA Ácido 4-(3-guanidin-propilamino)-guinolin-3- carboxílico (E5, n = 2) Este compuesto se elaboró de manera similar al ácido 4-(5-guanidin-pentilamino)-quinolin-3-carboxílico (E5, n = 4) usando t-butil éster del ácido n-(3-aminopropil)-carbámico y desprotegiendo con TFA. P.f. 231 °C, 1HNMR (400 MHz) d 10,48 (m, 1 H), 9,52 (br s, 1 H), 9,00 (s, 1 H), 8,20 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,75 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,60 (t, J = 6,8, 8,4 Hz, 2H), 7,35 (t, J = 7,6, 8 Hz, 2H), 3,75 (m, 3H), 3,22 (t, J = 7,2, 7,2Hz, 2H), 1 ,90 (m, 2H) EIMS m/z M+1 288,4. Anal. C14H17N5?2 + 2H2O Ácido 4-(2-guanidin-etilamino)-guinolin-3-carboxílico (E5. n = 1 ) Este compuesto se elaboró de manera similar al ácido 4-(5-guanidin-pentilamino)-quinolin-3-carboxílico (E5, n = 4) usando n-Boc-etilendiamina y desprotegiendo con TFA. P.f. 267 °C, 1HNMR (400 MHz) d 8,77 (s, 1 H), 8,42 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,84 (m, 3H), 7,57 (t, J = 8,4 Hz, 7,2 Hz 1 H), 7,28 (br s, 3H), 4,08 (br s, 2H). EIMS m/z M+1 274,5. Anal. C13H15N5O2 + 2H2O + 1TFA Pirimidinas Ácido 4-[3-(pirimidin-2-¡l-amino)-propilamino1-guinolin-3-carboxílico (E6, n = 2. R = H) A una solución de etil éster del ácido 4-(3-amino-propilamino)-quinolin-3-carboxílico (E3, n = 2, 177 mg, 0,65 mmol) en EtOH (35 ml) se agregó DIPEA (1 mmol, 129 mg, 173 µl) y 2-cloropirimidina (90 mg, 0,78 mmol) y la mezcla se calentó a reflujo durante 15 h. La solución se concentró y se tomó en EtOH (15 ml) y se agregó NaOH 1 M (5 ml) y la solución se agitó durante 15 h. La mezcla se concentró y el residuo se ajustó en pH -5 usando HCl 20%. El sólido resultante se recolectó y se purificó mediante HPLC de fase reversa, ACN/H2O 5-95% sobre C18 para obtener el producto como un sólido blanco después de una liofilización (135 mg). P.f. 269 °C. 1HNMR (400 MHz) d 8,47 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 8,19 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,80 (m, 2H), 7,50 (m, 1H), 7,26 (m, 1H), 6,52 (t, J = 4,4, 5,2 Hz, 1H), 3,99 (m, 2H) 2,00 (m, 2H). EIMS m/z M+1 324,5. Anal. C17H?7N5O2 + 1 H 2O + ITFA Etil éster del ácido 4-[5-(pirimidin-2-ilamino)-pentilamino1-guinolin-3-carboxílico (E6, n = 4. R = CH?CH3) A una solución de etil éster del ácido 4-(5-amino-pentilamino)-quinolin-3-carboxílico (E3, n = 4, 505 mg, 1 ,7 mmol) en EtOH (20 ml) se agregó DIPEA (323 mg, 2,5 mmol, 435uL) y 2-cloropirimidina (231 mg, 2 mmol) y la mezcla se calentó a reflujo durante 15 h. La mezcla se concentró y el residuo se purificó por HPLC de fase reversa, C18, ACN/H2O, 5-95% para obtener el producto como un sólido amarillento blancuzco (135 mg, 0,36 mmol, 21%). P.f. 108 °C 1HNMR (400 MHz) d 8,92 (m, 1 H), 8,83 (s, 1 H), 8,34 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 8,19 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,8 (m, 1 H), 7,71 (m, 1 H), 7,44 (m, 1 H), 7,09 (t, J = 6, 5,6 Hz, 1 H), 6,50 (t, J = 4,8, 4,8 Hz, 1 H), 3,68 (m, 2H), 3,22 (q, J = 6,8, 12,8 Hz, 2H), 1 ,68 (m, 2H), 1 ,52 (m, 2H), 1 ,41 (m, 2H). EIMS m/z M+1 380.5. Anal. C??H,5N5O2 Esquema F Esguema F Etil éster del ácido 4-amino -guinolin-3-carboxílico (F2) A una solución de 4-cloro quinolin-3-carboxilato de etilo (A2, 1 ,44 g, 0,6 mmol) en tolueno (10 ml) se agregó NH3 condensado y la mezcla se introdujo en una bomba de acero que se selló y se calentó a 125 °C durante 4 h. La bomba se enfrió y el sólido resultante blanco se recolectó por filtración bajo vacío y se secó para obtener el producto (1 ,5 g). Ácido 4-amino-guinolin-3-carboxílico (F3) A una solución de etil éster del ácido 4-amino-quinolin-3-carboxílico (F2) (250 mg, 1 ,2 mmol) en EtOH (5 ml) se agregó KOH 20% (10 ml) y la mezcla se calentó a reflujo durante 1 h. El EtOH se eliminó bajo presión reducida y la solución acuosa se ajustó en pH -6,5-7 usando HCl 20%. El sólido blanco se recolectó y se secó para obtener el producto (161 mg). El producto se cristalizó a partir de EtOH y se secó. P.f. 305 °C. 1HNMR (400 MHz) d 8,89 (s, 1H), 8,42 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,83 (m, 2H), 7,60 (m, 1 H). EIMS m/z M+1 189,4. Anal. C10H8N2O2 + 0,5 H2O Se pueden efectuar muchas modificaciones y variaciones de las modalidades descritas en la presente sin apartarse del alcance de la invención, como resultará evidente para el especialista en el arte. Las modalidades específicas descritas en la presente solamente se ofrecen a modo de ejemplo.
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Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un mediador del transporte inverso de colesterol, que comprende la siguiente estructura: donde A, B y C pueden estar en cualquier orden y donde A comprende un aminoácido o un análogo del mismo, que comprende un grupo ácido o un bioisostero del mismo; B comprende un grupo aromático o lipofílico que comprende un inhibidor de la HMG CoA reductasa o un análogo del mismo; y C comprende un aminoácido o un análogo del mismo, que comprende un grupo básico o un bioisostero del mismo; donde al menos uno de los grupos alfa-amino o alfa-carboxilo han sido eliminados de sus respectivos aminoácidos amino o carboxilo terminales o análogos de los mismos.
2. El mediador de la cláusula 1 , donde si no fue eliminado, el grupo alfa-amino está protegido con un grupo protector seleccionado del grupo formado por acetilo, fenilacetilo, benzoílo, pivolilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo, ácido 2-naftílico, ácido nicotínico, un grupo CH3 — (CH2)n — CO — donde el valor de n varía en un rango entre 3 y 20, di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, Fmoc, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado y heteroarilo saturado sustituido.
3. El mediador de la cláusula 1 , donde si no fue eliminado, el grupo alfa-carboxilo está protegido con un grupo protector seleccionado del grupo formado por una amina, tal como RNH donde R = H, di-ter-butil-4-hidroxi-fenilo, naftilo, naftilo sustituido, Fmoc, bifenilo, fenilo sustituido, heterociclos sustituidos, alquilo, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo fusionado, heteroarilo saturado y heteroarilo saturado sustituido.
4. El mediador de la cláusula 1 , donde el bioisostero del grupo ácido se selecciona del grupo formado por:
5. El mediador de la cláusula 1 , donde el bioisostero del grupo básico se selecciona del grupo formado por: S O NH NH N'NH2 NH N -OH N^NH2 ^N^NH2 ^N NHMe ^N^NMe2 ^N^NH2 ^N^NH2 ^N^NH, NH,
6. El mediador de la cláusula 1 , donde dicho mediador se selecciona del grupo formado por:
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