JP2009017783A - プロテイナーゼａをコードする遺伝子及びその用途 - Google Patents

プロテイナーゼａをコードする遺伝子及びその用途 Download PDF

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Abstract

【課題】泡持ちに優れたビールの製造方法を提供する。
【解決手段】以下の(a)〜(ｄ)のいずれかに記載のポリヌクレオチド： (a)ビール酵母由来の特定な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド； (b)ビール酵母由来の特定なアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド； (c)ビール酵母由来の特定なアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド； (ｄ)ビール酵母由来の特定な塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【選択図】なし

Description

本発明は、プロテイナーゼAをコードする遺伝子及びその用途に関する。特に、本発明は、醸造酵母のプロテイナーゼAであるPep4pをコードする遺伝子ScPEP4、又は特にビール酵母に特徴的なnonScPEP4遺伝子およびその用途に関し、泡持ちに優れたビールを製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。
ビールをグラスに注ぐと、上部に泡の層が形成される。この泡層は、ビール中の炭酸ガスの放出防止、ビールの空気との接触を遮断することによるビールの味の酸化劣化防止、外観によって見た目のうまさを演出する効果などの重要な役割を果たす。従って、グラスのビールを飲み干すまで、所定量の泡層を残しておくことが必要であり、泡層の持続性（泡持ち）が重要となる。
この泡持ちの良さは、ビール中に含まれる特定の蛋白質の存在に関係があることがわかっており、泡持ちを劣化させる要因として蛋白質分解酵素の存在が示唆されている。大麦由来の蛋白質分解酵素は麦汁煮沸により失活するが、ビール酵母由来にも蛋白質分解酵素は存在し、かつビール中に該蛋白質分解酵素が漏れていることが報告されている（Ormrod, J. H. L. Lalor, E. F. and Sharpe, F. R., The Journal of the Institute of Brewing, 1991, 97, 441-443：非特許文献１）。また、ビール酵母には蛋白質分解酵素であるendo型ペプチダーゼであるプロテイナーゼAが存在し、該プロテイナーゼAをビールに添加すると、ビール中の泡持ちが減少することが知られている（Dreyer, T., Biederman, K. and Ottesen, M., Carlsberg Research Communications, 1983, 48, 249-253：非特許文献２、Dreyer, T., Halkier, B., Svendsen, I. and Ottesen, M., Carlsberg Research Communications, 1986, 51, 27-41：非特許文献３）。
Ormrod, J. H. L. Lalor, E. F. and Sharpe, F. R., The Journal of the Institute of Brewing, 1991, 97, 441-443 Dreyer, T., Biederman, K. and Ottesen, M., Carlsberg Research Communications, 1983, 48, 249-253 Dreyer, T., Halkier, B., Svendsen, I. and Ottesen, M., Carlsberg Research Communications, 1986, 51, 27-41
上述の通り、ビール中の泡は、炭酸ガスの放出防止、ビールの空気との接触を遮断することによるビールの味の酸化劣化防止、外観によって見た目のうまさを演出する効果などの重要な役割を果たすため重要である。したがって、ビールの泡持ち能を調節できることが求められている。
また、ビールの泡持ちの劣化の原因は酵母のプロテイナーゼＡのビール中への漏出であることが報告されているため、泡持ちの良いビールを製造する上で、プロテイナーゼＡの漏出が少ない酵母の育種方法が強く望まれていた。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母からプロテイナーゼAをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子配列を利用して、プロテイナーゼA生成能を低減させた形質転換酵母を作製し、泡持ちが向上することを確認して、本発明を完成した。
すなわち本発明は、ビール酵母に存在するプロテイナーゼA遺伝子ScPEP4および又は特にビール酵母に特徴的に存在する新規プロテイナーゼ遺伝子nonScPEP4、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が減少させた酵母を用いることによる製品中の泡持ちの制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
（1）以下の(a)〜(f)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（２）以下の(g)〜(i)のいずれかである上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h)配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（５ａ）以下の(i)〜(v)のいずれかのポリヌクレオチド：
(i)配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(ii)配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(iii)配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(iv)配列番号１０の塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
(v)上記(i)〜(iv)のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（５ｂ）プライマーまたはプローブとして使用する、上記（５ａ）に記載のポリヌクレオチド。
（６）以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(j)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（８）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（８ａ）以下の（ａ）〜（ｃ）の構成要素を含む発現カセットを含む上記（８）に記載のベクター：
（ａ）酵母細胞内で転写可能なプロモーター
（ｂ）該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）に記載のポリヌクレオチド；および
（ｃ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（９）上記（６）に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（１０）以下の(ｎ)〜(ｐ)のいずれかであるポリヌクレオチドを含有するベクター：
(ｎ)配列番号：４のアミノ酸配列又は配列番号：４のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するポリヌクレオチド；
(ｏ)配列番号：４のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(ｐ)配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（１０ａ）以下の（ａ）〜（ｃ）の構成要素を含む発現カセットを含む上記（１０）に記載のベクター：
（ａ）酵母細胞内で転写可能なプロモーター
（ｂ）該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド；および
（ｃ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
（１１）以下の（ｑ）〜（ｔ）のいずれかであるポリヌクレオチドを含有するベクター：
(ｑ)上記（１０）に記載される（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(ｒ)上記（１０）に記載される（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(ｓ)上記（１０）に記載される（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(ｔ)上記（１０）に記載される（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
（１２）上記（９）または（１１）に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
（１３）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現が抑制された形質転換酵母。
（１４）上記（１０）に記載される（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された形質転換酵母。
（１５）上記（９）に記載のベクターを導入することによって、または、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）に係る遺伝子を破壊することによって、上記（５）に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現が抑制された醸造用酵母。
（１６）上記（１１）に記載のベクターを導入することによって、または、上記（１０）に記載されるポリヌクレオチド（ＤＮＡ）に係る遺伝子を破壊することによって、上記（１０）に記載されるポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現が抑制された醸造用酵母。
（１７）endo型ペプチダーゼ活性が減少した上記（１２）に記載の醸造用酵母。
（１８）泡持ちが向上した上記（１３）または（１４）に記載の醸造用酵母。
（１９）上記（７）に記載のタンパク質の発現量を抑制させることによって泡持ちが向上した上記（１５）に記載の醸造用酵母。
（２０）上記（１２）〜（１９）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（２１）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（２０）に記載の酒類の製造方法。
（２２）上記（２０）または（２１）に記載の方法で製造された酒類。
（２３）配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するプロテイナーゼＡ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の泡持ち能について評価する方法。
（２３ａ）上記（２３）に記載の方法によって、プロテイナーゼＡ生成能が低い酵母を選別する方法。
（２３ｂ）上記（２３ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（２４）被検酵母を培養し、配列番号：１の塩基配列を有するプロテイナーゼＡ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の泡持ち能を評価する方法。
（２４ａ）被検酵母を培養し、上記（７）に記載のタンパク質のendo型ペプチダーゼ活性を測定することによって、被検酵母の泡持ち能を評価する方法。
（２５）基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１の塩基配列を有するプロテイナーゼＡ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子の発現が抑制されている被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２６）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の少ない被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２６ａ）基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記（７）に記載のタンパク質のendo型ペプチダーゼ活性を測定し、基準酵母よりも該endo型ペプチダーゼ活性の少ない被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
本発明によれば、ビールの泡持ち能を調節することができる。
より具体的には、本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、プロテイナーゼAの抑制によりビール中へのプロテイナーゼAの漏出量が減少し、泡持ちが向上したビールを製造することが可能となる。
本発明者らは、酵母のプロテイナーゼAの遺伝子発現を減少させることによって、ビール中へのプロテイナーゼＡ漏出を減少させることが可能であると考えた。このような着想に基づいて研究を重ね、特開2004-283169に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、プロテイナーゼAをコードするScPEP4遺伝子、又は、特にビール酵母特有のプロテイナーゼAをコードするnon-ScPEP4遺伝子を単離・同定した。これらの塩基配列を配列番号：１および配列番号：３にそれぞれ示す。またこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２および配列番号：４にそれぞれ示す。
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（具体的には、DNA、以下、これらを単に「DNA」とも称する）；及び(b)配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするDNAは、上記のビール酵母由来のプロテイナーゼAをコードするDNAに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のDNAを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつendo型ペプチダーゼ活性を有することが挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号２または４のアミノ酸配列において、例えば、１〜100個、１〜90個、１〜80個、１〜70個、１〜60個、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつendo型ペプチダーゼ活性を有することが挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２または４のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上99.2％以上99.3％以上99.4％以上99.5％以上99.6％以上99.7％以上99.8％以上99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、endo型ペプチダーゼ活性は、例えば特開平08-67694号公報記載の方法によって測定することができる。
また、本発明は、(d)配列番号：１または３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(e)配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA）」とは、配列番号：１または３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号２または４に記載のアミノ酸配列をコードするDNAの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるDNAをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号２、４に記載のアミノ酸配列をコードするDNAと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上99.2％以上99.3％以上99.4％以上99.5％以上99.6％以上99.7％以上99.8％以上99.9％以上以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（proc. Natl． Acad． Sci． USA 872264-2268, 1990; proc Natl Acad Sci USA 90： 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J Mol Biol 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、(j) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド； (k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド； (l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記(a)〜(i)のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制することができる。したがって、上記DNAの発現を抑制することが好ましい場合に好適に利用することができる。
本明細書中、「DNAの転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンスDNAのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現 （日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993などを参照）。アンチセンスDNAの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンスDNAの長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。
本明細書中、「DNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、RNA interferance（RNAi）によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、21〜25塩基長のRNA干渉を生ずる二重鎖RNA、例えば、dsRNA (double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)又はshRNA(short hairpin RNA)が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖RNA(dsRNA、siRNA又はshRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), Feb., 180-183; Genesis, 26(4), April, 240-244； Nature, Spe. 21, 407:6802, 319-20; Genes & Dev., Vol.16, (8), Apr.16, 948-958; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 16 Apr., 5515-5520; Science, 296(5567), 19 Apr., 550-553; Proc Natl. Acad. Sci. USA, Apr. 30, 99:9, 6047-6052; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), May, 497-500; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), May, 500-508; Nucleic Acids Res., May 15, 30:10, e46；Nucleic Acids Res. Vol.31(15), 4481-4489,2003 等参照）。
本明細書中、「DNAの転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザイムのことをいう。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいい、ターゲットとするDNAの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992など参照）。また、「DNAの発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるDNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。
本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照）。
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(e)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２または４のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２または４のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２または４のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）もしくは上記(j)〜（m）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター、又は上記（ｎ）〜（ｐ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドもしくは上記（ｑ）〜（ｔ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクターに関する。また、本発明のベクターは、通常、(a)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(b)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかまたは上記（ｎ）〜（ｐ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(c)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。本発明においては、後述する酒類（例えば、ビール）の醸造において、上記本発明のたんぱく質を高発現させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかまたは上記（ｎ）〜（ｐ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入する。また、後述する酒類（例えば、ビール）の醸造において、上記本発明のたんぱく質の発現を抑制させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかまたは上記（ｎ）〜（ｐ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してアンチセンス方向に導入する。また、上記本発明のたんぱく質の発現を抑制させる場合は、上記(j)〜(m)のいずれかまたは上記（ｑ）〜（ｔ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能なようにベクターに導入することもできる。なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（DNA）を破壊することによって、上記DNAの発現または上記たんぱく質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 76.4951(1979) 、Methods in Enzymology.101 ，202(1983)、Yeast, 101793-1808 (1994) 、特開平6-253826号など参照）。
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリイオン金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
本発明においては、ターゲットとなる遺伝子の発現が抑制された醸造用酵母を用いることによって、所望の酒類で泡持ちが向上した酒類を製造することができる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、泡持ちが向上した酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、泡持ちが向上した酒類を、既存の施設用い、コストを増加させることなく製造することができる。
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号１または３の塩基配列を有するプロテイナーゼＡの塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の泡持ち能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、プロテイナーゼＡ遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母の泡持ち能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測・評価することが可能である。
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１または３の塩基配列を有するプロテイナーゼＡ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の泡持ち能を評価することもできる。この場合は、被検酵母を培養し、プロテイナーゼＡ遺伝子の産物であるmRNA又はたんぱく質を定量することによって可能である。mRNA又はたんぱく質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、たんぱく質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母は、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。また、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が増加された酵母、上述した本発明の蛋白質の発現が増加された酵母、突然変異処理が施された酵母などが、使用され得る。
基準酵母、被検酵母は上記酵母からのいずれかであれば、任意の組み合わせで選択しても良い。変異処理の方法としては、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法、自然変異法など、いかなる方法を用いてもよい。
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１：新規プロテイナーゼAをコードする遺伝子（nonScPEP4）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の新規プロテイナーゼAをコードする遺伝子、nonScPEP4を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScPEP4#for（配列番号：５）／nonScPEP4#rv（配列番号：６）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScPEP4の全長遺伝子を含むDNA断片（約1.2kb）を取得した。
上記のようにして得られたnonScPEP4遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。nonScPEP4の遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
実施例２：ビール試醸中のnonScPEP4遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図1）、外観エキス濃度（図2）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。nonScPEP4遺伝子の発現パターンを図3に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnonScPEP4遺伝子が発現していることが確認できた。
実施例３：nonScPEP4遺伝子の破壊
文献 (Goldstein et al., yeast. 15 1541 (1999))の方法に従って、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド(pFA6a (G418r), pAG25 (nat1),pAG32 (hph)) をテンプレートとしたPCRによって遺伝子破壊用断片を作製する。PCR用のプライマーとして、nonScPEP4破壊にはnonScPEP4#delta#for（配列番号９）、nonScPEP4#delta #rv（配列番号１０）を用いる。
上述の方法で作製した遺伝子破壊用断片でビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株、もしくはW34/70より分離した胞子クローン株（W34/70-2）を形質転換する。形質転換は特開平07-303475に記載された方法で行い、ジェネチシン(Geneticin)300mg/Lあるいはノーセオスリシン(Nourseothricin) 50mg/LあるいはハイグロマイシンB(Hygromycin B) 200mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択する。
実施例４：ビール試験醸造におけるプロテイナーゼＡ活性度、泡持ち度の解析
親株ならびに実施例３で得られたnonScPEP4遺伝子発現抑制株を用いた発酵試験を、以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度 １２％
麦汁容量 １Ｌ
麦汁溶存酸素濃度 約８ｐｐｍ
発酵温度 １５℃一定
酵母投入量 ５ｇ湿酵母菌体／Ｌ麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（ＯＤ６６０）、エキス消費量の経時変化を調べる。発酵終了時におけるプロテイナーゼＡ活性の定量は、特開平08-67694号公報記載の方法に従い、ビール液４０μｌ、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイン（McIlvaine ）緩衝液２５０μｌ、Suc−Ala−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA の１ｍＭ水溶液２μｌ及び蒸留水２０８μｌで反応液を作成し、３７℃で３時間反応させる。次いで、８０℃−５分の熱処理によりプロテイナーゼＡ反応を停止させた後に、ｐＨ８．５の１Ｍトリス塩酸緩衝液２００μｌとアミノペプチダーゼＭ溶液〔ピアース ケミカル社（Pierce Chemical Co. ）製のアミノペプチダーゼを蒸留水に０．２ｍｇ／ｍｌの濃度、溶解させたもの〕５μｌを加えて更に３７℃で１時間インキュベートした後、７倍に希釈したものの蛍光度を励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで測定する。既知濃度の市販酵素について測定した検量線からビール中のプロテイナーゼＡ含量を測定する。ビールの泡持ち度は、ビールの泡持ち度を泡の立ち具合とガラス面への泡の付着性を測定することにより評価する。すなわち、ビール全量を一度に２０秒間平均してメスシリンダーに注ぎ込み、注ぎ込み終了３０分後のメスシリンダー壁に付着して残っている泡の量をプラニメーターを用いて測り、泡持ち度を定量的に評価する。この際、泡持ち度の単位は平方センチメーターで表す〔化学と生物、ｐ１３５４、（１９７５）参照〕。
実施例5：プロテイナーゼAをコードする遺伝子（Sc PEP4）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母のプロテイナーゼAをコードする遺伝子、ScPEP4を見出した（配列番号：３）。得られた塩基配列情報を基に、全長遺伝子を増幅するためのプライマー、ScPEP4#for（配列番号：７）／ScPEP4#rv（配列番号：８）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株の染色体DNAを鋳型としたPCRによってScPEP4の全長遺伝子を含むDNA断片（約1.2kb）を取得した。
上記のようにして得られたScPEP4それぞれの遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。ScPEP4遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
実施例6：ビール試醸中のScPEP4遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図1）、外観エキス濃度（図2）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。ScPEP4遺伝子の発現パターンを図4に示す。この結果より、通常のビール発酵においてScPEP4遺伝子が発現していることが確認できた。
実施例7： ScPEP4遺伝子の破壊
文献 (Goldstein et al., yeast. 15 1541 (1999))の方法に従って、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド(pFA6a (G418r), pAG25 (nat1),pAG32 (hph)) をテンプレートとしたPCRによって遺伝子破壊用断片を作製する。PCR用のプライマーとして、ScPEP4破壊にはScPEP4#delta#for（配列番号１１）、ScPEP4#delta #rv（配列番号１２）を用いる。
上述の方法で作製した遺伝子破壊用断片でビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株、もしくはW34/70より分離した胞子クローン株（W34/70-2）を形質転換する。形質転換は特開平07-303475に記載された方法で行い、ジェネチシン(Geneticin)300mg/Lあるいはノーセオスリシン(Nourseothricin) 50mg/LあるいはハイグロマイシンB(Hygromycin B) 200mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択する。
実施例8：ビール試験醸造におけるプロテイナーゼＡ活性度、泡持ち度の解析
親株ならびに実施例7で得られたScPEP4遺伝子発現抑制株を用いた発酵試験を、以下の条件で行う。
麦汁エキス濃度 １２％
麦汁容量 １Ｌ
麦汁溶存酸素濃度 約８ｐｐｍ
発酵温度 １５℃一定
酵母投入量 ５ｇ湿酵母菌体／Ｌ麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（ＯＤ６６０）、エキス消費量の経時変化を調べる。発酵終了時におけるプロテイナーゼＡ活性の定量は、特開平08-67694号公報記載の方法に従い、ビール液４０μｌ、０．２Ｍリン酸水素二ナトリウムと０．１Ｍクエン酸を含むｐＨ５．５のマックルバイン（McIlvaine ）緩衝液２５０μｌ、Suc−Ala−Pro−Ala−Lys−Phe−Phe−Arg−Leu−MCA の１ｍＭ水溶液２μｌ及び蒸留水２０８μｌで反応液を作成し、３７℃で３時間反応させる。次いで、８０℃−５分の熱処理によりプロテイナーゼＡ反応を停止させた後に、ｐＨ８．５の１Ｍトリス塩酸緩衝液２００μｌとアミノペプチダーゼＭ溶液〔ピアース ケミカル社（Pierce Chemical Co. ）製のアミノペプチダーゼを蒸留水に０．２ｍｇ／ｍｌの濃度、溶解させたもの〕５μｌを加えて更に３７℃で１時間インキュベートした後、７倍に希釈したものの蛍光度を励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで測定する。既知濃度の市販酵素について測定した検量線からビール中のプロテイナーゼＡ含量を測定する。ビールの泡持ち度は、ビールの泡持ち度を泡の立ち具合とガラス面への泡の付着性を測定することにより評価する。すなわち、ビール全量を一度に２０秒間平均してメスシリンダーに注ぎ込み、注ぎ込み終了３０分後のメスシリンダー壁に付着して残っている泡の量をプラニメーターを用いて測り、泡持ち度を定量的に評価する。この際、泡持ち度の単位は平方センチメーターで表す〔化学と生物、ｐ１３５４、（１９７５）参照〕。
本発明の酒類製造法によれば、ビール醸造および製品中のプロテイナーゼAの濃度が低く抑えられるため、泡持ちに優れた酒類を製造することが可能となる。
ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。 ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。 ビール試験醸造中の酵母におけるnonScPEP4遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。 ビール試験醸造中の酵母におけるScPEP4遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
［配列番号１］ nonScPEP4の塩基配列
［配列番号２］ nonScPEP4のアミノ酸配列
［配列番号３］ ScPEP4の塩基配列
［配列番号４］ ScPEP4のアミノ酸配列
［配列番号５］ プライマー
［配列番号６］ プライマー
［配列番号７］ プライマー
［配列番号８］ プライマー
［配列番号９］ プライマー
［配列番号１０］ プライマー
［配列番号１１］ プライマー
［配列番号１２］ プライマー

Claims (24)

  1. 以下の(a)〜(f)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
    (a)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
    (b)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
    (c)配列番号：２のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
    (d)配列番号：２のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
    (e)配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
    (f)配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
  2. 以下の(g)〜(i)のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
    (g)配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
    (h)配列番号：２のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
    (i)配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
  3. 配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
  5. DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  6. 以下の(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
    (j)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
    (k)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
    (l)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
    (m)請求項５に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
  7. 請求項1〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
  8. 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
  9. 以下の（ｑ）〜（ｔ）のいずれかであるポリヌクレオチドを含有するベクター：
    (ｑ)以下に記載される（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
    (ｒ)以下に記載される（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
    (ｓ)以下に記載される（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
    (ｔ)以下に記載される（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド：
    (ｎ)配列番号：４のアミノ酸配列又は配列番号：４のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するポリヌクレオチド；
    (ｏ)配列番号：４のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
    (ｐ)配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつendo型ペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
  10. 請求項８または９に記載のベクターが導入された形質転換酵母。
  11. 請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現が抑制された形質転換酵母。
  12. 請求項９に記載される（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された形質転換酵母。
  13. 請求項８に記載のベクターを導入することによって、または、請求項５に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）に係る遺伝子を破壊することによって、請求項５に記載のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現が抑制された醸造用酵母。
  14. 請求項９に記載のベクターを導入することによって、または、請求項９に記載される（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド（ＤＮＡ）に係る遺伝子を破壊することによって、請求項９に記載される（ｎ）〜（ｐ）のいずれかのポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現が抑制された醸造用酵母。
  15. endo型ペプチダーゼ活性が減少した請求項１０に記載の醸造用酵母。
  16. 泡持ち能が向上した請求項１１または１２に記載の醸造用酵母。
  17. 請求項７に記載のタンパク質の発現量を抑制させることによって泡持ち能が向上した請求項１３に記載の醸造用酵母。
  18. 請求項１０〜１７のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
  19. 醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１８に記載の酒類の製造方法。
  20. 請求項１８または１９に記載の方法で製造された酒類。
  21. 配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するプロテイナーゼＡ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の泡持ち能について評価する方法。
  22. 被検酵母を培養し、配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するプロテイナーゼＡ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の泡持ち能を評価する方法。
  23. 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するプロテイナーゼＡ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子の発現が抑制されている被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
  24. 基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項７に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の少ない被検酵母を選択する、酵母の選択方法。



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