DE2818732A1

DE2818732A1 - Mischung und verfahren zur bestimmung von transferase- und proteaseaktivitaet

Info

Publication number: DE2818732A1
Application number: DE19782818732
Authority: DE
Inventors: Richard C Driscoll; Robert J Gargiulo
Original assignee: American Hospital Supply Corp
Current assignee: American Hospital Supply Corp
Priority date: 1977-08-05
Filing date: 1978-04-28
Publication date: 1979-02-15
Also published as: JPS5428195A; FR2399663B1; BE864577A; FR2399663A1; CA1087075A; CH645992A5

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft die fluorimetrische Bestimmung der Transferase- und Proteaseaktivität in Homogenaten und biologischen Lösungen bei Wellenlängen, die den im allgemeinen zur fluorimetrischen Bestimmung NADH-gekoppelter Reaktionen angewendet werden, unter Verwendung neuer Substratmischungen, die im wesentlichen aus bestimmten fluorigersen 5-Aminoisophthalsäurederivaten bestehen, die an Aminosäure— bestandteile gekoppelt sind, für welche die in Betracht kommenden Transferasen und Proteasen spezifisch sind.

Enzymsubstrate mit Naphthylaminen als chromogenen Gruppen, die an andere Aminosäuren gebunden sind, sind in der Literatur für die Bestimmung von Transferasen und Proteasen, wie y-Glutamyltranspeptidase, Leucinaminopeptidase, Oxytocinase -und Trypsin, beschrieben (siehe etwa Orlowski et al, Clin. Chim. Acta, 7:755-760 (1962) und hierin zitierte Autoren). Die Bestimmung von Transferase-und Proteaseaktivität in Humanserum, Urin und Geweben kann diagnostische Bedeutung haben, beispielsweise kann die Bestimmung der Y-Glutamyltranspeptidaseaktivität in Humanserum für die Differenzialdiagnose von Lebererkrankungen von Bedeutung sein, da die Enzymaktivität beim Stauungsikterus und bei Lebercarcinom besonders hoch ist, während bei Virushepatitis und Leberzirrhose geringere Aktivitäten beobachtet werden (siehe die obrige Arbeit von Orlowski et al, sowie Rosalki et al, Ann. Clin. Biochem. 7:14-3 (1970))· Die meisten Untersuchungen in Hinsicht auf die y-Glutamyltranspeptidasebestimmungen wurden unter Verwendung von Naphthylaminen bei der Zusammensetzung der Substrate ausgeführt" und unglücklicherweise sind die Produkte.(d.h. die Naphthylamine) sowohl toxisch als auch carcinogen, was ein unerwünschtes Risiko für den allgemeinen Laborgebrauch darstellt.

909&07/06B4

Viele der üblicherweise in klinischen Laboratorien durchgeführten Enzymbestimmungen sind NADH-abhängig, d.h. sie umfassen eine Reihe von Reaktionen, die schliesslich in der Reduktion von Nicotinamidadenindinucleotid (MD) in seine" reduzierte Form, NADH resultieren. Das NADH wird dann spektrofotometrisch oder fluorometrisch bestimmt. Die neueren fluorimetrischen Verfahren zeichnen sich vorteilhaft durch Einfachheit, Schnelligkeit und Wirtschaftlichkeit aus und weisen oft den weiteren Vorteil einer grösseren Empfindlichkeit auf. Typischerweise umfasst ein fluorimetri— scher NADH-abhängiger Test die Verwendung eines Filterfluorimeters, das ultraviolettes Licht bei einer Wellenlänge von etwa 340 nm auf die Oberfläche der Probe richtet und die !Fluoreszenz oder die Geschwindigkeit der !"luoreszenzänderung bei einer Emissionswellenlänge von etwa 465 nm misst.

Ils weitere Referenzstellen wird verwiesen auf die US-PS •3 979 '447, 3 862 011, 3 773 626, 3 591 4-58, 3 878 04-8, 3 892 631 sowie auf Wildes et al, J. Am. Chem. Soc, 95:8, 2610 (1973) und Bayley et al, Eur. J. Biochem. 56 (2)4-55-65 O975).

Die Erfindung liefert bestimmte Substanzen, die als Enzymsubstrate bei der fluorimetrischen Bestimmung von Transferase- (oder Transpeptidase-) Aktivität in Homogenaten und biologischen Flüssigkeiten brauchbar sind. Diese Substrate sind neu und im Laborgebrauch verhältnismässig sicher. Ein besonders wichtiger Vorteil liegt darin, dass diese Substrate bei der Spaltung durch die betreffenden Enzyme fluorigene Spaltprodukte liefern, die flu«rimetrische Erregungs_T und Emissionspeaks und -werte·aufweisen, die denen NADH-abhängiger Tests angenähert entsprechen, und dass deshalb die fluorimetrische Bestimmung der Transferase- oder Proteaseaktivität bei Verwendung solcher Substrate mit Standardfluorimetern unter Verwendung der gleichen !"ilter durchgeführt werden kann, wie sie für übliche NADH-abhängige■

-"■'■■■■■■"'■■-■-- — 6 —

Bestimmungen vorgesehen sind. So kann eine Transferase, wie γ-Glutamyltranspeptidase, unter Verwendung der gleichen fluorimetrischen Vorrichtung und Filter bestimmt werden, wie sie zur Durchführung äer Bestimmung anderer Enzyme, wie etwa SGOT, SGPT, GPK, LDH und HBD verwendet werden.

Die erfindungsgemässen Enzymsubstrate sind 5-Aminoisophthal säurederivate der allgemeinen Formel:

worin R₁ und R₂ jeweils -OH, -NH₂, -NHCH₃, -NHC₂Hc, -N(CH,)₂, -N(C₂H₅J₂, -N(CH₅) (C₂H₅), -OCH₃ oder -0(GHg)_nGH₅ mit η für eine ganze Zahl von 1 bis 4-, und R₃ einen Aminosäurerest, der vom Rest des Substrats abgespalten werden kann, wenn er einer für dieses Substrat spezifischen Transferase oder Protease ausgesetzt wird, in einigen Fällen in Gegenwart von Glycylglycin oder einem anderen geeigneten Akzeptor, wie Glutamat, Glycin oder Glycylglycylglycin, bedeuten. Solche Substrate, die Aminosäurereste (die mehrere Aminosäuregruppen umfassen können) besitzen und die für verschiedene Transferasen und Proteasen spezifisch sind, sind die im folgenden aufgeführten Verbindungen (der oben beschriebene fluorigene Rest ist jeweils mit dem Buchstaben A dargestellt):

Substrat Enzym. *

(A)-Lys-Ala DAP-II

(A)-Z-Ala-Arg-Arg Kathepsin B 1 ■

(A)-BZ-Val-Lys-Lys-Arg Kathepsin B 1a

(A 2-HCl)CBZ-Arg-Arg Kathepsin B 1 '

(A-Diacetat)-N-CBZ-Arg-Arg-Arg Trypsin .

(A 3-HCl)-L-Arg-Arg · DAP III

- 7 - ORIGINAL INSPECTED

909807/0654 · ■

Substrat Enzym

(A)-Z-Gly-Gly-Arg Anioaisches Trypsin, Plasminogen-

Aktivator, Proinsulin—Converting-

Enzym

(A)-Pro-Arg DAP-Ί oder Kathepsin C

(A)-fVBZ-Phe-Val-Arg Thrombin (di-A)-L-Gjstin Oxytocinase-

(A)-y-Glutamyl Y-Glutamyl-Transpeptidase

(A Fomniat)-L-I«eu-Gly-Gly

(A)-Leu Aminopeptidase

(A)-BZ-Arg-Pro-Gly-Phe-Phe-Leu Kathepsin D (A)-Phe-Pro-Ala-Met Kathepsin B 1b ^:

(A)-Glutaryl-Gly-L-Phe
(A)-Gly-Pro DAP-IV

(A)-CBZ-Pro-Ala-Gly-Pro Kollagenase (A)-His-Ser DAP I oder Kathepsin C

(A)-N-CBZ-L-Pro-L-Phe-L-His-L-
- Leu-ti-Leu-L-Val-L-Tyr-L-Ser
(A)-N-CBZ-Gly-L-Met Benin (A)-Glutaryl-Ala-Ala Elastase (A)-BZ-Arg-Pro-Gly-Phe-Phe-Pro - Kathepsin D (A)-AIa Aminopeptidase B

(A)-BZ-Arg Trypsin/Kathepsin B Λ

(A)-BZ-Arg-Gly-Leu
(A)-Met

(A)-BZ-Arg-Gly-Tyr DAP-I

(A)-Ser-Tyr Kathepsin C

In der obigen Tabelle werden die folgenden gebräuchlichen Abkürzungen verwendet: AIa (Alanin), Arg (Arginizf), BS (Benzoyl), CBZ und Z (Carbobenzoxy), GIy (Glycin), His (Histidin), Leu (Leucin), Lys (Lysin), Met (Methionin), Phe (Phenylalanin), Pro (Prolin), Ser (Serin), Tyr (Tyrosin), Tal (Yalin). Um die Lösungsraten zu erhöhen, können alle Substrate gegebenenfalls in Salze umgewandelt werden, wie

- 8 909807/0654 ORIGINAL INSPECTED

beispielsweise das Hydrochlorid, Hydrobromid, Acetat oder Formiat der betreffenden Aminosäure.

Jedes der Substrate wird, wenn es dem entsprechenden Enzym ausgesetzt ist, gespalten, wobei der Aminosäureanteil freigesetzt oder mit einem geeigneten Akzeptor, wie Glycylglycin, gekoppelt und das fluorigene primäre Amin (d.h. das oben genannte Substrat A, worin der Substi-tuent R^ ein Wasserstoffatom bedeutet) zurückbleibt. Alle diese fluorigenen aromatischen Amine weisen einen Erregungs- und Eiaissionseigenschaften (peaks) beim Kontakt mit UV-Licht auf, die hinreichend nahe an denen von NADH-abhängigen Tests liegen (Xex=340nm; Aem=465 nm),dass fluorimetrische Aktivitätsmessungen mit der gleichen Vorrichtung und den gleichen Filtern möglich sind, wie sie für übliche NADH-Tests eingesetzt werden. Diese Chromophore haben im besonderen einen Erregungspeak bei einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 380 nm und einen .JEmissionspeak bei einer Wellenlänge im Bereich von 420 bis 480 nm. Besitzt das Substrat A beispielsweise als Substituenten R/j und Rp Methoxygruppen, dann hat das erhaltene Chromophor einen Erregungspeak bei einer Wellenlänge von etwa 335 nm und einen Emissionspeak bei einer Wellenlänge von etwa 445

Bei der Durchführung des erfindungsgemassen Verfahrens wird das Substrat-zuerst in einer sterilen wässrigen Lösung gelöst, die vorzugsweise einen, geeigneten Puffer enthält, so dass das pH beim oder in der Nähe des pH-Optimums des in Betracht kommenden Enzyms gehalten wird. Soll beispielsweise als Enzym y-Glutamyltranspeptidase bestimmt werden, dann kann die Reaktion in einem breiten pH-Bereich>von etwa 7»5 bis 9,0 gemessen werden, wobei ein pH von 8,2 die maximale Aktivität im fluorimetrischen Bestimmungssystem liefert. Die Substratlösung wird mit der Probe (Suspension oder Lösung) gemischt und in eine geeignete Küvette überführt, wobei jedes geeignete iluorimeter zur Messung der Fluöres-

- 9 - -■■'■·■.: 90 9807/0654 - ■ '

zenz an der vorderen Oberfläche verwendet werden kann. Die Geschwindigkeit der Bildung der fluorigenen Verbindung ist der in der Probe vorliegenden Transferasemenge direkt proportional.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Serum-y-Glutamyltranspeptidase kann fluorimetrisch unter Verwendung von ^-(L-Glutamyl)-5-aniinoisophthalsäuredimethylester-Hydrochlorid als Substrat bestimmt werden. Dieses Substrat hat die folgende Strukturformel:

CIUO

O KH₂

HN-C-CH₀-CH₀-C-COOH' HCl

2 2 ,

H /C=O

OCH₃₅ ο

Die Reagenzienlösung enthielt 5 mM Substrat, 55 mM Glycylglycin und 100 mM Tris-Puffer (pH 8,2 bei 25°C), das Volumen der Lösung betrug 1,5 ml. Die Reagenzienlösung wurde auf 37°C erwärmt, die Probe wurde zugesetzt (Volumen 0,05 ml), die Reaktanten wurden gemischt und in eine Durchflussküvette gepumpt. Die Geschwindigkeit der Fluoreszenzzunahme wurde dann mindestens 4 min mit einem Instrument bestimmt, das die vordere Oberfläche erfasste (front-surface instrument) (A.ex=365 nm;/lem=4-65 nm). Nach einem solchen Verfahren* wurde " die Geschwindigkeit der Fluoreszenzänderung des Endprodukts (5-Aminoisophthalsäuredimethylester) der Hydrolyse des Substrats gemessen und die Steigung wurde als Änderung der Fluoreszenz pro Minute der Reaktion berechnet.

__ ₁₀ · 'ORIGINAL INSPECTED

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Beispiel 2

Die Ergebnisse von nach Beispiel 1 getesteten Serumproben wurden mit den Ergebnissen colorimetrischer Bestimmungen verglichen, die mit den gleichen Patientenproben unter Verwendung von GGTP-Eeagenz, wie es von der Dade Division der American Hospital Supply Corporation vertrieben wird, nach der in der Packungsbeilage dargelegten Methode erhalten worden. Um die Interpretation der Daten zu erleichtern, wurde der Wert für AP/min in internationale Einheiten pro Liter (IU/I) umgewandelt, indem man IU/1 und Λΐ/min aufsummierte dividierte' und hieraus einen Faktor IU/AF ableitete. Die Seren wurden in zwei Gruppen von je 14 getestet, wobei eine Gruppe nicht diagnostizierte Proben und die andere Gruppe diagnostizierte Proben umfasste. Die Ergebnisse waren wie folgt:

V-Glutamyl-rTranspeptidase-Aktivität (IU/1)

Probe	9	Fluorometrisch	Colorimetrisch.
1	47	45
2	• 52	51
3	12,5	17
4	85,4	79
VJl	113,4	110
6	196,9	195
7	14,5	17
8	14,5	18
9	345	344
10	43,4	48
11	48,8	* 72,
12	236,4 -	225
13 .	212,3	198 -
14	259,6 ·	260
15	80,9	87
16 Metastagierendes	Carcinom 87,5	119 -
17 Gastritis	~~. 89,5	94
	- 11 -
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ORiGINAL INSPECTED

166,4	172
23	26
181	184
250,4	264
146,7	148
164,0	167
215,4	200
14,7	14
62,8	47
174,2	150
193,5	178

Probe Fluorometrisch Colorimetrisch

18 Dehydratation

19 Verschlussikterus

20 Kolostomie

21 Hepatomegalie

22 Blasencarcinom

23 Ikterisch

24 Hüftleiden

25 M.Hodgkin

26 Brustschmerz, Hypertonie

27 PuIm. Embolus

28 Sarcoidose

Die erwähnten Werte zeigen eine ausgezeichnete Korrelation zwischen der fluorimetrischen Methode und der üblichen colorimetrischen Methode für die Bestimmung von γ-Glutamyl-Transpeptidase-rSerumspiegeln.

Beispiel 3

Das in Beispiel 1 als Substrat verwendete f-(L-GIutamyl)-5-aminoisophthalsäuredimethylester-Hydrochlorid kann hergestellt werden, indem man Phthaloylglutaminsäureanhydrid (13,2 g, 0,051 mol) und 5-Aminoisophthalsäuredimethylester (10,4 g, 0,050 mol) in 60 ml Dioxan mischt und 1,5 h bei 55 bis 60 C (Badtemperatur) rührt. Nach Abziehen des Lösungsmittels wird der Rückstand in 200 ml Methanol und Hydrazinhydrat (7,5 S, 0,15 mol) gelöst. Die Lösung sollte dann filtriert und 2 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen werden. Ein dabei entstehender weisser Niederschlag wird gesammelt, mit 100 ml Wasser und 25 ml Ethanol geVaschen, in 100 ml 0,5 N Salzsäure verrührt und filtriert. Das Filtrat wird mit Natriumbicarbonat auf einen pH von 6,5 bis 7,0 gebracht und der niederschlag (8 g) wird gesammelt und getrocknet. Das Hydrochloridsalz kann dann hergestellt werden, indem man 1 g des Glutamylderivats in einer Lösung von 0,3 ml konzentrierter Salzsäure und 6 ml Methanol löst.

Nach Abziehen des Methanols wird der Feststoff unter vermindertem Druck getrocknet.

Beispiel 4-

Das folgende Verfahren kann zur Herstellung anderer 5-Aminoisophthalsäurederivate, die dann an geeignete Aminosäurereste, wie bereits erwähnt, gekoppelt wer'den können, verwendet werden:

COOH

OOH

(1) SOCl.

(2) ROH

COOR

(H)

COOR

Soll ein Amid gebildet werden, dann wird in dieser Gleichung RNH₂ anstelle von ROH eingesetzt. In jedem lall wird das Endprodukt dann mit der jeweils gewünschten speziellen Aminosäure in der geeigneten Form (wie in Beispiel 3 im Zusammenhang mit Phthaloylglutaminsäureanhydrid) zur Reaktion gebracht und man erhält schliesslich das Aminosäurederivat von Aminophthalsäure, das als Substrat für die Bestimmung von Transpeptidase- und/oder Proteaseaktivität verwendet werden soll.

- 13 909807/0654

Claims

Dipl.-Ing.

RolfCharrier

Patentanwalt

Rehlingenstraße 8 ■ Postfach 260

D-8900 Augsburg 31

Telefon 0821/36015+36016

Telex 53 3 275

Postscheckkonto: München Nr. 1547 89-801

7516/03/

Augsburg, den 27. April 1978

American Hospital Supply Corporation One American Plaza
Evanston, Illinois 60201/USA

Mischung und Verfahren zur Bestimmung von Transferase- und Proteaseaktivität

PATENTANSPRÜCHE :

Substanz zur Verwendung als Substrat bei einer fluorimetrischen Bestimmung von Transferase- und Proteaseaktxvitat, dadurch gekennzeichnet, dass sie der folgenden allgemeinen Formel entspricht:

GOß.

NHR,

worin ILj und R₂ jeweils -OH, -NH₂, -NHCH,, -N(OgH₅)g, -N(CH₃) (C₂H₅), -OCH₅ oder 0(CSH₂

mit η-für

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■säurüfefeifBe-

eine ganze Zahl von 1 bis 4, und R₃ einen Aminosäure deuten, der vom Rest dieses Substrats in Gegenwart einer Transferase oder Protease mit einer für dieses Substrat spezifischen Wirkung abgespalten werden kann.
2. Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R, ein Aminosäurerest ist, der auf Glycylglycin übertragbar ist, wenn dieses Substrat mit Glycylglycin· in Gegenwart einer für dieses Substrat spezifischen Transferase zur Reaktion gebracht wird.
3. Substanz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass R- und R₂ jeweils -OCH₃ sind, und dieses Substrat bei der fluorimetrischen Bestimmung von γ-Glutamyltranspeptidase brauchbar ist.
4. Abänderung der Substanz nach Anspruch 1 als Reagenz zur Verwendung bei der fluorimetrischen Bestimmung der Trans-

"feraseaktivität von r-Glutamyltranspeptidase, dadurch gekennzeichnet, dass es ein y-Glutamylderivat von 5-Aminoisophthalsäure, des Dimethylesters davon oder von deren Salzen, einen Akzeptor für den GIutamy!anteil/ während dieses Derivat in Gegenwart von y-Glutamyltranspeptidase gespalten wird, sowie einen Puffer zur Einstellung eines pH im Bereich von 7,5 bis 9,0 umfasst.
5. Substanz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Akzeptor Glycylglycin ist.
6. Fluorimetrisches Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Transferasen und Proteasen in Proben von biologischen Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass ein Substrat und eine Probe von Körperflüssigkeit, die eine Transferase oder Protease enthält, die dieses Substrat spalten kann, gemischt und zur Reaktion gebracht werden, dieses Gemisch dann UV-Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 380 nm ausgesetzt und die Geschwindigkeit der Änderung der Fluoreszenz

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bei einer Wellenlänge im Bereich von 420 bis 480 nm gemessen wird, wobei das Substrat der allgemeinen Formel entspricht:

COE₁

-WHR₂

worin R^ und R₂ jeweils -OH, -NH₂, -NHCH₅, -NHC₂H₅, -N(C₂H₅J₂, -N(CH₅) (C₂H₅), -OCH₅ oder -0(CHg)_nGHj mit η für eine ganze Zahl von 1 bis 4, und R₅ einen Aminosäurerest, der vom Rest dieses Substrats in Gegenwart einer für dieses Substrat spezifischen Transferase oder Protease abgespalten werden kann, bedeuten.
7. " Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgemisch UV-Licht mit einer Wellenlänge von etwa 365 nm ausgesetzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung der Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von etwa 465 nm gemessen wird.
9. "Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Glycylglycin beim Mischen von Substrat und Probe miteingemischt wird und als R₅ ein Aminosäurerest verwendet wird, der während des Mischens auf Glycylglycin übertragen werden kann. «.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als R₅ y-Glutamyl und als Transferase ^Glutamyltranspeptidase verwendet werden.
11. Fluorimetrisches Verfahren zur Bestimmung der Akti-

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vität von y-Glutamyltranspeptidase in einer Probe einer
biologischen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass ein Ύ-Glutamylderivat von 5-Aminoisophthalsäure, dessen Dimethylesters oder von deren Salzen mit einem V-Glutamylakzeptor, einem Puffer zur Einstellung eines pH im Bereich von 7,5 bis 9,0 und einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, die
γ-Glutamyltranspeptidase enthält, gemischt und zur Reaktion gebracht wird, das Gemisch dann UV-Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 380 nm ausgesetzt und die Geschwindigkeit der Änderung der Fluoreszenz bei einer Wellenlänge im Bereich von 420 bis 480 nm gemessen wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgemisch UV-Licht mit einer Wellenlänge von etwa 365 nm ausgesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung der Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von etwa 465 nm gemessen wird.
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Akzeptor Glycylglycin verwendet wird.
15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man ein y-Glutamylderivat von 5-Aminoisophthalsäuredimethylester oder eines Salzes davon verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man ein y-Glutamylderivat von 5-Aminoisophthalsäure oder eines Salzes davon verwendet.

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