CH645992A5 - Reagent for the fluorimetric determination of transferase and protease activity and its use for this determination - Google Patents

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CH645992A5
CH645992A5 CH239478A CH239478A CH645992A5 CH 645992 A5 CH645992 A5 CH 645992A5 CH 239478 A CH239478 A CH 239478A CH 239478 A CH239478 A CH 239478A CH 645992 A5 CH645992 A5 CH 645992A5
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glycylglycine
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Robert J Gargiulo
Richard C Driscoll
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American Hospital Supply Corp
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Description

La présente invention a pour objet un réactif pour la détermination fluorimétrique de l'activité des transférases et des protéases dans des échantillons de liquides biologiques.
Elle se rapporte également à l'utilisation du réactif précité pour cette détermination fluorimétrique.
On a décrit dans la littérature des substrats enzymatiques comportant des naphtylamines comme groupes chromogènes unis à des amino-acides pour la détermination des transférases et des protéases telles que la y-glutamyltranspeptidase, la leucine-aminopeptidase, l'ocytocinase et la trypsine (cf. Orlowski et al., «Clin. Chim. Acta», 7:755-760 (1962) et les références qui y sont citées). La détermination de l'activité transférasique et protéasique du sérum, de l'urine et des tissus d'origine humaine peut être utile au diagnostic; par exemple, la détermination de l'activité y-glutamyltranspeptidasique dans le sérum humain peut être utile pour établir le diagnostic différentiel des affections hépatiques, car l'activité enzymatique est particulièrement élevée dans l'ictère par obstruction et le cancer du foie, alors qu'on observe des activités plus faibles dans l'hépatite virale et la cirrhose du foie [cf. Orlowski et al., supra, et également Rosalki et al., «Ann. Clin. Biochem.», 7:143 (1970)]. La majorité des études concernant la détermination de l'activité y-glutamyltranspeptidasi-que ont été effectuées avec ces naphtylamines dans les substrats, ces naphtylamines présentant l'inconvénient d'être toxiques et cancérigènes, si bien que, de façon générale, leur emploi au laboratoire est indésirable.
Beaucoup des déterminations enzymatiques couramment effectuées par les laboratoires médicaux comportent des séries de réactions qui se terminent par une réduction du nicotinamide-adéninedi-nucléotide (NAD) en sa forme réduite, le NADH. On détecte ensuite le NADH par spectrophotométrie ou fluorimétrie. Les méthodes fluorimétriques les plus récentes présentent l'avantage d'être simples, rapides et économiques et, souvent, plus sensibles. De façon typique, dans les déterminations fluorimétriques où l'on utilise le NADH, on utilise un fluorimètre à filtre qui dirige un faisceau de lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde d'environ 340 nm contre la surface de l'échantillon et on mesure la fluorescence ou la vitesse de variation de la fluorescence pour une longueur d'onde d'émission d'environ 465 nm.
On trouvera d'autres références relatives à l'art antérieur dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 3979447, 3862011, 3773626, 3591458, 3878048 et 3892631, ainsi que dans Wildes et al., «J. Am. Chem. Soc.», 95:8, 2610 (1973) et Bayley et al., «Eur. J. Biochem.», 56 (2), 465-65 (1975).
L'invention repose sur la découverte de certaines compositions utilisables comme substrats enzymatiques pour la détermination fluorimétrique de l'activité transférasique (ou transpeptidasique) dans des homogénéisats et des liquides biologiques. Ces substrats sont nouveaux et on peut les utiliser au laboratoire relativement sans risques. Un avantage particulièrement important est que ces substrats produisent, après attaque par les enzymes étudiées, des fragments fluorescents qui présentent un pic d'excitation fluorimétrique
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et des valeurs d'émission voisines de celles des déterminations utilisant le NADH, si bien que, pour déterminer par fluorimétrie l'activité transférasique ou protéasique avec ces substrats, on peut utiliser les fluorimètres classiques avec les mêmes filtres que pour les déterminations classiques à partir du NADH.
On peut ainsi évaluer l'activité d'une transférase telle que la y-glutamyltranspeptidase avec le même appareillage de fluorimétrie et les mêmes filtres que pour la détermination d'autres enzymes telles que la SGOT, la SGPT, la CPK, la LDH et l'HBD.
Les substrats enzymatiques de l'invention sont des dérivés d'acide amino-5 isophtalique de formule générale:
C0Ri vO/"nhr*
dans laquelle:
et R2 représentent, respectivement, —OH, —NH2, —NHCH3, —NHC2H5, — N(CH3)2, —N(C2H5)2, -N(CH3)(C2H5), -OCH3 ou -0(CH2)nCH3;
n est un nombre entier de 1 à 4, et
R3 représente un fragment d'amino-acide qui peut être séparé du reste du substrat sous l'effet d'une transférase ou d'une protéase présentant une activité spécifique vis-à-vis du substrat, dans certains cas en présence de glycylglycine ou d'un autre accepteur approprié tel qu'un glutamate, la glycine ou la glycylglycylglycine.
Ces substrats, qui comportent des fragments d'amino-acide (qui peuvent être constitués de plusieurs groupes d'amino-acides) et qui sont spécifiques de diverses transférases et protéases, figurent ci-après [dans chaque cäs, le fragment fluorescent précédemment indiqué est représenté par l'abréviation (A)]:
Substrat
Enzyme
(A)-lys-ala
DAP-II
(A)-Z-ala-arg-arg
Cathépsine B 1
(A)-BZ-val-lys-lys-arg
Cathepsine B la
(A 2-HCl)CBZ-arg-arg
Cathepsine B 1
(A-diacétate)-N-CBZ-arg-arg-
Trypsine arg
(A 3-HCl)-L-arg-arg
DAP-III
(A)-Z-gly-gly-arg
Trypsine anionique, activateur
de la profibrinolysine,
enzyme de conversion de la
pro-insuline
(A)-pro-arg
DAP-I ou cathepsine C
(A)-a-BZ-phe-val-arg
Thrombine
(di-A)-L-cystine
Ocytocinase
(A)-y-glutamyle y-Glutamyltranspeptidase
(A formiate)-L-leu-gly-gly
(A)-leu
Aminopeptidase
(A)-BZ-arg-pro-gly-phe-phe-
Cathepsine D
leu
(A)-phe-pro-ala-met
Cathepsine B lb
(A)-glutaryl-gly-L-phe
(A)-gly-pro
DAP-IV
(A)-CBZ-pro-ala-gly-pro
Collagénase
(A)-his-ser
DAP-I ou cathepsine C
(A)-N-CBZ-L-pro-L-phe-L-
his-L-leu-L-leu-L-val-L-tyr-
L-ser
Substrat
Enzyme
(A)-N-CBZ-gly-L-met
Rénine
(A)-glutaryl-ala-ala
Elastase
(A)-BZ-arg-pro-gly-phe-phe-
Cathepsine D
pro
(A)-ala
Aminopeptidase B ••.
(A)-BZ-arg
Trypsine/cathepsine B 1
(A)-BZ-arg-gly-leu
(A)-met
(A)-BZ-arg-gly-tyr
DAP-I
(A)-ser-tyr
Cathepsine C
Dans les formules ci-avant, on utilise les abréviations habituelles suivantes: ala (alanine), arg (arginine), BZ (benzoyle), CBZ et Z (carbobenzoxy), gly (glycine), his (histidine), leu (leucine), lys (lysine), met (métionine), phen (phénylalanine), pro (proline), ser (sérine), tyr (tyrosine) et val (valine). Pour accroître les taux de solubilité, on peut, si on le désire, transformer tous ces substrats en des sels tels que, par exemple, les chlorhydrates, bromhydrates, acétates ou formiates des amino-acides.
Chacun de ces substrats, lorsqu'on le met au contact de l'enzyme correspondante, est clivé, le fragment d'amino-acide étant libéré ou couplé à un accepteur approprié tel que la glycylglycine, pour laisser l'amine primaire fluorescente (c'est-à-dire le substrat (A) précédemment indiqué, où le symbole R3 représente un atome d'hydrogène). Toutes ces aminés aromatiques fluorescentes présentent un pic d'excitation et des caractéristiques d'émission, lorsqu'on les expose à la lumière ultraviolette, suffisamment voisines de celles observées dans les déterminations utilisant le NADH (Xex = 340 nm; Àcm=465 nm) pour permettre la mesure de l'activité fluorimétrique avec le même appareillage et les mêmes filtres que ceux employés pour les déterminations classiques utilisant le NADH. Plus particulièrement, ces chromophores ont des pics d'excitation correspondant à une longueur d'onde comprise dans la gamme de 320 à 380 nm et des pics d'émission correspondant à une longueur d'onde comprise dans la gamme de 420 à 480 nm. Par exemple, si les symboles Rj et R2 du substrat (A) sont des radicaux méthoxy, le chromophore présente un pic d'excitation à une longueur d'onde d'environ 335 nm et un pic d'émission à une longueur d'onde d'environ 445 nm.
Dans la mise en pratique du procédé de l'invention, on dissout tout d'abord le substrat dans une solution aqueuse stérile renfermant de préférence un tampon approprié afin que le pH soit maintenu à la valeur optimale d'activité de l'enzyme étudiée ou au voisinage de cette valeur. Par exemple, lorsque l'enzyme que l'on désire mesurer est la y-glutamyltranspeptidase, on peut effectuer la réaction dans une gamme étendue de pH d'environ 7,5 à 9,0, un pH de 8,2 conduisant à l'activité maximale dans le système de détermination fluorimétrique. On mélange la solution du substrat à l'échantillon (suspension ou solution) et on introduit l'ensemble dans une cuve appropriée d'un fluorimètre approprié pour mesurer la fluorescence de la surface avant. La vitesse de formation du composé fluorescent est directement proportionnelle à la quantité de transférase présente dans l'échantillon.
D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et des exemples donnés à titre illustratif mais non limitatif.
Exemple 1 :
On peut, pour déterminer par fluorimétrie la y-glutamyltranspeptidase sérique, utiliser comme substrat le chlorhydrate de l'ester diméthylique de l'acide y-(L-glutamyl)amino-5 isophtalique.
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4
Ce substrat répond à la formule développée suivante:
CH3°\ /°
Echantillon
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16 Cancer à métastases
Fluorimétrie
47
45
52
51
12,5
17
85,4
79
113,4
110
196,9
195
14,5
17
14,5
18
345
344
43,4
48
48,8
72
236,4
225
121,3
198
259,6
260
80,9
87
87,5
119
Colori-métrie nh2
NH-C-CH2-CH2-C-COOH» HCl
I
H
/C=°
OCH3
La solution réactive a une concentration de 5 mM en substrat, de 55 mM en glycylglycine et de 100 mM en tampon tris (pH 8,2 à 25°C), le volume de la solution étant de 1,5 ml. On chauffe la solution réactive à 37° C, on ajoute l'échantillon (0,05 ml), on mélange et on pompe dans une cuve à écoulement. On mesure ensuite la vitesse d'accroissement de la fluorescence pendant une durée minimale de 4 min avec un appareil de détermination de la fluorescence de la surface avant (Xex=365 nm; Xem=465 nm). On mesure ainsi la vitesse de variation de la fluorescence du produit final (ester dimé-thylique de l'acide amino-5 isophtalique) produit par l'hydrolyse du substrat et on calcule la pente pour connaître la variation de la fluorescence par minute de réaction.
Exemple 2:
On compare les résultats de déterminations effectuées sur des échantillons de sérum, comme indiqué dans l'exemple 1, aux résultats de déterminations colorimétriques effectuées sur les mêmes échantillons avec le réactif GGTP commercialisé par Dade Division of American Hospital Supply Corporation, que l'on utilise selon les indications de la notice jointe. Pour faciliter l'interprétation des résultats, on transforme la valeur AF/min en unités internationales par litre (UI/1) par totalisation de UI/1 et AF/min et détermination du facteur UI/AF. On analyse les sérums en deux groupes de 14, un groupe correspondant à des états non diagnostiqués et l'autre à des états diagnostiqués. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau ci-après.
Ces résultats montrent l'excellente corrélation entre le procédé fluorimétrique et le procédé colorimétrique classique dans la détermination des teneurs sériques en y-glutamyltranspeptidase.
Activité y-glutamyltranspeptidasique (UI/1)
Echantillon
Fluorimétrie
Colorimetrie
17 Gastrites
89,5
94
18 Déshydratation
166,4
172
19 Ictère par obstruction
23
26
20 Colostomie
181
184
21 Hépatomégalie
250,4
264
22 Cancer de la vessie
146,7
148
23 Ictère
164,0
167
24 Problèmes de hanche
215,4
200
25 Maladie de Hodgkin
14,7
14
26 Douleurs thoraciques, hypertension ...
62,8
47
27 Embolie pulmonaire
174,2
150
28 Sarcaïdose
193,5
178
30
40
Exemple 3:
Pour préparer le chlorhydrate de l'ester diméthylique de l'acide y-(L-glutamyl)amino-5 isophtalique utilisé comme substrat dans 1 l'exemple 1, on peut mélanger 13,2 g (0,051 mol) d'anhydride phta-loylglutamique et 10,4 g (0,050 mol) d'ester diméthylique de l'acide amino-5 isophtalique dans 60 ml de dioxanne et agiter au bain-marie à 55-60° C pendant 1,5 h. Après évaporation du solvant, on dissout le résidu dans 200 ml de méthanol et 7,5 g (0,15 mol) d'hydrate d'hy-drazine. On filtre ensuite la solution et on la laisse reposer pendant 2 d à la température ordinaire. On recueille un précipité blanc qu'on lave avec 100 ml d'eau et 25 ml d'éthanol, qu'on agite dans 100 ml d'acide chlorhydrique 0,5N, puis que l'on filtre. On traite le filtrat avec du bicarbonate de sodium pour porter le pH entre 6,5 et 7,0 et on recueille le précipité (8 g), puis on le sèche. On peut ensuite, pour préparer le chlorhydrate, dissoudre 1 g du dérivé glutamylique dans une solution de 0,3 ml d'acide chlorhydrique concentré et 6 ml de méthanol. Après évaporation du méthanol, on sèche le solide sous pression réduite.
Exemple 4:
On peut utiliser le mode opératoire suivant pour préparer 45 d'autres dérivés d'acide amino-5 isophtalique que l'on peut copuler avec des amino-acides appropriés comme indiqué:
COOH
(1) S0Ct2
55
65
COOR
COOR
Lorsqu'on désire former un amide, on remplace dans l'équation ROH par RNH2. Dans tous les cas, on fait ensuite réagir le produit
final avec l'amino-acide particulier désiré sous la forme appropriée (comme illustré dans l'exemple 3 pour l'anhydride phtaloylglut-amique) afin d'obtenir le dérivé d'amino-acide d'acide aminophtali-que final qu'on utilise comme substrat pour la détermination de l'activité transpeptidasique et/ou protéasique. 5
645 992
Bien entendu, la présente invention n'est nullement limitée aux exemples et modes de mise en œuvre mentionnés ci-dessus; elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans que l'on s'écarte de l'esprit de l'invention.
R

Claims (14)

645 992
1. Réactif pour la détermination fluorimétrique de l'activité des transférases et des protéases dans des échantillons de liquides biologiques, caractérisé en ce qu'il contient au moins un substrat ayant pour formule: mud cor2
dans laquelle:
Ri et R2 représentent, respectivement, —OH, —NH2,
-NHCH3, -NHC2H5, -N(CH3)2, -N(C2H5)2i -N(CH3)(C2H5), -OCHj ou — 0(CH2)nCH3;
n est un nombre entier de 1 à 4, et
R3 représente un fragment d'amino-acide pouvant être clivé du reste du substrat en présence d'une transférase ou d'une protéase ayant une activité spécifique sur ce substrat.
2. Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que R3 représente un fragment d'amino-acide pouvant être transféré à la glycylglycine lorsqu'on fait réagir ce substrat avec la glycylglycine en présence d'une transférase présentant une activité spécifique sur ce substrat.
2
REVENDICATIONS
3. Réactif selon la revendication 2, caractérisé en ce que Rj et R2 représentent, respectivement, —OCH3, ce substrat étant utile pour la détermination fluorimétrique de la y-glutamyltranspepti-dase.
4. Réactif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le substrat consiste en le dérivé y-glutamylique de l'ester dimé-thylique de l'acide amino-5 isophtalique ou d'un sel correspondant, et en ce qu'il contient en outre un accepteur du fragment glutamyle lorsque ce dérivé est clivé en présence de y-glutamyltranspeptidase et un tampon pour maintenir le pH dans la gamme de 7,5 à 9,0.
5. Réactif selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'accepteur est la glycylglycine.
6. Utilisation du réactif selon l'une des revendications 1 à 5 à la détermination fluorimétrique de l'activité des transférases et des protéases dans des échantillons de liquides biologiques, caractérisée en ce que l'on mélange et fait réagir ledit réactif et un échantillon de liquide biologique contenant une transférase ou une protéase capables de cliver le substrat, puis on expose ce mélange à l'action d'une lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde comprise dans la gamme de 320 à 380 nm et on mesure la vitesse de variation de la fluorescence à une longueur d'onde comprise dans la gamme de 420 à 480 nm.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'on expose le mélange réactionnel à l'action d'une lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde d'environ 365 nm.
8. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'on mesure la variation de la fluorescence à une longueur d'onde d'environ 465 nm.
9. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que, dans le stade de mélange, on mélange de la glycylglycine au réactif et à l'échantillon et en ce que le symbole R3 représente un fragment d'amino-acide pouvant être transféré sur la glycylglycine lors de ce stade de mélange.
10. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que R3 représente le radical y-glutamyle et la transférase est la y-glut-amyltranspeptidase.
11. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'on mélange et fait réagir un dérivé y-glutamylique de l'ester dimé-thylique de l'acide amino-5 isophtalique, ou un sel correspondant, avec un accepteur de y-glutamyle, un tampon pour maintenir le pH dans la gamme de 7,5 à 9,0 et un échantillon de liquide biologique contenant de la y-glutamyltranspeptidase, puis on expose le mélange
à l'action d'une lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde comprise dans la gamme de 320 à 380 nm et on mesure la vitesse de variation de la fluorescence à une longueur d'onde comprise dans la gamme de 420 à 480 nm.
12. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'on expose le mélange réactionnel à l'action d'une lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde d'environ 365 nm.
13. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'on mesure la variation de la fluorescence à une longueur d'onde d'environ 465 nm.
14. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'accepteur est la glycylglycine.
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