CH645992A5

CH645992A5 - Reagent for the fluorimetric determination of transferase and protease activity and its use for this determination

Info

Publication number: CH645992A5
Application number: CH239478A
Authority: CH
Inventors: Robert J Gargiulo; Richard C Driscoll
Original assignee: American Hospital Supply Corp
Priority date: 1977-08-05
Filing date: 1978-03-06
Publication date: 1984-10-31
Also published as: DE2818732A1; JPS5428195A; CA1087075A; BE864577A; FR2399663A1; FR2399663B1

Description

La présente invention a pour objet un réactif pour la détermination fluorimétrique de l'activité des transférases et des protéases dans des échantillons de liquides biologiques. The present invention relates to a reagent for the fluorimetric determination of the activity of transferases and proteases in samples of biological fluids.

Elle se rapporte également à l'utilisation du réactif précité pour cette détermination fluorimétrique. It also relates to the use of the aforementioned reagent for this fluorimetric determination.

On a décrit dans la littérature des substrats enzymatiques comportant des naphtylamines comme groupes chromogènes unis à des amino-acides pour la détermination des transférases et des protéases telles que la y-glutamyltranspeptidase, la leucine-aminopeptidase, l'ocytocinase et la trypsine (cf. Orlowski et al., «Clin. Chim. Acta», 7:755-760 (1962) et les références qui y sont citées). La détermination de l'activité transférasique et protéasique du sérum, de l'urine et des tissus d'origine humaine peut être utile au diagnostic; par exemple, la détermination de l'activité y-glutamyltranspeptidasique dans le sérum humain peut être utile pour établir le diagnostic différentiel des affections hépatiques, car l'activité enzymatique est particulièrement élevée dans l'ictère par obstruction et le cancer du foie, alors qu'on observe des activités plus faibles dans l'hépatite virale et la cirrhose du foie [cf. Orlowski et al., supra, et également Rosalki et al., «Ann. Clin. Biochem.», 7:143 (1970)]. La majorité des études concernant la détermination de l'activité y-glutamyltranspeptidasi-que ont été effectuées avec ces naphtylamines dans les substrats, ces naphtylamines présentant l'inconvénient d'être toxiques et cancérigènes, si bien que, de façon générale, leur emploi au laboratoire est indésirable. Enzymatic substrates comprising naphthylamines as chromogenic groups joined to amino acids have been described in the literature for the determination of transferases and proteases such as γ-glutamyltranspeptidase, leucine-aminopeptidase, oxytocinase and trypsin (cf. Orlowski et al., "Clin. Chim. Acta", 7: 755-760 (1962) and the references cited therein). Determination of the transferase and protease activity of serum, urine and tissues of human origin can be useful for diagnosis; for example, the determination of γ-glutamyltranspeptidasic activity in human serum can be useful for establishing the differential diagnosis of liver diseases, since the enzymatic activity is particularly high in obstructive jaundice and liver cancer, whereas 'weaker activities are observed in viral hepatitis and cirrhosis of the liver [cf. Orlowski et al., Supra, and also Rosalki et al., "Ann. Clin. Biochem. ", 7: 143 (1970)]. The majority of studies concerning the determination of the y-glutamyltranspeptidasi-activity have been carried out with these naphthylamines in the substrates, these naphthylamines having the disadvantage of being toxic and carcinogenic, so that, in general, their use in laboratory is undesirable.

Beaucoup des déterminations enzymatiques couramment effectuées par les laboratoires médicaux comportent des séries de réactions qui se terminent par une réduction du nicotinamide-adéninedi-nucléotide (NAD) en sa forme réduite, le NADH. On détecte ensuite le NADH par spectrophotométrie ou fluorimétrie. Les méthodes fluorimétriques les plus récentes présentent l'avantage d'être simples, rapides et économiques et, souvent, plus sensibles. De façon typique, dans les déterminations fluorimétriques où l'on utilise le NADH, on utilise un fluorimètre à filtre qui dirige un faisceau de lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde d'environ 340 nm contre la surface de l'échantillon et on mesure la fluorescence ou la vitesse de variation de la fluorescence pour une longueur d'onde d'émission d'environ 465 nm. Many of the enzyme determinations commonly performed by medical laboratories involve series of reactions that end in a reduction of the nicotinamide-adeninedi-nucleotide (NAD) to its reduced form, NADH. NADH is then detected by spectrophotometry or fluorimetry. The most recent fluorimetric methods have the advantage of being simple, rapid and economical and, often, more sensitive. Typically, in fluorimetric determinations where NADH is used, a filter fluorimeter is used which directs an ultraviolet light beam having a wavelength of about 340 nm against the surface of the sample and measures fluorescence or the rate of change of fluorescence for an emission wavelength of approximately 465 nm.

On trouvera d'autres références relatives à l'art antérieur dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 3979447, 3862011, 3773626, 3591458, 3878048 et 3892631, ainsi que dans Wildes et al., «J. Am. Chem. Soc.», 95:8, 2610 (1973) et Bayley et al., «Eur. J. Biochem.», 56 (2), 465-65 (1975). Other references relating to the prior art can be found in United States patents Nos. 3979447, 3862011, 3773626, 3591458, 3878048 and 3892631, as well as in Wildes et al., "J. Am. Chem. Soc. ", 95: 8, 2610 (1973) and Bayley et al.," Eur. J. Biochem. ”, 56 (2), 465-65 (1975).

L'invention repose sur la découverte de certaines compositions utilisables comme substrats enzymatiques pour la détermination fluorimétrique de l'activité transférasique (ou transpeptidasique) dans des homogénéisats et des liquides biologiques. Ces substrats sont nouveaux et on peut les utiliser au laboratoire relativement sans risques. Un avantage particulièrement important est que ces substrats produisent, après attaque par les enzymes étudiées, des fragments fluorescents qui présentent un pic d'excitation fluorimétrique The invention is based on the discovery of certain compositions which can be used as enzymatic substrates for the fluorimetric determination of transferase (or transpeptidasic) activity in homogenates and biological liquids. These substrates are new and can be used in the laboratory relatively safely. A particularly important advantage is that these substrates produce, after attack by the enzymes studied, fluorescent fragments which have a fluorimetric excitation peak

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

3 3

645 992 645,992

et des valeurs d'émission voisines de celles des déterminations utilisant le NADH, si bien que, pour déterminer par fluorimétrie l'activité transférasique ou protéasique avec ces substrats, on peut utiliser les fluorimètres classiques avec les mêmes filtres que pour les déterminations classiques à partir du NADH. and emission values close to those of the determinations using NADH, so that, to determine by fluorimetry the transferase or protease activity with these substrates, the conventional fluorimeters can be used with the same filters as for the conventional determinations from from NADH.

On peut ainsi évaluer l'activité d'une transférase telle que la y-glutamyltranspeptidase avec le même appareillage de fluorimétrie et les mêmes filtres que pour la détermination d'autres enzymes telles que la SGOT, la SGPT, la CPK, la LDH et l'HBD. We can thus evaluate the activity of a transferase such as γ-glutamyltranspeptidase with the same fluorimetry apparatus and the same filters as for the determination of other enzymes such as SGOT, SGPT, CPK, LDH and l 'HBD.

Les substrats enzymatiques de l'invention sont des dérivés d'acide amino-5 isophtalique de formule générale: The enzymatic substrates of the invention are derivatives of 5-isophthalic acid of general formula:

C0Ri vO/"nhr* C0Ri vO / "nhr *

dans laquelle: in which:

et R2 représentent, respectivement, —OH, —NH2, —NHCH3, —NHC2H5, — N(CH3)2, —N(C2H5)2, -N(CH3)(C2H5), -OCH3 ou -0(CH2)nCH3; and R2 represent, respectively, —OH, —NH2, —NHCH3, —NHC2H5, - N (CH3) 2, —N (C2H5) 2, -N (CH3) (C2H5), -OCH3 or -0 (CH2) nCH3 ;

n est un nombre entier de 1 à 4, et n is an integer from 1 to 4, and

R3 représente un fragment d'amino-acide qui peut être séparé du reste du substrat sous l'effet d'une transférase ou d'une protéase présentant une activité spécifique vis-à-vis du substrat, dans certains cas en présence de glycylglycine ou d'un autre accepteur approprié tel qu'un glutamate, la glycine ou la glycylglycylglycine. R3 represents an amino acid fragment which can be separated from the rest of the substrate under the effect of a transferase or of a protease exhibiting a specific activity with respect to the substrate, in certain cases in the presence of glycylglycine or another suitable acceptor such as glutamate, glycine or glycylglycylglycine.

Ces substrats, qui comportent des fragments d'amino-acide (qui peuvent être constitués de plusieurs groupes d'amino-acides) et qui sont spécifiques de diverses transférases et protéases, figurent ci-après [dans chaque cäs, le fragment fluorescent précédemment indiqué est représenté par l'abréviation (A)]: These substrates, which contain amino acid fragments (which may consist of several groups of amino acids) and which are specific for various transferases and proteases, appear below [in each case, the fluorescent fragment previously indicated is represented by the abbreviation (A)]:

Substrat Substrate

Enzyme Enzyme

(A)-lys-ala (A) -lys-ala

DAP-II DAP-II

(A)-Z-ala-arg-arg (A) -Z-ala-arg-arg

Cathépsine B 1 Cathépsine B 1

(A)-BZ-val-lys-lys-arg (A) -BZ-val-lys-lys-arg

Cathepsine B la Cathepsin B la

(A 2-HCl)CBZ-arg-arg (A 2-HCl) CBZ-arg-arg

Cathepsine B 1 Cathepsin B 1

(A-diacétate)-N-CBZ-arg-arg- (A-diacetate) -N-CBZ-arg-arg-

Trypsine arg Trypsin arg

(A 3-HCl)-L-arg-arg (A 3-HCl) -L-arg-arg

DAP-III DAP-III

(A)-Z-gly-gly-arg (A) -Z-gly-gly-arg

Trypsine anionique, activateur Anionic trypsin, activator

de la profibrinolysine, profibrinolysin,

enzyme de conversion de la conversion enzyme

pro-insuline pro-insulin

(A)-pro-arg (A) -pro-arg

DAP-I ou cathepsine C DAP-I or cathepsin C

(A)-a-BZ-phe-val-arg (A) -a-BZ-phe-val-arg

Thrombine Thrombin

(di-A)-L-cystine (di-A) -L-cystine

Ocytocinase Oxytocinase

(A)-y-glutamyle y-Glutamyltranspeptidase (A) -y-glutamyl y-Glutamyltranspeptidase

(A formiate)-L-leu-gly-gly (A formate) -L-leu-gly-gly

(A)-leu (A) -leu

Aminopeptidase Aminopeptidase

(A)-BZ-arg-pro-gly-phe-phe- (A) -BZ-arg-pro-gly-phe-phe-

Cathepsine D Cathepsin D

leu leu

(A)-phe-pro-ala-met (A) -phe-pro-ala-met

Cathepsine B lb Cathepsin B lb

(A)-glutaryl-gly-L-phe (A) -glutaryl-gly-L-phe

(A)-gly-pro (A) -gly-pro

DAP-IV DAP-IV

(A)-CBZ-pro-ala-gly-pro (A) -CBZ-pro-ala-gly-pro

Collagénase Collagenase

(A)-his-ser (A) -his-ser

DAP-I ou cathepsine C DAP-I or cathepsin C

(A)-N-CBZ-L-pro-L-phe-L- (A) -N-CBZ-L-pro-L-phe-L-

his-L-leu-L-leu-L-val-L-tyr- his-L-leu-L-leu-L-val-L-tyr-

L-ser L-ser

Substrat Substrate

Enzyme Enzyme

(A)-N-CBZ-gly-L-met (A) -N-CBZ-gly-L-met

Rénine Renin

(A)-glutaryl-ala-ala (A) -glutaryl-ala-ala

Elastase Elastase

(A)-BZ-arg-pro-gly-phe-phe- (A) -BZ-arg-pro-gly-phe-phe-

Cathepsine D Cathepsin D

pro pro

(A)-ala (A) -ala

Aminopeptidase B ••. Aminopeptidase B ••.

(A)-BZ-arg (A) -BZ-arg

Trypsine/cathepsine B 1 Trypsin / cathepsin B 1

(A)-BZ-arg-gly-leu (A) -BZ-arg-gly-leu

(A)-met (A) -met

(A)-BZ-arg-gly-tyr (A) -BZ-arg-gly-tyr

DAP-I DAP-I

(A)-ser-tyr (A) -ser-tyr

Cathepsine C Cathepsin C

Dans les formules ci-avant, on utilise les abréviations habituelles suivantes: ala (alanine), arg (arginine), BZ (benzoyle), CBZ et Z (carbobenzoxy), gly (glycine), his (histidine), leu (leucine), lys (lysine), met (métionine), phen (phénylalanine), pro (proline), ser (sérine), tyr (tyrosine) et val (valine). Pour accroître les taux de solubilité, on peut, si on le désire, transformer tous ces substrats en des sels tels que, par exemple, les chlorhydrates, bromhydrates, acétates ou formiates des amino-acides. In the above formulas, the following usual abbreviations are used: ala (alanine), arg (arginine), BZ (benzoyl), CBZ and Z (carbobenzoxy), gly (glycine), his (histidine), leu (leucine) , lys (lysine), met (metionine), phen (phenylalanine), pro (proline), ser (serine), tyr (tyrosine) and val (valine). To increase the solubility rates, it is possible, if desired, to transform all these substrates into salts such as, for example, hydrochlorides, hydrobromides, acetates or formates of amino acids.

Chacun de ces substrats, lorsqu'on le met au contact de l'enzyme correspondante, est clivé, le fragment d'amino-acide étant libéré ou couplé à un accepteur approprié tel que la glycylglycine, pour laisser l'amine primaire fluorescente (c'est-à-dire le substrat (A) précédemment indiqué, où le symbole R3 représente un atome d'hydrogène). Toutes ces aminés aromatiques fluorescentes présentent un pic d'excitation et des caractéristiques d'émission, lorsqu'on les expose à la lumière ultraviolette, suffisamment voisines de celles observées dans les déterminations utilisant le NADH (Xex = 340 nm; Àcm=465 nm) pour permettre la mesure de l'activité fluorimétrique avec le même appareillage et les mêmes filtres que ceux employés pour les déterminations classiques utilisant le NADH. Plus particulièrement, ces chromophores ont des pics d'excitation correspondant à une longueur d'onde comprise dans la gamme de 320 à 380 nm et des pics d'émission correspondant à une longueur d'onde comprise dans la gamme de 420 à 480 nm. Par exemple, si les symboles Rj et R2 du substrat (A) sont des radicaux méthoxy, le chromophore présente un pic d'excitation à une longueur d'onde d'environ 335 nm et un pic d'émission à une longueur d'onde d'environ 445 nm. Each of these substrates, when brought into contact with the corresponding enzyme, is cleaved, the amino acid fragment being released or coupled to an appropriate acceptor such as glycylglycine, to leave the primary fluorescent amine (c (i.e. the substrate (A) previously indicated, where the symbol R3 represents a hydrogen atom). All these aromatic fluorescent amines exhibit an excitation peak and emission characteristics, when exposed to ultraviolet light, sufficiently close to those observed in the determinations using NADH (Xex = 340 nm; Àcm = 465 nm) to allow the measurement of fluorimetric activity with the same apparatus and the same filters as those used for conventional determinations using NADH. More particularly, these chromophores have excitation peaks corresponding to a wavelength in the range of 320 to 380 nm and emission peaks corresponding to a wavelength in the range of 420 to 480 nm. For example, if the symbols Rj and R2 of the substrate (A) are methoxy radicals, the chromophore has an excitation peak at a wavelength of approximately 335 nm and an emission peak at a wavelength about 445 nm.

Dans la mise en pratique du procédé de l'invention, on dissout tout d'abord le substrat dans une solution aqueuse stérile renfermant de préférence un tampon approprié afin que le pH soit maintenu à la valeur optimale d'activité de l'enzyme étudiée ou au voisinage de cette valeur. Par exemple, lorsque l'enzyme que l'on désire mesurer est la y-glutamyltranspeptidase, on peut effectuer la réaction dans une gamme étendue de pH d'environ 7,5 à 9,0, un pH de 8,2 conduisant à l'activité maximale dans le système de détermination fluorimétrique. On mélange la solution du substrat à l'échantillon (suspension ou solution) et on introduit l'ensemble dans une cuve appropriée d'un fluorimètre approprié pour mesurer la fluorescence de la surface avant. La vitesse de formation du composé fluorescent est directement proportionnelle à la quantité de transférase présente dans l'échantillon. In practicing the process of the invention, the substrate is first dissolved in a sterile aqueous solution preferably containing an appropriate buffer so that the pH is maintained at the optimal value of activity of the enzyme studied or near this value. For example, when the enzyme to be measured is γ-glutamyltranspeptidase, the reaction can be carried out in a wide pH range from about 7.5 to 9.0, a pH of 8.2 leading to 1 activity in the fluorimetric determination system. The solution of the substrate is mixed with the sample (suspension or solution) and the assembly is introduced into a suitable tank of a fluorimeter suitable for measuring the fluorescence of the front surface. The rate of formation of the fluorescent compound is directly proportional to the amount of transferase present in the sample.

D'autres avantages et caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et des exemples donnés à titre illustratif mais non limitatif. Other advantages and characteristics of the present invention will appear on reading the following description and examples given by way of illustration but not limitation.

Exemple 1 : Example 1:

On peut, pour déterminer par fluorimétrie la y-glutamyltranspeptidase sérique, utiliser comme substrat le chlorhydrate de l'ester diméthylique de l'acide y-(L-glutamyl)amino-5 isophtalique. To determine the serum y-glutamyltranspeptidase by fluorimetry, the hydrochloride of the dimethyl ester of y- (L-glutamyl) amino-5-isophthalic acid can be used as substrate.

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

645 992 645,992

4 4

Ce substrat répond à la formule développée suivante: This substrate corresponds to the following structural formula:

CH3°\ /° CH3 ° \ / °

Echantillon Sample

1 1

2 2

3 3

4 4

5 5

6 6

7 7

8 8

9 9

10 10

11 11

12 12

13 13

14 14

15 15

16 Cancer à métastases 16 Metastasis cancer

Fluorimétrie Fluorimetry

47 47

45 45

52 52

51 51

12,5 12.5

17 17

85,4 85.4

79 79

113,4 113.4

110 110

196,9 196.9

195 195

14,5 14.5

17 17

14,5 14.5

18 18

345 345

344 344

43,4 43.4

48 48

48,8 48.8

72 72

236,4 236.4

225 225

121,3 121.3

198 198

259,6 259.6

260 260

80,9 80.9

87 87

87,5 87.5

119 119

Colori-métrie nh2 Colorimetry nh2

NH-C-CH2-CH2-C-COOH» HCl NH-C-CH2-CH2-C-COOH »HCl

I I

H H

/C=° / C = °

OCH3 OCH3

La solution réactive a une concentration de 5 mM en substrat, de 55 mM en glycylglycine et de 100 mM en tampon tris (pH 8,2 à 25°C), le volume de la solution étant de 1,5 ml. On chauffe la solution réactive à 37° C, on ajoute l'échantillon (0,05 ml), on mélange et on pompe dans une cuve à écoulement. On mesure ensuite la vitesse d'accroissement de la fluorescence pendant une durée minimale de 4 min avec un appareil de détermination de la fluorescence de la surface avant (Xex=365 nm; Xem=465 nm). On mesure ainsi la vitesse de variation de la fluorescence du produit final (ester dimé-thylique de l'acide amino-5 isophtalique) produit par l'hydrolyse du substrat et on calcule la pente pour connaître la variation de la fluorescence par minute de réaction. The reactive solution has a concentration of 5 mM in substrate, 55 mM in glycylglycine and 100 mM in tris buffer (pH 8.2 at 25 ° C), the volume of the solution being 1.5 ml. The reactive solution is heated to 37 ° C, the sample (0.05 ml) is added, mixed and pumped into a flow cell. The speed of increase in fluorescence is then measured for a minimum duration of 4 min with a device for determining the fluorescence of the front surface (Xex = 365 nm; Xem = 465 nm). The speed of variation of the fluorescence of the final product (dimethyl ester of 5-isophthalic acid) produced by the hydrolysis of the substrate is thus measured and the slope is calculated to know the variation of the fluorescence per minute of reaction. .

Exemple 2: Example 2:

On compare les résultats de déterminations effectuées sur des échantillons de sérum, comme indiqué dans l'exemple 1, aux résultats de déterminations colorimétriques effectuées sur les mêmes échantillons avec le réactif GGTP commercialisé par Dade Division of American Hospital Supply Corporation, que l'on utilise selon les indications de la notice jointe. Pour faciliter l'interprétation des résultats, on transforme la valeur AF/min en unités internationales par litre (UI/1) par totalisation de UI/1 et AF/min et détermination du facteur UI/AF. On analyse les sérums en deux groupes de 14, un groupe correspondant à des états non diagnostiqués et l'autre à des états diagnostiqués. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau ci-après. The results of determinations carried out on serum samples, as indicated in Example 1, are compared with the results of colorimetric determinations carried out on the same samples with the reagent GGTP marketed by Dade Division of American Hospital Supply Corporation, which is used as indicated in the attached instructions. To facilitate the interpretation of the results, the AF / min value is transformed into international units per liter (IU / 1) by totaling UI / 1 and AF / min and determination of the UI / AF factor. The sera are analyzed in two groups of 14, one group corresponding to undiagnosed conditions and the other to diagnosed states. The results obtained are recorded in the table below.

Ces résultats montrent l'excellente corrélation entre le procédé fluorimétrique et le procédé colorimétrique classique dans la détermination des teneurs sériques en y-glutamyltranspeptidase. These results show the excellent correlation between the fluorimetric method and the conventional colorimetric method in determining the serum contents of γ-glutamyltranspeptidase.

Activité y-glutamyltranspeptidasique (UI/1) Y-glutamyltranspeptidasique activity (IU / 1)

Echantillon Sample

Fluorimétrie Fluorimetry

Colorimetrie Colorimetry

17 Gastrites 17 Gastritis

89,5 89.5

94 94

18 Déshydratation 18 Dehydration

166,4 166.4

172 172

19 Ictère par obstruction 19 Jaundice by obstruction

23 23

26 26

20 Colostomie 20 Colostomy

181 181

184 184

21 Hépatomégalie 21 Hepatomegaly

250,4 250.4

264 264

22 Cancer de la vessie 22 Bladder cancer

146,7 146.7

148 148

23 Ictère 23 Jaundice

164,0 164.0

167 167

24 Problèmes de hanche 24 Hip problems

215,4 215.4

200 200

25 Maladie de Hodgkin 25 Hodgkin's disease

14,7 14.7

14 14

26 Douleurs thoraciques, hypertension ... 26 Chest pain, hypertension ...

62,8 62.8

47 47

27 Embolie pulmonaire 27 Pulmonary embolism

174,2 174.2

150 150

28 Sarcaïdose 28 Sarcaidosis

193,5 193.5

178 178

30 30

40 40

Exemple 3: Example 3:

Pour préparer le chlorhydrate de l'ester diméthylique de l'acide y-(L-glutamyl)amino-5 isophtalique utilisé comme substrat dans 1 l'exemple 1, on peut mélanger 13,2 g (0,051 mol) d'anhydride phta-loylglutamique et 10,4 g (0,050 mol) d'ester diméthylique de l'acide amino-5 isophtalique dans 60 ml de dioxanne et agiter au bain-marie à 55-60° C pendant 1,5 h. Après évaporation du solvant, on dissout le résidu dans 200 ml de méthanol et 7,5 g (0,15 mol) d'hydrate d'hy-drazine. On filtre ensuite la solution et on la laisse reposer pendant 2 d à la température ordinaire. On recueille un précipité blanc qu'on lave avec 100 ml d'eau et 25 ml d'éthanol, qu'on agite dans 100 ml d'acide chlorhydrique 0,5N, puis que l'on filtre. On traite le filtrat avec du bicarbonate de sodium pour porter le pH entre 6,5 et 7,0 et on recueille le précipité (8 g), puis on le sèche. On peut ensuite, pour préparer le chlorhydrate, dissoudre 1 g du dérivé glutamylique dans une solution de 0,3 ml d'acide chlorhydrique concentré et 6 ml de méthanol. Après évaporation du méthanol, on sèche le solide sous pression réduite. To prepare the hydrochloride of the dimethyl ester of y- (L-glutamyl) amino-5-isophthalic acid used as substrate in Example 1, 13.2 g (0.051 mol) of phta- anhydride can be mixed loylglutamic acid and 10.4 g (0.050 mol) of 5-amino-isophthalic acid dimethyl ester in 60 ml of dioxane and stir in a water bath at 55-60 ° C for 1.5 h. After evaporation of the solvent, the residue is dissolved in 200 ml of methanol and 7.5 g (0.15 mol) of hy-drazine hydrate. The solution is then filtered and allowed to stand for 2 d at room temperature. A white precipitate is collected which is washed with 100 ml of water and 25 ml of ethanol, which is stirred in 100 ml of 0.5N hydrochloric acid, then filtered. The filtrate is treated with sodium bicarbonate to bring the pH between 6.5 and 7.0 and the precipitate (8 g) is collected, then dried. One can then, to prepare the hydrochloride, dissolve 1 g of the glutamyl derivative in a solution of 0.3 ml of concentrated hydrochloric acid and 6 ml of methanol. After evaporation of the methanol, the solid is dried under reduced pressure.

Exemple 4: Example 4:

On peut utiliser le mode opératoire suivant pour préparer 45 d'autres dérivés d'acide amino-5 isophtalique que l'on peut copuler avec des amino-acides appropriés comme indiqué: The following procedure can be used to prepare other 5-isophthalic acid derivatives which can be copulated with appropriate amino acids as indicated:

COOH COOH

(1) S0Ct2 (1) S0Ct2

55 55

65 65

COOR COOR

Lorsqu'on désire former un amide, on remplace dans l'équation ROH par RNH2. Dans tous les cas, on fait ensuite réagir le produit When it is desired to form an amide, it is replaced in the ROH equation by RNH2. In all cases, the product is then reacted

final avec l'amino-acide particulier désiré sous la forme appropriée (comme illustré dans l'exemple 3 pour l'anhydride phtaloylglut-amique) afin d'obtenir le dérivé d'amino-acide d'acide aminophtali-que final qu'on utilise comme substrat pour la détermination de l'activité transpeptidasique et/ou protéasique. 5 final with the particular amino acid desired in the appropriate form (as illustrated in Example 3 for phthaloylglut-amic anhydride) in order to obtain the amino acid derivative of final aminophthalic acid which is used as a substrate for the determination of transpeptidasic and / or protease activity. 5

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Bien entendu, la présente invention n'est nullement limitée aux exemples et modes de mise en œuvre mentionnés ci-dessus; elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans que l'on s'écarte de l'esprit de l'invention. Of course, the present invention is in no way limited to the examples and modes of implementation mentioned above; it is susceptible of numerous variants accessible to those skilled in the art, depending on the applications envisaged and without departing from the spirit of the invention.

R R

Claims

645,992

1. Reagent for the fluorimetric determination of the activity of transferases and proteases in samples of biological fluids, characterized in that it contains at least one substrate having the formula: mud cor2

in which:

Ri and R2 represent, respectively, —OH, —NH2,

-NHCH3, -NHC2H5, -N (CH3) 2, -N (C2H5) 2i -N (CH3) (C2H5), -OCHj or - 0 (CH2) nCH3;

n is an integer from 1 to 4, and

R3 represents an amino acid fragment which can be cleaved from the rest of the substrate in the presence of a transferase or a protease having a specific activity on this substrate.

2. Reagent according to claim 1, characterized in that R3 represents an amino acid fragment which can be transferred to glycylglycine when this substrate is reacted with glycylglycine in the presence of a transferase having a specific activity on this substrate .

2

3. Reagent according to claim 2, characterized in that Rj and R2 represent, respectively, —OCH3, this substrate being useful for the fluorimetric determination of the y-glutamyltranspepti-dase.

4. Reagent according to one of claims 1 to 3, characterized in that the substrate consists of the y-glutamyl derivative of the dimethyl ester of 5-amino-isophthalic acid or of a corresponding salt, and in which further contains an acceptor of the glutamyl fragment when this derivative is cleaved in the presence of γ-glutamyltranspeptidase and a buffer to maintain the pH in the range of 7.5 to 9.0.

5. Reagent according to claim 4, characterized in that the acceptor is glycylglycine.

6. Use of the reagent according to one of claims 1 to 5 for the fluorimetric determination of the activity of transferases and proteases in samples of biological fluids, characterized in that said reagent and a sample are mixed and reacted biological fluid containing a transferase or protease capable of cleaving the substrate, then exposing this mixture to the action of ultraviolet light having a wavelength in the range of 320 to 380 nm and measuring the speed of variation of fluorescence at a wavelength in the range of 420 to 480 nm.

7. Use according to claim 6, characterized in that the reaction mixture is exposed to the action of ultraviolet light having a wavelength of approximately 365 nm.

8. Use according to claim 6, characterized in that the variation in fluorescence is measured at a wavelength of approximately 465 nm.

9. Use according to claim 6, characterized in that, in the mixing stage, glycylglycine is mixed with the reagent and the sample and in that the symbol R3 represents an amino acid fragment which can be transferred to glycylglycine during this mixing stage.

10. Use according to claim 7, characterized in that R3 represents the y-glutamyl radical and the transferase is y-glut-amyltranspeptidase.

11. Use according to claim 6, characterized in that a y-glutamyl derivative of the dimethyl ester of 5-isophthalic acid, or a corresponding salt, is reacted with a y-acceptor. -glutamyl, a buffer to maintain the pH in the range of 7.5 to 9.0 and a sample of biological fluid containing y-glutamyltranspeptidase, then the mixture is exposed

to the action of ultraviolet light having a wavelength in the range of 320 to 380 nm and measuring the rate of change of fluorescence at a wavelength in the range of 420 to 480 nm.

12. Use according to claim 9, characterized in that the reaction mixture is exposed to the action of ultraviolet light having a wavelength of approximately 365 nm.

13. Use according to claim 9, characterized in that the variation in fluorescence is measured at a wavelength of approximately 465 nm.

14. Use according to claim 9, characterized in that the acceptor is glycylglycine.