KR101236449B1 - 강도 변조한 레이저광에 의한 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법 - Google Patents

강도 변조한 레이저광에 의한 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법 Download PDF

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쿄우지 도이
시게유키 나카다
히로노리 하야시
카즈테루 호시시마
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미쯔이 죠센 가부시키가이샤
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Abstract

플로우 사이토미터(flow cytometer)를 이용한 형광 검출 장치는, 변조 신호에 의하여 강도 변조한 레이저광을 출사(出射)하고, 이 레이저광의 계측점을 횡단하여 통과하는 측정 대상물이 발(發)하는 형광의 형광 신호를 취득한다. 형광 검출 장치는, 변조 신호의 주파수와 다른 주파수를 가지고, 변조 신호와 위상이 동기(同期)한 참조 신호를, 변조 신호와 따로 생성한다. 형광 검출 장치는, 형광 신호로부터 참조 신호를 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 산출한다.

Description

강도 변조한 레이저광에 의한 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법{FLUORESCENCE DETECTION DEVICE BY MEANS OF INTENSITY MOLUDATED LASER LIGHT AND METHOD FOR DETECTION FLUORSCENCE}
본 발명은, 강도 변조한 레이저광을 측정 대상물에 조사(照射)하는 것과 함께, 이 조사에 의한 측정 대상물로부터 형광을 받아 형광 신호를 얻고, 이 신호에 관하여 신호 처리를 행하는, 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 의료, 생물 분야에서 이용되는 플로우 사이토미터(flow cytometer)와 같은 단백질을 시작으로, 세포나 DNA나 RNA 등의 측정 대상물의 식별을 형광 색소가 발(發)하는 형광을 이용하여 행하여 측정 대상물의 분석 등을 단시간에 행하는 분석 장치에 적용되는 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법에 관한 것이다.
의료, 생물 분야에서 이용되는 플로우 사이토미터에는, 레이저광을 조사하는 것에 의하여 측정 대상물의 형광 색소로부터의 형광을 수광(受光)하여, 측정 대상물의 종류를 식별하는 형광 검출 장치가 짜 넣어져 있다. 의료 분야에서는, 단백질끼리의 생체 결합 등의 상호 작용에 관한 연구가 활발히 행하여지고 있다. 특히, 단백질끼리의 상호 작용에 관하여, 형광 공명 에너지 이동(FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer)의 계측을 이용하여 연구하는 것이 정력적으로 행하여지고 있다. 종래, FRET의 계측은 형광 강도의 변화에 의하여 행하여지고 있었지만, 근년, 형광 완화 시간(형광 수명)의 변화를 이용하여, 측정 대상물의 분석을 하는 플로우 사이토미터가 여러 가지 제안되고 있다.
일반적으로, 플로우 사이토미터에서는, 단백질을 시작으로, 세포, DNA, RNA, 효소의 생체 물질 등의 측정 대상물을 포함하는 혼탁액을 형광 색소(형광 시약)로 라벨화하고, 압력을 주어 매초 10m 이하의 속도로 관로 내에 시스액(sheath fluid)을 흐르게 하여, 이 시스액에 형광 색소로 라벨화한 측정 대상물을 포함하는 혼탁액을 흐르게 하여 측정 대상물의 플로우 셀을 형성한다. 이 플로우 셀 중의 측정 대상물이 레이저광에 의하여 조사되는 것에 의하여, 측정 대상물에 부착한 형광 색소가 발하는 형광이 수광된다. 이 수광한 형광이 라벨로서 식별되는 것으로 측정 대상물이 특정된다.
이 플로우 사이토미터에서는, 예를 들어, 세포 내의 DNA, RNA, 효소, 단백질 등의 측정 대상물의 세포 내 상대량을 계측하고, 또한 이들 측정 대상물의 움직임을 단시간에 해석할 수 있다. 또한, 특정 타입의 세포나 염색체를 형광에 의하여 특정하고, 특정한 세포나 염색체만을 산 상태로, 단시간에 선별 수집하는 셀(cell)·소터(sorter) 등이 이용된다. 이 사용에서는, 보다 많은 측정 대상물을 단시간에 형광의 정보로부터 정확하게 특정하는 것이 요구되고 있다.
하기 특허 문헌 1에서는, 다른 형광 색소로 라벨된 개개의 입자나 세포를, 형광 수명(형광 완화 시간)에 기초하여 식별하는 장치 및 방법이 기재되어 있다.
당해 문헌에서는, 모듈레이터(modulator)로부터의 변조 신호에 의하여 강도 변조된 레이저광이 광원으로부터 출사(出射)되고, 플로우 챔버 내의 조사구(照射口)를 향하여 입자나 세포에 하나 하나 조사한다. 입자나 세포가 발하는 형광은, 광 검출기에서 형광 신호로 바뀌어, 2개의 믹서로 보내진다.
한편, 모듈레이터의 변조 신호는, 가변 위상 시프터(shifter)를 통하여 상기 2개의 믹서로 보내진다. 그 때, 일방(一方)의 믹서에는, 신호의 위상을 90도 시프트시키는 90도 위상 시프터를 통하여, 위상이 90도 시프트한 변조 신호가 공급되고, 타방(他方)의 믹서에는, 위상 시프트가 없는 변조 신호가 그대로 공급된다.
이렇게 하여, 각 믹서로 보내진 형광 신호와 변조 신호는 혼합되고, 로 패스 필터(low pass filter)를 통하여, 형광 신호의 위상 지연의 정보인 실수부 성분과 허수부 성분이 얻어진다. 이 실수부 성분과 허수부 성분의 비율로부터 형광 수명이 산출된다.
이것에 의하여, 형광 수명에 기초하여 개개의 입자나 세포를 식별할 수 있다고 여겨지고 있다.
이 밖에, 특허 문헌 2 및 3에도, 형광의 위상 지연을 이용하여 형광 수명을 구하는 것에 의하여, 입자나 세포를 식별하는 플로우 사이토미터가 기재되어 있다.
특허 문헌 1 : US 등록특허공보 5504337호 특허 문헌 2 : US 등록특허공보 5270548호 특허 문헌 3 : US 등록특허공보 5317162호
그러나, 상기 특허 문헌에 기재되어 있는 플로우 사이토미터에 있어서, 형광 신호의, 변조 신호에 대한 위상 지연의 정보인 실수부 성분(혹은 코사인 성분)과 허수부 성분(사인 성분)은 일정값으로 되어야 하는 것이다. 한편, 형광 신호와 변조 신호를 혼합하는 믹서는 변조 신호에 의한 DC 성분의 오프셋을 포함하여 출력한다. 이 오프셋은, 형광 신호의 형광 강도가 약한(형광 신호의 레벨이 작은) 경우, 형광 강도의 형광 완화 시간을 구하기 위한 위상 지연의 정보에 큰 영향을 주기 때문에, 상기 플로우 사이토미터는, 반드시 정확한 형광 완화 시간을 산출할 수 없다고 한, 문제가 있었다.
그래서, 본 발명은, 상기 문제점을 해결하기 위하여, 측정 대상물에, 소정의 주파수로 강도 변조한 레이저광을 조사하는 것에 의하여 측정 대상물이 발하는 형광을 수광하고, 이때 얻어지는 형광 신호의 신호 처리를 행하여 형광 검출을 행할 때, 종래와 같이 믹서가 출력하는 혼합 신호가 DC 성분을 포함하여도, 종래에 비하여 정도(精度)가 높은 형광 완화 시간을 산출할 수 있는 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양(態樣)은, 측정 대상물에 레이저광을 조사하는 것에 의하여 측정 대상물이 발하는 형광을 수광하고, 이 형광의 수광에 의하여 얻어지는 형광 신호로부터, 형광 완화 시간을 구하는 형광 검출 장치이고,
측정 대상물에 조사하는, 강도 변조된 레이저광을 출사하는 레이저 광원부와,
강도 변조된 레이저광의 조사에 의하여 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호를 출력하는 수광부와,
상기 레이저 광원부로부터 출사하는 레이저광을 강도 변조시키기 위하여, 소정의 주파수의 변조 신호를 생성하고, 나아가, 상기 변조 신호의 주파수와 다른 주파수를 가지고, 상기 변조 신호와 동기(同期)한 제1 참조 신호를, 상기 변조 신호와 따로 생성하는 신호 생성부와,
상기 변조 신호를 이용하여 강도 변조한 레이저광을 측정 대상물에 조사하는 것에 의하여 상기 수광부에서 출력되는 형광 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제1 믹싱 처리를 행하는 제1 믹서와, 상기 제1 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 변조 신호의 주파수와 상기 제1 참조 신호의 주파수와의 가산 주파수보다 낮고, 상기 변조 신호의 주파수와 상기 제1 참조 신호의 주파수와의 사이의 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프(cut off) 주파수로 하는 제1 로 패스 필터링 처리를 행하여 형광 신호 베이스의 저주파 신호를 출력하는 제1 로 패스 필터를 가지는 신호 처리부와,
상기 형광 신호 베이스의 저주파 신호를 디지털 신호로 변환하고, 이 디지털 신호 중, 상기 차분 주파수에 대응하는 제1 신호 성분을 이용하여, 상기 변조 신호에 대한 상기 형광 신호의 위상을 산출하고, 상기 위상으로부터, 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구하는 형광 검출부를 가진다.
그 때, 형광 검출 장치의 상기 신호 생성부는, 클록(clock) 신호를 생성하는 제1 발진기와,
상기 제1 발진기가 생성한 상기 클록 신호에 동기하여 상기 변조 신호를 생성하는 제2 발진기와, 상기 제1 참조 신호를, 상기 클록 신호에 동기하여 생성하는 제3 발진기를 가지는 것이 바람직하다.
상기 형광 검출부는, 상기 차분 주파수를 주파수로 하는 디지털 신호인 제2 참조 신호를 상기 저주파 신호의 디지털 신호와 믹싱하는 것에 의하여, 상기 제1 신호 성분을 구할 수 있다.
삭제
혹은, 상기 신호 처리부는, 상기 변조 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제2 믹싱 처리를 행하는 제2 믹서와, 상기 제2 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 제2 로 패스 필터링 처리에 의하여, 상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 정현파 신호를 출력하는 제2 로 패스 필터를 가지고, 상기 형광 검출부는, 상기 제2 로 패스 필터로부터 출력된 상기 정현파 신호를 디지털화하는 것에 의하여, 상기 제2 참조 신호를 생성할 수도 있다.
또한, 상기 형광 검출부는, 상기 형광 신호 베이스의 저주파 신호의 디지털 신호에 대하여 FFT(Fast Fourier Transformation) 처리를 실시하고, 상기 FFT 처리에 의하여 얻어지는, 상기 차분 주파수에 대응하는 실수부와 허수부의 값을 상기 제1 신호 성분으로서 산출하고, 상기 실수부와 상기 허수부의 값으로부터 상기 위상을 산출할 수도 있다.
또한, 상기 수광부는, 상기 형광을 수광하는 수광 소자 외에, 상기 레이저광에 의한 측정 대상물의 측방 산란광을 수광하는 수광 소자를 가지며, 상기 측방 산란광의 수광에 의하여 얻어진 수광 신호를 출력하고, 상기 신호 처리부는, 상기 수광 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제3 믹싱 처리를 행하는 제3 믹서와, 상기 제3 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 제3 로 패스 필터링 처리를 행하여 수광 신호 베이스의 저주파 신호를 출력하는 제3 로 패스 필터를 가지고, 상기 형광 검출부는, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호와 상기 제2 참조 신호와의 믹싱 처리에 의하여, 혹은, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호에 대하여 FFT 처리를 실시하는 것에 의하여, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호 중, 상기 차분 주파수에 대응하는 제2 신호 성분의 위상을 구하고, 이 제2 신호 성분의 위상을 기준으로 하여, 상기 형광 신호의 위상을 보정하며, 보정된 상기 위상을 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구할 수 있다.
또한, 상기 신호 처리부는, 상기 변조 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제2 믹싱 처리를 행하는 제2 믹서와, 상기 제2 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 제2 로 패스 필터링 처리에 의하여, 상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 정현파 신호를 출력하는 제2 로 패스 필터를 가지고, 상기 형광 검출부는, 상기 제2 로 패스 필터로부터 출력된 상기 정현파 신호를 디지털화하는 것에 의하여, 상기 제2 참조 신호를 생성하고, 상기 제2 참조 신호의 위상을, 상기 형광 신호의 위상으로부터 빼는 것에 의하여, 상기 형광 신호의 위상을 보정하고, 보정한 상기 위상을 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구할 수도 있다.
그 때, 상기 형광 검출부는, 상기 제2 참조 신호를 FFT 처리하는 것에 의하여, 혹은, 별도 생성된 상기 차분 주파수를 가지는 정현파 신호를, 상기 제2 참조 신호와 믹싱하는 것에 의하여, 상기 제2 참조 신호의 위상을 구할 수 있다.
또한, 상기 형광 검출부는, 상기 별도 작성된 상기 차분 주파수를 가지는 정현파 신호를, 상기 제2 참조 신호와 믹싱할 때, 사인 신호 및 코사인 신호의 각각을 상기 제2 참조 신호와 믹싱하고, 상기 사인 신호 및 상기 코사인 신호의 각각을 믹싱한 결과의 값의 비율을 구하는 것에 의하여, 상기 제2 참조 신호의 위상을 구할 수도 있다.
상기 형광 검출부는, 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구할 때, 미리 설정된 보정량을 이용하여 상기 형광 신호의 상기 보정을 한 위상을 더 보정하고, 상기 보정량을 이용한 보정 후의 위상을 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구하고, 상기 보정량은, 기지(旣知)의 형광 완화 시간에서 형광을 발하는 형광 색소를 측정 대상물로서, 형광을 측정하였을 때에 구하여진 상기 형광 완화 시간이, 상기 형광 색소가 가지는 형광 완화 시간에 일치하도록, 구하여진 양인 것이 바람직하다.
상기 수광부는, 상기 형광을 수광하는 수광 소자 외에, 상기 레이저광에 의한 측정 대상물의 측방 산란광을 수광하는 수광 소자를 가지고, 상기 측방 산란광의 수광에 의하여 얻어진 수광 신호를 출력하며, 상기 신호 처리부는, 상기 수광 신호와 상기 참조 신호와의 제3 믹싱 처리를 행하는 제3 믹서와, 상기 제3 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 제3 로 패스 필터링 처리에 의하여, 상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 수광 신호 베이스의 저주파 신호를 출력하는 제3 로 패스 필터를 가지고, 상기 형광 검출부는, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호의 진폭을 구하고, 상기 형광 검출부는, 구한 상기 진폭을 상기 측방 산란광의 강도로서 정하고, 나아가, 상기 제1 신호 성분으로부터 구하여지는 진폭을 형광 강도로서 정하며, 상기 측방 산란광의 강도, 상기 형광 강도 및 상기 형광 완화 시간을 출력하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 태양은, 측정 대상물에 레이저광을 조사하는 것에 의하여 측정 대상물이 발하는 형광을 수광하고, 이 형광의 수광에 의하여 얻어지는 형광 신호로부터, 형광 완화 시간을 구하는 형광 검출 방법이고,
소정의 주파수의 변조 신호에 의하여 강도 변조를 받은 레이저광을 측정 대상물에 조사하는 스텝과,
레이저광이 조사된 측정 대상물이 발하는 형광을 검출 수단으로 수광하고, 상기 검출 수단에 의하여 얻어지는 형광 신호를 취득하는 스텝과,
상기 변조 신호의 주파수와 다른 주파수를 가지고, 상기 변조 신호와 위상이 동기한 제1 참조 신호를, 상기 변조 신호와 따로 생성하는 스텝과,
강도 변조한 레이저광을 측정 대상물에 조사하는 것에 의하여 상기 검출 수단으로 얻어진 형광 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제1 믹싱 처리를 하고, 나아가, 상기 변조 신호의 주파수와 상기 참조 신호의 주파수와의 가산 주파수보다 낮고, 상기 변조 신호의 주파수와 상기 참조 신호의 주파수와의 사이의 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 제1 로 패스 필터링 처리를 실시하는 것에 의하여, 형광 신호 베이스의 저주파 신호를 생성하는 스텝과,
생성된 상기 형광 신호 베이스의 저주파 신호를 디지털 신호로 변환하고, 상기 디지털 신호 중, 상기 차분 주파수에 대응하는 제1 신호 성분을 이용하여, 상기 변조 신호에 대한 상기 형광 신호의 위상을 산출하고, 상기 위상으로부터, 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구하는 스텝을 가진다.
그 때, 상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 디지털 정현파 신호를 제2 참조 신호로 하였을 때, 상기 제1 신호 성분은, 상기 제2 참조 신호와, 상기 형광 신호 베이스의 저주파 신호의 디지털 신호와 믹싱 처리를 행하는 것에 의하여 구하여지는 것이 바람직하다.
그 때, 상기 형광 신호에 대하여 상기 제1 믹싱 처리와 상기 제1 로 패스 필터링 처리를 행하는 것 외에, 상기 변조 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제2 믹싱 처리를 행하고, 상기 제2 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 제2 로 패스 필터링 처리를 행하여, 상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 정현파 신호를 출력하고, 상기 제2 로 패스 필터링 처리에 의하여 얻어진 상기 정현파 신호를 디지털화하는 것에 의하여, 상기 제2 참조 신호를 생성할 수 있다.
또한, 상기 형광의 수광 시, 상기 형광의 수광 외에, 상기 레이저광에 의한 측정 대상물의 측방 산란광이 수광되고, 상기 측방 산란광의 수광에 의하여 얻어지는 수광 신호가 출력되고, 상기 수광 신호에는, 상기 수광 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제3 믹싱 처리와, 상기 제3 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하고, 수광 신호 베이스의 저주파 신호를 출력하는 제3 로 패스 필터링 처리가 실시되고, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호와 상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 디지털 정현파 신호와의 믹싱 처리를 하는 것에 의하여, 혹은, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호에 대하여 FFT 처리를 실시하는 것에 의하여, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호의, 상기 차분 주파수에 대응하는 제2 신호 성분의 위상을 구하고, 상기 제2 신호 성분의 위상을 기준으로 하여, 상기 형광 신호의 위상을 보정하고, 보정 후의 위상을 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구할 수 있다.
또한, 상기 형광 신호의 위상으로부터, 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구할 때, 미리 설정된 보정량을 이용하여 상기 형광 신호의 위상을 보정하고, 이 보정 후의 위상을 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구할 수도 있다. 이 경우, 상기 보정량은, 기지의 형광 완화 시간에서 형광을 발하는 형광 색소를 측정 대상물로서 형광을 측정했을 때에, 상기 보정 후의 위상으로부터 구하여지는 상기 형광 완화 시간이, 상기 형광 색소가 가지는 형광 완화 시간에 일치하도록, 구하여지는 양이다.
본 발명의 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법의 일 태양에서는, 레이저광을 강도 변조하는 변조 신호의 주파수와 참조 신호의 주파수가 다르도록 설정된다. 이 때문에, 변조 신호와 마찬가지의 주파수로 강도가 변화하는 형광 신호와 참조 신호와의 믹싱 처리를 행하여도, 로 패스 필터링 처리 후의 신호는, 변조 신호의 주파수와 참조 신호의 주파수의 차분 주파수를 주성분으로 하는 AC 성분의 신호로 되어 있다. 따라서, 이 신호로부터, 변조 신호에 대한 형광 신호의 위상(위상 지연)을 산출하는 것에 의하여, 종래와 같이 믹서가 출력하는 혼합 신호가 DC 성분의 오프셋을 포함하여도, 종래에 비하여 정도 높은 형광 완화 시간을 산출할 수 있다.
또한, 변조 신호와 참조 신호를 다른 발진기를 이용하여 생성하기 때문에, 변조 신호 및 참조 신호에는, 발진기에 의하여 생기는 노이즈 성분이 동 시각에 포함되는 것은 적다. 이 때문에, 형광 신호와 참조 신호를 믹싱하여 얻어지는 위상 지연 정보를 포함하는 신호에 노이즈 성분은 적다. 이 때문에, 종래와 같이, 1개의 발진기를 이용하여 변조 신호 및 참조 신호를 생성하는 경우에 비하여, 정도 높게, 형광 완화 시간을 산출할 수 있다.
본 발명의 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법의 일 태양은, 참조 신호와 형광 신호의 전송이나 신호 처리의 지연을 고려하여, 측방 산란광의 위상의 정보를 이용하여 형광 신호의 위상을 보정하는 것으로, 혹은, 변조 신호와 참조 신호의 차분 주파수의 신호의 위상 정보를 이용하여 형광 신호의 위상을 보정하는 것으로, 형광 신호의 위상을 정도 높게 구할 수 있다. 따라서, 본 발명의 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법은, 정확한 형광 완화 시간을 구할 수 있다.
또한, 기지의 형광 완화 시간에서 형광을 발하는 형광 색소를 측정 대상물로서 이용하여, 형광 색소가 발하는 형광이 측정될 때, 본 발명의 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법의 일 태양은, 형광 신호의 위상으로부터 구하여지는 상기 형광 완화 시간이, 상기 형광 색소가 가지는 형광 완화 시간에 일치하도록, 보정 시에 이용하는 보정량을 이용하여 형광 완화 시간의 교정을 행하기 때문에, 정확한 형광 완화 시간이 산출될 수 있다.
도 1은 본 발명의 강도 변조한 레이저광에 의한 형광 검출 장치를 이용한 플로우 사이토미터의 개략 구성도이다.
도 2는 도 1에 도시하는 플로우 사이토미터의 구성을 보다 자세하게 설명한 도면이다.
도 3은 도 1에 도시하는 플로우 사이토미터의 신호 처리부의 구성을 설명하는 도면이다.
도 4는 도 1에 도시하는 플로우 사이토미터의 분석 장치에 있어서의 처리 내용을 설명하는 도면이다.
도 5는 도 4에 도시하는 분석 장치에 있어서의 처리 내용과 다른 그 밖의 처리 내용의 예를 설명하는 도면이다.
도 6은 도 4, 도 5에 도시하는 분석 장치에 있어서의 처리 내용과 다른 그 밖의 처리 내용의 예를 설명하는 도면이다.
도 7은 도 4 ~ 6에 도시하는 분석 장치에 있어서의 처리 내용과 다른 그 밖의 처리 내용의 예를 설명하는 도면이다.
도 8은 도 4 ~ 7에 도시하는 분석 장치에 있어서의 처리 내용과 다른 그 밖의 처리 내용의 예를 설명하는 도면이다.
이하, 본 발명의 강도 변조한 레이저광에 의한 형광 검출 장치를 호적하게 적용한 플로우 사이토미터를 기본으로 상세하게 설명한다.
도 1은, 강도 변조한 레이저광(L)에 의한 형광 검출 장치에 적용한 플로우 사이토미터(10)의 개략 구성도이다. 도 2는, 플로우 사이토미터(10)의 구성을 보다 자세하게 설명한 도면이다. 이하, 플로우 사이토미터(10)의 구성에 관하여 설명한다.
플로우 사이토미터(10)는, 신호 처리 장치(20)와 분석 장치(80)를 가진다. 신호 처리 장치(20)는, 측정 대상으로 하는 단백질 등의 측정 대상물의 시료(12)를 플로우 셀로서 1개씩 흐르게 하여 레이저광을 조사한다. 신호 처리 장치(20)는, 이 때, 시료(12)에 라벨화를 위하여 부착한 형광 색소가 발하는 형광의 형광 신호를 검출하여 신호 처리를 한다.
분석 장치(80)는, 신호 처리 장치(20)에서 얻어진 처리 결과로부터 형광의 형광 완화 시간을 구하고, 나아가, 시료(12) 중의 측정 대상물의 분석을 행한다. 즉, 분석 장치(80)는, 본 발명에 있어서의 형광 검출부에 대응한다.
신호 처리 장치(20)는, 레이저 출사부(22)와 수광부(24, 26)와 제어·처리부(28)와 관로(30)를 가진다. 제어·처리부(28)는, 레이저 출사부(22)로부터의 레이저광을 소정의 주파수로 강도 변조시키는 제어부, 및 시료(12)로부터의 형광 신호를 식별하는 신호 처리부를 포함한다. 관로(30)는, 고속 흐름을 형성하는 시스액에 시료(12)를 1개씩 포함하게 하여 흐르게 한 플로우 셀을 형성한다.
관로(30)의 출구에는, 도 1에 도시하는 바와 같이, 회수 용기(32)가 설치되어 있다. 플로우 사이토미터(10)에는, 레이저광(L)의 조사에 의하여 단시간 내에 시료(12) 중의 특정의 세포 등의 생체 물질을 분리하기 위한 셀·소터를 배치하여 다른 회수 용기로 분리하도록 구성할 수도 있다.
시료(12)는, 단백질을 시작으로, 세포, DNA, RNA, 효소의 생체 물질 등의 측정 대상물이며, 이 시료(12)는 형광 시약(형광 색소)으로 미리 라벨화되고, 도 1에 도시하는 바와 같이, 혼탁액의 상태로 준비된다. 시료(12)는, 예를 들어, 종류가 다른 복수의 생체 물질을 포함하고, 생체 물질에는, 생체 물질의 종류마다 다른 기지의 파장의 형광을 발하는 기지의 색소가, 형광 색소로서 부착되도록, 준비된다. 이것에 의하여, 플로우 사이토미터(10)는, 복수의 종류의 생체 물질 간의 생체 결합 등의 특성을 조사할 수 있다.
시료(12)는, 생체 물질에 한정되지 않고, 예를 들어, 특정의 생체 물질과 결합 가능한 인공적인 구조를 마련한 마이크로 비즈여도 무방하다.
레이저 출사부(22)는, 레이저 광원부(23)와 레이저 드라이버(34)를 가진다.
레이저 광원부(23)는, 소정의 파장의 레이저광(L)을 출사하는 부분이다. 레이저광(L)은, 관로(30) 중의 소정의 위치에 집속하도록, 도시되지 않는 렌즈계가 설치되고, 이 집속 위치가 시료(12)의 계측점을 형성한다. 레이저광(L)의 계측점에 있어서의 빔 직경은 수 10μm이다. 덧붙여, 레이저 광원부(23)는, 1개의 파장의 레이저광(L)을 출사하지만, 복수의 레이저광을 1개의 레이저 빔으로서 형성하여 출사할 수도 있다. 이 경우, 레이저 광원부(23)는, 반투명 유리(half mirror) 등을 이용하여 레이저광을 1개의 광속에 모은다.
레이저 광원부(23)에서는, 강도가 일정한 CW(연속파) 레이저광(L)이, 소정의 주파수에 의하여 강도 변조를 받아 출사한다.
레이저광(L)을 출사하는 광원으로서 예를 들어 반도체 레이저가 이용된다.
레이저광(L)은, 예를 들어 5 ~ 100mW 정도의 출력이다. 한편, 레이저광(L)의 강도를 변조하는 주파수(변조 주파수)는, 그 주기가 형광 완화 시간에 비하여 약간 긴 주파수이며, 예를 들어 10 ~ 50MHz이다.
레이저 드라이버(34)는, 제어·처리부(28)에 접속되어, 레이저광(L)의 출사의 강도가 제어된다. 여기서, 레이저광(L)의 각각은, 후술하는 바와 같이 변조 신호에 의하여, 소정의 주파수로 강도가 변조된다.
레이저 광원부(23)는, 레이저광(L)이 형광 색소를 여기(勵起)하여 특정의 파장 대역의 형광을 발하도록, 미리 정해진 파장 대역으로 발진한다. 레이저광(L)에 의하여 여기되는 형광 색소는 생체 물질 등의 시료(12)에 부착되어 있고, 시료(12)가 측정 대상물로서 관로(30)를 통과할 때, 시료(12)는 계측점에서 레이저광(L)의 조사를 받아 특정의 파장으로 형광을 발한다.
수광부(24)는, 관로(30)를 사이에 두고 레이저 광원부(23)와 대향하도록 배치되어 있다. 수광부(24)는, 광전 변환기(24a)와, 집광 렌즈(24b)와, 차폐판(24c)을 구비한다. 광전 변환기(24a)는, 측정점을 통과하는 시료(12)에 의하여 레이저광이 전방(前方) 산란하는 것에 의하여, 시료(12)가 측정점을 통과하는 취지의 검출 신호를 출력한다. 차폐판(24c)은, 광전 변환기(24a)가 레이저광(L)을 직접 수광하는 것 없이, 전방 산란광을 수광하도록 레이저광(L)의 광속을 차폐하기 위하여 이용한다.
이 수광부(24)로부터 출력되는 신호는, 후술하는 분석 장치(80) 중의 AD 변환 보드(82)의 AD 변환 개시 및 분석 장치 본체(84)의 분석 개시의 타이밍으로 되는 트리거 신호로서 이용된다.
한편, 수광부(26)는, 레이저 광원부(23)로부터 출사되는 레이저광의 출사 방향에 대하여 직교하는 방향이고, 또한 관로(30) 중의 시료(12)의 이동 방향에 대하여 직교하는 방향에 배치되어 있다. 수광부(26)는, 계측점에서 조사된 시료(12)가 발하는 형광 및 레이저광의 측방 산란광을 수광하는 광전 변환기를 구비한다.
도 2에는, 수광부(26)의 일례의 개략의 구성이 도시되어 있다.
수광부(26)는, 시료(12)로부터의 형광 신호를 집속시키는 렌즈계(26a)와, 다이크로익 미러(dichroic mirror, 26b1, 26b2, 26b3)와, 밴드 패스 필터(band-pass filter, 26c1, 26c2, 26c3, 26c4)와, 광전자 배증관 등의 광전 변환기(27a ~ 27d)를 가진다.
렌즈계(26a)는, 수광부(26)에 입사한 형광을 광전 변환기(27a ~ 27d)의 수광면에 집속시킨다.
다이크로익 미러(26b1, 26b2, 26b3)는, 소정의 범위의 파장 대역의 형광을 반사시키고, 그 이외는 투과시키는 미러이다.
시료(12)로부터의 각 형광의 파장에 따라 다이크로익 미러(26b1, 26b2, 26b3) 및 밴드 패스 필터(26c1, 26c2, 26c3, 26c4)가 소정의 파장 대역의 형광을 투과시키도록, 다이크로익 미러(26b1, 26b2, 26b3) 및 밴드 패스 필터(26c1, 26c2, 26c3, 26c4)의 반사 파장 대역 혹은 투과 파장 대역이 설정되어 있다. 다이크로익 미러(26b2)는, 레이저광의 측방 산란광의 파장 영역의 광을 반사하고, 형광의 파장을 포함하는 파장 영역의 광을 투과하는 미러이다.
밴드 패스 필터(26c1, 26c2, 26c3, 26c4)는, 광전 변환기(27a, 27b, 27c, 27d) 각각의 전면(前面)에 설치되고, 소정의 파장 대역의 형광만이 투과하는 필터이다. 다이크로익 미러(26b2)는, 변환기(27a, 27d)의 수광면의 전면에 설치되고, 광전 변환기(27a)는, 다이크로익 미러(26b2)의 투과광을 수광하며, 광전 변환기(27d)는, 다이크로익 미러(26b2)의 반사광을 수광한다.
투과하는 형광의 파장 대역은, 형광 색소가 발하는 형광의 파장 대역에 대응하여 설정되어 있다.
광전 변환기(27a ~ 27d)는, 예를 들어 광전자 배증관을 구비한 센서를 구비하고, 수광면인 광전면에서 수광한 광을 전기 신호로 변환하는 센서이다. 광전 변환기(27a ~ 27c)는, 다이크로익 미러 및 밴드 패스 필터에 의하여 빛의 파장 영역이 제한되어 소정의 파장의 형광을 수광한다. 광전 변환기(27d)가 수광하는 빛의 파장 영역은 다이크로익 미러(26b2)에 의하여 제한되고, 광전 변환기(27d)는 레이저광(L)의 측방 산란광을 수광한다. 이와 같이, 수광부(26)는, 3개의 파장이 다른 형광을 수광하는 것과 함께, 레이저광(L)의 측방 산란광을 수광한다.
여기서, 수광하는 형광 및 측방 산란광은, 일정한 주파수로 강도 변조된 신호 정보를 가진 광 신호로서 수광되기 때문에, 출력되는 형광 신호 및 수광 신호는, 강도 변조된 레이저광(L)에 대응한 주파수를 가지는 신호 및 신호로 된다. 이 형광 신호 및 수광 신호는 제어·처리부(28)로 공급된다. 이후, 형광의 수광에 의하여 얻어지는 신호를 형광 신호라고 하고, 레이저광(L)의 측방 산란광에 의하여 얻어지는 신호를 수광 신호라고 한다.
제어·처리부(28)는, 신호 생성부(40)와, 신호 처리부(42)를 가지고 구성된다.
신호 생성부(40)는, 레이저광의 강도를 소정의 주파수로 변조(강도 변조)하기 위한 변조 신호를 생성하는 것 외, 참조 신호를 생성하는 부분이다.
구체적으로는, 신호 생성부(40)는, 발진기(제1 발진기, 46), 발진기(제2 발진기, 47) 및 발진기(제3 발진기, 48)를 가진다. 이들 발진기는, 회로에 의하여 구성된 것이어도 무방하다.
발진기(46)는, 소정의 주파수의 클록 신호를 생성하는 클록 생성기이다.
발진기(47)는, 레이저광(L)의 강도 변조를 행하기 위한 변조 신호를 생성하고, 도시되지 않는 필터에 의하여 단일의 주파수 성분으로 하여, 앰프를 통하여 변조 신호를 레이저 드라이버(34)로 공급한다. 레이저 드라이버(34)에서는, 별도 준비된 직류 전류가 중첩되어, 레이저 광원부(23)로 공급된다.
발진기(48)는, 후술하는 바와 같이, 형광 완화 시간을 구하기 위하여 이용하는 참조 신호(제1 참조 신호)를 생성한다. 발진기(47)에서 생성되는 변조 신호와 발진기(48)에서 생성되는 참조 신호는, 주파수가 달라 있지만, 서로 동기한 신호로 되어 있다. 서로 동기하고 있다는 것은, 신호의 생성 개시 시점에서, 같은 위상의 신호가 생성되는 것을 말하고, 서로 위상 0으로 되는 시각이 주기적으로 도래한다. 발진기(47) 및 발진기(48)에 있어서 신호의 생성은, 발진기(46)가 생성하는 클록 신호에 동기하여 행하여진다. 따라서, 변조 신호와 참조 신호는, 서로 동기하여 생성된다.
변조 신호와 참조 신호의 사이의 차분 주파수는, 예를 들어 100kHz ~ 1MHz 이하이며, 통상, 수100kHz이다. 차분 주파수의 범위의 하한은, 시료(12)가 계측점을 통과하는 시간을 T초라 하였을 때, 1/T의 4배이며, 상한은 후술하는 AD 변환 보드(82)의 샘플링 주파수인 것이 바람직하다.
신호 생성부(40)는, 발진기(47) 및 발진기(48)에 대신하여, 위상 비교기, 루프 필터, 전압 제어 발진 회로 및 분주기를 구비한 PLL 회로(Phase Locked Loop)를 이용할 수도 있다. 이 경우, PLL 회로는, 변조 신호 및 참조 신호를 동기하여 생성할 수도 있다.
이와 같이, 변조 신호 및 참조 신호를 따로 따로 생성하는 이유는, 1개의 발진기에 의하여 변조 신호 및 참조 신호를 생성하는 경우에 비하여, 후술하는 RF 믹서에서 변조 신호와 참조 신호를 믹싱하여 얻어지는 혼합 신호가, 발진기에 유래하는 노이즈 성분의 영향을 받기 어려워지기 때문이다. 나아가, 변조 신호 및 참조 신호는, 다른 발진기를 이용하여 생성되기 때문에, 믹싱 처리의 대상으로 되는 변조 신호 및 참조 신호에, 동 시각에 노이즈 성분이 포함되는 기회는 적어진다.
변조 신호 및 참조 신호의 주파수가 서로 다르도록 발진기(47) 및 발진기(48)의 주파수가 설정되는 이유는, 후술하는 바와 같이, 형광 신호 및 참조 신호의 믹싱이 RF 믹서에서 행하여질 때, 종래 기술로서 문제가 있던 혼합 신호에 포함되는 DC 성분의 오프셋의 영향을 작게 하기 위함이다. 이 점은, 후술한다.
신호 처리부(42)는, 광전 변환기(27a ~ 27d)로부터 출력되는 형광 신호 및 측방 산란광의 수광 신호를 이용하여, 레이저광의 조사에 의하여 시료(12)가 발하는 형광의, 변조 신호에 대한 위상, 구체적으로는, 변조 신호에 대한 위상 지연에 관한 정보를 추출하는 부분이다. 구체적으로는, 광전 변환기(27a ~ 27c)로부터의 형광 신호를 따로 따로 처리하는 신호 처리 채널 1, 2, 3과, 광전 변환기(27d)로부터의 수광 신호를 처리하는 신호 처리 채널 4를 가진다. 신호 처리 채널 1 ~ 4의 신호 처리 내용은 동일하다.
덧붙여, 상기 위상 지연에 관한 정보는, 예를 들어, 정현파 신호의 위상 지연을 복소수 표시하였을 때의 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)을 포함한다.
신호 처리부(42)의 신호 처리 채널 1은, 처리 회로(52a)를 가진다. 신호 처리 채널 2 ~ 4는, 처리 회로(52b ~ 52d)를 각각 가진다.
도 3은, 처리 회로(52a, 52b, 52c, 52d)의 내용을 도시하는 구성도이다.
처리 회로(52a ~ 52d)는 각각, 형광 신호(수광 신호)를 증폭하는 앰프(54)와, 가변 증폭 앰프(56)와, 증폭된 형광 신호(수광 신호)를 분배하는 파워 스플리터(58)와, RF 믹서(제1 믹서, 60, 62)와, 90도 하이브리드 위상 시프터(64)와, 앰프(66, 68)와, 로 패스 필터(제1 로 패스 필터, 70, 72)와, 하이 패스 필터(74, 76)를 가진다. 신호 처리 채널 4에 있어서의 RF 믹서는 제3 믹서에, 로 패스 필터는 제3 로 패스 필터에 대응한다.
광전 변환기(27a ~ 27d)로부터 보내진 형광 신호(수광 신호)는, 앰프(54)에서 증폭되고, 나아가, 가변 증폭 앰프(56)에서 소망한 레벨로 증폭된다. 나아가, 형광 신호(수광 신호)는, 파워 스플리터(58)에서 2분(分)되고, RF 믹서(60, 62)로 보내진다.
덧붙여, 신호 처리 채널 1,2,3의 처리 회로(52a, 52b, 52c)에 있어서의 RF 믹서는 본 발명에 있어서의 제1 믹서에 대응하고, 신호 처리 채널 4의 처리 회로(52d)에 있어서의 RF 믹서(60, 62)는 본 발명에 있어서의 제3 믹서에 대응한다.
한편, 발진기(48)가 생성한 참조 신호는, 90도 하이브리드 위상 시프터(64)로 공급되어, 위상이 90도 시프트한 참조 신호와, 위상이 유지된(위상 시프트가 0도의) 참조 신호가 생성된다. 90도 하이브리드 위상 시프터(64)에 의하여 90도 위상 시프트한 참조 신호는, RF 믹서(62)로 공급된다. 한편, 위상이 유지된 참조 신호는, RF 믹서(60)로 공급된다.
RF 믹서(60, 62)는 각각, 공급된 참조 신호와 공급된 형광 신호(수광 신호)를 믹싱 처리한다. RF 믹서(60, 62)에는, 액티브 믹서(active mixer)나, 더블 밸런스드 믹서(double balanced mixer) 등의 패시브 믹서(passive mixer)가 이용된다.
본 실시예에서는, 참조 신호의 위상을 90도 시프트시켜 RF 믹서(62)로 공급하였지만, 90도 시프트시키는 신호를 형광 신호(수광 신호)로 하여도 무방하다.
앰프(66, 68)는, RF 믹서(60, 62)에 있어서 참조 신호와 형광 신호(수광 신호)로 만들어진 혼합 신호를 증폭한다.
로 패스 필터(70, 72)는, 믹싱 처리에 의하여 얻어진 혼합 신호 중, 참조 신호의 주파수와 형광 신호(수광 신호)의 주파수와의 가산 주파수를 성분으로 하는 고주파 성분을 제거하고, 참조 신호의 주파수와 형광 신호(수광 신호)의 주파수와의 사이의 차분 주파수를 성분으로 하는 저주파 성분을 통과하도록, 예를 들어, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수가 컷오프 주파수로서 설정되어 있다. 이것에 의하여, 로 패스 필터(70)로부터 형광 신호(수광 신호)의 위상 지연의 정보인 실수부 성분(Re 성분)과, 로 패스 필터(72)로부터 형광 신호(수광 신호)의 위상 지연의 정보인 허수부 성분(Im 성분)이 출력된다. 이 Re 성분과 Im 성분의 신호는, 하이 패스 필터(74, 76)로 보내진다. 하이 패스 필터(74, 76)는, Re 성분과 Im 성분의 신호의 DC 성분을 제거한다. 이것에 의하여, 형광 신호(수광 신호)의 위상 지연의 정보를 AC 성분에 포함시킨 채로, RF 믹서(60, 62)가 출력하는 혼합 신호에 포함되는 DC 성분의 오프셋을 제거할 수 있다. 하이 패스 필터(74, 76)를 통과한 Re 성분과 Im 성분의 신호는, 분석 장치(80)의 AD 변환 보드(82)로 보내진다.
덧붙여, 신호 처리 채널 1, 2, 3의 처리 회로(52a, 52b, 52c)에 있어서의 로 패스 필터는 본 발명에 있어서의 제1 로 패스 필터에 대응하고, 신호 처리 채널 4의 처리 회로(52d)에 있어서의 해당하는 로 패스 필터는 본 발명에 있어서의 제3 로 패스 필터에 대응한다.
상술한 바와 같이 변조 신호의 주파수와 참조 신호의 주파수는 다르다. 이 때문에 형광 신호(수광 신호)의 주파수도 참조 신호의 주파수와 달라 있다. 따라서, 로 패스 필터(70, 72)로부터 출력되는 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)의 신호는, 변조 신호의 주파수와 참조 신호의 주파수와의 차분 주파수를 가진 AC 성분의 신호이다. 이 신호에 위상 지연에 관한 정보가 포함되어 있다. 종래의 방법에서는, 변조 신호와 참조 신호의 주파수가 같기 때문에, 로 패스 필터(70, 72)로부터 출력되는 신호는 일정한 값을 가지는 DC 성분이다. 상술한 바와 같이, RF 믹서에 의한 믹싱 결과에는 오프셋한 DC 성분이 겹치기 때문에, 위상 지연에 관한 정보가 DC 성분인 경우, 분석 장치(80)에 있어서 정도가 높은 형광 완화 시간을 구할 수는 없다. 이 때문에, 플로우 사이토미터(10)에서는, 믹싱 결과로서 얻어지는 위상 지연에 관한 정보가 AC 성분에 포함되도록, 변조 신호의 주파수와 참조 신호의 주파수가 설정되어 있다.
AC 성분인 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)은, 분석 장치(80)로 보내진다.
분석 장치(80)는, 신호 처리 채널 1 ~ 4마다 보내져 오는 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)을 디지털 신호로 변환하는 AD 변환 보드(도 1 참조, 82)와, 분석 장치 본체(컴퓨터, 84)를 가진다.
AD 변환 보드(82)는, 수광부(24)로부터 보내진 신호를 트리거 신호로서 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)의 AD 변환을 개시한다. 나아가, 디지털화된 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)은 분석 장치 본체(84)로 공급된다. 분석 장치(80)는, 디지털화된 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)을 이용하여 분석을 개시한다.
분석 장치 본체(84)는, 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)에 기초하여, 형광의 레이저광에 대한 위상 지연의 각도를 구하고, 나아가, 이 위상 지연의 각도로부터 형광 완화 시간을 구한다. 구한 형광 완화 시간에 기초하여, 수광부(26)로부터 출력된 형광 신호가, 어느 형광 색소에 유래한 것인지 여부를 특정한다.
분석 장치 본체(84)는, 형광 완화 시간의 산출 결과가 어느 신호 처리 채널의 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)에 기초한 것인지를 아는 것에 의하여, 형광 완화 시간이 어느 파장의 형광에 유래한 것인지를 알 수 있다. 또한, 형광 색소가 발하는 형광의 형광 완화 시간은, 형광 색소마다 정해져 있기 때문에, 분석 장치 본체(84)는, 형광 완화 시간의 값과 어느 신호 처리 채널의 형광 완화 시간인지를 아는 것에 의하여, 어느 형광 색소가 발한 형광인지를 특정할 수 있다. 나아가, 형광 색소는, 어느 시료(12)에 부착된 것인지 기지이기 때문에, 분석 장치 본체(84)는, 형광의 특정에 의하여, 계측점을 통과한 시료(12)가 어느 종류의 것인지를 알 수 있다. 따라서, 시료(12) 내의 다른 종류의 생체 물질끼리가 생체 결합한 경우, 생체 물질에 결합한 양방(兩方)의 형광 색소의 형광이 대략 동시에 검출되기 때문에, 분석 장치 본체(84)는, 형광 완화 시간에 기초하여 형광의 종류를 특정하는 것으로, 생체 결합하는 생체 물질의 종류를 알 수 있다. 이와 같은 분석은, 시료(12)가 플로우 상태로 되어 계측점을 1개씩 횡단할 때마다 행하여지기 때문에, 분석 장치 본체(84)는, 얻어진 다수의 결과를 통계 처리하여 종합적인 시료(12)의 분석을 할 수 있다.
분석 장치 본체(84)는, 본 발명에 있어서의 형광 완화 시간을 산출하는 형광 검출부를 형성하고, 컴퓨터에 의하여 구성된다.
도 4는, 분석 장치 본체(84)에서 행하여지는 처리 내용의 예를 설명하는 도면이다.
분석 장치 본체(84)에서는, AD 변환 보드(82)에 의하여, 각 신호 처리 채널의 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)이 디지털 데이터로 변환된 후, 도 4에 도시하는 처리가 행하여진다. 이 처리는, 소프트웨어 처리이다.
소프트웨어 처리에서는, 각 처리가, 각 서브 프로그램이나 서브 루틴에 의하여 모듈화되어 있다. 분석 장치 본체(84)에는, 구체적으로는, FFT 처리 모듈(86), 진폭 산출 모듈(88), 위상 산출 모듈(90), 위상 지연 산출 모듈(92), 보상된 형광 강도 산출 모듈(94), 형광 완화 시간 산출 모듈(96)이 설치되어 있다.
도 4에 도시하는 예에서는, 처리 회로(52a) 및 처리 회로(52d)로부터 보내지는 형광의 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)과, 레이저광(L)의 측방 산란광의 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)의 처리 내용이 도시되어 있다. 도 4에 도시하는 예에서는, 처리 회로(52b, 52c)로부터 보내지는 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)의 처리 내용은 도시되어 있지 않다. 처리 회로(52b, 52c)로부터 보내지는 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)의 처리 내용은, 처리 회로(52a)로부터의 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)의 처리 내용과 같기 때문에, 그 처리 내용은 도시되지 않고, 설명도 생략한다.
처리 회로(52d)로부터 보내진 측방 산란광의 위상 지연에 관한 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분), 및 형광의 실수부 성분(Re 성분) 및 허수부 성분(Im 성분)은 각각, FFT 처리 모듈(86)로 보내져 FFT 처리가 실시된다.
FFT 처리 모듈(86)은, 변조 신호와 참조 신호와의 사이의 차분 주파수 Δf에 대응하는 실수부 성분의 값(Re_Δf)을 실수부 성분(Re 성분)으로부터 구하고, 차분 주파수 Δf에 대응하는 허수부 성분의 값(Im_Δf)을 허수부 성분(Im 성분)으로부터 구한다. 구하여진 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)은, 진폭 산출 모듈(88)로 보내진다. 형광 신호로부터 얻어진 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)이 본 발명에 있어서의 차분 주파수에 대응하는 제1 신호 성분에 대응하고, 수광 신호로부터 얻어진 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)이 본 발명에 있어서의 차분 주파수에 대응하는 제2 신호 성분에 대응한다.
진폭 산출 모듈(88)은, 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)의 제곱 가산의 제곱근을 계산하고, 이 계산 결과를 강도로서 출력한다. 즉, 진폭 산출 모듈(88)에서는, 측방 산란광의 강도와 형광 강도가 출력된다.
또한, FFT 처리에 의하여 얻어진 차분 주파수에 대응하는 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)은, 위상 산출 모듈(90)로 보내진다. 위상 산출 모듈(90)에서는, tan-1(Im_Δf/Re_Δf)가 산출된다. 이것에 의하여, 측방 산란광의 위상과 형광의 위상 지연이 산출된다.
나아가, 위상 지연 산출 모듈(92)은, 위상 산출 모듈(90)에서 구하여진 형광의 위상 지연으로부터 위상 산출 모듈(90)에서 구하여진 측방 산란광의 위상 지연을 빼는 것에 의하여, 보정된, 참조 신호에 대한 형광 신호의 위상 지연을 구한다. 이와 같이 보정이 행하여지는 것은, 참조 신호의 전송 선로와, 형광 신호나 측방 산란광의 수광 신호의 전송 선로의 차이에 의한 위상의 어긋남을 보정하기 위함이다.
다음으로, 형광 완화 시간 산출 모듈(96)에서, 보정된 위상 지연 θ를 이용하여, tanθ/ω가 산출된다. 이 산출 결과가 형광 완화 시간 τ이다. 여기서, ω는, 2πf이며, f는 변조 신호의 주파수를 나타낸다.
tanθ/ω의 값을 형광 완화 시간 τ로 할 수 있는 것은, 형광의 완화 과정이 1차 지연 응답을 따라 형광을 발하기 때문이다.
나아가, 보상된 형광 강도 산출 모듈(94)에서, (1+(τω)2)(1/2)가 산출되고, 이 산출된 값이, 진폭 산출 모듈(88)에서 산출된 형광의 진폭에 곱셈되고, τ로 보상된 형광 강도가 산출된다.
분석 장치 본체(84)는, 이상과 같이, 측방 산란광 강도와, 형광 강도와, 형광 완화 시간 τ와, τ로 보상된 형광 강도를 산출하고, 이들의 결과를, 통계적 처리 및 분석에 이용한다. 물론, 측방 산란광 강도와, 형광 강도와, 형광 완화 시간 τ와, τ로 보상된 형광 강도를 모두 산출하고, 통계적 처리 및 분석에 이용하지 않아도 무방하다. 적어도 형광 완화 시간 τ을 산출하고, 형광 완화 시간 τ을 통계적 처리 및 분석에 이용하면 된다. 덧붙여, 측방 산란광 강도는, 시료(12)의 구조에 의하여, 산란 강도가 크게 다른 것으로부터, 시료(12)의 구조의 복잡함을 나타내는 지표로서 이용할 수 있다.
플로우 사이토미터(10)는 이상과 같이 구성된다.
플로우 사이토미터(10)에서는, 발진기(46)는 클록 신호를 생성하고, 이 발진기(46)가 생성한 클록 신호에 동기하여 발진기(47)는 변조 신호를 생성하고, 발진기(48)는, 클록 신호에 동기하여 참조 신호를 생성한다.
이 때문에, 발진기(47)의 변조 신호와 발진기(48)의 참조 신호에 포함되는 노이즈 성분은, 독립하고 있기 때문에, RF 믹서(60, 62)에 있어서, 형광 신호와 참조 신호가 믹싱 처리되어도, 종래와 같이, 노이즈 성분을 포함하는 형광 신호와 동 시각의 노이즈 성분을 포함하는 참조 신호가 곱셈되어 혼합 신호에 큰 노이즈 성분이 포함되는 것이 없다.
이와 같은 플로우 사이토미터(10)의 신호 처리 장치(20)에서는, 우선, 발진기(46)가 발하는 클록 신호에 동기하여 소정의 주파수의 변조 신호를 발진기(47)는 발생한다. 이 신호가 레이저 드라이버(34)에서 소정의 처리가 실시되어, 레이저 광원부(23)로 공급된다. 레이저 광원부(23)는, 변조 신호의 주파수에 따라 광 강도가 변조된 레이저광(L)을 계측점을 향하여 출사한다. 계측점에서는, 레이저광(L)은, 도시되지 않는 렌즈계에 의하여 수 10μm의 직경의 빔으로 되어 있다.
이 상태로, 시료(12)가 관로(30)를 흘러, 플로우가 형성된다. 플로우는, 예를 들어 100μm의 유로 직경에 1 ~ 10m/초의 유속을 가진다.
레이저 광원부(23)는, 레이저광(L)을 계측점을 향하여 조사한다. 수광부(24)가 시료(12)의 통과를 검출하는 검출 신호를 생성하면, 이 검출 신호를 트리거 신호로서 분석 장치(80)로 출력한다.
발진기(48)는, 이 트리거 신호에 맞추어 발진기(46)의 클록 신호에 동기한 참조 신호를 생성한다.
신호 처리부(42)는, 광전 변환기(27a ~ 27d)로부터 보내져 오는 형광 신호 및 수광 신호와, 참조 신호를 이용하여, 도 3에 도시하는 신호 처리 회로를 따라, 믹싱 처리 및 로 패스 필터링 처리를 행한다. 이렇게 하여, 신호 처리부(42)는, 형광 및 측방 산란광의 각 신호의 위상 지연에 관한 정보인 실수부 성분(Re 성분)과 허수부 성분(Im 성분)을 생성한다.
여기서, 레이저광(L)을 변조하는 변조 신호의 주파수는, 예를 들어 10 ~ 50MHz이며, 변조 신호와 참조 신호와의 차분 주파수는, 100kHz ~ 1MHz이다. 참조 신호의 주파수는, 변조 신호의 주파수에 대하여 높아도 무방하고, 또한 낮아도 무방하다.
산출된 실수부 성분(Re 성분)과 허수부 성분(Im 성분)은, 분석 장치(80)로 보내진다.
분석 장치(80)는, 보내져 온 실수부 성분(Re 성분)과 허수부 성분(Im 성분)의 신호에 AD 변환을 실시하여 디지털화한다. 이 후, 분석 장치(80)는, 도 4에 도시하는 처리를 행하고, 측방 산란광의 강도와, 형광 강도와, 형광 완화 시간 τ와, τ에 의하여 보상된 형광 강도를 산출한다. 이들의 산출 결과가, 시료(12)의 통계적 처리나 분석에 이용된다. 덧붙여, 분석 장치(80)는, 형광 완화 시간을, 측방 산란광에 의하여 얻어지는 수광 신호의 위상 지연을 기준으로 한 형광 신호의 위상 지연 θ에 기초하여, tanθ/ω의 식에 따라 산출한다.
(변형예 1)
도 5는, 분석 장치 본체(84)에서 행하여지는 도 4에 도시하는 처리 내용과 다른 처리 내용의 예를 설명하는 도면이다. 도 5에 도시하는 처리는, 도 4에 도시하는 기능을 구비한 FFT 처리 모듈(86), 진폭 산출 모듈(88), 위상 산출 모듈(90), 위상 지연 산출 모듈(92), 보상된 형광 강도 산출 모듈(94), 형광 완화 시간 산출 모듈(96)이 이용된다.
도 5에 도시하는 처리 내용을 행하려면, RF 믹서(제2 믹서, 52e)와 로 패스 필터(제2 로 패스 필터, 52f)를 가지는 회로를 신호 처리부(42)에 설치한다. 상기 RF 믹서(52e)는, 발진기(47)에서 생성된 변조 신호에 대하여 발진기(48)에서 생성된 참조 신호를 믹싱 처리한다. 상기 로 패스 필터(52f)는, 믹서의 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 변조 신호의 주파수와 참조 신호의 주파수와의 사이의 가산 주파수보다 낮고, 변조 신호의 주파수와 참조 신호의 주파수와의 사이의 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 로 패스 필터링 처리를 행하고, 차분 주파수를 주파수로 가지는 정현파 신호(제2 참조 신호)를 출력한다. 이 때, 상기 회로로부터의 신호가 AD 변환 보드(82)를 통하여 분석 장치 본체(84)로 공급된다.
도 5에 도시하는 처리 내용에서는, 우선, 신호 처리 채널 4에서 산출된 수광 신호의 실수부 성분(Re 성분)과 허수부 성분(Im 성분)이 FFT 처리 모듈(86)에서 처리되고, 차분 주파수 Δf에 있어서의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)이 구하여진다. 이 2개의 값을 이용하여 진폭 산출 모듈(88)에서, 측방 산란광의 수광 신호의 진폭이 산출되고, 이 진폭이 측방 산란광 강도로서 출력된다.
한편, 신호 처리 채널 1에서 얻어진 형광 신호의 실수부 성분(Re 성분)과 허수부 성분(Im 성분)이 FFT 처리 모듈(86)에서 처리되고, 차분 주파수 Δf에 있어서의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)이 구하여지고, 이 2개의 값을 이용하여, 진폭 산출 모듈(88) 및 위상 산출 모듈(90)에서 형광 강도 및 형광 신호의 위상 지연 θa가 산출된다. 신호 처리 채널 2, 3에서 얻어진 형광 신호의 실수부 성분(Re 성분)과 허수부 성분(Im 성분)의 처리도, 신호 처리 채널 1에서 얻어진 형광 신호의 실수부 성분(Re 성분)과 허수부 성분(Im 성분)의 처리와 같은 내용이기 때문에, 그 설명은 생략된다. 신호 처리 채널 2, 3에서 얻어진 형광 신호의 처리의 도시도 생략되어 있다.
상술한 바와 같이, 분석 장치 본체(84)는, 변조 신호와 참조 신호를 믹싱하여 로 패스 필터링 처리를 실시하는 것에 의하여 얻어진 차분 주파수 Δf의 신호의 AD 변환 후의 데이터를 뽑는다. 이 후, FFT 처리 모듈(86)은, 차분 주파수 Δf에 있어서의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)을 구한다. 이 2개의 값을 위상 산출 모듈(90)이 이용하여 위상 θb를 산출한다.
다음으로, 위상 지연 산출 모듈(92)은, 형광 신호의 위상 지연 θa와 상기 위상 θb와, 미리 분석 장치 본체(84)에 기억 보지(保持)되어 있는 보정 위상 θc를 이용하여, θa-θb-θc를 산출하는 것에 의하여, 보정된 형광 신호의, 참조 신호에 대한 위상 지연 θ을 산출한다. 형광 신호의 위상 지연 θa로부터 상기 위상 θb를 빼는 이유는, 신호 처리부(42)에 이르는 신호의 전송 지연 시간 및 처리에 걸리는 지연 시간에 의한 위상 지연을 제거하기 위함이다.
여기서, 보정 위상(보정량, θc)은, 분석 장치 본체(84)에 미리 기억 보지되어 있다. 이 보정 위상 θc에 관해서는 이하와 같이 정해져 기억된다. 즉, 기지의 형광 완화 시간에서 형광을 발하는 기지의 형광 색소를 시료(12)로 하여, 이 시료(12)의 형광이 측정된다. 이때, 보정된 위상 지연 θa-θb-θc로부터 구하여지는 형광 완화 시간이, 형광 색소가 가지는 기지의 형광 완화 시간에 일치하도록, 보정 위상 θc가 정하여진다.
이와 같이, 보정 위상 θc는, 계측 결과가, 기지의 형광 완화 시간에 일치하도록 교정하기 위한 보정량이다.
보정된 위상 지연 θ은, 형광 완화 시간 산출 모듈(96)로 보내진다. 형광 완화 시간 산출 모듈(96)은, tanθ/ω를 산출하는 것에 의하여, 형광 완화 시간 τ을 산출한다.
나아가, 보상된 형광 강도 산출 모듈(94)은, (1+(τω)2)(1/2)를 산출하고, τ로 보상된 형광 강도를 산출한다.
이렇게 하여, 분석 장치 본체(84)는, 측방 산란광 강도, τ로 보상된 형광 강도, 형광 강도, 형광 완화 시간 τ을 산출하고, 산출 결과를 시료(12)의 통계적 처리나 분석에 이용한다.
(변형예 2)
도 6은, 도 4, 도 5에 도시하는 분석 장치 본체(84)에서 행하여지는 처리 내용과 다른 처리 내용의 예를 설명하는 도면이다. 도 6에 도시하는 처리는, 도 4에 도시하는 기능을 구비한 진폭 산출 모듈(88), 위상 산출 모듈(90), 위상 지연 산출 모듈(92), 보상된 형광 강도 산출 모듈(94), 형광 완화 시간 산출 모듈(96), 및 믹싱 처리 모듈(98)이 이용된다.
도 6에 도시하는 처리 내용은, 도 4에 도시하는 처리 내용이 FFT 처리 모듈(86)을 이용하여 차분 주파수 Δf의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)을 구하는 내용인 것과 달리, 분석 장치 본체(84)에서 별도 생성된 cos(2π·Δf·t)를 이용하여 형광 신호 및 측방 산란광의 수광 신호의 실수부 성분(Re 성분)과 허수부 성분(Im 성분)을 각각, 믹싱 처리 모듈(98)을 이용하여 믹싱 처리한다. 이 믹싱 처리에 의하여, 차분 주파수 Δf의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)을 구한다.
믹싱 처리 모듈(98)은, 컴퓨터인 분석 장치 본체(84)의 소프트웨어 처리에 의하여 행하여지기 때문에, RF 믹서(60, 62)에서 행할 때에 발생하는 DC 성분의 오프셋이 없다. 이 때문에, 정도가 높은 믹싱 처리를 행할 수 있다.
덧붙여, DC 성분의 오프셋의 발생이 없도록, RF 믹서(60, 62)의 믹싱 처리를 분석 장치(80)에서 행하는 것도 생각할 수 있다. 그러나, 분석 장치(80)의 AD 변환 보드(82)에서, 10 ~ 50MHz로 강도 변조하는 형광 신호나 수광 신호를 AD 변환하는 AD 변환 보드는 고가이고, 이 고가의 보드를 이용하는 것은 실용적이지 않다.
믹싱 처리 모듈(98)에서 산출된, 차분 주파수 Δf에 있어서의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)은, 진폭 산출 모듈(88), 위상 산출 모듈(90)로 보내지고, 이후, 도 4에 도시하는 처리 내용과 같은 처리를 행한다. 이후의 처리 내용의 설명은 생략한다.
이렇게 하여, 분석 장치 본체(84)는, 측방 산란광 강도, τ로 보상된 형광 강도, 형광 강도, 형광 완화 시간 τ을 산출하고, 산출 결과를 시료(12)의 통계적 처리나 분석에 이용한다.
(변형예 3)
도 7은, 도 4, 도 5, 도 6에 도시하는 분석 장치 본체(84)에서 행하여지는 처리 내용과 다른 처리 내용의 예를 설명하는 도면이다. 도 7에 도시하는 처리는, 도 5에 도시하는 기능을 구비한 진폭 산출 모듈(88), 위상 산출 모듈(90), 위상 지연 산출 모듈(92), 보상된 형광 강도 산출 모듈(94), 형광 완화 시간 산출 모듈(96), 및, 도 6에 도시하는 믹싱 처리 모듈(98)이 이용된다.
도 7에 도시하는 처리 내용은, 도 5에 도시하는 처리 내용이 FFT 처리 모듈(86)을 이용하여 차분 주파수 Δf의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)을 구하는 내용인 것과 달리, 분석 장치 본체(84)는, 분석 장치 본체(84)에서 생성한 cos(2π·Δf·t)와, 형광 신호 및 측방 산란광의 수광 신호의 실수부 성분(Re 성분), 허수부 성분(Im 성분)을 각각, 믹싱 처리 모듈(98)을 이용하여 믹싱 처리하는 것에 의하여, 차분 주파수 Δf의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)을 구한다. 나아가, 분석 장치 본체(84)는, 분석 장치 본체(84)에서 생성한 cos(2π·Δf·t)와, 별도 생성한 sin(2π·Δf·t)와, 차분 주파수 Δf의 신호를, 믹싱 처리 모듈(98)을 이용하여 믹싱 처리한다. 차분 주파수 Δf의 신호란, 도 7에 도시하는 바와 같이, 변조 신호와 참조 신호를 RF 믹서(52e)를 이용하여 믹싱 처리하고, 로 패스 필터(52f)에 의한 로 패스 필터링 처리를 실시하여, AD 변환된 신호이다. 이것에 의하여, 차분 주파수 Δf의 신호에 있어서의 차분 주파수 Δf의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)을 구한다.
믹싱 처리 모듈(98)에서 산출된 차분 주파수 Δf의 신호에 있어서의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)은, 위상 산출 모듈(90)로 보내진다. 이후, 도 5에 도시하는 처리 내용과 같은 처리를 행한다. 이후의 처리 내용의 설명은 생략한다.
이렇게 하여, 분석 장치 본체(84)는, 측방 산란광 강도, τ로 보상된 형광 강도, 형광 강도, 형광 완화 시간 τ을 산출하고, 산출 결과를 시료(12)의 통계적 처리나 분석에 이용한다.
(변형예 4)
도 8은, 도 4 ~ 7에 도시하는 분석 장치 본체(84)에서 행하여지는 처리 내용과 다른 처리 내용의 예를 설명하는 도면이다. 도 8에 도시하는 처리는, 도 5에 도시하는 진폭 산출 모듈(88), 위상 산출 모듈(90), 위상 지연 산출 모듈(92), 보상된 형광 강도 산출 모듈(94), 형광 완화 시간 산출 모듈(96), 및, 도 6에 도시하는 믹싱 처리 모듈(98)이 이용된다.
도 8에 도시하는 처리 내용을 행하려면, 도 5에 도시하는 처리 내용과 같이, 신호 처리부(42)에 있어서 변조 신호와 참조 신호를 믹싱하여 로 패스 필터링 처리를 실시하는 것에 의하여, 차분 주파수 Δf의 신호를 산출하는 회로, 즉, 도 8에 도시하는 RF 믹서(52e) 및 로 패스 필터(52f)가 설치된 회로로부터의 신호가 AD 변환 보드(82)를 통하여 분석 장치 본체(84)로 공급된다.
도 8에 도시하는 처리 내용에서는, 우선, 신호 처리 채널 4에서 산출된 수광 신호 및 형광 신호의 실수부 성분(Re 성분)과 허수부 성분(Im 성분)의 각각을, 믹싱 처리 모듈(98)이, 상기 차분 주파수 Δf의 신호와 믹싱 처리하여, 차분 주파수 Δf에 있어서의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)을 구한다. 이 2개의 값을 이용하여 진폭 산출 모듈(88)은, 측방 산란광의 수광 신호의 진폭 및 형광 신호의 진폭을 산출하고, 이들의 진폭을 측방 산란광 강도 및 형광 강도로서 출력한다. 또한, 위상 산출 모듈(90)은, 형광 신호의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)으로부터 형광 신호의 위상 θa를 산출한다.
다음으로, 형광 완화 시간 산출 모듈(96)은, 산출된 형광 신호의 위상 θa와, 미리 분석 장치 본체(84)에 기억 보지되어 있는 보정 위상 θc를 이용하여, θa-θc를 산출하는 것에 의하여, 보정된 형광 신호의, 참조 신호에 대한 위상 지연 θ을 산출한다.
여기서, 보정 위상(보정량) θc는, 분석 장치 본체(84)에 미리 기억 보지되어 있다. 이 보정 위상 θc에 관해서는, 도 5에 도시하는 보정 위상 θc와 마찬가지로 정해져 기억된다. 즉, 기지의 형광 완화 시간에서 형광을 발하는 기지의 형광 색소를 시료(12)로서 정하고, 이 시료(12)의 형광이 측정된다. 이때, 보정된 위상 지연 θa-θc로부터 구하여지는 형광 완화 시간 τ이, 형광 색소가 가지는 기지의 형광 완화 시간에 일치하도록, 보정 위상 θc가 정해진다. 이와 같이, 보정 위상 θc는, 계측 결과가, 기지의 형광 완화 시간에 일치하도록 교정하기 위한 보정량이다.
덧붙여, 도 8에 도시하는 처리 내용에서는, 도 5에 도시하는 처리 내용과 달리, 위상 θb를 이용하여 위상 지연 θ을 산출하지 않는다. 이 이유는, 차분 주파수 Δf의 신호를 이용하여 믹싱 처리를 행하여 얻어진 형광 신호의 실수부 성분의 값(Re_Δf)과 허수부 성분의 값(Im_Δf)에는, 신호의 전송 시간이나 신호 처리의 지연 시간에 의하여 생기는 위상 지연이 빼진 정보로 되어 있기 때문이다.
따라서, θa-θc를 산출하는 것에 의하여, 보정된 위상 지연 θ을 구할 수 있다.
이후의 처리는, 도 5에 도시하는 처리와 같기 때문에 그 설명은 생략한다.
이렇게 하여, 분석 장치 본체(84)는, 측방 산란광 강도, τ로 보상된 형광 강도, 형광 강도, 형광 완화 시간 τ을 산출하여, 산출 결과를 시료(12)의 통계적 처리나 분석에 이용한다.
이와 같이 각 변형예에서는, 위상 지연의 산출을 위한 보정을 행하지만, 이 때의 보정의 방법이 여러 가지 다르다.
이상, 본 발명의 강도 변조한 레이저광에 의한 형광 검출 장치 및 형광 검출 방법에 관하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고, 본 발명의 주지를 일탈하지 않는 범위에 있어서, 여러 가지의 개량이나 변경을 하여도 무방한 것은 물론이다.
10: 플로우 사이토미터
12: 시료
20: 신호 처리 장치
22: 레이저 출사부
23: 레이저 광원부
24, 26: 수광부
24b: 집광 렌즈
26a: 렌즈계
26b1, 26b2, 26b3: 다이크로익 미러
26c1, 26c2, 26c3, 26c4: 밴드 패스 필터
27a, 27b, 27c, 27d: 광전 변환기
28: 제어·처리부
30: 관로
32: 회수 용기
34: 레이저 드라이버
40: 신호 생성부
42: 신호 처리부
46, 47, 48: 발진기
52a ~ 52d: 처리 회로
54, 66, 68: 앰프
56: 가변 증폭 앰프
58: 파워 스플리터
60, 62, 52e: RF 믹서
64: 90도 하이브리드 위상 시프터
70, 72, 52f: 로 패스 필터
74, 76: 하이 패스 필터
80: 분석 장치
82: AD 변환 보드
84: 분석 장치 본체
86: FFT 처리 모듈
88: 진폭 산출 모듈
90: 위상 산출 모듈
92: 위상 지연 산출 모듈
94: 보상된 형광 강도 산출 모듈
96: 형광 완화 시간 산출 모듈
98: 믹싱 처리 모듈

Claims (17)

  1. 측정 대상물에 레이저광을 조사(照射)하는 것에 의하여 측정 대상물이 발(發)하는 형광을 수광하고, 이 형광의 수광에 의하여 얻어지는 형광 신호로부터, 형광 완화 시간을 구하는 형광 검출 장치이고,
    측정 대상물에 조사하는, 강도 변조된 레이저광을 출사하는 레이저 광원부와,
    강도 변조된 레이저광의 조사에 의하여 측정 대상물이 발하는 형광의 형광 신호를 출력하는 수광부와,
    상기 레이저 광원부로부터 출사하는 레이저광을 강도 변조시키기 위하여, 소정의 주파수의 변조 신호를 생성하고, 나아가, 상기 변조 신호의 주파수와 다른 주파수를 가지고, 상기 변조 신호와 동기(同期)한 제1 참조 신호를, 상기 변조 신호와 따로 생성하는 신호 생성부와,
    상기 변조 신호를 이용하여 강도 변조한 레이저광을 측정 대상물에 조사하는 것에 의하여 상기 수광부에서 출력되는 형광 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제1 믹싱 처리를 행하는 제1 믹서와, 상기 제1 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 변조 신호의 주파수와 상기 제1 참조 신호의 주파수와의 가산 주파수보다 낮고, 상기 변조 신호의 주파수와 상기 제1 참조 신호의 주파수와의 사이의 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프(cut off) 주파수로 하는 제1 로 패스 필터링(low pass filtering) 처리를 행하여 형광 신호 베이스의 저주파 신호를 출력하는 제1 로 패스 필터를 가지는 신호 처리부와,
    상기 형광 신호 베이스의 저주파 신호를 디지털 신호로 변환하고, 이 디지털 신호 중, 상기 차분 주파수에 대응하는 제1 신호 성분을 이용하여, 상기 변조 신호에 대한 상기 형광 신호의 위상을 산출하고, 상기 위상으로부터, 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구하는 형광 검출부를 가지는 것을 특징으로 하는 강도 변조한 레이저광에 의한 형광 검출 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신호 생성부는, 클록(clock) 신호를 생성하는 제1 발진기와,
    상기 제1 발진기가 생성한 상기 클록 신호에 동기하여 상기 변조 신호를 생성하는 제2 발진기와,
    상기 제1 참조 신호를, 상기 클록 신호에 동기하여 생성하는 제3 발진기를 가지는 형광 검출 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 형광 검출부는, 상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 디지털 신호인 제2 참조 신호를 상기 형광 신호 베이스의 저주파 신호의 디지털 신호와 믹싱하는 것에 의하여, 상기 제1 신호 성분을 구하는 형광 검출 장치.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서,
    상기 신호 처리부는, 상기 변조 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제2 믹싱 처리를 행하는 제2 믹서와, 상기 제2 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 제2 로 패스 필터링 처리에 의하여, 상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 정현파 신호를 출력하는 제2 로 패스 필터를 가지고,
    상기 형광 검출부는, 상기 제2 로 패스 필터로부터 출력된 상기 정현파 신호를 디지털화하는 것에 의하여, 상기 제2 참조 신호를 생성하는 형광 검출 장치.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 형광 검출부는, 상기 형광 신호 베이스의 저주파 신호의 디지털 신호에 대하여 FFT(Fast Fourier Transformation) 처리를 실시하고, 상기 FFT 처리에 의하여 얻어지는, 상기 차분 주파수에 대응하는 실수부와 허수부의 값을 상기 제1 신호 성분으로서 산출하고, 상기 실수부와 상기 허수부의 값으로부터 상기 위상을 산출하는 형광 검출 장치.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 수광부는, 상기 형광을 수광하는 수광 소자 외에, 상기 레이저광에 의한 측정 대상물의 측방 산란광을 수광하는 수광 소자를 가지고, 상기 측방 산란광의 수광에 의하여 얻어진 수광 신호를 출력하고,
    상기 신호 처리부는, 상기 수광 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제3 믹싱 처리를 행하는 제3 믹서와, 상기 제3 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 제3 로 패스 필터링 처리를 행하여 수광 신호 베이스의 저주파 신호를 출력하는 제3 로 패스 필터를 가지고,
    상기 형광 검출부는, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호와 상기 제2 참조 신호와의 믹싱 처리에 의하여, 혹은, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호에 대하여 FFT 처리를 실시하는 것에 의하여, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호 중, 상기 차분 주파수에 대응하는 제2 신호 성분의 위상을 구하고, 이 제2 신호 성분의 위상을 기준으로 하여 상기 형광 신호의 위상을 보정하며, 보정된 상기 위상을 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구하는 형광 검출 장치.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 신호 처리부는, 상기 변조 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제2 믹싱 처리를 행하는 제2 믹서와, 상기 제2 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 제2 로 패스 필터링 처리에 의하여, 상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 정현파 신호를 출력하는 제2 로 패스 필터를 가지고,
    상기 형광 검출부는, 상기 제2 로 패스 필터로부터 출력된 상기 정현파 신호를 디지털화하는 것에 의하여, 상기 제2 참조 신호를 생성하고, 상기 제2 참조 신호의 위상을, 상기 형광 신호의 위상으로부터 빼는 것에 의하여, 상기 형광 신호의 위상을 보정하고, 보정한 상기 위상을 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구하는 형광 검출 장치.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 형광 검출부는, 상기 제2 참조 신호를 FFT 처리하는 것에 의하여, 혹은, 별도 생성된 상기 차분 주파수를 가지는 정현파 신호를, 상기 제2 참조 신호와 믹싱하는 것에 의하여, 상기 제2 참조 신호의 위상을 구하는 형광 검출 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 형광 검출부는, 상기 별도 작성된 상기 차분 주파수를 가지는 정현파 신호를, 상기 제2 참조 신호와 믹싱할 때, 사인 신호 및 코사인 신호의 각각을 상기 제2 참조 신호와 믹싱하고, 상기 사인 신호 및 상기 코사인 신호의 각각을 믹싱한 결과의 값의 비율을 구하는 것에 의하여, 상기 제2 참조 신호의 위상을 구하는 형광 검출 장치.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 형광 검출부는, 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구할 때, 미리 설정된 보정량을 이용하여 상기 형광 신호의 상기 보정을 한 위상을 더 보정하고, 상기 보정량을 이용한 보정 후의 위상을 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구하고,
    상기 보정량은, 기지(旣知)의 형광 완화 시간에서 형광을 발하는 형광 색소를 측정 대상물로서, 형광을 측정했을 때에 구하여지는 상기 형광 완화 시간이, 상기 형광 색소가 가지는 형광 완화 시간에 일치하도록, 구하여진 양인 형광 검출 장치.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 수광부는, 상기 형광을 수광하는 수광 소자 외에, 상기 레이저광에 의한 측정 대상물의 측방 산란광을 수광하는 수광 소자를 가지고, 상기 측방 산란광의 수광에 의하여 얻어진 수광 신호를 출력하고,
    상기 신호 처리부는, 상기 수광 신호와 상기 참조 신호와의 제3 믹싱 처리를 행하는 제3 믹서와, 상기 제3 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 제3 로 패스 필터링 처리에 의하여, 상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 수광 신호 베이스의 저주파 신호를 출력하는 제3 로 패스 필터를 가지고,
    상기 형광 검출부는, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호의 진폭을 구하고,
    상기 형광 검출부는, 구한 상기 진폭을 상기 측방 산란광의 강도로서 정하고, 나아가, 상기 제1 신호 성분으로부터 구하여지는 진폭을 형광 강도로서 정하고, 상기 측방 산란광의 강도, 상기 형광 강도 및 상기 형광 완화 시간을 출력하는 형광 검출 장치.
  13. 측정 대상물에 레이저광을 조사하는 것에 의하여 측정 대상물이 발하는 형광을 수광하고, 이 형광의 수광에 의하여 얻어지는 형광 신호로부터, 형광 완화 시간을 구하는 형광 검출 방법이고,
    소정의 주파수의 변조 신호에 의하여 강도 변조를 받은 레이저광을 측정 대상물에 조사하는 스텝과,
    레이저광이 조사된 측정 대상물이 발하는 형광을 검출 수단으로 수광하고, 상기 검출 수단에 의하여 얻어지는 형광 신호를 취득하는 스텝과,
    상기 변조 신호의 주파수와 다른 주파수를 가지고, 상기 변조 신호와 위상이 동기한 제1 참조 신호를, 상기 변조 신호와 따로 생성하는 스텝과,
    강도 변조한 레이저광을 측정 대상물에 조사하는 것에 의하여 상기 검출 수단으로 얻어진 형광 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제1 믹싱 처리를 하고, 나아가, 상기 변조 신호의 주파수와 상기 참조 신호의 주파수와의 가산 주파수보다 낮고, 상기 변조 신호의 주파수와 상기 참조 신호의 주파수와의 사이의 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 제1 로 패스 필터링 처리를 실시하는 것에 의하여, 형광 신호 베이스의 저주파 신호를 생성하는 스텝과,
    생성된 상기 형광 신호 베이스의 저주파 신호를 디지털 신호로 변환하고, 상기 디지털 신호 중, 상기 차분 주파수에 대응하는 제1 신호 성분을 이용하여, 상기 변조 신호에 대한 상기 형광 신호의 위상을 산출하고, 상기 위상으로부터, 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구하는 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 강도 변조한 레이저광에 의한 형광 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 디지털 정현파 신호를 제2 참조 신호로 하였을 때, 상기 제1 신호 성분은, 상기 제2 참조 신호와, 상기 형광 신호 베이스의 저주파 신호의 디지털 신호와 믹싱 처리를 행하는 것에 의하여 구하여지는 형광 검출 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 형광 신호에 대하여 상기 제1 믹싱 처리와 상기 제1 로 패스 필터링 처리를 행하는 것 외에, 상기 변조 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제2 믹싱 처리를 행하고, 상기 제2 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하는 제2 로 패스 필터링 처리를 행하여, 상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 정현파 신호를 출력하고,
    상기 제2 로 패스 필터링 처리에 의하여 얻어진 상기 정현파 신호를 디지털화하는 것에 의하여, 상기 제2 참조 신호를 생성하는 형광 검출 방법.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 형광의 수광 시, 상기 형광의 수광 외에, 상기 레이저광에 의한 측정 대상물의 측방 산란광이 수광되고, 상기 측방 산란광의 수광에 의하여 얻어지는 수광 신호가 출력되며,
    상기 수광 신호에는, 상기 수광 신호와 상기 제1 참조 신호와의 제3 믹싱 처리와, 상기 제3 믹싱 처리로 얻어진 혼합 신호에 대하여, 상기 가산 주파수보다 낮고, 상기 차분 주파수보다 높은 주파수를 컷오프 주파수로 하고, 수광 신호 베이스의 저주파 신호를 출력하는 제3 로 패스 필터링 처리가 실시되고,
    상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호와 상기 차분 주파수를 주파수로 가지는 디지털 정현파 신호와의 믹싱 처리를 하는 것에 의하여, 혹은, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호에 대하여 FFT 처리를 실시하는 것에 의하여, 상기 수광 신호 베이스의 저주파 신호의, 상기 차분 주파수에 대응하는 제2 신호 성분의 위상을 구하고, 상기 제2 신호 성분의 위상을 기준으로 하여, 상기 형광 신호의 위상을 보정하고, 보정 후의 위상을 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구하는 형광 검출 방법.
  17. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 형광 신호의 위상으로부터, 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구할 때, 미리 설정된 보정량을 이용하여 상기 형광 신호의 위상을 보정하고, 이 보정 후의 위상을 이용하여 측정 대상물의 형광의 형광 완화 시간을 구하며,
    상기 보정량은, 기지의 형광 완화 시간에서 형광을 발하는 형광 색소를 측정 대상물로서 형광을 측정했을 때에, 상기 보정 후의 위상으로부터 구하여지는 상기 형광 완화 시간이, 상기 형광 색소가 가지는 형광 완화 시간에 일치하도록, 구하여진 양인 형광 검출 방법.

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