CN100494989C - 微弱荧光光谱的测量方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及光谱检测技术，特别涉及原子和分子光谱的检测、测量技术，具体为微弱荧光光谱的测量方法及装置。解决现有微弱荧光光谱的测量方法信噪比低的问题。采用低频正弦调制电压作为激光调制信号，以三角波电压为激光扫频信号，通过探测激光激发产生的微弱荧光，获得被调制了的荧光的光子计数光谱，将光子计数结果转换成相应的模拟电压信号后，通过谐波解调获得实际被测微弱荧光的荧光光谱。有效地抑制了光子计数方法中的量子散粒噪声，可应用于单原子、分子的实时监控以及其他微弱荧光光谱的测量。

Description

微弱荧光光谱的测量方法及装置

技术领域

本发明涉及光谱检测技术，特别涉及原子和分子光谱的检测与信号处理技术，具体为(原子和分子)微弱荧光光谱的测量方法及装置。

背景技术

人们对于原子和分子的认识绝大部分是通过光谱研究进行的。从激光与物质相互作用产生的微弱荧光光谱中，人们能够取得原子、分子及其周围环境的信息，从而在物理、化学及生物研究中得到了广泛的应用。测量激光激发的荧光光谱时，保持激发光强度不变，连续地调谐激发光的波长，并测量在某波长位置上样品发射的荧光强度变化。如激发光的波长选择在发射强度的峰值处，则所测量得的发射光谱强度很大。通过测量光谱，得到不同原子和分子在发射光谱强度最大时对应的激发光的波长。这对于一些工业应用领域有特殊的作用和意义，如测量原子和分子的浓度，能够广泛应用于气体激光监测、气体化学成分分析等实用领域。

在荧光辐射功率很小时，通常采用光子计数的方法来测量微弱荧光光谱。所谓的光子计数是使用量子计数器来测量光场的光子概率分布。现有技术测量微弱荧光光谱时，采用外腔式可调谐二极管激光器产生激光，在该外腔式激光器谐振腔后镜或外腔的反馈光栅的压电陶瓷上施加三角波形(锯齿形)的扫频电压信号，驱动其旋转而实现波长的连续调节，从而使该激光器产生光强度不变(光强度是由通过激光二极管的电流决定的)、波长缓慢线性变化的激光，实现对样品整个荧光谱线的完整扫描；用该激光照射样品，使用单光子探测器接收样品发出的荧光光子，单光子探测器对入射荧光光子响应，并将光子到达的事件光电转化为一个标准的逻辑电脉冲输出信号。用计数器对电脉冲的个数进行计数，即记录微小时间间隔(也称采样时间)τ内(由于采样时间τ很短，在该微小时间间隔τ内激光的波长可近似地认为是一定值)到达计数器的逻辑电脉冲的个数，将逻辑电脉冲的计数结果进行显示(如用示波器或直接在计算机上进行显示)，就可以得到样品的光子计数光谱(如附图3所示)。光子个数越多表示光强越大。因此，附图3实质反映的是在不同激光频率(或波长)下样品所发荧光的强度变化。由于现有测量方法的信噪比较低，因此从附图3中只能粗略地看出在某一频率下对应的样品所发荧光的强度，测量精度较低。

在光子计数光谱中，噪声主要来自于基底荧光、环境光、探测器的热噪声以及由光子数起伏引入的量子散粒噪声。基底荧光和环境光可以通过设置合适的门开关得到抑制，探测器的热噪声可以通过降低探测器的温度得到抑制，而量子散粒噪声在光子计数光谱中是无法得到抑制的。对于光子计数光谱，其光子计数分布服从Poisson分布，光子数起伏可以表示为F＝(Sτ)^1/2，其中S为单位时间的计数率，τ为采样时间。当探测器工作于低温环境，且对于环境光进行了光屏蔽的情况下，背景杂散光和探测器的热噪声相比于信号的散粒噪声可以忽略，光子计数光谱的最佳信噪比可以表示为 $\mathrm{SNR}=\mathrm{S\τ}/\sqrt{\mathrm{S\τ}}=\sqrt{\mathrm{S\τ}}.$

为了提高光子计数光谱的信噪比，通常采用的方法是增大采样时间τ。当采样时间τ足够大时，光子计数分布的平均值Sτ很大，光子计数光谱的信噪比(Sτ)^1/2也很大。但是当实验中的样品(例如具有漂白效应的分子)或测量系统(例如能量和波长漂移的激光器)不够稳定时，过长的采样时间是无法在实际测量中实现的。因此，依靠增大采样时间τ的方法不能真正有效解决现有测量方法信噪比低的问题。

发明内容

本发明为了解决现有微弱荧光光谱的测量方法信噪比低的问题，提供一种能极大提高测量信噪比的微弱荧光光谱的测量方法。

本发明的另一个目的为提供实现上述测量方法的装置。并仅以提高该装置的硬件结构为目的。

本发明是采用如下技术方案实现的：微弱荧光光谱的测量方法，采用外腔式可调谐二极管激光器产生激光，在外腔式可调谐二极管激光器的谐振腔后镜或外腔的反馈光栅的压电陶瓷上施加三角波形的扫频电压信号，在外腔式可调谐二极管激光器谐振腔后镜或外腔的反馈光栅的压电陶瓷上还施加一正弦波形的调制电压信号；用激光器产生的激光照射样品，使用单光子探测器接收样品发出的荧光光子，单光子探测器对入射荧光光子响应，并将光子到达的事件光电转化为一个标准的逻辑电脉冲输出信号；在各采样时间τ内对逻辑电脉冲进行计数(如附图5所示)；将逻辑电脉冲的计数结果进行数-模转换，将计数结果转换为模拟电压信号(即将计数结果线性转换为与计数结果成正比的模拟电压信号)，对计数结果的模拟电压信号进行正弦波形调制电压信号的偶次倍频解调，得到被测微弱荧光光谱(的谐波信号)(如附图6所示)并对荧光光谱进行显示。针对不同的荧光寿命、不同的荧光强度，对由调制信号的不同偶次倍频解调后所得的光谱信号的信噪比进行优选分析、决定所用最佳探测谐波的内容。

外腔式可调谐二极管激光器一般工作于恒温21℃，不同的激光器有不同的空气中的中心波长，根据被测对象的不同，选择具有与被测对象吸收峰对应的中心波长的激光器。通过在扫描电压信号上叠加调制正弦波信号，改变加在激光器压电陶瓷上的电压，可以实现激光器频率几个GHz的连续变化，扫描到完整的吸收线。通过调制和解调的过程，只容许包含吸收信号的调制波得到放大，而抑制了其他频率的背景信号，即通过压缩噪声带宽有效降低量子噪声，从而提高光谱信号的信噪比。

现有技术中，照射激光可采用连续激光或激光脉冲序列。将连续激光变换为激光脉冲序列的方法是把连续激光通过声光调制器，屏蔽掉声光调制器的零级光斑，保留一级光斑进入后续光路，通过在声光调制器的驱动模块上施加逻辑控制信号对于一级衍射光进行选通来实现的。在激光脉冲序列照射样品的应用场合下，按照信号采集的基本原理，采样时间τ的重复周期应当远高于激光脉冲序列的重复周期。并且最好使激光脉冲序列的重复频率为采样时间τ的重复频率的整数倍，以采集到更加准确的计数信号。与现有技术一样，本发明中的激光也可采用连续激光或激光脉冲序列。由于本发明施加了调制电压信号，为了充分采集到调制电压信号的变化，同样按照信号采集的基本原理，在连续激光照射样品的应用场合下，采样时间τ的重复频率应当远高于调制电压信号的频率(采样时间τ的周期应当远低于调制电压信号的周期)。在光脉冲序列照射样品的应用场合下，采样时间τ的周期应当远低于调制电压信号的周期，而且远高于光脉冲序列的重复周期。并且最好使光脉冲序列的重复频率为采样时间τ的重复频率的整数倍，采样时间τ的重复频率为调制电压信号的重复频率的整数倍。

本发明中，逻辑电脉冲的计数结果进行数-模转换可采用多种公知的集成芯片。本发明选用National Instruments、NI6251型号的多功能数据采集卡。该多功能数据采集卡具有计数和模-数转换的双重功能，因此，逻辑电脉冲的计数和数-模转换都可以在该多功能数据采集采集卡上完成，从而简化结构。计数结果的模拟电压信号进行正弦波形调制电压信号的偶次倍频解调可采用相关器来完成。

本发明采用低频正弦调制电压作为激光调制信号，以三角波电压为激光扫频信号，通过探测激光激发产生的微弱荧光，获得被调制了的荧光的光子计数光谱，将光子计数结果转换成相应的模拟电压信号后，通过谐波解调获得实际被测微弱荧光的荧光光谱。有效地抑制了光子计数方法中的量子散粒噪声，可以有效抑制连续背景噪声，提高了微弱荧光光谱的信噪比，增加了微弱荧光光谱的分辨率，可应用于单原子、分子的实时监控以及其他微弱荧光光谱的测量。

附图说明

图1为实现本发明所述方法的装置结构示意图；

图2为激光器控制端施加的扫描电压波形图；

图3为仅施加扫描电压的光子计数光谱；

图4为激光器控制端施加扫描和调制后的电压波形图；

图5为施加扫描和调制电压后的光子计数光谱；

图6为谐波解调后的荧光光谱。

图1中：1、2-函数信号发生器，3-合成器，4-外腔式可调谐二极管激光器，5-饱和吸收光谱，6-声光调制器，7-可调衰减片，8-样品池，9-单光子探测器，10-He-Ne激光器，11-计算机，12-相关器，13-脉冲信号发生器，14-(10^-2)分频器，15-(10^-4)分频器，16-分频电路。

具体实施方式

下面对具体实现本发明所述测量方法的装置进行描述，并结合附图1装置结构示意图对本发明所述的测量方法进行进一步的详细描述。本具体实施方式用于测量铯蒸汽微弱荧光光谱的场合。

实现本发明所述测量方法的装置包括外腔式可调谐二极管激光器4、样品池8、位于样品池侧面的单光子探测器9、三角波的信号发生器2、脉冲信号发生器13、与脉冲信号发生器13相连的分频电路16、计算机11，单光子探测器9的信号输出端与计算机相连，分频电路16的输出端与计算机11相连；还包含正弦波调制信号的函数信号发生器1和合成器3，正弦波调制信号的函数信号发生器1和三角波的信号发生器2的输出分别与合成器3相连，合成器的输出与外腔式可调谐二极管激光器4的谐振腔后镜或外腔的反馈光栅的压电陶瓷的电压控制端相连，分频电路16与正弦波调制信号的函数信号发生器1相连，计算机11内设置有多功能数据采集卡，与计算机11连接有相关器12，分频电路16与相关器12相连。所述的分频电路16由10^-2分频器14和10^-4分频器15构成，10^-2分频器14与计算机11相连，10^-4分频器15与正弦波调制信号的函数信号发生器1和相关器12相连。在外腔式可调谐二极管激光器4与样品池8之间设有声光调制器6和可调衰减片7，同时，脉冲信号发生器13与声光调制器6的驱动模块相连，以此将连续激光变换为激光脉冲序列。

参见附图1。输出正弦波调制信号的函数信号发生器1(HP，33120A型)和输出三角波的信号发生器2(HP，33120A型)的输出分别与合成器3(MiniCircuit，ZFRSC-2050型)相连，合成器的输出施加到外腔式可调谐二极管激光器4(Sacher，TEC-100型)谐振腔后镜或外腔的反馈光栅的压电陶瓷的电压控制端上。激光器输出的连续激光经过声光调制器6(Crystal Technology，3080-122型)斩波和可调衰减片7衰减后成为弱光脉冲序列，入射充有铯原子饱和蒸汽的样品池8。单光子探测器9(Perkin-Elmer，SPCM-AQR-15型)从样品池8的侧面收集荧光，并将探测到的光子转化为逻辑电脉冲信号。计算机11内置的多功能数据采集卡(National Instruments，NI6251型)将测量到的计数结果线性转化为相应的模拟信号，计算机11模拟信号的输出端与相关器12(Stanford Research Systems，SR830型)相连。计算机11处理来自相关器12的谐波信号，得出检测结果。

为了保证整个装置的严格同步，脉冲信号发生器13(SRS，DG535)输出的频率为f_rep＝0.98MHz的基频信号经过分频电路，得到了两组频率分别为f_rep/10²和f_rep/10⁴的时钟信号。第一组频率为f_rep/10²的时钟信号连接到计算机11内置的数据采集卡上，用于设置计数器的采样时间τ＝10²/f_rep。第二组频率为f_rep/10⁴的时钟信号用于函数发生器2的外部触发同步信号。函数发生器2输出频率为f_rep/10⁴的正弦调制信号，与函数发生器1输出的0.5Hz的三角波信号通过加法器叠加在一起，加载到激光器4的压电陶瓷上用于激光器波长的调制与扫频。

本例中，外腔式二极管激光器工作于恒温21℃，空气中的中心波长为852.1nm。改变加在激光器压电陶瓷上的电压，可以实现激光器频率几个GHz的连续变化，扫描到完整的吸收线。在样品池中抽真空至133.3×10^-6Pa后充以纯金属铯，以铯原子饱和蒸汽作为被测气体。铯原子蒸汽在室温及超低压状态下主要受温度展宽影响，吸收信号呈现高斯线型。实验中记录了Cs原子D2线的饱和吸收谱，用于频率参考。

本实例中使用的单光子探测器9在852nm处的量子效率为48％，死时间为50ns，平均暗计数率低于50cps。He-Ne激光器发出的激光用于模拟不同背景光强度下的背景噪声。

样品池发出的荧光，经过探测器转化为逻辑电脉冲信号后，通过数据采集卡的计数模块采集(图5所示)。并将这些数字信号线性转换成了可解调的模拟信号，数模转换的倍乘因子g＝0.3mV/计数。模拟信号输入相关器，用于偶次谐波nf_rep(n＝2，4，6)解调。整个装置的仪器控制和数据采集通过在相应软件支持下的电脑来完成。

本例中，解调所得的谐波选择为偶次谐波，这是由于偶次谐波的峰值位置与直接吸收信号(无调制)的峰值位置一致，从而便于分析。对于奇次谐波，直接吸收信号的峰值位置对应的是谐波的零点位置，不予考虑。

图2为连续调节激光器的波长所用的扫频电压，图3为在激光器上施加扫频电压而不施加调制电压时得到的光子计数光谱，图4为将调制电压叠加到扫频电压上时的电压信号，图5为调制电压叠加到激光器上得到的光子计数光谱。

图6中，(a)、(b)和(c)分别表示探测到的二次、四次和六次谐波信号。测得现有光子计数方法得到的荧光光谱的信号噪声比SNR＝6.1(图3)，相应的二次、四次和六次谐波探测的信号噪声比分别为SNR＝2305、SNR＝2267、SNR＝1780。高次谐波的调制展宽明显减小，但是信噪比并没有进一步的改善。在此例中使用二次谐波更有利于提高信噪比。本例通过光子计数调制光谱有效的消除了光子计数光谱中的光子计数起伏，提高了光子计数光谱的信噪比，提高了微弱荧光光谱的灵敏度。

从本例的测量结果中可以估计出，最低可探测光子数为5×10^-4光子/脉冲，这一标准远低于通常实用条件下的0.1光子/脉冲，因此这种方法适用于几乎所有微弱荧光光谱测量场合。

Claims (7)

1、一种微弱荧光光谱的测量方法，采用外腔式可调谐二极管激光器产生激光，在外腔式可调谐二极管激光器谐振腔后镜或外腔的反馈光栅的压电陶瓷上施加三角波形的扫频电压信号，其特征为：在外腔式可调谐二极管激光器谐振腔后镜或外腔的反馈光栅的压电陶瓷上还施加一正弦波形的调制电压信号；用激光器产生的激光照射样品，使用单光子探测器接收样品发出的荧光光子，单光子探测器对入射荧光光子响应，并将光子到达的事件光电转化为一个标准的逻辑电脉冲输出信号；在各采样时间τ内对逻辑电脉冲进行计数；将逻辑电脉冲的计数结果进行数-模转换，将计数结果转换为模拟电压信号，对计数结果的模拟电压信号进行正弦波形调制电压信号的偶次倍频解调，得到被测微弱荧光的荧光光谱并对光谱进行显示。

2、如权利要求1所述的微弱荧光光谱的测量方法，其特征为：对逻辑电脉冲的计数结果进行数-模转换采用National InstrumentsNI6251型号的多功能数据采集卡。

3、如权利要求2所述的微弱荧光激发光谱的测量方法，其特征为：逻辑电脉冲的记数和数-模转换都在多功能数据采集采集卡上完成。

4、如权利要求1或2或3所述的微弱荧光光谱的测量方法，其特征为：计数结果的模拟电压信号进行正弦波形调制电压信号的偶次倍频解调采用相关器来完成。

5、实现如权利要求1所述微弱荧光光谱的测量方法的装置，包括外腔式可调谐二极管激光器(4)、样品池(8)、位于样品池侧面的单光子探测器(9)、三角波的信号发生器(2)、脉冲信号发生器(13)、与脉冲信号发生器(13)相连的分频电路(16)、计算机(11)，单光子探测器(9)的信号输出端与计算机相连，分频电路(16)的输出端与计算机(11)相连；其特征为：还包含正弦波调制信号的函数信号发生器(1)和合成器(3)，正弦波调制信号的函数信号发生器(1)和三角波的信号发生器(2)的输出分别与合成器(3)相连，合成器的输出与外腔式可调谐二极管激光器(4)的谐振腔后镜或外腔的反馈光栅的压电陶瓷的电压控制端相连，分频电路(16)与正弦波调制信号的函数信号发生器(1)相连，计算机(11)内设置有多功能数据采集卡，与计算机(11)连接有相关器(12)，分频电路(16)与相关器(12)相连。

6、如权利要求5所述的装置，其特征为：分频电路(16)由10^-2分频器(14)和10^-4分频器(15)构成，10^-2分频器(14)与计算机(11)相连，10^-4分频器(15)与正弦波调制信号的函数信号发生器(1)和相关器(12)相连。

7、如权利要求5或6所述的装置，其特征为：在外腔式可调谐二极管激光器(4)与样品池(8)之间设有声光调制器(6)和可调衰减片(7)，同时，脉冲信号发生器(13)与声光调制器(6)的驱动模块相连。

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