ES2316538T3 - Fluorimetro de obtencion de imagenes para fluorescencia analizada en el tiempo. - Google Patents
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Abstract
Un sistema de obtención de imágenes para fluorimetría con resolución temporal de muestras químicas, biológicas y médicas dispuestas sobre un medio que las contiene en el que se han de someter a iluminación, haciendo que las mismas emitan luz, comprendiendo el sistema de obtención de imágenes: una fuente de iluminación (5, 11) que puede ser modulada desde una intensidad sustancialmente completa en las muestras hasta menos de aproximadamente el 1% de la intensidad completa, en un tiempo menor que aproximadamente 100 microsegundos; un sistema de iluminación (6, 7, 12, 13) para iluminar desde la fuente hasta una zona en la que las muestras pueden ser mayores que el campo de visión de un microscopio; un sistema de lentes (4) para recoger la luz emitida desde las muestras contenidas dentro de la zona iluminada; un dispositivo (4) de formación de imágenes situado de manera que la luz desde las muestras, que pasa a través de las lentes, incide en el dispositivo y el dispositivo produce una representación de una imagen de las emisiones de la muestra; un único obturador de cristal ferroeléctrico (14) colocado entre las muestras y el dispositivo de formación de imágenes, que comprende un analizador de polarización y que incluye un dispositivo de cristal ferroeléctrico configurado como un polarizador que cambia la rotación de polarización de la luz que pasa a través del mismo, dependiendo de un campo eléctrico aplicado; y un analizador de polarización insertado en la trayectoria de emisión entre las muestras y el dispositivo de formación de imágenes; de manera que el obturador (14) se puede hacer opaco (desactivado) o transparente (activado), con un periodo de activación-desactivación más corto que aproximadamente 100 microsegundos y con una relación de contraste entre activación y desactivación en exceso de aproximadamente 100:1; y un dispositivo de control para ajustar los tiempos de activación/desactivación de la fuente de iluminación y los tiempos de apertura/cierre del obturador; en el que el sistema de lentes (4) tiene una óptica fabricada de este modo y el obturador está situado dentro de la óptica en la trayectoria óptica de la luz emitida, de manera que los ángulos de incidencia de la luz con respecto a la normal sobre el obturador no exceden los 20º, de modo que se consigue la mejor relación de contraste posible y se minimizan los efectos de dicho obturador sobre las características de la longitud de onda de la luz transmitida.
Description
Fluorímetro de obtención de imágenes para
fluorescencia analizada en el tiempo.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Esta solicitud reivindica prioridad bajo el 35
U.S.C. \NAK119(e), basándose en la solicitud provisional de
EE.UU. con número de serie 60/272.083, presentada el 28 de febrero
de 2001, cuya descripción completa se incorpora en esta memoria como
referencia.
La presente invención se refiere a un aparato y
un método para fluorescencia con resolución temporal de obtención de
imágenes en muestras bioquímicas y médicas.
Se emite fluorescencia cuando un fluoróforo
interactúa con un fotón incidente (excitación). La absorción del
fotón hace que un electrón en el fluoróforo salte desde su estado
fundamental hasta un nivel de energía superior. Después de un
tiempo, que depende del fluoróforo y su entorno, el electrón vuelve
a su nivel original, liberando un fotón (emisión de fluorescencia),
dependiendo la longitud de onda de la cantidad de energía que se
libera durante el retorno al estado anterior. Un fluoróforo puede
emitir en una única longitud de onda o en múltiples (creando un
espectro de emisión), mientras los electrones caen desde diversas
órbitas hasta sus estados fundamentales. El espectro de emisión es
constante para cada especie de fluoróforo.
Las etiquetas fluorescentes son típicamente
pequeñas moléculas de tinte orgánico, tales como fluoresceína, Texas
Red o rodamina, que se pueden conjugar fácilmente para realizar
sondeos de moléculas, tales como estreptavidina. Los fluoróforos
pueden ser detectados por iluminación con luz de una frecuencia de
excitación apropiada y las emisiones espectrales resultantes pueden
ser detectadas por sensores electroópticos o a ojo.
Los métodos para realizar análisis en materiales
fluorescentes son bien conocidos en la técnica y se describen, por
ejemplo, en Lakowicz, J. R, "Principles of Fluorescence
Spectroscopy", New York: Plenum Press (1983); Herman, B.,
"Resonance Energy Transfer Microscopy", en: Fluorescence
Microscopy of Living Cells in Culture, parte B, Methods in Cell
Biology, volumen 30, edición Taylor, D. L. y Wang, Y.-L., San Diego:
Academic Press (1989), páginas 219-243; Turro, N.
J., Modem Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings
Publishing Co, Inc. (1978), páginas 296-361 y en el
Molecular Probes Catalog (2001), OR, U.S.A.
Un fluorímetro es un instrumento que mide la
fluorescencia. Los fluorímetros tienen tres componentes principales:
(a) fuente de luz para excitación, que es la mayoría de veces
típicamente una fuente láser o de banda ancha; (b) filtros y/o
monocromadores dispersivos para seleccionar zonas de longitud de
onda de interés, tanto en excitación como en emisión; (c) un
detector que convierte la emisión de fluorescencia incidente en una
señal eléctrica. La presente invención se refiere a fluorímetros que
miden la fluorescencia en muestras biológicas, más específicamente
en muestras biológicas utilizadas en programas de descubrimiento de
medicamentos.
Algunos fluorímetros (fluorímetros micro) están
fabricados en torno a microscopios confocales o no confocales, y
están diseñados para observar células marcadas de modo fluorescente
o microvolúmenes de muestra como objetivos discretos. Existe un
conjunto enorme de la técnica anterior que es relevante para tales
fluorímetros micro. Un subconjunto de este conjunto de la técnica
anterior se refiere al uso de fluorímetros micro con placas de
micropocillos o microplaquetas (por ejemplo, Galbraith, et
al.,1991; Rigler, 1995).
Otros fluorímetros (fluorímetros macro) no miden
la resolución celular sino, más bien, usan óptica de bajo aumento
para recoger señales procedentes de cada muestra en una pluralidad
de muestras (como en las patentes de EE.UU. números 5.125.748, de
Bjornson et al.; y 5.340.747, de Eden), más típicamente, los
pocillos están dispuestos dentro de placas de micropocillos (como en
las patentes de EE.UU. números 6.071.748, de Modlin et al.; y
5.670.113, de Akong et al.).
Los medios con los que se mide una pluralidad de
muestras difieren entre un "fluorímetro de exploración", un
"fluorímetro de etapas" y un "fluorímetro de obtención de
imágenes por zonas".
En un fluorímetro macro de exploración (como se
describe en la patente de EE.UU. número 5.672.880, de Kain), se
realizan detecciones de una pluralidad de muestras en serie,
explorando un haz de excitación la muestra y recogiendo en serie
cada punto de emisión. Un fluorímetro de exploración puede resolver
cada muestra en múltiples puntos de resolución.
En un fluorímetro macro de etapas, el haz de
excitación y el detector (usualmente un tubo fotomultiplicador o
diodo) se mueven de forma gradual de muestra a muestra. El detector
(o agrupación de detectores) realiza una medición unitaria
procedente de cada muestra, y no discrimina múltiples puntos de
resolución dentro de cada muestra (como por ejemplo en las patentes
de EE.UU. números 5.589.351, de Harootunian; 5.670.113, de Akong
et al.; 6.144.455, de Tuunanen et al.; y 6.127.133, de
Akong et al.).
\global\parskip1.000000\baselineskip
En un fluorímetro macro de obtención de imágenes
por zonas, el detector está expuesto a una pluralidad de muestras en
paralelo (sin exploración o sin etapas), y se realizan detecciones
de cada muestra en una porción diferente de la zona del detector. Al
localizar muestras diferentes en puntos diferentes del detector, el
fluorímetro de obtención de imágenes por zonas mantiene la capacidad
para discriminar muestras discretas de una pluralidad de muestras.
El fluorímetro macro de obtención de imágenes por zonas puede
discriminar o no múltiples puntos de resolución dentro de cada
muestra.
Son bien conocidos los fluorímetros macro de
obtención de imágenes por zonas (por ejemplo, Haggart, 1994; las
patentes de EE.UU. números 6.140.653, de Che; 6.069.734, de Kawano
et al.; y muchos sistemas comerciales). La mayoría de los
mismos son adecuados para muestras planas, tales como geles de
electroforesis. Algunos documentos (por ejemplo, las patentes de
EE.UU. números 5.275.168, de Reintjes et al.; y 5.309.912, de
Knuttel) requieren métodos altamente especializados, tales como
espectroscopia de Raman o modulación de fase/amplitud de la
iluminación, y no serían adecuados para mediciones de la intensidad
de fluorescencia inmediata o resolución temporal como se usan con
una pluralidad de muestras biológicas. Otros documentos (5.854.684,
de Stabile et al.) mencionan el uso general de detectores de
obtención de imágenes para cuantificar la luz reflejada desde una
pluralidad de muestras, sin describir realizaciones específicas
dentro de los sistemas de iluminación y detección óptica que
permitirían el uso eficaz de los detectores de obtención de imágenes
en fluorimetría macro. Finalmente, otros documentos (WO 96/05488, de
McNeil et al.) describen medios específicos para conseguir
fluorimetría macro de obtención de imágenes por zonas, medios que no
son óptimos para este objetivo.
Existe una necesidad de conseguir altos valores
de rendimiento para las muestras en aplicaciones de descubrimiento
de medicamentos, en las que los especímenes fluorescentes están
agrupados usualmente dentro de una pluralidad de pocillos, por lo
que se requiere un alto rendimiento. Aunque un fluorímetro de
obtención de imágenes por zonas ofrece ventajas conocidas en su
capacidad para cuantificar gran número de muestras en paralelo,
consiguiendo por ello un alto rendimiento, se requieren
realizaciones específicas apropiadas para este objetivo si el
instrumento ha de ser tanto de alto rendimiento como de alta
sensibilidad.
Es evidente, en vista de la técnica de
fluorímetros macro de obtención de imágenes por zonas, situar una
cámara CCD a fin de obtener imágenes de un especímen, suministrar
excitación de fluorescencia por medios conocidos y recoger la luz
emitida usando una lente de forma conocida. Sin embargo, los
fluorímetros de obtención de imágenes de la clase descrita por
McNeil et al. (WO 96/05488) no consiguen la equivalencia en
sensibilidad con fluorímetros que no son de obtención de imágenes, y
adolecen de errores en la detección de señales. Por ejemplo,
utilizan sistemas de lentes estándares que no contienen mecanismos
calculados de manera que minimicen las reflexiones y otras formas de
señales falsas, adolecen de errores de paralaje y requieren
usualmente que las placas de micropocillos sean de la clase que
tiene una parte inferior transparente, a través de la que se leen
las muestras. En contraste a esto, los fluorímetros que no son de
obtención de imágenes son altamente sensibles, no tienen errores de
paralaje, son capaces de leer desde la parte superior o inferior de
una placa y no requieren placas de parte inferior transparente que
son caras. Los usuarios potenciales de los fluorímetros de obtención
de imágenes por zonas en cribado de fármacos no han adoptado
ampliamente ningún sistema de la técnica anterior, debido a factores
tales como los detallados anterior-
mente.
mente.
Se presentan desafíos al aplicar fluorimetría de
obtención de imágenes por zonas al cribado de fármacos, en su mayor
parte, por cuatro factores:
a) Los pocillos forman aberturas que interactúan
con el ángulo de incidencia de la iluminación. Los pocillos que
reciben iluminación con ángulos mayores están iluminados peor que
los pocillos que reciben iluminación más directa. Como la mayoría de
los fluorímetros de obtención de imágenes por zonas, suministran
iluminación desde una zona lateral a la lente de recogida (por
ejemplo, Neri et al., 1996), pueden tener éxito con
especímenes planos, pero no logran iluminar apropiadamente pocillos
profundos. En la práctica, no es poco frecuente observar
variaciones en exceso del 300% en el suministro de luz a los
pocillos que se encuentran en diferentes posiciones de una placa de
micropocillos, a menos que se presente un suministro de iluminación
sólo a través de la parte inferior de la placa de micropocillos
(como en la patente de EE.UU. número 5.355.215, de Schroeder, y en
el documento WO 96/05488, de McNeil et al.).
b) Los pocillos están muy poco iluminados. Una
pluralidad de pocillos contenidos dentro de una placa de
micropocillos estándar ocupa una extensión espacial de
aproximadamente 96 centímetros cuadrados. Si un fluorímetro macro de
obtención de imágenes por zonas ha de ser capaz de obtener imágenes
de todos los pocillos en paralelo, todos ellos deben ser iluminados
al mismo tiempo. Por lo tanto, la cantidad de iluminación
suministrada a cualquier pocillo (como se describe por una relación
geométrica inversa entre zona iluminada e intensidad/área unitaria)
es muy baja y la cantidad de fluorescencia emitida desde cualquier
pocillo tiende también a ser pequeña, por lo que se requiere un
detector sensible. Por muy sensible que sea el detector, es
importante que todos los pocillos reciban el haz de iluminación tan
eficientemente como sea posible. Si la iluminación no logra alcanzar
el contenido de algunos pocillos, incluso el detector más sensible
será incapaz de extraer una señal que se pueda utilizar.
c) Existen errores de paralaje. Los pocillos
profundos situados en posiciones diferentes dentro de una placa de
micropocillos sirven para generar, por una lente estándar, imágenes
con ángulos diferentes. Estos errores de paralaje bien conocidos
tienen un efecto principal sobre la precisión de la óptica de
recogida de luz, particularmente cuando la óptica genera imágenes de
la pluralidad de pocillos desde la parte superior.
d) Los rayos de iluminación interactúan con la
óptica de detección. La óptica para el suministro de iluminación a
una placa de pocillos completa, y para la recogida simultánea de
emisión de fluorescencia desde la pluralidad de pocillos en la
placa, debe tener propiedades especiales. Por ejemplo, el método de
iluminación más eficiente es desde dentro de la lente de recogida
(epiiluminación), pero una lente macro de epiiluminación está
sometida a reflexiones y a otras fuentes no evidentes de señales
falsas.
Un sistema de obtención de imágenes para
conjuntos digitales de análisis en placas de pocillos, geles y blots
se describe en las solicitudes de patente de EE.UU. números
09/240.649 y 09/477.444, de Ramm et al. Este sistema
satisface la necesidad de que la fluorimetría de obtención de
imágenes por zonas tenga alto rendimiento, y consigue un avance
técnico porque supera los problemas planteados en los puntos
a-d anteriores. Más específicamente, el sistema
descrito:
a) interactúa mínimamente con las aberturas de
los pocillos para iluminar una pluralidad de los mismos de forma
eficiente y uniforme, desde arriba o desde abajo;
b) al iluminar de manera eficiente, se permite
mejor sensibilidad en fluorimetría de obtención de imágenes por
zonas;
c) usa una óptica telecéntrica para evitar
errores de paralaje;
d) contiene una óptica y unos componentes
calculados para minimizar las fuentes de señales de fondo que surgen
en fluorimetría macro de obtención de imágenes por zonas (por
ejemplo, minimiza las reflexiones internas desde filtros de emisión
montados dentro de la lente de recogida).
El sistema descrito se ha reducido para su
puesta en práctica y se ha usado ampliamente para obtener imágenes
por zonas de señales de luminiscencia y fluorescencia inmediata. En
las solicitudes de patente citadas, se describen medios para usar el
sistema a fin de obtener imágenes de fluorescencia con resolución
temporal, pero sin descripción detallada de las realizaciones para
este objetivo. La presente invención describe realizaciones
preferidas de un fluorímetro con resolución temporal de obtención de
imágenes por zonas para análisis en placas de pocillos, geles y
blots.
La emisión de fluorescencia inmediata está
definida por el suministro de iluminación de excitación, al mismo
tiempo que se recoge la fluorescencia emitida. Los desafíos en
fluorescencia inmediata incluyen:
- \bullet
- las alteraciones muy pequeñas en emisión se deben detectar mientras el sistema se inunda de luz de excitación;
- \bullet
- la emisión es mucho menor en intensidad que la excitación, y es difícil filtrar toda la excitación para dejar la emisión sin alterar;
- \bullet
- el medio de las muestras (por ejemplo, disolventes, células que contienen compuestos marcados), la óptica (por ejemplo, en Beverloo et al., 1990, 1992) y el soporte de las muestras (placa de pocillos, cubeta) pueden emitir componentes espectrales similares a los del fluoróforo de interés.
Colectivamente, cualquier contribución de luz de
excitación o medio de las muestras que alcanza el detector se
denomina "efecto de fondo". Un filtro de emisión está colocado
entre la muestra y el detector para bloquear tanto como sea posible
la señal del efecto de fondo impidiendo que alcance el detector
(como se describe en la publicación de solicitud internacional de
patente número WO 99/08233, de Ramm et al.). Sin embargo, el
filtro de emisión no puede eliminar todo el efecto de fondo y la
fuga restante del efecto de fondo sobre el detector da como
resultado una degradación de la sensibilidad de detección. Es decir,
la sensibilidad de los fluorímetros tiende a estar limitada por la
presencia de altos niveles de señales del efecto de fondo.
La fluorescencia con resolución temporal (TRF)
es una técnica bien conocida (por ejemplo, en las patentes de EE.UU.
números 4.565.790, de Hemilla et al., 4.808.541, de Mikola
et al., y 5.736.410, de Zarling et al.) que se utiliza
para reducir el efecto de fondo y aumentar la sensibilidad de
detección. En TRF, una fuente de luz se usa para excitar la muestra
y se extingue o cierra entonces rápidamente. Durante el periodo de
excitación, el detector está apagado. Al estar apagado, no está
sometido a las contribuciones del efecto de fondo que surgen del
periodo de excitación (por ejemplo, las fugas de la luz de
excitación a través del filtro de emisión).
La mayoría de contribuciones del efecto de fondo
no están presentes o se desintegran rápidamente (por ejemplo, la
fluorescencia de los disolventes) después de terminar la excitación.
En contraste a esto, los fluoróforos no cesan su emisión
inmediatamente. Más bien, existe un periodo (que varía de
picosegundos a milisegundos) durante el que el fluoróforo sigue
emitiendo después de que ha terminado la excitación. Durante este
periodo, el detector está encendido para observar las señales de
fluorescencia relevantes con efecto de fondo mínimo. Esta
sincronización retardada del periodo de detección es el principio
clave de la TRF.
Para permitir detección TRF, el detector se debe
encender y apagar dentro de un periodo de tiempo controlado. El
periodo de detección comienza algo después de terminar la excitación
(tras un tiempo de retardo) y dura un periodo de tiempo (el tiempo
de adquisición). La TRF se utiliza muy a menudo con fluoróforos
basados en lantánidos (Eu, Tb, etc.), que tienen tiempos de
desintegración del orden de 100 microsegundos a 2 milisegundos,
mucho más largos que los tiempos de desintegración típicos de las
fuentes del efecto de fondo. Típicamente, el tiempo de retardo es
del orden de decenas de microsegundos y el tiempo de adquisición es
de decenas a cientos de microsegundos.
Durante el periodo de excitación y el tiempo de
retardo, el detector está cerrado o apagado (denominado en lo
sucesivo desactivado). Durante el tiempo de adquisición, el detector
está expuesto a emisiones procedentes de la muestra (denominado en
lo sucesivo activado). Es improbable que algún ciclo único de
desactivación y activación periódicas genere una señal fiable en el
detector, de manera que el ciclo se repite hasta que se han
acumulado suficientes señales.
La emisión de fluorescencia retardada es mucho
menos intensa que la emisión de fluorescencia inmediata, y los
sistemas de obtención de imágenes por zonas deben trabajar con
niveles muy bajos de emisión/área unitaria. Por lo tanto, un
fluorímetro de obtención de imágenes por zonas está más sometido a
la pérdida de emisión retardada en el límite inferior del ruido del
detector que en otro tipo de fluorímetro. Por consiguiente, es
deseable que un sistema TRF tenga una geometría que dé como
resultado alto rendimiento óptico (eficacia óptica) y bajas pérdidas
de transmisión. Por ello, surgen desafíos al optimizar un sistema
para conseguir esta combinación de rápida activación periódica y
alta eficacia óptica.
Se deben poder activar periódicamente tanto la
luz de excitación como el detector. Se conoce ampliamente el modo de
activar periódicamente la excitación con discriminadores mecánicos
y/o usando láseres pulsatorios (por ejemplo, Gadella y Jovin, 1995),
como es mediante la utilización de lámparas flash que disminuyen su
intensidad suficientemente rápido para que su contribución a la
captación retardada sea mínima (como se describe en el documento WO
99/08233, de Ramm et al.; y en EP 0987540A2, de Vaisala et
al.; Vereb et al. 1998).
Existen tres métodos en el uso común para la
activación periódica de la trayectoria de emisión en TRF:
(a) Una rueda obturadora se hace girar
rápidamente para producir una activación periódica a escala de
microsegundos de la luz emitida. Esta aproximación se ha aplicado en
microscopia TRF (Seveus et al., 1992) para rechazar la señal
procedente de la fluorescencia inmediata y reducir por ello la
autofluorescencia. Un método similar se describe en el documento EP
0626575A1, de Vaisala et al., y en sistemas de detección por
exploración (en la patente de EE.UU. número 5.780.857, de Harju,
et al.). En un microscopio o en un sistema que detecta una
muestra cada vez, es viable un único obturador rápido porque la
eficacia óptica es muy pequeña. En contraste a esto, la eficacia
óptica de sistemas macro de obtención de imágenes es grande,
aproximadamente dos veces el orden de magnitud mayor que la de un
microscopio. Un sistema macro de obtención de imágenes requeriría un
gran mecanismo obturador mecánico, con una transición relativamente
gradual de abierto a cerrado.
(b) Un obturador mecánico de múltiples
componentes, que usa rápidas ruedas obturadoras rotatorias, tiene
aberturas sincronizadas de tal modo que expone cada vez pequeñas
secciones del detector. Esta disposición (como se describe en el
documento EP 0987540A2, de Vaisala et al.) es más rápida que
la de una única rueda, pero es compleja, ya que está compuesta por
partes que se mueven rápidamente y tiene mala eficacia óptica.
(c) El detector está activado periódicamente, de
manera eléctrica, y convierte también los fotones de emisión en
electrones. En este método, un fotocátodo está colocado en la
trayectoria óptica. El fotocátodo puede ser encendido y apagado en
cortos intervalos para facilitar los requisitos de sincronización de
la TRF. Sin embargo, este tipo de dispositivo tiene bajo rendimiento
cuántico y no se podría utilizar para obtener imágenes de emisión de
fluorescencia muy poco iluminadas sobre un detector de obtención de
imágenes. Por lo tanto, se aplica un campo eléctrico acelerador
para aumentar la energía de los fotoelectrones antes del objetivo y,
en muchos casos, los electrones acelerados son guiados a través de
una placa microcanal, en la que se inicia la emisión de muchos más
electrones acelerados. Así, el detector activado eléctricamente
incorpora usualmente un amplificador de luz, que amplifica la
corriente de electrones antes del objetivo.
Se ha descrito (WO 99/08233, Ramm et al.;
Ramm, 1999) un sistema macro de obtención de imágenes TRF que usa un
detector activado eléctricamente, con una amplificación de
fotocátodo y de placa microcanal. El uso de un fotocátodo
amplificado entre la lente y el detector tiene desventajas
intrínsecas:
(a) Más típicamente, se emite TRF en largas
longitudes de onda largas. Esto es particularmente cierto con pares
de donador-aceptor en transferencia de energía de
resonancia por fluorescencia (FRET), que tienden a emitir en el
tramo rojo del espectro. A fin de detectar estos tipos de señales,
la anchura de banda del fotocátodo tiene que ser suficientemente
baja para permitir que un fotón de gran longitud de onda genere un
fotoelectrón. Sin embargo, los materiales de baja anchura de banda
son propensos a generar señales térmicas y producir un efecto de
fondo instrumental que puede ser muy difícil de distinguir de la
señal a detectar. Un enfriamiento ligero del fotocátodo (como se
lleva a la práctica en dispositivos disponibles comercialmente) no
elimina el efecto de fondo térmico. Un fuerte enfriamiento del
fotocátodo, hasta temperaturas suficientemente bajas para reducir
mucho el efecto de fondo térmico, presenta desafíos tecnológicos
significativos y no es común en la práctica.
(b) El componente de la cámara de un sistema
reforzado produce ruido, particularmente efecto de fondo térmico. A
fin de superar lo anterior, la CCD se puede enfriar para reducir el
efecto de fondo térmico (como se lleva a la práctica en varios
dispositivos comerciales). Las dificultades se presentan al enfriar
una CCD acoplada con fibras que está absorbiendo carga térmica de un
dispositivo reforzador, y al mantener una unión entre el
acoplamiento caliente de fibras y la CCD fría.
(c) La QE del componente de activación
periódica/amplificación es baja, típicamente del orden del 10% en
longitudes de onda del azul-verde, y tan baja como
el 1% en el rojo. Por lo tanto, se pierde la mayor parte de la señal
que incide en el sistema de activación amplificada y es problemático
el uso del sistema en compuestos fluorescentes con resolución
temporal que emiten en el rojo.
(d) El procedimiento de amplificación no produce
un número constante de electrones por fotoelectrón incidente. Este
ruido de amplificación se supera, típicamente, estableciendo un
umbral mínimo para casos detectados y haciendo recuento sólo de los
casos que tienen una alta probabilidad de ser válidos. De este modo,
el dispositivo amplificado funciona como un contador, en vez de como
un generador de imágenes de integración. Aunque es altamente
sensible en este modo de recuento, el dispositivo amplificado es
también muy ineficiente y se requieren largos periodos de detección
para acumular suficientes casos de supraumbrales a fin de creen una
imagen.
Existen otras desventajas, incluyendo la
fragilidad del amplificador de luz (es destruido fácilmente por
luces brillantes) y la mala transferencia de modulación en las
imágenes amplificadas. Además, las zonas brillantes del especímen
tenderán a influir en otras zonas alrededor de las anteriores y, por
lo tanto, la obtención de imágenes de placas de micropocillos está
altamente sometida a interferencias entre pocillos. En resumen,
todos los sistemas de la técnica anterior que usan activación
periódica y amplificación de fotocátodo presentan deficiencias en
el campo técnico de la presente invención.
Es posible fabricar un fluorímetro macro de
obtención de imágenes por zonas para TRF, en el que las funciones de
activación periódica y amplificación sean intrínsecas al detector.
Por ejemplo, se ha determinado que una CCD de bombardeo de
electrones (EBCCD) puede estar implementada dentro de un sistema de
la configuración descrita por Ramm et al. (WO 99/08233). Se
prevé que otros detectores amplificados integralmente, tales como la
CCD amplificadora de electrones (como se lleva a la práctica por la
firma Marconi Applied Technologies del Reino Unido), serían
aplicables también a un sistema de la configuración descrita. En
comparación con las cámaras CCD reforzadas, una ventaja de la EBCCD
(y, quizás, de otros detectores activados integralmente) es que
muestra muy pocas interferencias en la obtención de imágenes de
placas de micropocillos, mientras se mantiene suficientemente
sensible para detectar débiles señales de fluorescencia
retardada.
Casi cualquier tipo de obturador rápido se
podría disponer como activación para un sistema TRF. Se ha descrito
(WO 99/08233, Ramm et al.) una TRF con un sistema macro de
epiiluminación que usa un cristal líquido, lámina u otro obturador
montado en la trayectoria óptica después del especímen, pero antes
del detector. En una realización preferida, la presente invención
incorpora tal obturador implementado dentro de un sistema que está
optimizado para permitir su uso.
Aunque no se ha descrito específicamente la
automatización del procedimiento por el que se aplica la presente
invención, es previsible que la misma se pueda usar con sistemas y
métodos que utilizan estaciones de trabajo que están automatizadas y
se pueden integrar para identificar moduladores, trayectorias,
productos químicos que tienen actividad útil y otros métodos
descritos en esta memoria. Tales sistemas se describen generalmente
en la técnica (véanse, la patente de EE.UU. número 4.000.976, de
Kramer et al. (expedida el 4 de enero de 1977), la patente de
EE.UU. número 5.104.621, de Pfost et al. (expedida el 14 de
abril de 1992), la patente de EE.UU. número 5.125.748, de Bjornson
et al. (expedida el 30 de junio de 1992), la patente de
EE.UU. número 5.139.744, de Kowalski (expedida el 18 de agosto de
1992), la patente de EE.UU. número 5.206.568, de Bjornson et
al. (expedida el 27 de abril de 1993), la patente de EE.UU.
número 5.350.564, de Mazza et al. (27 de septiembre de 1994),
la patente de EE.UU. número 5.589.351, de Harootunian (expedida el
31 de diciembre de 1996) y las solicitudes PCT números: WO 93/20612,
de la firma Baxter Deutschland GmbH (publicada el 14 de octubre de
1993), WO 96/05488, de McNeil et al. (publicada el 22 de
febrero de 1996) y WO 93/13423, de Agong et al. (publicada el
8 de julio de 1993)).
De acuerdo con la presente invención, se ha
previsto un sistema de obtención de imágenes según la
reivindica-
ción 1.
ción 1.
En algunas realizaciones, un sistema de
obtención de imágenes por zonas para fluorimetría con resolución
temporal de muestras en placas de pocillos, geles y blots incorpora
un obturador de emisión electrónica de actuación rápida implementado
dentro de un sistema iluminado con estroboscopio de gran eficacia
óptica, acoplado a una cámara de alta sensibilidad (preferiblemente
como se describe en el documento WO 99/08233, de Ramm et
al.). El obturador de emisión del sistema está basado en la
tecnología de cristal ferroeléctrico (FLC). El obturador FLC es un
dispositivo con base ferroeléctrica compuesto por un polarizador de
entrada, un material ferroeléctrico que cambia la rotación de
polarización dependiendo del campo eléctrico y un analizador de
polarización insertado en la trayectoria de emisión de sistemas
direccionales de obtención de imágenes, entre la muestra y un
detector direccional de estado sólido.
Una propiedad del sistema de la presente
invención es que los componentes ópticos/de detección que contienen
el obturador FLC son tan sensibles que se facilita la pérdida de
transmisión a través del obturador electrónico, sin requerir una
etapa de amplificación luminosa. En una configuración preferida, el
rendimiento cuántico del detector es alto y la eficacia óptica del
sistema óptico es grande. Cuando se usa dentro de tal sistema, el
obturador de la presente invención transmite suficiente
fluorescencia retardada para producir mediciones comparables a las
obtenidas a partir de fluorímetros con resolución temporal que no
son de obtención de imágenes, y excede la sensibilidad de sistemas
que usan fotocátodos amplificados sin las desventajas
(interferencias, fragilidad, etc.) de tales sistemas.
Un experto en la técnica apreciará que un
obturador electrónico rápido sería útil como un mecanismo de
activación periódica para TRF. Sin embargo, la mayoría de los
obturadores rápidos, como las células de Kerr, los moduladores
optoacústicos o los moduladores electroópticos, tienen eficacia
óptica limitada que restringe sus aplicaciones a sistemas con
pequeña eficacia óptica, como es el caso de los microscopios. Una
ventaja del obturador electrónico de la presente invención es que
tiene una gran apertura y se aprovecha de la eficacia óptica del
sistema de la presente invención.
El sistema podría estar equipado con un
obturador con base de cristal líquido. Mientras que este tipo de
obturador puede tener una apertura suficiente para ser utilizada con
la gran eficacia óptica del presente sistema, tiene una mala
relación del estado transmisor al estado de bloqueo (definida como
la relación de contraste). Más típicamente, la relación de contraste
de un obturador de cristal líquido es del orden de <200:1, si se
compara con el >400:1 observado con un obturador FLC. El
obturador con base de cristal líquido no es tampoco suficientemente
rápido para obtener imágenes TRF con muchos compuestos fluorescentes
utilizados comúnmente.
El sistema de la presente invención incorpora un
único obturador con base de cristal ferroeléctrico (FLC). Una
ventaja del sistema de la presente invención es que el obturador FLC
puede pasar de activado a desactivado en menos de 100 microsegundos,
y es adecuado para obtener imágenes de fluorescencia retardada de
compuestos fluorescentes de lantánido, europio y terbio utilizados
comúnmente.
La desventaja de los FLC, como se describe en
intentos previos de usar obturadores FLC en microscopia TRF, ha sido
el débil rechazo de la fluorescencia inmediata debido a una relación
de contraste inadecuada (Verwoerd et al., 1994; Shotten,
1995). Esta mala relación de contraste ha llevado al uso de dos
obturadores FLC en serie, y la pérdida de transmisión resultante ha
sido tan alta (Vereb et al., 1998) que sería imposible su uso
en un fluorímetro macro de obtención de imágenes. En la presente
invención, el FLC está colocado dentro de la óptica, en una posición
que produzca la mejor relación de contraste posible. Una propiedad
del sistema de la presente invención es que la óptica está fabricada
de modo que el obturador rápido está situado en la trayectoria
óptica de la fluorescencia emitida, de tal manera que los ángulos de
incidencia con respecto a la normal sobre el obturador no exceden
los 20º. Esta colocación consigue la mejor relación de contraste
posible desde el obturador, y minimiza los efectos de dicho
obturador sobre las características de longitud de onda de la luz
transmitida.
En una realización preferida de la presente
invención, la fuga a través del obturador FLC se corrige haciendo,
en primer lugar, una imagen de fluorescencia inmediata con el
obturador cerrado (la imagen de fuga). Esta imagen se lee a la
salida de la cámara CCD, antes de la captación de la imagen de
fluorescencia retardada. Luego, la imagen de fuga se sustrae de la
imagen de fluorescencia retardada para dejar esta última sin efecto
de fondo añadido por fuga a través del obturador FLC.
Una ventaja del sistema de iluminación y del
obturador electrónico de la presente invención es que pueden ser
adaptados para su uso en fluorímetros macro existente de obtención
de imágenes por zonas, sin requerir modificaciones importantes de
dichos dispositivos (por ejemplo, como se describe en el documento
WO 99/08233, de Ramm et al.). Más bien, el sistema de
iluminación de la presente invención se puede montar en un
fluorímetro macro existente de obtención de imágenes por zonas, y el
obturador se puede montar también en dicho dispositivo sin
modificaciones importantes.
Una ventaja de la presente invención es que el
obturador se inserta o retira fácilmente de un fluorímetro macro de
obtención de imágenes por zonas, lo que permite que dicho
fluorímetro se use para una variedad muy amplia de aplicaciones sin
que dicho obturador interfiera.
Una ventaja del sistema de la presente invención
es que se puede usar con sistemas y métodos que utilizan estaciones
de trabajo que están automatizadas y que se pueden integrar para
identificar moduladores, trayectorias, productos químicos que tienen
actividad útil y otros métodos descritos en esta memoria. Tales
sistemas se describen generalmente en la técnica (véanse, la patente
de EE.UU. número 4.000.976, de Kramer et al. (expedida el 4
de enero de 1977), la patente de EE.UU. número 5.104.621, de Pfost
et al. (expedida el 14 de abril de 1992), la patente de
EE.UU. número 5.125.748, de Bjornson et al. (expedida el 30
de junio de 1992), la patente de EE.UU. número 5.139.744, de
Kowalski (expedida el 18 de agosto de 1992), la patente de EE.UU.
número 5.206.568, de Bjornson et al. (expedida el 27 de abril
de 1993), la patente de EE.UU. número 5.350.564, de Mazza et
al. (27 de septiembre de 1994), la patente de EE.UU. número
5.589.351, de Harootunian (expedida el 31 de diciembre de 1996) y
las solicitudes PCT números: WO 93/20612, de la firma Baxter
Deutschland GmbH (publicada el 14 de octubre de 1993), WO 96/05488,
de McNeil et al. (publicada el 22 de febrero de 1996) y WO
93/13423, de Akong et al. (publicada el 8 de julio de
1993)).
Aunque la presente invención está dirigida a la
obtención de imágenes por zonas de fluorescencia macro con
resolución temporal, se ha de comprender que un experto en la
técnica podría usar las capacidades de polarización de la presente
invención, como se consiguen con el obturador FLC, para fabricar un
sistema de obtención de imágenes por zonas de fluorescencia macro de
polarización. En tal sistema, la luz de excitación es polarizada al
hacerla pasar, en primer lugar, a través de un obturador FLC. La luz
emitida se hace pasar a través de un polarizador montado en la
trayectoria de emisión. Se puede hacer girar cualquier polarizador
con respecto a otro, y el sistema es de tan alta sensibilidad que
consigue una medición de polarización comparable a la de
dispositivos por zonas que no son de obtención de imágenes.
Los anteriores y otros objetivos, propiedades y
ventajas de la presente invención se entenderán más completamente a
partir de la descripción siguiente de realizaciones actualmente
preferidas, pero no obstante ilustrativas, de acuerdo con la
presente invención, haciendo referencia a los dibujos que se
acompañan, en los que:
la figura 1 es una vista esquemática en sección
transversal de una realización preferida de un sistema óptico, de
acuerdo con la presente invención, útil para obtener imágenes de
fluorescencia;
la figura 2 es una vista en sección transversal
de un sistema óptico, como en la figura 1, con el iluminador anular
reemplazado por un sistema de iluminación epitaxial;
la figura 3 es una vista en sección transversal,
similar a la figura 2, que muestra la adición de un obturador
rápido;
la figura 4 es un diagrama de rayos de luz que
muestra el funcionamiento del obturador y el filtro en el sistema
óptico;
la figura 5 muestra gráficos que comparan el
comportamiento de un sistema, de acuerdo con la presente invención,
con el de un fluorímetro con resolución temporal que no es de
obtención de imágenes; y
la figura 6 muestra gráficos que comparan el
comportamiento de una cámara CCD de bombardeo de electrones
implementada dentro del sistema actual con el de un fluorímetro con
resolución temporal que no es de obtención de imágenes.
La figura 1 muestra un sistema óptico 1 en
sección transversal, como se usa para obtener imágenes de
fluorescencia de una pluralidad de pocillos 2 contenidos dentro de
una placa 3 de micropocillos. Los componentes principales del
sistema óptico 1 son un sistema de lentes 4, una fuente de luz
pulsatoria 5, un filtro de excitación primaria 6, un iluminador
anular 7, un filtro de emisión primaria 8 (para eliminar longitudes
de onda que son irrelevantes para la señal de muestreo deseada) y un
sistema de cámara CCD 9. El sistema de lentes 4 del sistema óptico
1 comprende un elemento delantero 4a que funciona en un espacio
telecéntrico, y que forma una imagen de la placa 3 de pocillos sobre
un detector CCD 10 de la cámara CCD 9.
En funcionamiento, la fuente de luz 5
proporciona la energía luminosa necesaria para ser aplicada a los
especímenes dentro de los pocillos 2. Preferentemente, la fuente de
luz puede ser modulada desde una intensidad alta hasta menos del 1%
de dicha intensidad alta en un tiempo menor que 100 microsegundos.
La luz procedente de la fuente se transmite a través del filtro 6 y
se dirige mediante una guía de luz, tal como un mazo de fibra óptica
o una guía luminosa líquida, al iluminador anular 7, interno al
sistema de lentes, realizando dicho iluminador anular
epiiluminación, iluminando preferiblemente una zona mayor que 25
centímetros cuadrados. La energía luminosa emitida por un especímen
excitado por epiiluminación se transmite a través de la lente 4a y
de todo el sistema de lentes 4 a la cámara 9, en la que se forma una
imagen sobre el detector CCD 10.
La figura 2 repite la figura 1, con el reemplazo
del iluminador anular por un sistema de iluminación epitaxial. La
iluminación epitaxial está compuesta por una fuente de luz
pulsatoria 11, un filtro de excitación primaria 12 y un espejo
dicroico 13 para reflejar las longitudes de onda de excitación sobre
la muestra y transmitir las longitudes de onda emitidas desde un
especímen hacia la cámara.
La figura 3 repite la figura 2, con la adición
del obturador rápido 14. El obturador 14 se encuentra muy próximo al
filtro de emisión 8, en una posición en la que todos los rayos están
próximos al eje óptico. El obturador 14 está hecho de un material
que se puede poner opaco (desactivado) o transparente (activado),
con un periodo de activación-desactivación más corto
que 100 microsegundos y con una relación de contraste en exceso de
200:1. Se prefiere también que el obturador sea transmisor más del
20% a longitudes de onda de la luz entre 500 y 700 nanómetros. El
obturador 14 es un dispositivo FLC. Sin embargo, el principio de
aplicar un obturador electrónico de actuación rápida en la
trayectoria de emisión es general y, como un ejemplo comparativo, el
obturador 14 podría ser cualquier otro obturador electrónico de
actuación rápida. Por ejemplo, el obturador 14 podría estar
constituido por un polarizador de entrada compuesto por un material
piezoeléctrico que cambia la rotación de polarización dependiendo
del campo eléctrico, y un analizador de polarización, colocado entre
la muestra 3 y la cámara CCD 9.
La figura 4 muestra cómo los rayos
A1-A3, que tienen su origen en un punto de una
esquina de la placa, pasan entonces a través del obturador rápido 14
y del filtro de emisión 8. Se muestran también los rayos
B1-B3 y los rayos C1-C3, que tienen
su origen en el centro y en las esquinas opuestas de la placa,
respectivamente. El obturador 14 y el filtro 8 están en una posición
calculada para ser la posición conjugada infinita con respecto a la
placa 3 cuando se obtienen las imágenes a través de la lente 4. El
obturador 14 y el filtro 8 están situados de manera que: a) los
ángulos con los que los rayos de emisión (como se muestra por los
rayos A1'-A3', B1'-B3' y
C1'-C3') pasan a través del eje óptico del filtro 8
son ambos próximos a la normal a su superficie, y están centrados
alrededor de la normal al filtro 8, y b) la distribución de rayos
procedentes de la placa 3 sobre el filtro 8 es uniforme. En la
configuración mostrada, el sistema de la presente invención es capaz
de minimizar los desplazamientos espectrales que surgen de las
acciones del filtro de emisión 8, cuando el filtro es de la clase de
interferencia. Las características de esta realización, en la que el
filtro de emisión está en la posición conjugada infinita de la lente
4, y en la que los haces golpean también el obturador 14 con un
pequeño ángulo respecto a la normal, tienen las propiedades
beneficiosas: a) la relación de contraste del obturador 14 es
máxima; b) el tamaño del filtro de emisión 8 y del obturador 14
están minimizados para un ángulo máximo de incidencia dado; y c) el
efecto de los defectos puntuales inevitables del obturador 14 se
distribuirá uniformemente por todo el detector, sin producir puntos
brillantes u oscuros en la imagen creada sobre el detector 10.
La figura 5 muestra el comportamiento del
sistema de la presente invención, si se compara con un fluorímetro
con resolución temporal que no es de obtención de imágenes (en este
caso mostrado por un Wallac Victor 2 (Perkin Elmer Life Sciences))
equipado con los componentes óptimos para fluorescencia con
resolución temporal. El límite de detección para el europio está
definido por una relación señal a ruido de 3:1, y es similar para
ambos instrumentos. Si acaso, la presente invención proporciona un
comportamiento superior cerca del límite de detección.
La figura 6 muestra el comportamiento de una
cámara CCD de bombardeo de electrones (Hamamatsu), como está
implementada dentro del sistema de la presente invención. En este
caso, se consigue la activación periódica dentro del detector CCD de
bombardeo de electrones en oposición al uso de un obturador
electrónico rápido montado dentro de la lente 4. En esta
configuración, el comportamiento es, de nuevo, igual al de un
fluorímetro que no es de obtención de imágenes. La figura 6 muestra
que el sistema de la presente invención puede ser implementado con
múltiples formas de activación periódica electrónica, bien por un
obturador en la trayectoria de emisión o por un mecanismo de
activación periódica implementado dentro del dispositivo de
detección.
Se apreciará por las figuras 5 y 6 que la
presente invención hace posible conseguir un comportamiento en un
sistema de fluorímetro de obtención de imágenes con resolución
temporal que es al menos tan satisfactorio como los mejores
fluorímetros que no son de obtención de imágenes.
Así, la descripción anterior es ilustrativa y no
limitativa. Por lo tanto, la intención es que esté limitada sólo por
el alcance de las reivindicaciones adjuntas a dicha descripción.
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A., van GelderenBoele, S. y Tanke, H.J.: "Inorganic
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time-resolved microscopy", Cytometry.
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2. Beverloo, H.B., van Schadewijk,
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Verwoerd, N.P., Vrolijk, J., Ploem, J.S. y
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3. Gadella, T.W.J. Jr. y Jovin,
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imaging microscopy. A stereochemical model of tyrosine kinase
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time-resolved fluorescence microscopy".
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16(2):113-7.
Claims (8)
1. Un sistema de obtención de imágenes para
fluorimetría con resolución temporal de muestras químicas,
biológicas y médicas dispuestas sobre un medio que las contiene en
el que se han de someter a iluminación, haciendo que las mismas
emitan luz, comprendiendo el sistema de obtención de imágenes:
una fuente de iluminación (5, 11) que puede ser
modulada desde una intensidad sustancialmente completa en las
muestras hasta menos de aproximadamente el 1% de la intensidad
completa, en un tiempo menor que aproximadamente 100
microsegundos;
un sistema de iluminación (6, 7, 12, 13) para
iluminar desde la fuente hasta una zona en la que las muestras
pueden ser mayores que el campo de visión de un microscopio;
un sistema de lentes (4) para recoger la luz
emitida desde las muestras contenidas dentro de la zona
iluminada;
un dispositivo (4) de formación de imágenes
situado de manera que la luz desde las muestras, que pasa a través
de las lentes, incide en el dispositivo y el dispositivo produce una
representación de una imagen de las emisiones de la muestra;
un único obturador de cristal ferroeléctrico
(14) colocado entre las muestras y el dispositivo de formación de
imágenes, que comprende un analizador de polarización y que incluye
un dispositivo de cristal ferroeléctrico configurado como un
polarizador que cambia la rotación de polarización de la luz que
pasa a través del mismo, dependiendo de un campo eléctrico aplicado;
y
un analizador de polarización insertado en la
trayectoria de emisión entre las muestras y el dispositivo de
formación de imágenes;
de manera que el obturador (14) se puede hacer
opaco (desactivado) o transparente (activado), con un periodo de
activación-desactivación más corto que
aproximadamente 100 microsegundos y con una relación de contraste
entre activación y desactivación en exceso de aproximadamente 100:1;
y
un dispositivo de control para ajustar los
tiempos de activación/desactivación de la fuente de iluminación y
los tiempos de apertura/cierre del obturador;
en el que el sistema de lentes (4) tiene una
óptica fabricada de este modo y el obturador está situado dentro de
la óptica en la trayectoria óptica de la luz emitida, de manera que
los ángulos de incidencia de la luz con respecto a la normal sobre
el obturador no exceden los 20º, de modo que se consigue la mejor
relación de contraste posible y se minimizan los efectos de dicho
obturador sobre las características de la longitud de onda de la luz
transmitida.
2. El sistema según cualquier reivindicación
precedente, en el que el medio que contiene las muestras está
compuesto por una pluralidad de pocillos dispuestos dentro de una
placa y la lente está fabricada para detectar todo el contenido de
los pocillos sin error de paralaje.
3. El sistema de iluminación según cualquier
reivindicación precedente, en el que la fuente de iluminación (5, 7)
es una lámpara flash.
4. El sistema según cualquier reivindicación
precedente, en el que el dispositivo de control está fabricado para
accionar el obturador y la fuente de iluminación por múltiples
ciclos de activación y desactivación, acumulando el dispositivo de
formación de imágenes la luz que incide en el mismo durante
múltiples ciclos.
5. El sistema de obtención de imágenes según
cualquier reivindicación precedente, en el que la luz emitida
presenta una disminución de intensidad y el obturador se activa y se
desactiva más de una vez durante la desintegración que sigue a una
iluminación de las muestras, para adquirir imágenes en diferentes
momentos durante el proceso de desintegración.
6. El sistema según cualquier reivindicación
precedente, en el que el sistema de iluminación está fabricado para
guiar la luz desde la fuente hacia dentro y hacia fuera de la lente
en dirección a las muestras.
7. El sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el sistema de iluminación
comprende un divisor de haz entre la lente y las muestras, fabricado
para guiar la luz a través del sistema de lentes en dirección a la
lente.
8. El sistema según cualquier reivindicación
precedente, que comprende además un procesador de corrección
adaptado para almacenar una imagen de fuga de fluorescencia
inmediata con el obturador cerrado y adaptado para sustraer esta
imagen de fuga, almacenada a partir de una imagen posterior de
fluorescencia retardada, para producir una imagen corregida de
fluorescencia retardada.
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