JP2012220361A - 光量測定装置および光量測定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】煩雑な作業を要することなく、絶対光量を測定可能な光量測定装置等を提供する。
【解決手段】信号取得手段は、積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を前記積分型半導体検出器で受けたときの信号の値を複数回、取得する。算出手段は、前記信号取得手段により取得された前記信号の値の分布に基づいて、前記積分型半導体検出器から出力される前記信号の値と前記積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出する。絶対光量測定手段は、前記算出手段により算出された前記関係に基づいて、前記積分型半導体検出器を用いて計測される光の絶対光量を測定する。
【選択図】図2
【解決手段】信号取得手段は、積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を前記積分型半導体検出器で受けたときの信号の値を複数回、取得する。算出手段は、前記信号取得手段により取得された前記信号の値の分布に基づいて、前記積分型半導体検出器から出力される前記信号の値と前記積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出する。絶対光量測定手段は、前記算出手段により算出された前記関係に基づいて、前記積分型半導体検出器を用いて計測される光の絶対光量を測定する。
【選択図】図2
Description
本発明は、積分型半導体検出器から出力される信号の値に基づいて前記積分型半導体検出器を用いて計測される光の光量を測定する光量測定装置等に関する。
創薬のスクリーニング分野では、蛍光標識した細胞に対して多種の薬剤を異なる濃度で投与し、その蛍光画像を観察して薬効を判定するHCA(High Contents Analysis)、HCS(High Contents Screening)という手法が開発されている。
上記の蛍光画像から測定される最も基本的な計測量は光の強度と細胞の形状である。現段階では、光の強度は画像の画素値(AD変換により得られるデジタル値)で表されているが、その値が具体的に光子何個に相当するか、あるいは、何J(ジュール)の励起光(レーザ光)を照射した場合に単位体積(または、細胞1個あたり、細胞内の器官1個あたり、または、蛍光標識1個あたり)から何J(ジュール)の蛍光が得られたか、という絶対値をMKSA系で表現可能とするような計測は行われていない。
現段階では、光の強度はある細胞試料(アッセイ系)に対して、あるいは薬剤の種類や濃度に応じて、相対的なデジタル値で計測、記録されるに止まっている。例えば、薬剤Aを量aの濃度で投与した場合と、薬剤Bを量bの濃度で投与した場合に得られる信号量の比は、1000対10000となる、などの情報は得られる。しかし、この単位はあくまでも[ADU/pixel](ADU=Analog to Digital conversion Unit;AD変換器でデジタル変換された値の意味)などであって、[J]や[W]の単位ではない。
同様の状況は、遺伝子計測においても存在する。特開2007−212478号公報(特許文献1)には、光パワーの国家標準にトレーザビリティがとれた光パワーメータを用いることで絶対光量を較正する点の開示がある。
上記のように、従来の創薬スクリーニングでは、蛍光や発光の光量の絶対値が測定されていないため、異なる研究所で行った実験の結果を定量的に比較することが困難であり、したがって実験の妥当性の検証が困難となる。
何故なら、仮に異なる研究者が同じ種類の細胞に同じ薬剤を同量適用しても、使用する装置によって励起のためのレーザ照射の条件やカメラのAD変換の単位などが異なるため、画像の画素値を対等に比較できないからである。あるいは同一の研究者が、生物学的には同等の実験を時間を空けて行ったような場合に、光源のレーザの経年変化によって照明が暗くなり、画像として出力されるデジタル値が変化する、などの現象も発生しうる。
上記のように、遺伝子計測分野では、特開2007−212478号公報に開示されたような方法が提案されているが、較正の対象となる装置の他に、別途、基準光源や国家標準にトレーサビリティがとれた光パワーメータが必要となること、また、測定精度がその光パワーメータに依存することが課題となる。
また、較正は定期的、あるいは可能ならば実験ごとに行うことが望まれるが、毎回の実験ごとに主検出器(CCD等)と光パワーメータを入れ替えて測定する作業は手間がかかり、現実的ではない。
本発明の目的は、煩雑な作業を要することなく、絶対光量を測定可能な光量測定装置等を提供することにある。
本発明の光量測定装置は、積分型半導体検出器から出力される信号の値に基づいて前記積分型半導体検出器を用いて計測される光の光量を測定する光量測定装置において、前記積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を前記積分型半導体検出器で受けたときの前記信号の値を複数回、取得する信号取得手段と、前記信号取得手段により取得された前記信号の値の分布に基づいて、前記積分型半導体検出器から出力される前記信号の値と前記積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出する算出手段と、前記算出手段により算出された前記関係に基づいて、前記積分型半導体検出器を用いて計測される光の絶対光量を測定する絶対光量測定手段と、を備えることを特徴とする。
この光量測定装置によれば、積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を積分型半導体検出器で受けたときの信号の値を複数回、取得し、その信号の値の分布に基づいて、積分型半導体検出器から出力される信号の値と積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出するので、煩雑な作業を要することなく、絶対光量を測定できる。
この光量測定装置によれば、積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を積分型半導体検出器で受けたときの信号の値を複数回、取得し、その信号の値の分布に基づいて、積分型半導体検出器から出力される信号の値と積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出するので、煩雑な作業を要することなく、絶対光量を測定できる。
前記積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を前記積分型半導体検出器に照射する照明手段と、前記信号取得手段により前記信号の値を取得する際に前記照明手段による照射を行わせるとともに、その際に前記信号取得手段により取得された前記信号の値に基づく前記算出手段による前記関係の算出を実行させるように、前記信号取得手段、算出手段および前記照明手段を制御する制御手段と、を備えてもよい。
前記絶対光量測定手段により測定される前記絶対光量は、蛍光観察における蛍光の絶対光量であってもよい。
本発明の光量測定方法は、積分型半導体検出器から出力される信号の値に基づいて前記積分型半導体検出器を用いて計測される光の光量を測定する光量測定方法において、前記積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を前記積分型半導体検出器で受けたときの前記信号の値を複数回、取得する信号取得ステップと、前記信号取得ステップにより取得された前記信号の値の分布に基づいて、前記積分型半導体検出器から出力される前記信号の値と前記積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出する算出ステップと、前記算出ステップにより算出された前記関係に基づいて、前記積分型半導体検出器を用いて計測される光の絶対光量を測定する絶対光量測定ステップと、をコンピュータが実行することを特徴とする。
この光量測定方法によれば、積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を積分型半導体検出器で受けたときの信号の値を複数回、取得し、その取得された信号の値の分布に基づいて、積分型半導体検出器から出力される信号の値と積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出するので、煩雑な作業を要することなく、正確に(高精度に)、絶対光量を測定できる。
この光量測定方法によれば、積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を積分型半導体検出器で受けたときの信号の値を複数回、取得し、その取得された信号の値の分布に基づいて、積分型半導体検出器から出力される信号の値と積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出するので、煩雑な作業を要することなく、正確に(高精度に)、絶対光量を測定できる。
前記絶対光量測定ステップにより測定される前記絶対光量は、蛍光観察における蛍光の絶対光量であってもよい。
本発明の光量測定装置によれば、積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を積分型半導体検出器で受けたときの信号の値を複数回、取得し、その取得された信号の値の分布に基づいて、積分型半導体検出器から出力される信号の値と積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出するので、煩雑な作業を要することなく、絶対光量を測定できる。
本発明の光量測定方法によれば、積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を積分型半導体検出器で受けたときの信号の値を複数回、取得し、その信号の値の分布に基づいて、積分型半導体検出器から出力される信号の値と積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出するので、煩雑な作業を要することなく、絶対光量を測定できる。
以下、本発明による光量測定装置の実施形態について説明する。
本発明は、スクリーニングの画像を取得するCCDやCMOSなどの半導体画像センサのノイズの性質を利用して、他の検出器との相対値を利用せずに絶対光量を測定可能とするものである。
図1は、CCDの入射光量とノイズとの関係を両対数グラフで表示したものである。図1のグラフでは、横軸に入射光子数(入射光量)を、縦軸に電子数(ノイズ)を、それぞれ対応付けている。半導体画像センサの主要なノイズは「読出しノイズ」、「暗電流ノイズ」、および「光ショットノイズ」の成分からなる。一般に、光の入射量が多い領域では、「光ショットノイズ」が支配的となる(例えば、「ImagEM 技術資料 2009年12月 浜松ホトニクス」参照)。
「光ショットノイズ」の大きさは、光源からの光の強度の平均値が一定(例えば、光子数が100個/秒)で、カメラに入射する光量が一定であったとしても、単位時間に検出される光子数は100個/秒とはならず、95,101,90,106,・・・個などと、測定ごとにランダムにばらつく程度を示す。この光子数の分布はポアソン分布(光子数が多い場合には正規分布)なので、誤差は光子数の平方根になる。
したがって、入射光量を変えながらノイズを測定すると、「光ショットノイズ」が支配的な領域では、ノイズの入射光量への依存性は1/2乗になる(図1における点線の傾きに示される)。
以上の知見から、半導体画像センサで計測した画素値をp、半導体画像センサのゲイン(1ADUが電子何個に相当するかという値)をg[e-/ADU]とすると、半導体画像センサで検出された光子数(画素内に生成された電子数)はp×g[個]であり、そのばらつきは(p×g)1/2個であることが分かる。
画素値p[ADU]と、そのばらつきσ[ADU]は計測可能な量なので、両辺の単位を電子数[個]として、
σ×g=(p×g)1/2 (1)式
と置くことで、(1)式により未知数g[e-/ADU]を求めることができる。
σ×g=(p×g)1/2 (1)式
と置くことで、(1)式により未知数g[e-/ADU]を求めることができる。
このようにしてゲインを求める方法は、「フォトントランスファー法」などと呼ばれており、天文学などのCCDによる精密な測光を行う分野でしばしば利用される。その特徴として、単純な物理法則に基づいているため得られるgが正確であるという点が挙げられる。
以上の手順で半導体画像センサのゲインg[e-/ADU]が分かるので、半導体センサで検出、計測した測定値の単位[ADU]にgを掛け合わせると検出した電子数を求められる。したがって、創薬スクリーニング装置において、(1)レーザ光源のワット(W)数、(2)結像に用いた対物レンズの開口数NA=x、(3)撮影時の露光時間(秒)、に基づいて半導体画像センサの画素内に生じた電子数を算出できる。
また、電子数から入射光子数([個]または[個/秒])への変換は、電子数を量子効率で除算すると求められる。量子効率とは、光子が半導体画像センサへ入射したとき、光電効果によって確率的にいくつの電子を生成するか、という確率である。
異なる実験どうしを比較する場合には、上記の(1)、(2)、(3)などの項目について線形、または非線形にスケーリングして実験結果の同等性を定量的に比較できる。例えば、比較対象に対して、他の条件は同じで開口数が2倍明るい対物レンズを使用した場合であれば、光子数としては4倍になるはずであるから、この場合に比較対象に対し画像の画素値が4倍となっていれば矛盾していないと言える。
実験結果を相互比較する場合に基準とする単位は任意でよいが、例えば、(1)試料面におけるレーザ強度[W/m2]、(2)対物レンズの開口数から得られる蛍光集光の立体角、(3)露光時間、(4)対物レンズ以降の光学系の透過効率、等で規格化すればよい。なお、(1)のレーザ強度(絶対強度)は別途フォトダイオード等で測定してもよいが、本発明により較正された光量測定装置を用いて測定してもよい。その際には、落射形式の顕微鏡(対物レンズを通して試料を照明し、蛍光の戻り光を観察する形式の顕微鏡)では、試料がないと戻り光が発生せずに信号が出ないので、照射されたレーザのレーザ強度と戻り光の光強度との関係が既知であるような基準となる蛍光板、蛍光ビーズなどを使用すればよい。また、反射されたレーザ光の光量を測定する場合には、照射されたレーザのレーザ強度と反射光の光強度との関係が既知であるような散乱板を使用すればよい。また、レーザ強度(絶対強度)の測定のための光路ないし光学系として、試料の位置からの戻り光を測定する本測定時とは別の光路ないし光学系を設けるとともに、これらの光路ないし光学系を切り替える光路切り替え機構を設けることにより、適時、容易にレーザ強度(絶対強度)を測定することが可能となる。
図2は、本発明による光量測定装置の構成例を示すブロック図である。
図2に示すように、光量測定装置は、蛍光観察を行うための顕微鏡装置1と、顕微鏡装置1に接続された演算制御装置2と、を備える。
図2に示すように、顕微鏡装置1には観察像の蛍光の光量を計測するためのCCDなどの積分型半導体検出器11と、後述する積分型半導体検出器11の較正時に使用される照明手段12と、が設けられる。
また、演算制御装置2には、積分型半導体検出器11のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を積分型半導体検出器11で受けたときの信号の値を複数回、取得する信号取得手段21と、信号取得手段21により取得された信号の値の代表値と、その信号の値の分布とに基づいて、積分型半導体検出器11から出力される信号の値と積分型半導体検出器11が受ける光の絶対光量との関係を算出する算出手段22と、算出手段22により算出された関係に基づいて、積分型半導体検出器11を用いて計測される光の絶対光量を測定する絶対光量測定手段23と、が設けられる。
図3は、演算制御装置2の動作を示すフローチャートである。
図3のステップS1では、顕微鏡装置1の照明手段12による照明を開始する。このとき、積分型半導体検出器11には、積分型半導体検出器11のノイズのうち光ショットノイズが支配的となるのに充分な強度の光が与えられる。
次に、ステップS2では、単位時間の間に信号取得手段21が積分型半導体検出器11から出力された信号を取得し、その値を保存する。
次に、ステップS3では、ステップS2が実行された回数が所定の回数に到達したか否か判断し、判断が否定されればステップS2へ戻り、判断が肯定されればステップS4へ進む。ここで、ステップS2が実行されるべき回数(上記所定の回数)は、後述する演算処理(ステップS5)における演算結果に充分な精度を与える回数とする。
ステップS4では、照明手段12による照明を停止する。
次に、ステップS5では、ステップS2で保存された積分型半導体検出器11からの信号の値に基づいて画素値p[ADU]と、そのばらつきσ[ADU]を算出する。さらに、
σ×g=(p×g)1/2 (1)式
を解いて、未知数g[e-/ADU]を求め、絶対光量測定手段23に与え、処理を終了する。
σ×g=(p×g)1/2 (1)式
を解いて、未知数g[e-/ADU]を求め、絶対光量測定手段23に与え、処理を終了する。
以降は、顕微鏡装置1による測定時には、絶対光量測定手段23において、積分型半導体検出器11から出力された画素値p[ADU]に、g[e-/ADU]信号を掛ける演算を行うことで、画素値pを絶対光量に変換することができる。
以上のステップS1〜ステップS4の較正のための手順は、適時、実行でき、例えばコンピュータプログラムに従って毎回の計測の前後等に自動的に較正を行うことができる。
以上のように、本発明の光量測定装置によれば、異なる機会に異なる装置で計測した創薬スクリーニングの結果を相互に定量的に比較することなども可能となる。
例えば、異なる研究所で異なる薬剤について行った実験についても、蛍光強度を[ADU]単位ではなく、[photon/s/(W/m2)/sr/細胞]等の単位にすれば、同じグラフ上に表示し議論して、どちらの薬剤の薬効が高いか直接比較することが可能になる。
あるいは、同一の実験を複数回行った場合に、例えば、N回目の実験は、[photon/s/(W/m2)/sr/細胞]等の単位系では著しく蛍光強度が低いことから細胞や投薬の過程に何らかの問題があったと考えられる、などの実験の品質管理にかかる情報が得られる。従来は、例えば、蛍光強度が低い場合には実験者が経験に基づいて光源を明るくし、あるいは露光時間を長くして画像のSN比を稼ぐようにして、信号のデジタル値としては他と同様の画像を得る操作などをしており、その実験(試料)系の室が他と異なることなどの情報は、とくに異なる時期や異なる装置間での比較で得ることはできなかった。
また、本発明の光量測定装置によれば、本来の観察時の撮影に用いる積分型半導体検出器自体を較正するので、パワーメータ等の較正用の検出器と積分型半導体検出器とを交互に切り替える(チョッピング)する必要がない。したがって、カメラの切り替えや移動のための作業を要することなく、較正が可能である。
本発明は、フォトントランスファー法でゲインを求めることを本質とするものであり、任意の積分型半導体検出器を用いる計測に適用可能である。例えば、生物系の分野では、遺伝子チップの読み取りを絶対光量系で行うことが可能となる。
また、上記実施形態では、蛍光の絶対光量を求める場合を例示しているが、蛍光に限らず、発光、反射光、その他の現象についても適用できる。
また、本発明は、CCD検出器内部で電子増倍を行わない一般的なCCDのほか、電子増倍機構があるCCD(いわゆるEM−CCD;Electron Multiplication CCD)に対しても適用できる。電子数の増倍が異なるだけであり、本質的に同じ方法を適用可能である。さらに、本発明は、CCDに限らず、CMOS等の積分型半導体検出器(積分型半導体画像検出器)に対しても適用できる。
なお、精密な測光を行う場合の多くは、画像のAD変換器のビット数に合わせて16ビット等のデータを保存するが、本発明を用いて較正した画像は、[photon/s/(W/m2)/sr/細胞]等の浮動小数点データで保存してもよい。または、[photon/s/(W/m2)/sr/細胞]等の単位に変換する係数を画像ファイルとともに保存してもよい。例えば、その係数はTIFF形式のファイルのヘッダに記述することが考えられる。
以上説明したように、本発明の光量測定装置等によれば、積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を積分型半導体検出器で受けたときの信号の値を複数回、取得し、その取得された信号の値の分布に基づいて、積分型半導体検出器から出力される信号の値と積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出するので、煩雑な作業を要することなく、絶対光量を測定できる。
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、積分型半導体検出器から出力される信号の値に基づいて前記積分型半導体検出器を用いて計測される光の光量を測定する光量測定装置等に対し、広く適用することができる。
2 演算制御装置(制御手段)
11 積分型半導体検出器
12 照明手段
21 信号取得手段
22 算出手段
23 絶対光量測定手段
11 積分型半導体検出器
12 照明手段
21 信号取得手段
22 算出手段
23 絶対光量測定手段
Claims (5)
- 積分型半導体検出器から出力される信号の値に基づいて前記積分型半導体検出器を用いて計測される光の光量を測定する光量測定装置において、
前記積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を前記積分型半導体検出器で受けたときの前記信号の値を複数回、取得する信号取得手段と、
前記信号取得手段により取得された前記信号の値の分布に基づいて、前記積分型半導体検出器から出力される前記信号の値と前記積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出する算出手段と、
前記算出手段により算出された前記関係に基づいて、前記積分型半導体検出器を用いて計測される光の絶対光量を測定する絶対光量測定手段と、
を備えることを特徴とする光量測定装置。 - 前記積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を前記積分型半導体検出器に照射する照明手段と、
前記信号取得手段により前記信号の値を取得する際に前記照明手段による照射を行わせるとともに、その際に前記信号取得手段により取得された前記信号の値に基づく前記算出手段による前記関係の算出を実行させるように、前記信号取得手段、算出手段および前記照明手段を制御する制御手段と、
を備えることを特徴とする請求項1に記載の光量測定装置。 - 前記絶対光量測定手段により測定される前記絶対光量は、蛍光観察における蛍光の絶対光量であることを特徴とする請求項1または2に記載の光量測定装置。
- 積分型半導体検出器から出力される信号の値に基づいて前記積分型半導体検出器を用いて計測される光の光量を測定する光量測定方法において、
前記積分型半導体検出器のノイズのうち光ショットノイズが支配的となる光強度の光を前記積分型半導体検出器で受けたときの前記信号の値を複数回、取得する信号取得ステップと、
前記信号取得ステップにより取得された前記信号の値の分布に基づいて、前記積分型半導体検出器から出力される前記信号の値と前記積分型半導体検出器が受ける光の絶対光量との関係を算出する算出ステップと、
前記算出ステップにより算出された前記関係に基づいて、前記積分型半導体検出器を用いて計測される光の絶対光量を測定する絶対光量測定ステップと、
をコンピュータが実行することを特徴とする光量測定方法。 - 前記絶対光量測定ステップにより測定される前記絶対光量は、蛍光観察における蛍光の絶対光量であることを特徴とする請求項4に記載の光量測定方法。
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CN110806264A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-02-18 | 中电科仪器仪表有限公司 | 一种自适应光强的ccd光电探测器积分时间控制方法 |
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