CN114846132A - 核酸序列测定装置、核酸序列测定方法以及计算机可读取的非临时性记录介质 - Google Patents

核酸序列测定装置、核酸序列测定方法以及计算机可读取的非临时性记录介质 Download PDF

Info

Publication number
CN114846132A
CN114846132A CN202080089112.2A CN202080089112A CN114846132A CN 114846132 A CN114846132 A CN 114846132A CN 202080089112 A CN202080089112 A CN 202080089112A CN 114846132 A CN114846132 A CN 114846132A
Authority
CN
China
Prior art keywords
image
nucleic acid
acid sequence
light amount
target
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080089112.2A
Other languages
English (en)
Inventor
宫内祐树
蓼沼崇
田口朋之
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yokogawa Electric Corp
Original Assignee
Yokogawa Electric Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yokogawa Electric Corp filed Critical Yokogawa Electric Corp
Publication of CN114846132A publication Critical patent/CN114846132A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N2021/0106—General arrangement of respective parts
    • G01N2021/0112—Apparatus in one mechanical, optical or electronic block
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N2021/0106—General arrangement of respective parts
    • G01N2021/0118—Apparatus with remote processing
    • G01N2021/0125—Apparatus with remote processing with stored program or instructions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N2021/0181—Memory or computer-assisted visual determination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

核酸序列测定装置(1)测定样品中包含的具有特定的核酸序列的目标(TG)。核酸序列测定装置(1)具备：检测从因目标(TG)的添加而发出荧光的核酸序列测定用设备(DV)发出的荧光的检测部(12)；以及基于检测部(12)的检测结果，根据以下的第1光量与第2光量的差而测定所述目标的演算部(25)，所述第1光量表示对核酸序列测定用设备(DV)添加样品之前或刚添加之后的第1时间点的、从核酸序列测定用设备(DV)的预先规定的测定区域发出的荧光的光量，所述第2光量表示对核酸序列测定用设备(DV)添加样品起经过预先规定的时间后的第2时间点的、从相同测定区域发出的荧光的光量。

Description

核酸序列测定装置、核酸序列测定方法以及计算机可读取的 非临时性记录介质
技术领域
本发明涉及核酸序列测定装置、核酸序列测定方法以及计算机可读取的非临时性记录介质。
背景技术
作为测定样品中包含的具有特定的核酸序列的目标(target)的方法，已知有使用DNA芯片(将具有所述特定的核酸序列的互补序列的检测探针设置于基板等的固相面而成)的方法。该方法是利用添加至DNA芯片的样品中包含的目标通过杂交被DNA芯片的检测探针所捕获的性质而测定目标的方法。在该方法中，能够检测目标是否包含在样品中，测定样品中包含的目标的量。
在以下的专利文献1中，公开了：使用设置有附加有荧光分子的荧光探针和附加有使荧光分子的荧光淬灭(quenching)的淬灭分子的淬灭探针作为所述检测探针的核酸序列测定用设备(device)(DNA芯片)，来测定目标的方法。在该方法中，可以不进行对于目标的荧光分子的附加以及DNA芯片的清洗(用于除去未被捕获的目标等的清洗)而测定目标。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2015-43702号公报
发明内容
本发明所要解决的技术问题
然而，在使用所述专利文献1中公开的核酸序列测定用设备测定目标的方法中，会因为基于淬灭分子的淬灭的不完全性、荧光的不均(光量波动)等原因，而存在测定精度劣化的问题。
本发明鉴于所述问题而开发，目的在于：提供一种与现有技术相比能够提高样品中包含的具有特定的核酸序列的目标的测定精度的核酸序列测定装置、核酸序列测定方法、以及计算机可读取的非临时性记录介质。
解决技术问题的技术手段
为了解决所述技术问题，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定装置中，在对样品中包含的具有特定的核酸序列的目标(TG)进行测定的核酸序列测定装置(1)中具备：检测部(12)，其对从因所述目标的添加而发出荧光的核酸序列测定用设备(DV)发出的荧光进行检测；以及演算部(25)，其基于所述检测部的检测结果，根据以下的第1光量与第2光量的差而测定所述目标，第1光量表示对所述核酸序列测定用设备添加所述样品之前或刚添加之后的第1时间点的、从所述核酸序列测定用设备的预先规定的测定区域(SP)发出的荧光的光量，第2光量表示对所述核酸序列测定用设备添加所述样品起经过预先规定的时间后的第2时间点的、从所述测定区域发出的荧光的光量。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定装置中，所述检测部具备至少取得包含所述测定区域的图像取得区域(BK)的图像的图像取得部(12a)，所述演算部进行作为在所述第1时间点取得的所述图像取得区域的图像的第一图像以及作为在所述第2时间点取得的所述图像取得区域的图像的第二图像的图像处理，分别求得所述第1光量以及所述第2光量。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定装置中，作为所述图像处理，所述演算部进行：求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域的图像的像素的平均阶调值作为所述第1光量的处理(S13)、以及求出形成所述第二图像中包含的所述测定区域的图像的像素的平均阶调值作为所述第2光量的处理(S14)。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定装置中，所述演算部提取所述第一图像与所述第二图像的每个像素的阶调值的差超过预先规定的第1阈值的像素，并进行：求得所述第一图像的被提取的像素的平均阶调值以作为所述第1光量的处理(S26)、以及求得所述第二图像的被提取的像素的平均阶调值以作为所述第2光量的处理(S27)。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定装置中，所述演算部求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域的图像的像素的阶调值的标准偏差，并根据所述标准偏差设定所述第1阈值。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定装置中，作为所述图像处理，所述演算部进行：求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域的图像的各像素的阶调值与形成所述第二图像中包含的所述测定区域的图像的各像素的阶调值的差，以作为所述第1光量与所述第2光量的差的处理(S33)。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定装置中，所述演算部提取所述第1光量与所述第2光量的差超过预先规定的第2阈值的像素，并根据提取的像素的数量测定所述目标。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定装置中，所述演算部求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域以外的区域的图像的像素的阶调值的标准偏差，并根据所述标准偏差设定所述第2阈值。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定装置中，所述图像取得部以不同的解像度取得所述图像取得区域的图像。
基于本发明的一种方式的核酸序列测定方法是一种通过对样品中包含的具有特定的核酸序列的目标(TG)进行测定的核酸序列测定装置而实行的核酸序列测定方法，其中，
求出下述第1光量与第2光量的差(S15，S28，S33)，
所述第1光量表示对因所述目标的添加而发出荧光的核酸序列测定用设备添加所述样品之前或刚添加之后的第1时间点的、从所述核酸序列测定用设备的预先规定的测定区域发出的荧光的光量，
第2光量表示对所述核酸序列测定用设备添加所述样品起经过预先规定的时间后的第2时间点的、从所述测定区域发出的荧光的光量，
并根据所述第1光量与所述第2光量的差测定所述目标(S16，S29，S36)。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定方法中，取得至少包含所述测定区域的图像取得区域的图像，进行作为在所述第1时间点取得的所述图像取得区域的图像的第一图像以及作为在所述第2时间点取得的所述图像取得区域的图像的第二图像的图像处理，分别求得所述第1光量以及所述第2光量。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定方法中，作为所述图像处理而进行：求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域的图像的像素的平均阶调值作为所述第1光量的处理(S13)、以及求出形成所述第二图像中包含的所述测定区域的图像的像素的平均阶调值作为所述第2光量的处理(S14)。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定方法中，提取所述第一图像与所述第二图像的每个像素的阶调值的差超过预先规定的第1阈值的像素，进行：求得所述第一图像的被提取的像素的平均阶调值以作为所述第1光量的处理(S26)、以及求得所述第二图像的被提取的像素的平均阶调值以作为所述第2光量的处理(S27)。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定方法中，求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域的图像的像素的阶调值的标准偏差，并根据所述标准偏差设定所述第1阈值。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定方法中，作为所述图像处理而进行：求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域的图像的各像素的阶调值与形成所述第二图像中包含的所述测定区域的图像的各像素的阶调值的差，以作为所述第1光量与所述第2光量的差的处理(S33)。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定方法中，提取所述第1光量与所述第2光量的差超过预先规定的第2阈值的像素，并根据提取的像素的数量测定所述目标。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定方法中，求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域以外的区域的图像的像素的阶调值的标准偏差，并根据所述标准偏差设定所述第2阈值。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定方法中，以不同的解像度取得所述图像取得区域的图像。
基于本发明的一种方式的计算机可读取的非临时性记录介质是一种存储通过对样品中包含的具有特定的核酸序列的目标(TG)进行测定的核酸序列测定装置而实行的程序的计算机可读取的非临时性记录介质，其中，所述程序使所述核酸序列测定装置进行以下操作：
求出下述第1光量与第2光量的差(S15，S28，S33)，
所述第1光量表示对因所述目标的添加而发出荧光的核酸序列测定用设备添加所述样品之前或刚添加之后的第1时间点的、从所述核酸序列测定用设备的预先规定的测定区域发出的荧光的光量，
第2光量表示对所述核酸序列测定用设备添加所述样品起经过预先规定的时间后的第2时间点的、从所述测定区域发出的荧光的光量，
并根据所述第1光量与所述第2光量的差测定所述目标(S16，S29，S36)。
此外，在基于本发明的一种方式的核酸序列测定方法中，所述程序使所述核酸序列测定装置进行以下操作：取得至少包含所述测定区域的图像取得区域的图像，进行作为在所述第1时间点取得的所述图像取得区域的图像的第一图像以及作为在所述第2时间点取得的所述图像取得区域的图像的第二图像的图像处理，分别求得所述第1光量以及所述第2光量。
就本发明的其他特征以及方式而言，参照添附的附图，从以下阐述的实施方式的详细说明出发，是显而易见的。
发明的效果
根据本发明，能够实现与现有技术相比能够提高样品中包含的具有特定的核酸序列的目标的测定精度这一效果。
附图说明
[图1]示意性地表示本发明的实施方式中使用的核酸序列测定用设备的外观的立体图。
[图2]示意性地表示本发明的实施方式中使用的核酸序列测定用设备的检测探针的图。
[图3]表示基于本发明的实施方式的核酸序列测定装置的主要部分构成的区块图。
[图4]表示第1核酸序列测定方法的流程图。
[图5A]表示通过第1核酸序列测定方法取得的图像的一个例子的图。
[图5B]表示通过第1核酸序列测定方法取得的图像的一个例子的图。
[图6]表示第2核酸序列测定方法的流程图。
[图7A]表示通过第2核酸序列测定方法取得的图像的一个例子的图。
[图7B]表示通过第2核酸序列测定方法取得的图像的一个例子的图。
[图8A]表示杂交前后的点区域内的像素的阶调值的波动分布的一个例子的图。
[图8B]表示杂交前后的点区域内的像素的阶调值的波动分布的一个例子的图。
[图9]表示杂交前后的点区域内的像素的平均阶调值以及标准偏差的一个例子的图。
[图10]表示第3核酸序列测定方法的流程图。
[图11]表示通过第3核酸序列测定方法取得的图像的一个例子的图。
[图12A]表示通过变形例的核酸序列测定装置取得的图像的一个例子的图。
[图12B]表示通过变形例的核酸序列测定装置取得的图像的一个例子的图。
[图12C]表示通过变形例的核酸序列测定装置取得的图像的一个例子的图。
[图13]表示以高解像度进行拍摄的情况下的、杂交前后的点区域内的像素的阶调值的波动分布的一个例子的图。
具体实施方式
以下，将参照附图，对基于本发明的实施方式的核酸序列测定装置、核酸序列测定方法、以及计算机可读取的非临时性记录介质详细地进行说明。以下，首先对本发明的实施方式的概要进行说明，然后对本发明的实施方式的详细信息进行说明。
〔概要〕
本发明的实施方式旨在与以往的情况相比提高样品中包含的具有特定的核酸序列的目标的测定精度。例如，通过本发明的实施方式，即使样品中包含的目标极少，也能够进行目标的测定。具体而言，本发明的实施方式通过极力排除在未添加样品的情况下从核酸序列测定用设备发出的微弱的荧光(偏置光(offset光))、荧光的不均(光量波动)等的影响，而实现高测定精度。
所述专利文献1中公开的核酸序列测定用设备具有附加有荧光分子的荧光探针和附加有淬灭分子的淬灭探针，荧光探针与淬灭探针结合而使得荧光分子的荧光通过淬灭分子被淬灭。在该核酸序列测定用设备中，添加作为测定对象的目标时，由于杂交，荧光探针与淬灭探针的结合被解除而发出荧光。
因此，在目标未被添加至核酸序列测定用设备中时，附加于荧光探针的荧光分子的荧光会由于附加于淬灭探针的淬灭分子而被淬灭，因此从核酸序列测定用设备中应该不会发出荧光。然而，在基于淬灭分子的荧光淬灭不完全的情况下，从核酸序列测定用设备中会发出偏置光。这样的偏置光会成为噪声而使测定精度劣化。例如，在目标极少的情况下，从核酸序列测定用设备发出的荧光也很微弱，如果该微弱的荧光被偏置光掩盖则无法进行目标的测定。
此外，在使用核酸序列测定用设备测定目标的情况下，会进行比较杂交前后从核酸序列测定用设备发出的荧光的光量的处理。即，进行将杂交前从核酸序列测定用设备发出的偏置光的光量与杂交后从核酸序列测定用设备发出的荧光的光量的比较的处理。
以往，使用除了添加有含有目标的样品的区块(block)(第1区块)以外，还准备了添加有不含目标的样品的区块(第2区块)的核酸序列测定用设备来进行所述处理。即，将从第2区块发出的荧光(偏置光)的光量与从第1区块发出的荧光(杂交后发出的荧光)的光量进行比较。
或者，使用添加有含有目标的样品的核酸序列测定用设备和添加有不含目标的样品的核酸序列测定用设备来进行所述处理。即，将从后者的核酸序列测定用设备发出的荧光(偏置光)的光量与从前者的核酸序列测定用设备发出的荧光(杂交后发出的荧光)的光量进行比较。
然而，由于核酸序列测定用设备的制造波动等原因，偏置光的光量在区块之间、核酸序列测定用设备之间存在波动。因此，偏置光的光量如果相对较少则可以测定目标，但如果偏置光的光量相对较大则可能会发生无法测定目标的情况。如此，根据区块之间、核酸序列测定用设备之间的偏置光的光量波动的大小，测定精度会有所劣化。
此外，在所述专利文献1公开的核酸序列测定用设备中，还存在从点(上述的处于结合状态的荧光探针和淬灭探针固定于基板上的区域)处发出的荧光的光量波动。这是由于点内的探针的固定量、反应的不均等所导致的。这样的点内的光量波动也会成为使测定精度劣化的原因。
在本发明的实施方式中，首先，求出下述第1光量与第2光量的差，所述第1光量表示对核酸序列测定用设备添加样品之前或刚添加之后的第1时间点的、从核酸序列测定用设备的预先规定的测定区域发出的荧光的光量，第2光量表示对核酸序列测定用设备添加样品起经过预先规定的时间后的第2时间点的、从测定区域发出的荧光的光量。然后，基于第1光量与第2光量的差而测定目标。
如此，在本发明的实施方式中，求得了第1时间点的、从某个测定区域发出的荧光的第1光量与第2时间点的、与从所述相同测定区域发出的荧光的第2光量的差。然后，基于第1光量与第2光量的差而测定目标。由此，能够使得样品中包含的具有特定的核酸序列的目标的测定精度与以往相比得到提高。
〔实施方式〕
以下，首先，将对核酸序列的测定中使用的核酸序列测定用设备进行说明。然后，将依次对使用所述核酸序列测定用设备对核酸序列进行测定的核酸序列测定装置以及核酸序列测定方法进行说明。
〈核酸序列测定用设备〉
图1是示意性地表示本发明的实施方式中使用的核酸序列测定用设备的外观的立体图。如图1所示，核酸序列测定用设备DV例如为在基板SB上形成有多个点SP(测定区域)的设备。作为基板SB，例如，可以使用俯视图中的形状形成为矩形形状的板状的玻璃、硅、氟化钙以及蓝宝石等单晶、陶瓷、以及树脂材料等。作为树脂材料，例如可以举出：光学特性、化学以及热稳定性优异的COP(环烯烃聚合物)、COC(环状烯烃共聚物)、聚碳酸酯、丙烯酸类树脂、聚乙烯树脂等。此外，基板SB的俯视形状可以为任意的形状。
点SP是固定有在作为测定对象的目标的检测中使用的检测探针的区域。该点SP以预先规定的数量为单位被划分为区块BK。对于核酸序列测定用设备DV的样品添加分别在各个区块BK进行。此外，核酸序列测定用设备DV的图像取得通常分别在各个区块BK进行。即，区块BK可以为图像取得区域。
图2是示意性地表示本发明的实施方式中使用的核酸序列测定用设备的检测探针的图。如图2所示，检测探针包含固定于基板SB上的荧光探针PB1和淬灭探针PB2。荧光探针PB1是将荧光分子FM附加于作为测定对象的目标TG的互补序列而得到的探针。淬灭探针PB2是将淬灭分子QM附加于至少一部分与荧光探针PB1的所述互补序列互补的序列而得到的探针。
荧光探针PB1与淬灭探针PB2以使得荧光分子FM的荧光通过淬灭分子QM被淬灭的方式进行了结合。在图2所示的例子中，荧光探针PB1与淬灭探针PB2通过结合部CN进行了结合。此处，荧光分子FM的荧光通过基于荧光共振能量转移的淬灭原理，而被淬灭分子QM所淬灭。
在目标TG不存在的情况下，荧光探针PB1与淬灭探针PB2通过结合部CN进行了结合，荧光分子FM与淬灭分子QM处于靠近的状态。在该状态下，即使照射激发光，也会因为荧光分子FM的荧光被淬灭分子QM所淬灭，而不发出荧光。
与之相对，在目标TG存在的情况下，如图2所示，具有目标TG的互补序列的荧光探针PB1与淬灭探针PB2解离，与目标TG结合。目标TG一旦与荧光探针PB1结合，则荧光探针PB1与淬灭探针PB2的结合被解除，荧光分子FM与淬灭分子QM变为分离的状态。如果变为该状态，则通过激发光的照射，会从荧光分子FM发出荧光。
需要说明的是，目标TG的互补序列也可以设置于淬灭探针PB2。即，也可以是：淬灭探针PB2是将淬灭分子QM附加于目标TG的互补序列而得到的探针，荧光探针PB1是将荧光分子FM附加于至少一部分与淬灭探针P B2的所述互补序列互补的序列而得到的探针。
〈核酸序列测定装置〉
图3表示基于本发明的实施方式的核酸序列测定装置的主要部分构成的区块图。如图3所示，基于本实施方式的核酸序列测定装置1具备检测装置10以及演算装置20，使用通过图1、2而说明的核酸序列测定用设备DV，进行样品中包含的目标的测定。
检测装置10具备温控台11以及检测部12，对从核酸序列测定用设备D V发出的荧光进行检测。温控台11以可以载置核酸序列测定用设备DV的方式而构成，进行载置的核酸序列测定用设备DV的温度调整。该温控台11是为了将核酸序列测定用设备DV的温度调整为常温而设置的。这是因为，荧光分子FM的光量可能会因温度而改变。需要说明的是，温控台11优选以以下的方式构成：为了促进杂交反应，而可以通过使核酸序列测定用设备DV振动或旋转等，进行样品的搅拌。
检测部12对核酸序列测定用设备DV照射激发光，检测从核酸序列测定用设备DV发出的荧光。该检测部12具备激发光源(图示省略)和图像取得部12a。未图示的激发光源发射对核酸序列测定用设备DV进行照射的激发光。就从激发光源发射的激发光而言，例如，分别对图1所示的各区块BK进行照射。作为未图示的激发光源，例如，可以使用发射单波长的激光或其扩展光的激光源、LED(Light Emitting Diode：发光二极管)、发射白色光的灯、包含LED与波长过滤器的组合的光源等。
图像取得部12a具备例如CCD(Charge Coupled Device：电荷耦合器件)或CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor：互补型金属氧化膜半导体)等固体图象传感器，取得核酸序列测定用设备DV的图像(二维图像)。图像取得部12a例如分别对图1所示的各区块BK取得图像。
演算装置20基于检测装置10的检测结果，进行目标TG的测定。具体而言，演算装置20测定添加至核酸序列测定用设备DV的样品中是否包含目标TG、以及样品中包含的目标的量。该演算装置20具备操作部21、显示部22、输入输出部23、存储部24、以及演算部25。
操作部21具备例如键盘、定点设备等输入装置，将与使用演算装置20的使用者的操作对应的指示(对于演算装置20的指示)输出至演算部25。显示部22具备例如液晶显示装置等显示装置，显示从演算部25输出的各种信息。需要说明的是，操作部21以及显示部22可以在物理层面上分离，也可以如兼具显示功能与操作功能的触摸面板式的液晶显示装置这样在物理层面上一体化。
输入输出部23与检测装置10的检测部12连接，进行与检测部12间的各种数据的输入输出。例如，输入输出部23对检测部12输出用于使未图示的激发光源发射激发光的控制数据。此外，检测装置10将检测部12的检测结果(图像取得部12a取得的图像的数据)输入至输入输出部23。然后，输入输出部23将检测部12的检测结果输出至演算部25。需要说明的是，也可以将输入输出部23与温控台11连接，使演算装置20进行核酸序列测定用设备DV的温度调节。
存储部24具备例如HDD(硬盘驱动器，Hard disk drive)、SSD(固态驱动器，Solidstate drive)等辅助存储装置，存储各种数据。例如，存储部24存储从检测部12输出的图像数据、演算部25的演算中所需要的各种数据、表示演算部25的演算结果的数据、其它的数据。需要说明的是，存储部24例如也可以存储实现演算部25的功能的程序。
演算部25使从输入输出部23输出的图像数据存储于存储部24。此外，演算部25读取存储于存储部24的图像数据，进行图像数据的图像处理，进行添加至核酸序列测定用设备DV的样品中包含的目标TG的测定。具体而言，演算部25在杂交前后，基于从同一点SP发出的荧光的光量变化量，进行目标TG的测定。此外，演算部25将对于检测部12的控制数据(例如，用于使未图示的激发光源发射激发光的控制数据)输出至输入输出部23。需要说明的是，演算部25进行的处理的详细内容如后所述。
演算部25的功能例如可以通过CPU(Central Processing Unit：中央处理装置)或MPU(Micro Processing Unit：微处理器)读取存储于存储部24的程序并实行，来通过软件实现。或者，演算部25的功能也可以使用FPGA(Field Programmable Gate Array)、LSI(Large Scale Integration：大规模集成电路)、ASIC(Application Specific IntegratedCircuit：特定用途集成电路)等硬件来实现。
〈核酸序列测定方法〉
接下来，对基于本发明的实施方式的核酸序列测定方法进行说明。以下，首先，对不考虑点SP内的荧光的不均(光量波动)的测定方法(以下，称为“第1核酸序列测定方法”)进行说明。接下来，对考虑点SP内的荧光的不均(光量波动)的2种测定方法(以下，分别称为“第2核酸序列测定方法”、“第3核酸序列测定方法”)进行说明。
《第1核酸序列测定方法》
图4是表示第1核酸序列测定方法的流程图。需要说明的是，在图4所示的流程图的处理开始前，进行包含目标TG的样品的调整。此外，进行在核酸序列测定装置1的温控台11上准备通过图1、2说明了的核酸序列测定用设备DV的操作。在以上的调整以及操作结束后，例如，向核酸序列测定用设备DV的多个区块BK中的1个(以下，称为“对象区块BK0”)中添加样品。
向核酸序列测定用设备DV中添加样品时，首先，检测部12取得刚添加样品后的时间点(第1时间点)的图像(第一图像)(步骤S11)。在该处理中，从演算装置20的演算部25输出的控制数据介由输入输出部23而输入至检测部12。由此，从设置于检测部12的未图示的激发光源发射激发光，照射对象区块BK0。然后，图像取得部12a取得正被激发光照射的对象区块BK0的图像。
此处，刚添加样品后是指，样品添加后可以认为杂交几乎还没有进行的期间。该期间也可以认为是即使添加了样品，从核酸序列测定用设备DV发出的荧光的光量也几乎没有变化的期间。需要说明的是，该期间会根据核酸序列测定用设备DV的性质(荧光探针PB1以及淬灭探针PB2的性质)、样品中包含的目标TG的量而变化。因此，取得第一图像的时机优选为尽量接近添加样品时间点的时间点。
接下来，检测部12取得样品添加起经过给定时间后的时间点(第2时间点)的图像(第二图像)(步骤S12)。具体而言，通过温控台11使核酸序列测定用设备DV的温度上升后，在经过可以认为杂交充分进行了的时间后，图像取得部12a取得对象区块BK0的图像。
此处，可以认为杂交充分进行了的时间会根据核酸序列测定用设备DV的性质(荧光探针PB1以及淬灭探针PB2的性质)、样品中包含的目标TG的量而变化。因此，例如，优选进行预实验预先确定所述时间。
步骤S11、S12中取得的图像从检测部12输出至演算装置20。此外，检测部12可以在每当各步骤结束时分别将步骤S11、S12中取得的图像输出至演算装置20。或者，也可以是检测部12暂时存储步骤S11中取得的图像，在步骤S12结束后，将其与步骤S12中取得的图像一同输出至演算装置20。从检测部12输出至演算装置20的图像存储于演算装置20的存储部24。
接下来，演算装置20的演算部25读取存储于存储部24的第一图像并进行图像处理，算出从各个点SP发出的荧光的光量(第1光量)(步骤S13)。具体而言，演算部25对步骤S11中取得的图像(对象区块BK0的图像)进行图像处理，提取点区域(被推测为点SP的图像的区域)。然后，演算部25对于各个提取的点区域，求出形成点SP的图像的各像素的平均阶调值作为第1光量。
接下来，演算装置20的演算部25读取存储于存储部24的第二图像并进行图像处理，算出从各个点SP发出的荧光的光量(第2光量)(步骤S14)。具体而言，演算部25对步骤S12中取得的图像(对象区块BK0的图像)进行图像处理，提取点区域。然后，演算部25对于提取的各个点区域，求出形成点SP的图像的各像素的平均阶调值作为第2光量。
然后，演算部25算出作为步骤S13中算出的平均阶调值(第1光量)与步骤S14中算出的平均阶调值(第2光量)的差(光量变化量)的光量变化量(步骤S15)。即，演算部25算出杂交前后，从同一点SP发出的荧光的光量变化量。
以上的处理结束时，演算装置20的演算部25对样品中包含的目标TG进行测定(步骤S16)。具体而言，演算部25会判定添加至核酸序列测定用设备DV的样品中是否包含目标TG。此外，演算部25会对样品中包含的目标的量进行测定。如此，进行样品中包含的目标TG的测定。
图5是表示通过第1核酸序列测定方法取得的图像的一个例子的图。图5A例如是杂交前的对象区块BK0的图像(第一图像)，图5B例如是杂交后的对象区块BK0的图像(第二图像)。
图5A以及图5B中以二维状排列的圆形区域表示设置于对象区块BK0内的点SP的图像(点区域)。就该点区域的颜色而言，从点SP发出的荧光的光量越少则阶调值越小(越接近黑色)，从点SP发出的荧光的光量越多则阶调值越大(越接近白色)。
如图5A所示，杂交前，各个点区域的颜色为灰色。这表示，由于基于设置于淬灭探针PB2的淬灭分子QM的淬灭的不完全性，从各个点SP发出了偏置光。如图5B所示，杂交后，被虚线包围的区域R内的点区域的颜色变成了白色。这表示，在区域R内的点SP中，目标TG被检测探针捕获而发出了强荧光。
在所述步骤S13的处理中，演算部25对于图5A所示的各个点区域，算出了平均阶调值作为第1光量。在所述步骤S14的处理中，演算部25对于图5B所示的各个点区域，算出了平均阶调值作为第2光量。然后，在所述步骤S15的处理中，演算部25对于各个点区域，算出了作为第1光量与第2光量的差的光量变化量。
图5A以及图5B所示的例中，在区域R内，存在排列为纵2列横5列的合计10个点区域，这10个点区域的光量变化量比其他点区域的光量变化量大。因此，在所述步骤S16的处理中，演算部25使用区域R内的10个点区域中的光量变化量，对样品中包含的目标TG进行测定。
如上所述，在第1核酸序列测定方法中，求出了刚添加样品后的时间点(第1时间点)的、从某个点SP发出的荧光的第1光量与样品添加起给定时间后的时间点(第2时间点)的、从同一点SP发出的荧光的第2光量的差。然后，基于第1光量与第2光量的差来测定目标。由此，能够有效地排除偏置光的影响，因此能够使样品中包含的具有特定的核酸序列的目标的测定精度相较于以往更为提高。
《第2核酸序列测定方法》
图6是表示第2核酸序列测定方法的流程图。需要说明的是，在图6中，对于与图4中所示的步骤同样的步骤，赋予了相同的符号。需要说明的是，在本测定方法中，在图6所示的流程图的处理开始前，也进行包含目标TG的样品的调整等，然后，向对象区块BK0中添加样品。
向核酸序列测定用设备DV中添加样品时，首先，检测部12取得刚添加样品后的时间点(第1时间点)的图像(第一图像)(步骤S11)。接下来，检测部12取得样品添加起经过给定时间后的时间点(第2时间点)的图像(第二图像)(步骤S12)。需要说明的是，步骤S11、S12的处理与通过图4说明了的处理相同，因此省略详细的说明。
接下来，演算部25对第一图像以及第二图像进行图像处理，从各个第一图像以及第二图像中提取点区域(步骤S21)。接下来，演算部25对于各个从第一图像中提取的点区域，算出阶调值标准偏差(步骤S22)。具体而言，演算部25对于各个从第一图像中提取的点区域，算出形成点SP的图像的像素的阶调值的标准偏差。然后，演算部25使用步骤S22中算出的阶调值标准偏差，设定各个点区域的置信区间(第1阈值)(步骤S23)。
此处，进行步骤S22的处理是为了求出各个点区域中荧光的不均(光量的波动)产生的程度。进行步骤S23的处理是为了在后述的步骤S25的处理中，对于各个点区域，进行杂交前后的光量变化量大到一定程度的像素(阶调值的差大到一定程度的像素)的提取。此外，置信区间的设定方法是任意的，例如，可以设定置信系数为0.95的置信区间。
接下来，演算部25对于各个以步骤S21的处理提取的点区域，算出形成点SP的图像的各像素的阶调值变化量(步骤S24)。然后，演算部25对于各个以步骤S21的处理提取的点区域，提取具有步骤S23中设定的置信区间以上的阶调值变化的像素(步骤S25)。
以上的处理结束时，演算部25对于各个通过步骤S21的处理而从第一图像中提取的点区域，算出通过步骤S25的处理提取的像素的平均阶调值(第1光量)以及阶调值标准偏差(步骤S26)。同样地，演算部25对于各个通过步骤S21的处理而从第二图像中提取的点区域，算出通过步骤S25的处理提取的像素的平均阶调值(第2光量)以及阶调值标准偏差(步骤S27)。
接下来，演算部25对步骤S26中算出的平均阶调值(第1光量)与步骤S27中算出的平均阶调值(第2光量)的差(光量变化量)进行检验(步骤S28)。具体而言，演算部25使用步骤S26、S27中算出的阶调值标准偏差，对所述的平均阶调值的差(光量变化量)进行检验。最后，演算部25基于步骤S28的检验结果，测定样品中包含的目标TG(步骤S29)。如此，进行样品中包含的目标TG的测定。
图7是表示通过第2核酸序列测定方法取得的图像的一个例子的图。图7A例如是杂交前取得的对象区块BK0的图像(第一图像)的一部分。图7B是将杂交前后取得的图像(第一图像，第二图像)的1个点区域扩大了的图。此外，在图7B中，图像G1是杂交前的图像，图像G2是杂交后的图像。
参照图7A，表示了3个点区域。这3个点区域的内部的阶调值不相同而是呈斑状模样。此外，这3个点区域的斑状模样不相同而是相互不同。由此，可以看出偏置光的光量波动不仅在点区域内，在点区域之间也存在。
参照图7B，可以看出，与图像G1相比，图像G2整体上更白(阶调值更大)。这表示，与杂交前相比，杂交后整体的光量有所增加。此外，参照图7B，图像G1、G2中的任一者的阶调值都不相同而是呈斑状模样。由此，可以看出，点区域内的荧光的光量波动不仅在杂交前，在杂交后也有发生。
图8是表示杂交前后的点区域内的像素的阶调值的波动分布的一个例子的图。图8A是表示图7B所示的图像G1、G2的阶调值的波动分布的直方图。与之相对，图8B是表示从图7B所示的图像G1、G2提取的像素(阶调变化量大的像素)的阶调值的波动分布的直方图。即，图8B是对于进行了图6所示的步骤S25的处理后的对象，以直方图表示其阶调值的波动分布的图表。
参照图8，可以看出，杂交前，像素的阶调值的分布为“20000”附近，杂交后，像素的阶调值的分布为“40000”附近。此外，将图8A与图8B比较，可以看出，与图8A相比，图8B的波动较小，平均阶调值更大。
图9是表示杂交前后的点区域内的像素的平均阶调值以及标准偏差的一个例子的图。图9中，记有“无像素提取”的是图7B所示的图像G1、G2的平均阶调值以及标准偏差。另一方面，图9中，记有“有像素提取”的是从图7B所示的图像G1、G2中提取的像素(阶调变化量大的像素)的平均阶调值以及标准偏差。图9中，平均阶调值以条状图表示，标准偏差以误差条表示。
参照图9，可以看出，无论是杂交前，还是杂交后，记有“有像素提取”的平均阶调值都比记有“无像素提取”的平均阶调值大。此外，还可以看出，无论是杂交前，还是杂交后，记有“有像素提取”的标准偏差都减少至记有“无像素提取”的标准偏差的三分之一的程度。
在图6所示的步骤S28的处理中，演算部25使用杂交前后的标准偏差对作为杂交前的平均阶调值与杂交后的平均阶调值的差的光量变化量进行检验。通过进行图6所示的步骤S25的处理，能够使标准偏差减少至三分之一的程度，因此能够提高目标的测定精度。
如上所述，在第2核酸序列测定方法中，首先，根据从第一图像中提取的点区域的阶调值标准偏差来设定置信区间，提取具有置信区间以上的阶调值变化的像素。接下来，对于各个第一图像的点区域，求出提取的像素的平均阶调值(第1光量)，对于各个第一图像的点区域，求出提取的像素的平均阶调值(第2光量)，对作为它们的差的光量变化量进行检验。然后，基于检验结果测定目标。由此，能够有效地排除点区域内的光量不均的影响，因此能够使样品中包含的具有特定的核酸序列的目标的测定精度与以往相比得到提高。
《第3核酸序列测定方法》
图10是表示第3核酸序列测定方法的流程图。此外，在图10中，对于与图4、图6中所示的步骤同样的步骤，附有相同的符号。此外，在本测定方法中，在图10所示的流程图的处理开始前，也进行包含有目标TG的样品的调整等，然后，向对象区块BK0中添加样品。
向核酸序列测定用设备DV中添加样品时，首先，检测部12取得刚添加样品后的时间点(第1时间点)的图像(第一图像)(步骤S11)。接下来，检测部12取得样品添加起经过给定时间后的时间点(第2时间点)的图像(第二图像)(步骤S12)。接下来，演算部25对第一图像以及第二图像进行图像处理，从各个第一图像以及第二图像中提取点区域(步骤S21)。
接下来，演算部25算出从第一图像中提取的点区域外的阶调值标准偏差(步骤S31)。具体而言，演算部25算出形成从第一图像中提取的点区域以外的任意区域中的图像的像素的阶调值的标准偏差。然后，演算部25使用步骤S31中算出的阶调值标准偏差，设定置信区间(第2阈值)(步骤S32)。
此处，进行步骤S31的处理是为了求出产生了多大程度的、例如核酸序列测定用设备DV的特性所引起的噪声、设置于图像取得部12a的固体图象传感器所引起的噪声所导致的光量的波动。进行步骤S32的处理是为了在后述的步骤S34的处理中，对于各个点区域，进行杂交前后的光量变化量大到一定程度的像素(阶调值的差大到一定程度的像素)的提取。需要说明的是，置信区间的设定方法是任意的，例如，可以设定置信系数为0.95的置信区间。
接下来，演算部25对于以步骤S21的处理提取的各个点区域，算出形成点SP的图像的各像素的阶调值变化量(步骤S33)。然后，演算部25对于各个以步骤S21的处理提取的点区域，提取具有步骤S32中设定的置信区间以上的阶调值变化的像素(步骤S34)。
以上的处理结束时，演算部25对于各个以步骤S21的处理提取的点区域，对提取的像素的数量进行计数(步骤S35)。最后，演算部25基于步骤S35的计数结果，测定样品中包含的目标TG(步骤S36)。如此，进行样品中包含的目标TG的测定。
图11是表示通过第3核酸序列测定方法取得的图像的一个例子的图。此外，在图3中，表示了在将目标TG的浓度不同的3个样品添加至核酸序列测定用设备DV的情况下所取得的杂交前后的点的图像。首先，在目标TG的浓度较低的情况下，杂交前后，图像的阶调值变化极小。因此，在图10的步骤S34的处理中几乎没有提取的像素。
接下来，随着目标TG的浓度提高，杂交前后，表现出较大的阶调值变化的像素的数量也随之增加。因此，在图10的步骤S34的处理中提取的像素随着目标TG的浓度提高而增加。如此，通过计数提取的像素的数量，能够测定样品中包含的目标TG。
如上所述，在第3核酸序列测定方法中，首先，根据从第一图像中提取的点区域外的阶调值标准偏差而设定置信区间。接下来，对于各个提取的点区域算出各像素的阶调值变化量，提取具有置信区间以上的阶调值变化的像素。然后，对于各个提取的点区域，对提取的像素的数量进行计数，基于该计数结果而测定目标。由此，能够有效地排除点区域内的光量不均的影响，因此能够使样品中包含的具有特定的核酸序列的目标的测定精度与以往相比得到提高。
〈变形例〉
也可以使基于本发明的实施方式的核酸序列测定装置1能够以不同的解像度取得核酸序列测定用设备DV的图像(区块BK或点SP的图像)。例如，可以设为在图3所示的图像取得部12a与温控台11(核酸序列测定用设备DV)之间，设置有能够改变光学倍率的光学系统的构成。或者，也可以将像素数不同的多个固体图象传感器设置于图3所示的图像取得部12a，以可根据解像度切换固体图象传感器的方式进行构成。这样做是为了通过以高解像度拍摄点SP，而使目标的测定精度进一步提高。
例如，点SP的直径设为100[μm]，固体图象传感器的1像素的大小设为10[μm]正方(10×10[μm])。在固体图象传感器以等倍拍摄点SP的情况下，拍摄点SP的像素只有78.5像素(5×5×π像素)左右。
与之相对，例如，如果通过所述光学系统使点SP的像扩大至10倍，则1像素拍摄的范围为1[μm]正方(1×1[μm])。于是，拍摄点SP的像素就为7850像素(50×50×π像素)左右，为扩大倍率的平方的解像度。如此，通过在低解像度(等倍)以外，能够以高解像度取得核酸序列测定用设备DV的图像，能够更为正确地捕捉点区域内的阶调值的波动。
图12是表示通过变形例的核酸序列测定装置取得的图像的一个例子的图。图12A是以等倍拍摄某个点SP时取得的图像。图12B是以10倍的倍率拍摄与图12A相同的点SP时取得的图像，图12C是以40倍的倍率拍摄与图12A相同的点SP时取得的图像。
参照图12A，可以看出，在以等倍拍摄的情况下，得到了像是覆盖了粗糙的马赛克的图像。参照图12B，可以看出，在以10倍的倍率拍摄的情况下，虽然与图12A所示的图像相比粗糙度较低，但还是得到了像是覆盖了马赛克的图像。与之相对，参照图12C，可以看出得到了阶调值流畅地变化的图像。
图13是表示以高解像度进行拍摄的情况下的、杂交前后的点区域内的像素的阶调值的波动分布的一个例子的图。将图13与图8A进行比较，可以看出，在以高解像度进行拍摄的情况下，能够正确地得到阶调值的波动分布。
以上，对基于本发明的实施方式的核酸序列测定装置以及核酸序列测定方法进行了说明，但本发明不限于所述实施方式，可以在本发明的范围内自由地进行变更。例如，在上述的实施方式中说明的图像取得部12a可以取得黑白的二维图像，也可以取得彩色的二维图像。
此外，图像取得部12a除了CCD、COMS以外，也可以具备灵敏度高的EMCCD(ElectronMultiplying CCD：电子增倍CCD)、数字CMOS。此外，检测部12也可以具备以与点SP一对一的方式配置的光电二极管来代替图像取得部12a(或与图像取得部12a一同具备)。
此外，在上述的实施方式中，对将刚添加样品后的图像(对象区块BK0的图像)作为第一图像而取得的例子进行了说明。然而，也可以将样品添加前的图像(对象区块BK0的图像)作为第一图像而取得。即，第一图像只要在样品添加前或刚添加后的第1时间点取得即可。但是，在将样品添加前的图像作为第一图像而取得的情况下，需要预先求出样品添加前得到的光量与添加了不包含目标的样品后得到的光量的差，将该差赋予第一图像的光量。此外，也可以在添加包含目标的样品前，将添加了不包含目标的样品的图像(对象区块BK0的图像)作为第一图像而取得。
此外，在上述的第1～第3核酸序列测定方法中，为了使说明简单化，对首先统一取得第一图像以及第二图像，然后进行第一图像以及第二图像的图像处理等的例子进行了说明。然而，也可以在从取得第一图像到取得第二图像之间，进行第一图像的图像处理等。
此外，上述的第3核酸序列测定方法中的置信区间的设定方法可以在上述的第2核酸序列测定方法中使用，相反，上述的第2核酸序列测定方法中的置信区间的设定方法也可以在上述的第3核酸序列测定方法中使用。具体而言，可以将图6的步骤S22、S23的处理替换为图10的步骤S31、S32的处理，也可以将图10的步骤S31、S32的处理替换为图6的步骤S22、S23的处理。
此外，基于本发明的实施方式的核酸序列测定装置以及核酸序列测定方法可以在荧光分子光量测定中的干式图像测定、生物芯片的荧光分子光量的液中观察、以及连续反应中的实时观察等中使用。具体而言，基于本发明的实施方式的核酸序列测定装置以及核酸序列测定方法例如可以在基于基因·高分子分析的菌种判别、癌基因、动植物判别、肠内细菌的检查等中使用。
此外，基于本发明的实施方式的核酸序列测定装置以及核酸序列测定方法也可以应用于临床检查等中使用的标记抗体法等如下所述的固相法。例如，可以举出使用荧光物质对组织或细胞内的特定的染色体或基因的表达进行荧光测定的FISH法(荧光in situ杂交)作为一个例子。除此以外，可以举出以下所述的各种手法中的应用作为一个例子。即，将铕等荧光发光物质作为标记而对抗原抗体反应进行测定的FIA法(荧光免疫测定法)、测定针对作为抗原的病原体等以荧光物质作为标签的血清(抗体)反应的IFA法(间接荧光抗体法)。
本说明书中“前、后、上、下、右、左、垂直、水平、纵、横、行和列”等表示方向的词语，在本发明的装置中的这些方向中有所言及。因此，本发明的说明书中的这些词语，在本发明的装置中应当做相对解释。
“构成”这一词语，用于表示为了实行本发明的功能而构成，或表示装置的构成、要素、部分。
此外，在权利要求中以“手段加功能(means·plus·function)”的形式表现的表达，包含为了实行本发明中包含的功能而可以利用的所有结构。
“单元”这一词语，用于表示构成要素、单元、硬件或为了实行期望的功能而编程的软件的一部分。硬件的典型例为设备、电路，但不限于此。
以上，对本发明的优选实施例进行了说明，但本发明不限于这些实施例。在不脱离本发明的主旨的范围内，可以进行构成的附加、省略、置换和其它变更。本发明不受以上说明的限定，而只受到权利要求书的范围的限定。
符号的说明
1 核酸序列测定装置
12 检测部
12a 图像取得部
25 演算部
BK 区块
DV 核酸序列测定用设备
SP 点
TG 目标

Claims (20)

1.一种核酸序列测定装置，其为对样品中包含的具有特定的核酸序列的目标进行测定的核酸序列测定装置，其中，
所述核酸序列测定装置具备：
检测部，其检测从因所述目标的添加而发出荧光的核酸序列测定用设备发出的荧光；
演算部，其基于所述检测部的检测结果，根据以下的第1光量与第2光量的差而测定所述目标，
所述第1光量表示对所述核酸序列测定用设备添加所述样品之前或刚添加之后的第1时间点的、从所述核酸序列测定用设备的预先规定的测定区域发出的荧光的光量，
所述第2光量表示对所述核酸序列测定用设备添加所述样品起经过预先规定的时间后的第2时间点的、从所述测定区域发出的荧光的光量。
2.根据权利要求1所述的核酸序列测定装置，其中，
所述检测部具备：取得至少包含所述测定区域的图像取得区域的图像的图像取得部，
所述演算部进行作为在所述第1时间点取得的所述图像取得区域的图像的第一图像以及作为在所述第2时间点取得的所述图像取得区域的图像的第二图像的图像处理，分别求得所述第1光量以及所述第2光量。
3.根据权利要求2所述的核酸序列测定装置，其中，
作为所述图像处理，所述演算部进行下述处理：
求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域的图像的像素的平均阶调值作为所述第1光量的处理、以及
求出形成所述第二图像中包含的所述测定区域的图像的像素的平均阶调值作为所述第2光量的处理。
4.根据权利要求3所述的核酸序列测定装置，其中，
所述演算部提取所述第一图像与所述第二图像的每个像素的阶调值的差超过预先规定的第1阈值的像素，并进行下述处理：
求得所述第一图像的被提取的像素的平均阶调值以作为所述第1光量的处理；以及
求得所述第二图像的被提取的像素的平均阶调值以作为所述第2光量的处理。
5.根据权利要求4所述的核酸序列测定装置，其中，
所述演算部求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域的图像的像素的阶调值的标准偏差，并根据所述标准偏差设定所述第1阈值。
6.根据权利要求2所述的核酸序列测定装置，其中，
作为所述图像处理，所述演算部进行下述处理：
求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域的图像的各像素的阶调值与形成所述第二图像中包含的所述测定区域的图像的各像素的阶调值的差，以作为所述第1光量与所述第2光量的差的处理。
7.根据权利要求6所述的核酸序列测定装置，其中，
所述演算部提取所述第1光量与所述第2光量的差超过预先规定的第2阈值的像素，并根据提取的像素的数量测定所述目标。
8.根据权利要求7所述的核酸序列测定装置，其中，
所述演算部求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域以外的区域的图像的像素的阶调值的标准偏差，并根据所述标准偏差设定所述第2阈值。
9.根据权利要求2～8中任一项所述的核酸序列测定装置，其中，
所述图像取得部以不同的解像度取得所述图像取得区域的图像。
10.一种核酸序列测定方法，其为通过对样品中包含的具有特定的核酸序列的目标进行测定的核酸序列测定装置而实行的核酸序列测定方法，其中，
求出下述第1光量与第2光量的差，并且
根据所述第1光量与所述第2光量的差测定所述目标，
所述第1光量表示对因所述目标的添加而发出荧光的核酸序列测定用设备添加所述样品之前或刚添加之后的第1时间点的、从所述核酸序列测定用设备的预先规定的测定区域发出的荧光的光量，
所述第2光量表示对所述核酸序列测定用设备添加所述样品起经过预先规定的时间后的第2时间点的、从所述测定区域发出的荧光的光量。
11.根据权利要求10所述的核酸序列测定方法，其中，
取得至少包含所述测定区域的图像取得区域的图像，
进行作为在所述第1时间点取得的所述图像取得区域的图像的第一图像以及作为在所述第2时间点取得的所述图像取得区域的图像的第二图像的图像处理，分别求得所述第1光量以及所述第2光量。
12.根据权利要求11所述的核酸序列测定方法，其中，
作为所述图像处理而进行下述处理：
求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域的图像的像素的平均阶调值作为所述第1光量的处理、以及
求出形成所述第二图像中包含的所述测定区域的图像的像素的平均阶调值作为所述第2光量的处理。
13.根据权利要求12所述的核酸序列测定方法，其中，
提取所述第一图像与所述第二图像的每个像素的阶调值的差超过预先规定的第1阈值的像素，进行下述处理：
求得所述第一图像的被提取的像素的平均阶调值以作为所述第1光量的处理、以及求得所述第二图像的被提取的像素的平均阶调值以作为所述第2光量的处理。
14.根据权利要求13所述的核酸序列测定方法，其中，
求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域的图像的像素的阶调值的标准偏差，并根据所述标准偏差设定所述第1阈值。
15.根据权利要求11所述的核酸序列测定方法，其中，
作为所述图像处理而进行下述处理：
求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域的图像的各像素的阶调值与形成所述第二图像中包含的所述测定区域的图像的各像素的阶调值的差，以作为所述第1光量与所述第2光量的差的处理。
16.根据权利要求15所述的核酸序列测定方法，其中，
提取所述第1光量与所述第2光量的差超过预先规定的第2阈值的像素，并根据提取的像素的数量测定所述目标。
17.根据权利要求16所述的核酸序列测定方法，其中，
求出形成所述第一图像中包含的所述测定区域以外的区域的图像的像素的阶调值的标准偏差，并根据所述标准偏差设定所述第2阈值。
18.根据权利要求11～17中任一项所述的核酸序列测定方法，其中，
以不同的解像度取得所述图像取得区域的图像。
19.一种计算机可读取的非临时性记录介质，其为存储通过对样品中包含的具有特定的核酸序列的目标进行测定的核酸序列测定装置而实行的程序的计算机可读取的非临时性记录介质，其中，
所述程序使所述核酸序列测定装置进行以下操作：
求出下述第1光量与第2光量的差，并且
根据所述第1光量与所述第2光量的差测定所述目标，
所述第1光量表示对因所述目标的添加而发出荧光的核酸序列测定用设备添加所述样品之前或刚添加之后的第1时间点的、从所述核酸序列测定用设备的预先规定的测定区域发出的荧光的光量，
所述第2光量表示对所述核酸序列测定用设备添加所述样品起经过预先规定的时间后的第2时间点的、从所述测定区域发出的荧光的光量。
20.根据权利要求19所述的计算机可读取的非临时性记录介质，其中，
所述程序使所述核酸序列测定装置进行以下操作：
取得至少包含所述测定区域的图像取得区域的图像，
进行作为在所述第1时间点取得的所述图像取得区域的图像的第一图像以及作为在所述第2时间点取得的所述图像取得区域的图像的第二图像的图像处理，分别求得所述第1光量以及所述第2光量。
CN202080089112.2A 2019-12-23 2020-11-18 核酸序列测定装置、核酸序列测定方法以及计算机可读取的非临时性记录介质 Pending CN114846132A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019231995A JP2021097648A (ja) 2019-12-23 2019-12-23 核酸配列計測装置及び核酸配列計測方法
JP2019-231995 2019-12-23
PCT/JP2020/042910 WO2021131411A1 (ja) 2019-12-23 2020-11-18 核酸配列計測装置、核酸配列計測方法、及びコンピュータ読み取り可能な非一時的記録媒体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114846132A true CN114846132A (zh) 2022-08-02

Family

ID=76540548

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080089112.2A Pending CN114846132A (zh) 2019-12-23 2020-11-18 核酸序列测定装置、核酸序列测定方法以及计算机可读取的非临时性记录介质

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230002813A1 (zh)
EP (1) EP4083179A4 (zh)
JP (1) JP2021097648A (zh)
CN (1) CN114846132A (zh)
WO (1) WO2021131411A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7409354B2 (ja) * 2021-07-30 2024-01-09 横河電機株式会社 核酸計測デバイス、その設計方法、製造方法及び計測方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19811730A1 (de) * 1998-03-18 1999-09-23 November Ag Molekulare Medizin Verfahren und Vorrichtung zum Identifizieren einer Markierung
US20070059693A1 (en) * 2003-01-02 2007-03-15 University Of Rochester Hybridization-based biosensor containing hairpin probes and use thereof
WO2005047545A2 (en) * 2003-11-04 2005-05-26 Applera Corporation Microarray controls
US11525156B2 (en) * 2006-07-28 2022-12-13 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
JP6003033B2 (ja) * 2010-11-11 2016-10-05 ソニー株式会社 核酸の検出方法及びサンプルの光学観察方法並びに蛍光体
JP5802440B2 (ja) * 2011-06-02 2015-10-28 オリンパス株式会社 蛍光観察装置
JP5928906B2 (ja) * 2013-08-27 2016-06-01 横河電機株式会社 核酸配列計測方法、核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測用デバイスの製造方法および核酸配列計測装置
CN106414772B (zh) * 2014-04-08 2021-02-19 华盛顿大学商业中心 用于使用多分散小滴执行数字检定的方法和设备
WO2016149694A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-22 Quandx Inc. Ided double-stranded probes for detection of nucleic acid and uses of same

Also Published As

Publication number Publication date
US20230002813A1 (en) 2023-01-05
WO2021131411A1 (ja) 2021-07-01
JP2021097648A (ja) 2021-07-01
EP4083179A4 (en) 2024-01-24
EP4083179A1 (en) 2022-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9651495B2 (en) Signal noise reduction for imaging in biological analysis
US7608840B2 (en) System and method employing photokinetic techniques in cell biology imaging applications
KR101513602B1 (ko) 바이오칩 스캐닝 방법
US20150063666A1 (en) Systems and Methods for Assessing Images
US20110007178A1 (en) Correction of spot area in measuring brightness of sample in biosensing device
AU2020276115A1 (en) Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing
WO2007013551A1 (ja) 光強度測定方法および光強度測定装置
JP2009068995A (ja) マイクロアレイ装置
JP2024534332A (ja) 周期的にパターン化された表面のためのシーケンサ焦点品質メトリック及び焦点追跡
JP4728025B2 (ja) 細胞画像解析装置
CN114846132A (zh) 核酸序列测定装置、核酸序列测定方法以及计算机可读取的非临时性记录介质
JP4089916B2 (ja) 多細胞応答同時測定法
KR102048599B1 (ko) 판정 방법, 판정 장치, 판정 시스템 및 프로그램
JP4603591B2 (ja) 核酸分析装置
WO2012176775A1 (ja) 光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラム
EP1788523B1 (en) Image based correction for unwanted light signals in a specific region of interest
US20050219368A1 (en) Photography system
JP2006300795A (ja) 生体情報測定装置および方法、プログラム並びに記録媒体
WO2021179997A1 (zh) 生物芯片的检测方法、装置及设备
US20230184681A1 (en) Sample observation device and sample observation method
JP2009068996A (ja) マイクロアレイ装置及びマイクロアレイ解析方法
US20240100518A1 (en) Flow cell based motion system calibration and control methods
CN117859086A (zh) 用于周期性图案化表面的测序仪聚焦质量度量和聚焦跟踪
JP2006300796A (ja) 生体情報処理装置および方法、プログラム並びに記録媒体
Charlot Automation in image cytometry: continuous HCS and kinetic image cytometry

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination