WO2012176775A1

WO2012176775A1 - 光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラム

Info

Publication number: WO2012176775A1
Application number: PCT/JP2012/065637
Authority: WO
Inventors: 卓治片岡; 松原　正典
Original assignee: 浜松ホトニクス株式会社
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2012-12-27
Also published as: CN103635792B; EP2725345A1; CN103635792A; EP2725345A4; US20140152798A1; JP2013003091A; US10379334B2; EP2725345B1; JP5869239B2

Abstract

光測定装置１は、試料Ｓからの光を測定する光測定装置であって、試料Ｓからの光を含む二次元光像の動画像データを取得する動画像取得部４０と、動画像データに対して解析処理を行う解析処理部５１とを備える。解析処理部５１は、複数のウェル２１に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得部５２ａと、輝度値データから輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出部５２ｂと、ピーク値とボトム値とに基づいて輝度値の変化の状態を評価する評価値を計算し、評価値の繰り返し状態に基づいて複数の画素から解析の対象となる対象画素を特定する画素特定部５２ｃと、を含む。

Description

光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラム

　本発明は、心筋細胞から放出される光を測定する光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムに関する。

　創薬分野では、心筋細胞などの試料に投与した薬品の影響を、試料から放出された光に基づいて評価する場合がある。特許文献１には、試料からの光に対する測定感度を向上することが可能な光測定装置が開示されている。この装置では、光検出画像上でウェルに対応して設定される測定領域に対して、測定領域内での二次元の輝度値分布と所定の輝度値閾値とを比較して、測定領域から解析処理の対象となる解析領域を抽出する。そして解析領域内での輝度値のデータを解析データとして解析処理を行う。

特開２００７－２７８９８５号公報

　特許文献１に記載された光測定装置では、解析対象となる画素を特定する場合に、測定領域内での二次元の輝度値分布と所定の輝度値閾値とを比較して解析領域を抽出する。このため、心筋細胞と心筋細胞ではない細胞とが測定領域内にあり、いずれも輝度値閾値を超える輝度値を有する光を放出しているとき、心筋細胞の領域のみを解析領域として設定することが難しい。また、心筋細胞は拍動し、心筋細胞の領域は経時変化するので、心筋細胞の境界を設定することが困難である。

　上述した問題点に鑑みて、本発明は、心筋細胞を含む試料から放出された光を含む画像において、輝度値が経時的に変化する心筋細胞の像を構成する画素を特定可能な光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムを提供することを目的とする。

　本発明の一側面に係る光測定装置は、心筋細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された心筋細胞から放出された光を測定する光測定装置である。この装置は、試料ケースの保持部の内部に保持された試料から放出された光を含む試料ケースの二次元光像を検出して、二次元光像の動画像データを取得する動画像取得手段と、動画像データに対して解析処理を行う解析処理手段と、を備える。解析処理手段は、動画像データに含まれる保持部に対応する領域から、保持部に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得手段と、輝度値データから輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出手段と、輝度値データにおいて繰り返し現れる輝度値の経時変化を評価する評価値をピーク値とボトム値とに基づいて計算し、評価値に基づいて複数の画素から心筋細胞の像を構成する対象画素を特定する画素特定手段と、を含む。

　本発明の一側面に係る光測定方法は、心筋細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された心筋細胞から放出された光を測定する光測定方法である。この方法は、試料ケースの保持部の内部に保持された試料から放出された光を含む試料ケースの二次元光像を検出して、二次元光像の動画像データを取得する動画像取得ステップと、動画像データに対して解析処理を行う解析処理ステップと、を備える。解析処理ステップは、動画像データに含まれる保持部に対応する領域から、保持部に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得ステップと、輝度値データから輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出ステップと、輝度値データにおいて繰り返し現れる輝度値の経時変化を評価する評価値をピーク値とボトム値とに基づいて計算し、評価値に基づいて複数の画素から心筋細胞の像を構成する対象画素を特定する画素特定ステップと、を含む。

　本発明の一側面に係る光測定プログラムは、心筋細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された心筋細胞から放出された光を測定する光測定プログラムである。このプログラムは、コンピュータを、動画像取得手段によって取得された、試料ケースの保持部の内部に保持された試料から放出された光を含む試料ケースの二次元光像を検出した動画像データに対し、動画像データに含まれる保持部に対応する領域から、保持部に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得手段、輝度値データから輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出手段、輝度値データにおいて繰り返し現れる輝度値の経時変化を評価する評価値をピーク値とボトム値とに基づいて計算し、評価値に基づいて複数の画素から心筋細胞の像を構成する対象画素を特定する画素特定手段、として機能させる。

　光測定装置、光測定方法、或いは光測定プログラムによれば、試料ケースの保持部内に保持された心筋細胞を含む試料からの光を含む試料ケースの二次元光像を検出して、二次元の動画像データを取得する。次に、動画像データを構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得して、輝度値データから輝度値のピーク値とボトム値とを取得する。そして、ピーク値とボトム値とに基づいて、解析の対象となる心筋細胞の像を構成する画素を特定する。従って、経時的に輝度値が変化する光が繰り返し放出されている心筋細胞の像を構成する画素を特定することができる。

　本発明の一側面に係る光測定装置は、評価値が、ピーク値とボトム値との差分により得られる輝度値の振幅であってもよい。これによれば、一定の輝度値を有する光が放出されている領域の画素では輝度値の振幅はゼロであるので、所定の振幅閾値を設定することにより、閾値以上の輝度値の振幅を有する画素のみを特定することができる。従って、輝度値が経時的に変化する光が繰り返し放出されている心筋細胞の像を構成する画素を好適に特定することができる。

　本発明の一側面に係る光測定装置は、評価値が、ボトム値に対するピーク値の比率により得られる輝度値の変化率であってもよい。これによれば、一定の輝度値を有する光が放出されている領域の画素では輝度値の変化率は１であるので、所定の変化率閾値を設定することにより、閾値以上の輝度値の変化率を有する画素のみを特定することができる。従って、輝度値が経時的に変化する光が繰り返し放出されている心筋細胞の像を構成する画素を好適に特定することができる。

　本発明の一側面に係る光測定装置は、画素特定手段が、予め取得された閾値を評価値が超えた回数に基づいて、対象画素を特定してもよい。これによれば、輝度値が経時的に変化する光が繰り返し放出されている心筋細胞の像を構成する画素をより好適に特定することができる。

　本発明の一側面に係る光測定装置は、画素特定手段が、評価値の平均値と予め取得された閾値とを比較して、対象画素を特定してもよい。これによれば、経時的に輝度値が変化する光が繰り返し放出されている画素をより好適に特定することができる。

　本発明の一側面に係る光測定装置は、解析処理手段が、対象画素の輝度値データを解析データとして、解析処理を行うデータ処理手段をさらに含んでいてもよい。これによれば、画素特定部により特定された心筋細胞の像を構成する画素の輝度値データを用いて評価を行うことができる。従って、心筋細胞から放出された光に対する測定感度を向上させた解析処理を行うことができる。

　本発明による光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムによれば、試料から放出された光を含む画像において、輝度値が経時的に変化する心筋細胞の像を構成する画素を特定することができる。

光測定装置の一実施形態を模式的に示す図である。マイクロプレートの構成の一例を示す図である。図２に示したマイクロプレートを側面視した断面構造を示す図である。データ解析装置の構成の一例を示す図である。光測定方法の一実施形態を示す図である。輝度値データの例を説明するための図である。解析結果の表示の一例を示す図である。記録媒体に記録されたプログラムを実行するためのコンピュータのハードウェア構成を示す図である。記録媒体に記録されたプログラムを実行するためのコンピュータを示す図である。光測定方法の一適用例を説明するための図である。光測定方法の他の適用例を説明するための図である。光測定方法のさらに他の適用例を説明するための図である。光測定方法のさらに他の適用例を説明するための図である。光測定方法のさらに他の適用例を説明するための図である。

　以下、添付図面を参照しながら光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムの実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

　図１は、光測定装置１の一実施形態の構成を模式的に示す図である。図２は、マイクロプレート２０の構成の一例を示す図である。図３は、図２に示したマイクロプレート２０を側面視した断面の構造を示す図である。一実施形態の光測定装置１は、試料ケースの一例としてマイクロプレート２０を用いてもよい。光測定装置１は、マイクロプレート２０によって保持された状態で測定位置Ｐに配置された試料Ｓ（図３参照）からの蛍光を測定する装置である。

　試料Ｓは、心筋細胞を含む細胞である。一実施形態の光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムは、蛍光測定以外にも、例えば燐光や発光など、試料からの光を測定する光測定に一般に適用可能である。以下、光測定装置１の構成について説明する。

　図１に示すように、光測定装置１は、データ取得装置１０と、励起光源３０と、データ解析装置５０とを備えて構成されている。データ取得装置１０は、暗箱１５と、動画像取得部４０とを有している。暗箱１５は、蛍光測定の対象となる心筋細胞を含む試料Ｓを保持したマイクロプレート２０をその内部に収容する。動画像取得部４０は、暗箱１５の内部に設置されて測定位置Ｐに配置された試料Ｓからの蛍光を測定する。

　図２及び図３に示すように、一実施形態の試料ケースとして用いられているマイクロプレート２０は、複数のウェル（保持部）２１が二次元アレイ状に並設された板状部材である。複数のウェル２１のそれぞれは、試料Ｓを保持可能な構成を有している。例えば、図２に示すように、複数のウェル２１として、８×１２＝９６個のウェル２１が二次元アレイ状に配置されている。ウェル２１の形状は円形でも矩形状でもよい。マイクロプレート２０の底面２２は、試料Ｓに照射される蛍光測定用の励起光及び試料Ｓから放出される蛍光を透過可能な材質によって形成されている。一般に光測定装置１においては、マイクロプレート２０の底面２２は、測定対象となる試料Ｓからの光を透過可能な材質によって形成されていればよい。

　暗箱１５内には、マイクロプレート２０が設置されている。マイクロプレート２０は、蛍光観察用の開口を有するマイクロプレートホルダ１１によって保持されている。暗箱１５内には、マイクロプレート搬送機構１２が設置されている。マイクロプレート搬送機構１２は、マイクロプレート２０を保持したホルダ１１を、暗箱１５内で所定の方向に搬送する。所定の方向は、図１中においては、右側から左側へと向かう方向である。

　搬入側マイクロプレートストッカー１３は、マイクロプレート２０の搬送方向に対して搬入側となる暗箱１５の一方側に設置されている。搬入側マイクロプレートストッカー１３は、試料Ｓが保持された測定前のマイクロプレート２０を所定枚数（例えば、２５枚）ストックする。搬出側マイクロプレートストッカー１４は、マイクロプレート２０の搬送方向に対して搬出側となる暗箱１５の他方側に設置されている。搬出側マイクロプレートストッカー１４は、測定後のマイクロプレート２０をストックする。

　このような構成において、搬入側マイクロプレートストッカー１３から暗箱１５内へと搬入されたマイクロプレート２０は、マイクロプレートホルダ１１によって保持されるとともに搬送機構１２によって搬送される。そして、マイクロプレート２０は測定位置Ｐで一旦停止させられ、この状態で、マイクロプレート２０によって保持された試料Ｓに対して必要な光測定が行われる。測定完了後、マイクロプレート２０は再び搬送機構１２によって搬送され、搬出側マイクロプレートストッカー１４へと搬出される。図１では、マイクロプレート２０を搬入、搬送、搬出するための搬送機構１２、及びストッカー１３、１４の具体的な構成の図示を省略している。

　分注装置１６は、測定位置Ｐの上方に設置されている。分注装置１６は、マイクロプレート２０のウェル２１内に試薬等を注入する。測定位置Ｐは、蛍光測定の実行時にマイクロプレート２０、及びそれに保持された試料Ｓが配置される位置である。動画像取得部４０は、ウェル２１内に収容された試料Ｓからマイクロプレート２０の底面２２を介して放出される蛍光を検出する。

　動画像取得部４０は、二次元光像の動画像データを取得する動画像取得手段である。動画像取得部４０は、マイクロプレート２０のウェル２１内に保持された試料Ｓからの光を含むマイクロプレート２０の複数のウェル２１からの光像を含む二次元光像を検出する。この二次元光像は、マイクロプレート２０のウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された光を含んでいる。動画像取部４０は、試料Ｓから放出される蛍光による二次元の光検出画像である蛍光画像を取得可能な撮像装置４５を有している。動画像取得部４０は、複数の画素が二次元に配列された二次元画素構造を有している。この撮像装置４５としては、例えば高感度のＣＣＤカメラやＣＭＯＳイメージカメラを用いることができる。必要があれば、動画像取得部４０は、撮像装置４５の前段に配置されるイメージ増倍管、リレーレンズ等を有していてもよい。

　導光光学系４１は、マイクロプレート２０が配置される測定位置Ｐと、撮像装置４５との間に設置されている。導光光学系４１は、複数のウェル２１のそれぞれに試料Ｓが保持されたマイクロプレート２０を底面２２側からみた二次元光像を撮像装置４５へと導く光学系である。導光光学系４１の具体的な構成については、マイクロプレート２０及び撮像装置４５の構成等に応じ、必要な機能（例えば集光機能、光像縮小機能等）を実現可能な光学素子によって適宜構成することができる。そのような光学素子としては、一細胞あたり一画素以上の分解能を与える光学縮小機能をもつ光学素子であればよく、例えばテーパファイバがある（特開２００１－１８８０４４号公報参照）。

　光学フィルタ部４２は、導光光学系４１と撮像装置４５との間に設置されている。光学フィルタ部４２は、導光光学系４１と撮像装置４５との間に、必要に応じて蛍光の導光光路上への光学フィルタの配置、切換等を行う。ただし、このような光学フィルタ部４２については、不要であれば設けなくてもよい。

　光測定装置１は、励起光源３０を有する。励起光源３０は、試料Ｓに対して蛍光測定用の励起光を供給するための励起光供給手段である。励起光源３０は、蛍光測定の対象となる試料Ｓの種類、試料Ｓに照射する励起光の波長等に応じて適宜構成することができる。励起光源３０は、例えば、光を供給する照明光源と、励起光の波長の選択、切換を行うための光学フィルタ部とによって構成することができる。試料Ｓに対して行われる光測定の種類により、励起光の供給が不要な場合には、光測定装置１は励起光源３０を設けない構成としてもよい。

　図１に示すように、励起光源３０は、暗箱１５に対して外側に配置されている。励起光源３０から供給される励起光は、励起光供給用ライトガイド３１及び導光光学系４１を介して試料Ｓへと照射される。このような構成では、導光光学系４１は、マイクロプレート２０及び試料Ｓからの二次元光像を撮像装置４５へと導くとともに、励起光源３０からの励起光を試料Ｓへと導くことが可能な光学系である。このような導光光学系４１は、例えば、マイクロプレート２０からの蛍光を通過させるとともに、励起光源３０からの励起光を反射させるダイクロイックミラー等を用いて構成することができる。なお、図１においては、導光光学系４１における蛍光及び励起光の光路を、それぞれ実線及び破線によって模式的に示している。

　光測定装置１は、データ解析装置５０を有する。データ解析装置５０は、動画像取得部４０によって取得された光検出画像を含む動画像データに対して解析処理を行う解析処理手段である。データ解析装置５０は、データ取得装置１０及び励起光源３０の各部の動作を制御することによって、光測定装置１における試料Ｓに対する蛍光測定を制御する。図１に示すように、データ解析装置５０には、測定結果等を表示する表示装置６１と、データの入力や蛍光測定に必要な指示の入力等に用いられる入力装置６２とが接続されている。

　以上の構成において、蛍光測定用の励起光が試料Ｓに照射される。励起光は、ライトガイド３１及び導光光学系４１を介して、励起光源３０から供給されている。試料Ｓは、マイクロプレート２０のウェル２１内に保持され、暗箱１５内で測定位置Ｐに配置されている。そして、試料Ｓから放出された蛍光を含む二次元光像は、導光光学系４１を介して撮像装置４５へと導かれ、撮像装置４５によって所定のフレームレートで二次元光像の動画像データが取得される。動画像取得部４０によって取得された蛍光画像を含む動画像データは、データ解析装置５０へと送られる。そして、データ解析装置５０は、入力された動画像データから心筋細胞の像を構成する画素を特定し、評価等に必要な解析処理を行う。

　試料ケースは、上述したマイクロプレート２０に限定されるものではない。複数の試料Ｓが、試料ケースとしてシャーレのようなディッシュに保持されてもよい。さらに、光測定装置１は、顕微鏡を介してシャーレに保持された試料を観察する装置構成であってもよい。

　図４は、光測定装置１が備えるデータ解析装置５０の概略構成を示す図である。

　データ解析装置５０は、動画像データから画素毎の輝度値データを取得し、その輝度値データに基づいて解析対象となる心筋細胞の像を構成する対象画素を特定して、対象画素に対して所定の解析処理を実施するための情報処理装置である。この動画像データは、上述したウェル２１内に保持された試料Ｓから放出される光を含むマイクロプレート２０を撮影した画像を、デジタルデータに変換したものである。動画像データは、通信ネットワークやＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、半導体メモリ等の記録媒体を介してデータ解析装置５０に入力されてもよい。

　データ解析装置５０は、機能的構成要素として、解析処理部５１と閾値記録部５４とを備える。データ解析装置５０は、データ取得装置１０、表示装置６１及び入力装置６２に接続されている。

　解析処理部５１は、機能的構成要素として、領域特定部５２とデータ処理部５３とを備えている。解析処理部５１は、データ取得装置１０の動画像取得部４０によって取得された試料Ｓの動画像データから心筋細胞などの細胞の像を構成する対象画素を特定する。解析処理部５１は、対象画素が有する輝度値データを解析データとして、解析処理を行う解析処理手段である。解析処理部５１は、閾値記録部５４と接続される。

　領域特定部５２は、輝度値データ取得部（輝度値データ取得手段）５２ａと、輝度値抽出部（輝度値抽出手段）５２ｂと、画素特定部（画素特定手段）５２ｃとを含んでいる。領域特定部５２は、動画像データにおける画素が有する輝度値の経時変化の波形の特徴値に基づき、ウェル２１に対応する測定領域から、心筋細胞などの細胞の像を構成する対象画素を特定する。この特徴値には、例えば輝度値の経時変化の波形のピーク値、ボトム値等がある。領域特定部５２は、データ処理部５３に接続されている。

　閾値記録部５４は、対象画素を特定するときに用いられる閾値を記録している。閾値には、例えばピーク値閾値、振幅閾値、及び変化率閾値などがある。閾値記録部５４は、領域特定部５２から参照可能に構成されている。

　輝度値データ取得部５２ａは、動画像取得部４０から入力された動画像データに含まれる複数のウェル２１に対応する領域から、複数のウェル２１に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値データを取得する。輝度値データは、画素が有する輝度値の経時変化を示す。輝度値データ取得部５２ａは、ウェル２１の像が含まれた領域を１つの測定領域として、その測定領域を構成する画素毎に輝度値データを取得する。輝度値データ取得部５２ａにおいて取得された輝度値データは、輝度値抽出部５２ｂに出力される。

　輝度値抽出部５２ｂは、輝度値データ取得部５２ａから入力された画素の輝度値データに基づいてピーク値とボトム値とを抽出する。ピーク値とボトム値とは、画素特定部５２ｃに出力される。

　画素特定部５２ｃは、輝度値抽出部５２ｂから入力されたピーク値とボトム値とに基づいて、心筋細胞の像を構成する対象画素を特定する。対象画素の情報は、データ処理部５３に出力される。対象画素を特定する方法は、後に詳細に説明する。

　データ処理部（データ処理手段）５３は、位相補正部５３ａと輝度値データ処理部５３ｂとを含んでいる。データ処理部５３は、領域特定部５２において特定された対象画素を参照し、対象画素が有する輝度値データを解析データとして、心筋細胞の像を構成する対象画素について解析処理を行う。データ処理部５３は、領域特定部５２に接続されている。

　位相補正部５３ａは、輝度値データにおいて、画素毎の輝度値データの位相をそろえる為に、ボトム値からピーク値に変化するタイミングを補正する。位相補正部５３ａにより補正された輝度値データは、輝度値データ処理部５３ｂに出力される。

　輝度値データ処理部５３ｂは、位相補正部５３ａにより位相補正された輝度値データを、例えばウェル２１毎に処理する。輝度値データ処理部５３ｂにより処理されたウェル２１毎の輝度値データは、表示装置６１に出力される。

　次に、一実施形態の光測定装置１によって実行される光測定方法を説明すると共に、一実施形態の光測定方法について詳細に説明する。ここでは、動画像データから心筋細胞の像を構成する対象画素を特定する工程を説明する。図５は、一実施形態の光測定方法の主要な工程を説明するための図である。

　工程Ｓ１０は、データ取得装置１０の動画像取得部４０により実行される。工程Ｓ１では、二次元光像の動画像データを取得する（動画像取得ステップ）。二次元光像は、データ取得装置１０を用いてマイクロプレート２０のウェル２１の内部に保持された心筋細胞を含む試料Ｓからの光を含む像である。動画像データとは、所定の時間間隔で検出された二次元画像データを経時的に並べた二次元画像データの集まりである。この動画像データにより、二次元画像を構成する各画素の輝度値の時間変化を抽出することが可能となる。

　はじめに心筋細胞を含む試料Ｓがウェル２１内に保持されたマイクロプレート２０の二次元画像を動画像取得部４０の撮像装置４５で検出して、動画像データを取得する。動画像データは、予め設定された時間の間だけ取得される。動画像データの取得を開始するタイミングは、ウェル２１の試料Ｓに投薬により刺激を与える前であってもよい。ウェル２１の試料Ｓに刺激を与えた後であってもよい。動画像データの取得中に投薬により刺激を与えてもよい。取得された動画像データは、データ取得装置１０からデータ解析装置５０へ入力される。

　工程Ｓ１１は、データ解析装置５０により実行される。工程Ｓ１１では、工程Ｓ１０でデータ取得装置１０により取得された動画像データに対して解析処理を行う（解析処理ステップ）。工程Ｓ１１は、解析の対象となる対象画素を特定するステップ（領域特定ステップ）と対象画素について解析処理を実施するステップ（データ処理ステップ）とを有する。

　工程Ｓ２０は、データ解析装置５０の領域特定部５２により実行される。工程Ｓ２０では、工程Ｓ１０で取得された動画像データの画素における輝度値データに基づいて、解析の対象となる対象画素を特定する。工程Ｓ２０は、輝度値データ取得ステップＳ２１と、輝度値抽出ステップＳ２２と、画素特定ステップＳ２３とを有する。輝度値データ取得ステップＳ２１では、画素毎の輝度値データを取得する。輝度値抽出ステップＳ２２では、各画素の輝度値データからピーク値とボトム値とを取得する。画素特定ステップＳ２３では、ピーク値とボトム値とに基づいて対象画素を特定する。

　工程Ｓ２１は、輝度値データ取得部５２ａにより実行される。工程Ｓ２１では画素毎の輝度値データを取得する。繰り返し現れる輝度値の経時変化の具体例について説明する。繰り返し現れる輝度値の経時変化の具体例は、図６に示された５つのグラフの輝度値の経時変化に例示される。図６（ａ）を参照すると、輝度値データには輝度値が一定の周期で変化する場合がある。このとき周期Ｃ１は１秒程度である。一方、輝度値データには輝度値のピークが現われる周期が時間経過とともに変化する場合がある。図６（ｂ）は輝度値のピークが現われる周期が時間経過とともに長くなる場合であり、周期Ｃ２は周期Ｃ１よりも長い。図６（ｃ）は輝度値のピークが現われる周期が時間経過とともに短くなる場合であり、周期Ｃ３は周期Ｃ１よりも短い。図６（ｄ）は輝度値のピークが現われる周期が不規則に変化する場合である。図６（ｅ）を参照すると、ボトム値からピーク値に変化し、再びボトム値に戻るまでの時間ｔ１、ｔ２、ｔ３が時間経過と共に長くなる場合を示す。繰り返し現れる輝度値の経時変化は、図６に例示されるものに限定されない。

　図５を参照すると、工程Ｓ２２は、輝度値抽出部５２ｂにより実行される。工程Ｓ２２では、工程Ｓ２１において取得された輝度値データからピーク値とボトム値を抽出する。ピーク値は、一つの画素における輝度値データの経時変化から、複数個抽出される。ボトム値は、一つの画素における輝度値データの経時変化から、複数個抽出される。

　工程Ｓ２３では、画素特定部５２ｃにより実行される。工程Ｓ２３では、工程Ｓ２２において取得されたピーク値及びボトム値に基づいて、心筋細胞の像を構成する対象画素を特定する。繰り返し現われる輝度値の経時変化の状態を評価する評価値を計算する。この評価値には、ピーク値、輝度値の振幅、及び輝度値の変化率（レシオ値）などがある。図６（ａ）を参照すると、ピーク値とは、輝度値データに現われるピークの絶対値Ｌである。ボトム値とは、輝度値データに現われるボトムの絶対値Ｂである。ボトム値は予め取得されたバックグラウンドの輝度値データをボトム値として用いてもよい。輝度値の振幅とは、ピーク値とボトム値との差分（Ｌ－Ｂ）である。輝度値の変化率とは、ボトム値に対するピーク値の比率（Ｌ／Ｂ）である。

　対象画素の特定は、上記評価値のうち、少なくとも一つの評価値が用いられる。例えば対象画素の特定に用いられる評価値として、以下のような（ｉ）～（ｖｉ）の組み合わせがある。
　（ｉ）輝度値の振幅のみを評価値として用いる。
　（ｉｉ）輝度値の変化率のみを評価値として用いる。
　（ｉｉｉ）ピーク値と、輝度値の振幅とを評価値として用いる。
　（ｉｖ）ピーク値と、輝度値の変化率とを評価値として用いる。
　（ｖ）輝度値の振幅と、輝度値の変化率とを評価値として用いる。
　（ｖｉ）ピーク値と、輝度値の振幅と、輝度値の変化率とを評価値として用いる。

　評価値と閾値との比較では、評価値が予め設定された閾値を超えた回数に基づいて、対象画素を特定する。例えば、一の画素が有する複数の評価値が、閾値をｎ回（ｎは１以上の整数）超えた場合に、当該一の画素は対象画素として特定される。評価値の平均値と予め設定された閾値とを比較して、対象画素を特定してもよい。例えば、一の画素が有する複数の評価値の平均値を算出する。該平均値が閾値を超えた場合に、当該一の画素は対象画素として特定される。このように、繰り返し現れる輝度値の経時変化が評価値に基づいて評価される。

　上記（ｉｉｉ）～（ｖｉ）のように対象画素の特定に複数の評価値を用いる場合は、対象画素の特定に用いられた全ての評価値が閾値により規定された条件を満たすときに、当該画素が対象画素として特定される。

　工程Ｓ３０は、データ処理部５３により実行される。工程Ｓ３０では、工程Ｓ２０において特定された心筋細胞の像を構成する対象画素について解析処理を実施する。工程Ｓ３０は、補正ステップＳ３１と、輝度値データ処理ステップＳ３２とを有する。補正ステップＳ３１では、対象画素の輝度値データを補正する。輝度値データ処理ステップＳ３２では、正された輝度値データに基づいてデータ処理を行う。

　工程Ｓ３１は、位相補正部５３ａにより実行される。工程Ｓ３１ではボトム値からピーク値に変化するタイミングを補正することにより、補正輝度値データを算出する。心筋細胞の位置や投薬により心筋細胞から放射される輝度値の経時変化では、刺激の伝わり方により反応が現われるタイミングにずれが生じる場合がある。例えば、刺激の中心から離れた位置にある心筋細胞の像を構成する画素に反応が現われるタイミングは、刺激の中心に近い位置にある画素に反応が現われるタイミングよりも遅い。従って、位相補正部５３ａは、ボトム値からピーク値に変化するタイミングを複数の画素間で合わせるように補正する。これにより、測定感度を向上させることができる。タイミングのずれが予め設定された時間の範囲内である場合には、工程Ｓ３１を省略してもよい。

　工程Ｓ３２は、輝度値データ処理部５３ｂにより実行される。工程Ｓ３２では、補正された輝度値データに基づいて輝度値データの処理が行われる。この処理では、例えば、ウェル２１における対象画素の輝度値データを二次元画像データ毎に平均した平均輝度値データを各時間で算出する処理が実行される。これにより、特定の時間における細胞からの放出される光の平均輝度を算出することができる。工程Ｓ３１で位相補正された補正輝度値データを用いて、各時間における平均輝度値データを算出するので、測定感度を向上させることができる。ウェル２１中に複数の心筋細胞がある場合は、対象画素が構成する心筋細胞の領域毎に対象画素の輝度値データを平均した平均輝度データを算出してもよい。

　上述した各工程を実施することにより、ウェル２１毎または心筋細胞領域毎の平均輝度値データが得られる。ウェル２１毎の解析結果を表示装置６１に表示する場合には、図７に示すように画面を二次元に配列された複数の表示領域（図７では８×１２＝９６個の表示領域）に区分し、そのそれぞれに対応するウェル２１での平均輝度値データの時間変化を表示してもよい。

　工程Ｓ３２では、ウェル２１毎の輝度値の変化率を算出してもよい。ウェル２１毎の輝度値の変化率を算出するときには、ウェル２１における対象画素の輝度値データを平均化する。次に、平均化された輝度値データからピーク値とボトム値とを抽出して、輝度値の変化率を算出してもよい。画素毎の輝度値データから画素毎のピーク値とボトム値とを抽出して、画素毎の輝度値の変化率を算出した後に、画素毎の輝度値の変化率を平均化してもよい。

　上述した光測定方法は、例えば心筋細胞の評価において、心筋細胞の拍動周期の測定に用いることができる。

　以下、コンピュータを光測定装置１として動作させる光測定プログラムについて説明する。

　一実施形態の光測定プログラムは、記録媒体に格納されて提供される。記録媒体としては、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、あるいはＲＯＭ等の記録媒体、あるいは半導体メモリ等が例示される。

　図８は、記録媒体に記録されたプログラムを実行するためのコンピュータのハードウェア構成を示す図である。図９は、記録媒体に記憶されたプログラムを実行するためのコンピュータの図である。コンピュータとして、ＣＰＵを具備しソフトウエアによる処理や制御を行うサーバ装置、パーソナルコンピュータ等の各種データ処理装置を含む。

　図８に示すように、コンピュータ７０は、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ装置、ＣＤ－ＲＯＭドライブ装置、ＤＶＤドライブ装置等の読取装置７２と、オペレーティングシステムを常駐させた作業用メモリ（ＲＡＭ）７３と、記録媒体７１に記憶されたプログラムを記憶するメモリ７４と、ディスプレイといった表示装置７５と、入力装置であるマウス７６及びキーボード７７と、データ等の送受を行うための通信装置７８と、プログラムの実行を制御するＣＰＵ７９とを備えている。コンピュータ７０は、記録媒体７１が読取装置７２に挿入されると、読取装置７２から記録媒体７１に格納された光測定プログラムにアクセス可能になり、当該光測定プログラムによって、一実施形態の光測定装置１として動作することが可能になる。

　図９に示すように、光測定プログラムは、搬送波に重畳されたコンピュータデータ信号７９としてネットワークを介して提供されるものであってもよい。この場合、コンピュータ７０は、通信装置７８によって受信した光測定プログラムをメモリ７４に格納し、当該光測定プログラムを実行することができる。

　一実施形態の光測定装置１及び光測定方法は、複数のウェル２１に対応する領域毎の二次元光像の動画像データを取得し（Ｓ１０）、動画像データを構成する複数の各画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得し（Ｓ２１）、輝度値データから輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する（Ｓ２２）。そして、光測定装置１及び光測定方法は、ピーク値とボトム値とに基づいて輝度値の変化の状態を評価する評価値を計算し、この評価値の繰り返し状態に基づいて複数の画素から解析の対象となる心筋細胞の像を構成する対象画素を特定する（Ｓ２３）。このように、光測定装置１及び光測定方法は、画素が有する輝度値の経時変化に基づいて対象領域を特定する。従って、光測定装置１及び光測定方法は、経時的に輝度値が変化する光が繰り返し放出されている心筋細胞の像を構成する画素を特定することができる。さらに、光測定装置１及び光測定方法は、輝度値の経時変化を示す輝度値データに基づいて対象画素を特定しているので、心筋細胞のように拍動により細胞の領域が変化するときであっても、心筋細胞の境界を容易に特定することができる。

　光測定装置１では、評価値がピーク値とボトム値との差分により得られる輝度値の振幅であってもよい。この評価値によれば、一定の輝度値である領域の画素では輝度値の振幅はゼロであるので、振幅の閾値を設定することにより、閾値以上の輝度値の振幅を有する画素のみを特定することができる。従って、輝度値が経時的に変化する光が繰り返し放出されている心筋細胞の像を構成する画素を好適に特定することができる。

　光測定装置１は、評価値がボトム値に対するピーク値の比率により得られる輝度値の変化率であってもよい。この評価値によれば、一定の輝度値である領域の画素では輝度値の変化率は１であるので、変化率の閾値を設定することにより、閾値以上の輝度値の変化率を有する画素のみを特定することができる。従って、輝度値が経時的に変化する光が繰り返し放出されている心筋細胞の像を構成する画素を好適に特定することができる。

　光測定装置１では、画素特定部５２ｃが予め取得された閾値を評価値が超えた回数に基づいて対象画素を特定してもよい。この方法によれば、輝度値が経時的に変化する光が繰り返し放出されている心筋細胞の像を構成する画素をより好適に特定することができる。

　光測定装置１では、画素特定部５２ｃが評価値の平均値と予め取得された閾値とを比較して対象画素を特定してもよい。輝度値が経時的に変化する光が繰り返し放出されている心筋細胞の像を構成する画素をより好適に特定することができる。

　光測定装置１では、解析処理部５１が対象画素の輝度値データを解析データとして、解析処理を行うデータ処理部５３をさらに含んでいてもよい。この構成によれば、画素特定部５２ｃにより選択された画素の輝度値データを用いて試料Ｓの評価を行うことができる。従って、試料Ｓからの光に対する感度を向上させた解析処理を行うことができる。すなわち、画素毎の輝度値データに基づいて類似した経時変化をする輝度値データを有する画素を特定して平均を算出するので、一のウェル２１が占める領域を一つの解析領域とする場合よりも、心筋細胞の像を構成する画素からの光に対する感度を向上させた解析処理を行うことができる。

　次に、光測定装置１を細胞の評価に用いる例を説明する。

　一実施形態では、評価値にはピーク値、輝度値の振幅、及び輝度値の変化率を用いた。評価値には輝度値の周期を用いてもよい。評価値には複数の対象画素により構成される領域が有する面積の経時変化を用いてもよい。また、一実施形態では、ピーク値、輝度値の振幅、及び輝度値の変化率、輝度値の周期及び面積の経時変化から複数個の評価値を組み合わせて解析処理を行ってもよい。さらに、二つの輝度値データが表示された画像に基づいて得られる、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）反応の有無を対象画素の特定に用いてもよい。

　図１０（ａ）に示されるように、測定領域Ｒ１の細胞の有無を判定するときには、例えばピーク値を評価値として用いることができる。測定領域Ｒ１には心筋細胞の領域Ａ１、心筋細胞ではない細胞の領域Ａ２、及び複数のゴミの領域Ａ３がある。測定領域Ｒ１に含まれる複数の正方形の一領域は、一画素に対応する。このとき、それぞれの要素が含まれた画素の輝度値に対して、それぞれの要素が含まれた画素の数を整理すると図１０（ｂ）を得る。グラフＧ１は心筋細胞の領域Ａ１における輝度値の度数を示す。グラフＧ２は心筋細胞ではない細胞の領域Ａ２における輝度値の度数を示す。所定の輝度値の範囲Ｓ１を設定することにより、測定領域Ｒ１から心筋細胞の領域Ａ１、及び心筋細胞ではない細胞の領域Ａ２の画像に含まれた画素を特定することができる。

　図１１（ａ）に示されるように、異なる種類の細胞を含んだ領域において、例えば心筋細胞を特定するときには、輝度値の振幅又は輝度値の変化率を評価値として用いることができる。測定領域Ｒ２には、心筋細胞の領域Ａ１、心筋細胞ではない細胞の領域Ａ２がある。この心筋細胞は拍動する。この拍動に対応して、図１１（ｂ）のグラフＧ５に示されるように、領域Ａ１に含まれる画素の輝度値は時間的に変化する。一方、心筋細胞ではない細胞は拍動しないので、グラフＧ６に示されるように輝度値は一定である。従って、輝度値の振幅又は輝度値の変化率を用いることにより、測定領域Ｒ２から心筋細胞の領域Ａ１の画像に含まれる画素を特定することができる。心筋細胞は、一定の周期Ｃ１で拍動するので、輝度値の周期を用いることにより、さらに確実に心筋細胞の領域Ａ１の画像に含まれる画素を特定することができる。

　図１２（ａ）に示されるように、複数の心筋細胞を含んだ領域Ｒ３において、所望の心筋細胞の領域Ａ１ａを特定するときには、輝度値の周期を評価値として用いることができる。図１２（ｂ）のグラフＧ７は、心筋細胞の領域Ａ１ａに含まれる画素の輝度値の経時変化を示し、グラフＧ８は心筋細胞の領域Ａ１ｂに含まれる画素の輝度値の経時変化を示す。例えば心筋細胞の領域Ａ１ａにおける輝度値の周期Ｃ８と、心筋細胞の領域Ａ１ｂにおける輝度値の周期Ｃ９とは異なっている。従って、周期Ｃ８と周期Ｃ９とを比較することにより、所望の心筋細胞を特定することができる。この方法よれば、心筋細胞ではあるが、解析には適さないものを排除することができる。この方法は、より好適な解析対象を特定するスクリーニングの実施に用いることができる。

　複数の互いに異なる心筋細胞、及び心筋細胞でない細胞を含んだ領域において、各細胞を判別するときには、ピーク値と、輝度値の振幅又は輝度値の変化率のいずれか一方と、輝度値の周期と、を評価値として、組み合わせて用いることができる。ピーク値を用いることにより、所定のピーク値閾値を超える細胞を特定することができる。すなわち、染色状態のよい細胞を特定することができる。輝度値の振幅又は輝度値の変化率のいずれか一方を用いることにより、心筋細胞と心筋細胞ではない細胞とを判別することができる。そして、輝度値の周期を用いることにより、一の心筋細胞と他の心筋細胞とを判別することができる。

　図１３（ａ）に示されるように、測定領域Ｒ４から解析対象となり得ないゴミの領域Ａ３ａ、Ａ３ｂ、及び背景を特定するときには、ピーク値、輝度値の振幅、輝度値の変化率、及び輝度値の周期を評価値として用いることができる。例えば、図１３（ｂ）を参照すると、領域Ａ３ａの輝度値データであるグラフＧ９は飽和しているので、解析対象とはなり得ない。従って、領域Ａ３ａはゴミ又は背景として排除される。領域Ａ３ｂの輝度値データであるグラフＧ１０は、ピーク値閾値Ｇ１１を下回るので、解析対象とはなり得ない。従って、領域Ａ３ｂはゴミ又は背景として排除される。

　図１４に示されるように、測定領域Ｒ５から解析対象となり得ないゴミの領域Ａ３ａ、Ａ３ｂを特定するときには、対象画素が構成する領域の面積を評価値として用いることができる。例えば、対象画素として特定された複数の画素ｅ１～ｅ２４からなる領域Ａ３ｂは、心筋細胞の領域Ａ１と比較して極端に大きい面積を有している。このような極端に大きい面積を有している領域Ａ３ｂは、心筋細胞等である可能性は低い。従って、解析対象となり得ないゴミの領域Ａ３ｂを特定することができる。

　心筋細胞の像を構成する対象画素の輝度値データを基に評価するとき、光測定装置１は輝度値の周期に基づいて心筋細胞の拍動数を検出してもよい。光測定装置１は輝度値の変化率と周期とに基づいて不整脈の状態を判定してもよい。光測定装置１は輝度値の変化率と周期とに基づいて細胞に投与された薬剤の効果を判定してもよい。

１…光測定装置、２０…マイクロプレート、２１…ウェル、４０…動画像取得部、５０…データ処理装置、５１…解析処理部、５２ａ…輝度値データ取得部、５２ｂ…輝度値抽出部、５２ｃ…画素特定部、Ｓ…試料。

Claims

　心筋細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された前記心筋細胞から放出された光を測定する光測定装置であって、
　前記試料ケースの前記保持部の内部に保持された前記試料から放出された光を含む前記試料ケースの二次元光像を検出して、前記二次元光像の動画像データを取得する動画像取得手段と、
　前記動画像データに対して解析処理を行う解析処理手段と、
を備え、
　前記解析処理手段は、
　前記動画像データに含まれる前記保持部に対応する領域から、前記保持部に対応する領域を構成する前記複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得手段と、
　前記輝度値データから前記輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出手段と、
　前記輝度値データにおいて繰り返し現れる前記輝度値の経時変化を評価する評価値を前記ピーク値と前記ボトム値とに基づいて計算し、前記評価値に基づいて前記複数の画素から前記心筋細胞の像を構成する対象画素を特定する画素特定手段と、
を含むことを特徴とする光測定装置。
　前記評価値は、前記ピーク値と前記ボトム値との差分により得られる輝度値の振幅であることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
　前記評価値は、前記ボトム値に対する前記ピーク値の比率により得られる輝度値の変化率であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の光測定装置。
　前記画素特定手段は、前記評価値が予め取得された閾値を超えた回数に基づいて、前記対象画素を特定することを特徴とする請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の光測定装置。
　前記画素特定手段は、前記評価値の平均値と予め取得された閾値とを比較して、前記対象画素を特定することを特徴とする請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の光測定装置。
　前記解析処理手段は、前記対象画素の前記輝度値データを解析データとして、解析処理を行うデータ処理手段をさらに含むことを特徴とする請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の光測定装置。
　心筋細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された前記心筋細胞から放出された光を測定する光測定方法であって、
　前記試料ケースの前記保持部の内部に保持された前記試料から放出された光を含む前記試料ケースの二次元光像を検出して、前記二次元光像の動画像データを取得する動画像取得ステップと、
　前記動画像データに対して解析処理を行う解析処理ステップと、
を備え、
　前記解析処理ステップは、
　前記動画像データに含まれる前記保持部に対応する領域から、前記保持部に対応する領域を構成する前記複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得ステップと、
　前記輝度値データから前記輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出ステップと、
　前記輝度値データにおいて繰り返し現れる前記輝度値の経時変化を評価する評価値を前記ピーク値と前記ボトム値とに基づいて計算し、前記評価値に基づいて前記複数の画素から前記心筋細胞の像を構成する対象画素を特定する画素特定ステップと、
を含むことを特徴とする光測定方法。
　心筋細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された前記心筋細胞から放出された光を測定する光測定プログラムであって、
　コンピュータを、
　動画像取得手段によって取得された、前記試料ケースの前記保持部の内部に保持された前記試料から放出された光を含む前記試料ケースの二次元光像を検出した動画像データに対し、前記動画像データに含まれる前記保持部に対応する領域から、前記保持部に対応する領域を構成する前記複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得手段、
　前記輝度値データから前記輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出手段、
　前記輝度値データにおいて繰り返し現れる前記輝度値の経時変化を評価する評価値を前記ピーク値と前記ボトム値とに基づいて計算し、前記評価値に基づいて前記複数の画素から前記心筋細胞の像を構成する対象画素を特定する画素特定手段、
として機能させることを特徴とする光測定プログラム。