WO2012176783A1 - 光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラム - Google Patents

光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラム Download PDF

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卓治 片岡
松原 正典
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浜松ホトニクス株式会社
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    • G06T2207/30072Microarray; Biochip, DNA array; Well plate

Definitions

  • the present invention relates to a light measurement device, a light measurement method, and a light measurement program for measuring light emitted from a cell.
  • Patent Document 1 discloses a method for evaluating cells by performing image processing on cell images of animals and plants.
  • a protrusion protruding outward from a cell body such as a nerve cell is extracted from a cell image by an image processing technique.
  • a pixel having a luminance value exceeding a predetermined threshold is extracted from a plurality of pixels constituting an image as an analysis processing target.
  • the temporal emission characteristics of light may vary depending on the cell type. For example, neuronal responses are characterized by time changes.
  • an image including light emitted from a specific cell such as a stained cell includes a pixel that receives light having a certain luminance value, and a pixel that receives light having a luminance value that changes over time. May be included.
  • a cell image in which light having a constant luminance value is emitted is distinguished from a cell image in which light having a luminance value that changes with time is emitted. I can't. Further, the image processing method described in Patent Document 1 cannot distinguish a plurality of types of cell images having different light temporal emission characteristics.
  • the present invention is an optical measurement that can classify an image of a cell whose luminance value changes over time in an image including light emitted from a sample including cells such as nerve cells.
  • An object is to provide an apparatus, a light measurement method, and a light measurement program.
  • An optical measurement device is an optical measurement device that measures light emitted from a cell held by a sample case having a holding unit that holds a sample containing cells.
  • This apparatus detects moving image data of a two-dimensional light image by detecting a two-dimensional light image of the sample case including light emitted from the sample held in the holding part of the sample case.
  • analysis processing means for performing analysis processing on the moving image data.
  • the analysis processing means acquires luminance value data acquisition means for acquiring luminance value data indicating a change with time in luminance values in a plurality of pixels constituting the area corresponding to the holding unit from the area corresponding to the holding unit included in the moving image data.
  • a luminance value extracting means for extracting the peak value and bottom value of the luminance value from the luminance value data, and an evaluation value for evaluating the temporal change of the luminance value is calculated based on the peak value and the bottom value.
  • Pixel extraction means for extracting a target pixel constituting an image of a predetermined cell from a plurality of pixels. The pixel extracting means is based on at least one of the amplitude of the luminance value obtained from the difference between the peak value and the bottom value and the rate of change of the luminance value obtained from the ratio of the peak value to the bottom value as the evaluation value. Extract pixels.
  • the light measurement method is a light measurement method for measuring light emitted from a cell held by a sample case having a holding unit that holds a sample containing cells.
  • This method includes a moving image acquisition step of detecting a two-dimensional light image of a sample case including light emitted from a sample held in a holding portion of the sample case and acquiring moving image data of the two-dimensional light image And an analysis processing step for performing analysis processing on the moving image data.
  • the analysis processing step is a luminance value data acquisition step of acquiring luminance value data indicating a change in luminance value with time in a plurality of pixels constituting the region corresponding to the holding unit from the region corresponding to the holding unit included in the moving image data.
  • a luminance value extraction step for extracting the peak value and the bottom value of the luminance value from the luminance value data, and an evaluation value for evaluating the temporal change of the luminance value is calculated based on the peak value and the bottom value.
  • the light measurement program is a light measurement program for measuring light emitted from a cell held by a sample case having a holding unit that holds a sample containing cells.
  • This program is used for moving image data obtained by detecting a two-dimensional light image of a sample case including light emitted from a sample held in a holding unit of the sample case, acquired by a moving image acquisition unit.
  • Luminance value data acquisition means for acquiring luminance value data indicating a change in luminance value with time in a plurality of pixels constituting the region corresponding to the holding unit, from the region corresponding to the holding unit included in the moving image data, the luminance value data Luminance value extracting means for extracting the peak value and the bottom value of the luminance value from the calculation value, the evaluation value for evaluating the temporal change of the luminance value is calculated based on the peak value and the bottom value, and from a plurality of pixels based on the evaluation value It is made to function as pixel extraction means for extracting a target pixel constituting an image of a predetermined cell.
  • the pixel extracting means is based on at least one of the amplitude of the luminance value obtained from the difference between the peak value and the bottom value and the rate of change of the luminance value obtained from the ratio of the peak value to the bottom value as the evaluation value. It has a function of extracting pixels.
  • the two-dimensional light image of the sample case including the light emitted from the sample including the cells held in the holding part of the sample case is detected and two-dimensional The moving image data of is acquired.
  • luminance value data indicating a change with time of luminance values in a plurality of pixels constituting the moving image data is acquired.
  • the peak value and bottom value of the brightness value are acquired from the brightness value data. Based on one of the amplitude of the luminance value obtained by the difference between the peak value and the bottom value, and the change rate of the luminance value obtained by the ratio of the peak value to the bottom value, an image of a predetermined cell from a plurality of pixels Are extracted.
  • the light measurement device, the light measurement method, or the light measurement program extracts the target pixel based on the luminance value data, so that light having a luminance value that changes with time is emitted.
  • the target pixels constituting the cell image can be segmented.
  • the pixel extraction unit uses the peak period, the number of peaks, the peak time defined by the time from the predetermined timing to the peak, and the bottom value to the peak value as the evaluation value.
  • the target pixel may be further extracted on the basis of at least one of the peak fluctuation ranges that are the differences of.
  • the light measurement apparatus uses the peak period, the number of peaks, the peak time, the rise time, the fall time, and the peak fluctuation range as parameters for extracting the target pixel. Accordingly, since the feature of the luminance value with time can be determined in detail, the target pixels constituting the image of the predetermined cell can be accurately classified.
  • an analysis processing unit corrects a phase shift between a plurality of luminance value data, and calculates a corrected luminance value data subjected to phase correction, and a plurality of corrections Processing means for processing the brightness value data to calculate average brightness value data that is an average of the plurality of corrected brightness value data.
  • the correcting means corrects the luminance value data of the pixel selected by the pixel extracting unit and calculates corrected luminance value data.
  • the processing means averages the plurality of corrected luminance value data to calculate average luminance value data. Therefore, analysis processing with improved measurement sensitivity for light emitted from the cells can be performed.
  • the analysis processing unit compares the average luminance value data with the sample luminance value data acquired in advance, and identifies the image configured by the target pixel. May further be included. According to this, the kind of image comprised by a desired cell image can be discriminate
  • An optical measurement device is an optical measurement device that measures light emitted from a cell held by a sample case having a holding unit that holds a sample containing cells.
  • This apparatus detects moving image data of a two-dimensional light image by detecting a two-dimensional light image of the sample case including light emitted from the sample held in the holding part of the sample case.
  • analysis processing means for performing analysis processing on the moving image data.
  • the analysis processing means acquires luminance value data acquisition means for acquiring luminance value data indicating a change with time in luminance values in a plurality of pixels constituting the area corresponding to the holding unit from the area corresponding to the holding unit included in the moving image data.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a configuration of an embodiment of the light measurement device 1.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating an example of the configuration of the microplate.
  • FIG. 3 is a view showing a cross-sectional structure of the microplate shown in FIG. 2 as viewed from the side.
  • a microplate 20 may be used as an example of a sample case.
  • the light measurement device 1 is a device that measures fluorescence from a sample S (see FIG. 3) placed at a measurement position P while being held by a microplate 20.
  • Sample S includes predetermined cells.
  • the predetermined cell include a nerve cell.
  • the light measurement device, the light measurement method, and the light measurement program according to the embodiment are generally applicable to light measurement that measures light emitted from a sample, such as phosphorescence or light emission. .
  • the configuration of the light measurement apparatus 1 will be described.
  • the light measurement device 1 includes a data acquisition device 10, an excitation light source 30, and a data analysis device 50.
  • the data acquisition device 10 includes a dark box 15 and a moving image acquisition unit 40.
  • the dark box 15 accommodates therein a microplate 20 that holds cells to be subjected to fluorescence measurement.
  • the moving image acquisition unit 40 measures fluorescence from the sample S installed in the dark box 15 and disposed at the measurement position P.
  • the bottom surface 22 of the microplate 20 is formed of a material that can transmit the excitation light for fluorescence measurement irradiated to the sample S and the fluorescence emitted from the sample S. In general, the bottom surface 22 of the microplate 20 included in the light measurement device 1 may be formed of a material that can transmit light emitted from the sample S to be measured.
  • a microplate 20 is installed in the dark box 15.
  • the microplate 20 is held by a microplate holder 11 having an opening for fluorescence observation.
  • the dark box 15 is provided with a microplate transport mechanism 12.
  • the microplate transport mechanism 12 transports the holder 11 holding the microplate 20 in a predetermined direction in the dark box 15.
  • the predetermined direction is a direction from the right side to the left side in FIG.
  • the carry-in side microplate stocker 13 is installed on one side 15 a of the dark box 15 which is the carry-in side with respect to the transport direction of the microplate 20.
  • the carry-in side microplate stocker 13 stocks a predetermined number (for example, 25) of the microplate 20 before measurement on which the sample S is held.
  • the carry-out side microplate stocker 14 is installed on the other side 15b of the dark box 15 which is on the carryout side with respect to the conveyance direction of the microplate 20.
  • the carry-out side microplate stocker 14 stocks the microplate 20 after the measurement.
  • the microplate 20 carried into the dark box 15 from the carry-in microplate stocker 13 is held by the microplate holder 11 and carried by the carrying mechanism 12.
  • the microplate 20 is temporarily stopped at the measurement position P, and in this state, necessary light measurement is performed on the sample S held by the microplate 20.
  • the microplate 20 is again transported by the transport mechanism 12 and unloaded to the unloading side microplate stocker 14.
  • FIG. 1 illustration of specific configurations in the transport mechanism 12 and the stockers 13 and 14 for loading, transporting, and unloading the microplate 20 is omitted.
  • the dispensing device 16 is installed above the measurement position P.
  • the dispensing device 16 injects a reagent or the like into the well 21 of the microplate 20.
  • the measurement position P is a position where the microplate 20 and the sample S held on the microplate 20 are arranged when the fluorescence measurement is performed.
  • the moving image acquisition unit 40 is installed below the measurement position P. The moving image acquisition unit 40 detects fluorescence emitted from the sample S accommodated in the well 21 through the bottom surface 22 of the microplate 20.
  • the moving image acquisition unit 40 is a moving image acquisition unit that acquires moving image data of a two-dimensional light image.
  • the moving image acquisition unit 40 detects a two-dimensional light image including light images from the plurality of wells 21 of the microplate 20. This two-dimensional light image includes light emitted from the sample S held in the well 21 of the microplate 20.
  • the moving image acquisition unit 40 has a two-dimensional pixel structure in which a plurality of pixels are two-dimensionally arranged, and acquires a fluorescence image that is a two-dimensional photodetection image by fluorescence emitted from the sample S.
  • It has a possible imaging device 45.
  • the imaging device 45 for example, a highly sensitive CCD camera or CMOS image camera can be used.
  • the moving image acquisition unit 40 may include an image intensifier tube, a relay lens, and the like that are arranged in front of the imaging device 45.
  • the light guide optical system 41 is installed between the measurement position P where the microplate 20 is arranged and the imaging device 45.
  • the light guide optical system 41 is an optical system that guides a two-dimensional light image obtained by viewing the microplate 20 from the bottom surface 22 side to the imaging device 45. In the microplate 20, the sample S is held in each of the plurality of wells 21.
  • the light guide optical system 41 can be appropriately configured by an optical element capable of realizing necessary functions (for example, a condensing function, a light image reduction function, etc.) according to the configurations of the microplate 20 and the imaging device 45.
  • Such a light guide optical system 41 may be an optical element having an optical reduction function that provides a resolution of one pixel or more per cell, and includes, for example, a tapered fiber (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-188044).
  • the optical filter unit 42 is installed between the light guide optical system 41 and the imaging device 45.
  • the optical filter unit 42 performs arrangement, switching, and the like of the optical filter on the fluorescent light guide optical path as necessary. However, such an optical filter unit 42 may not be provided if unnecessary.
  • the light measuring device 1 has an excitation light source 30.
  • the excitation light source 30 is excitation light supply means for supplying the sample S with excitation light for fluorescence measurement.
  • the excitation light source 30 can be appropriately configured according to the type of sample S to be subjected to fluorescence measurement, the wavelength of excitation light irradiated on the sample S, and the like.
  • the excitation light source 30 can be configured by, for example, an illumination light source that supplies light and an optical filter unit that performs selection and switching of the wavelength of the excitation light.
  • the light measurement device 1 may be configured without the excitation light source 30.
  • the excitation light source 30 is disposed outside the dark box 15 and connected to a light guide optical system 41 via an excitation light supply light guide 31.
  • Excitation light supplied from the excitation light source 30 is applied to the sample S via the excitation light supply light guide 31 and the light guide optical system 41.
  • the light guide optical system 41 can guide the two-dimensional light image from the microplate 20 and the sample S to the imaging device 45 and guide the excitation light from the excitation light source 30 to the sample S.
  • It is a simple optical system.
  • Such an optical system can be configured using, for example, a dichroic mirror that allows the fluorescence from the microplate 20 to pass and reflects the excitation light from the excitation light source 30.
  • the optical paths of fluorescence and excitation light in the light guide optical system 41 are schematically shown by solid lines and broken lines, respectively.
  • the light measurement device 1 has a data analysis device 50.
  • the data analysis device 50 is an analysis processing unit that performs analysis processing on moving image data including a photodetection image acquired by the moving image acquisition unit 40.
  • the data analysis device 50 controls the fluorescence measurement on the sample S in the light measurement device 1 by controlling the operation of each part of the data acquisition device 10 and the excitation light source 30.
  • Connected to the data analysis device 50 are a display device 61 that displays measurement results and the like, and an input device 62 that is used for inputting data and instructions necessary for fluorescence measurement.
  • the sample S is irradiated with excitation light for fluorescence measurement.
  • This excitation light is supplied from the excitation light source 30 via the light guide 31 and the light guide optical system 41.
  • the sample S is held in the well 21 of the microplate 20 and is disposed at the measurement position P in the dark box 15.
  • the two-dimensional light image including fluorescence emitted from the sample S is guided to the imaging device 45 via the light guide optical system 41, and the moving image data of the two-dimensional light image at a predetermined frame rate by the imaging device 45. Is acquired.
  • the moving image data including the fluorescent image acquired by the moving image acquisition unit 40 is sent to the data analysis device 50.
  • the data analysis device 50 extracts a target pixel constituting an image of a nerve cell from the input moving image data, and performs analysis processing necessary for evaluation and the like.
  • the sample case is not limited to the microplate described above.
  • the plurality of samples S may be held in a dish such as a petri dish as a sample case.
  • the light measurement device 1 may have a device configuration for observing a sample held in a petri dish via a microscope.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating an example of the configuration of the data analysis device included in the light measurement device 1 according to an embodiment.
  • the data analysis device 50 acquires luminance value data for each pixel from the moving image data, extracts a target pixel constituting an image of a nerve cell to be analyzed based on the luminance value data, and extracts the target pixel.
  • This moving image data is obtained by converting an image obtained by photographing the microplate 20 including light emitted from the sample S held in the well 21 to digital data.
  • the moving image data may be input to the data analysis device 50 via a communication network, a recording medium such as a CD-ROM, a DVD, or a semiconductor memory.
  • the data analysis apparatus 50 includes an analysis processing unit 51, a threshold recording unit 54, and a sample luminance value data recording unit 55 as functional components.
  • the data analysis device 50 is connected to the data acquisition device 10, the display device 61, and the input device 62.
  • the analysis processing unit 51 includes an extraction unit 52 and a data processing unit 53 as functional components.
  • the analysis processing unit 51 extracts target pixels constituting an image of a cell such as a nerve cell to be analyzed from the moving image data acquired by the moving image acquisition unit 40.
  • the analysis processing unit 51 performs an analysis process using the luminance value data of the target pixel as analysis data.
  • the extraction unit 52 includes a luminance value data acquisition unit (luminance value data acquisition unit) 52a, a luminance value extraction unit (luminance value extraction unit) 52b, and a pixel extraction unit (pixel extraction unit) 52c.
  • the extraction unit 52 extracts a target pixel that constitutes an image of a cell such as a nerve cell that is actually a target of analysis processing from the measurement region corresponding to the well 21.
  • the target pixel is extracted based on the feature value indicating the waveform feature of the luminance value data. Examples of the feature value include a peak value, a bottom value, a rate of change at the time of Ratio calculation, a frequency, a period, an interval between peak values, a rising speed, a falling speed, an integral value, and the like. In the present embodiment, a case where the feature value is a peak value and a bottom value will be described.
  • the extraction unit 52 is connected to the data processing unit 53.
  • the extraction unit 52 is connected to the threshold recording unit 54.
  • the threshold recording unit 54 records thresholds related to various evaluation values used when extracting the target pixel. Examples of the threshold include a peak value threshold, an amplitude threshold, and a change rate threshold.
  • the threshold recording unit 54 is configured to be referred to from the extraction unit 52.
  • the luminance value data acquisition unit 52a acquires luminance value data from the moving image data input from the moving image acquisition unit 40. That is, the luminance value data acquisition unit 52a acquires luminance value data for each pixel in the measurement area of the moving image data input from the data acquisition device 10. The luminance value data indicates a change with time of the luminance value of the pixel. The luminance value data acquired by the luminance value data acquisition unit 52a is output to the luminance value extraction unit 52b.
  • the luminance value extraction unit 52b extracts the peak value and the bottom value from the luminance value data of the pixels input by the luminance value data acquisition unit 52a.
  • the peak value and the bottom value are output to the pixel extraction unit 52c.
  • the pixel extraction unit 52c extracts a target pixel constituting an image of a nerve cell based on the peak value and the bottom value input from the luminance value extraction unit 52b. Information on the target pixel is output to the data processing unit 53. A method of extracting the target pixel will be described in detail later.
  • the data processing unit (data processing unit) 53 includes a phase correction unit (correction unit) 53a, a luminance value data processing unit (processing unit) 53b, and a luminance value data identification unit (identification unit) 53c.
  • the data processing unit 53 refers to the target pixel extracted by the extraction unit 52, and performs analysis processing on the target pixel constituting the nerve cell image using the luminance value data of the target pixel as analysis data.
  • the data processing unit 53 is connected to the extraction unit 52. Further, the data processing unit 53 is connected to the sample luminance value data recording unit 55.
  • the phase correction unit 53a corrects the timing of changing from the bottom value to the peak value in order to align the phases of the luminance value data for each pixel in the luminance value data of the extracted target pixel.
  • the phase correction unit 53a corrects the phase of each luminance value data based on the rise time and the peak time.
  • the luminance value data corrected by the phase correction unit 53a is output to the luminance value data processing unit 53b.
  • the luminance value data processing unit 53b calculates the average of the corrected luminance value data phase-corrected by the phase correcting unit 53a.
  • the average luminance value data calculated by the luminance value data processing unit 53b is output to the display device 61 or the luminance value data identification unit 53c.
  • the luminance value data identification unit 53c identifies an image constituted by the target pixel. This identification is performed using the average luminance value data calculated by the luminance value data processing unit 53b and the sample luminance value data recorded in the sample luminance value data recording unit 55.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining main steps of the light measurement method according to the embodiment.
  • Process S10 is executed by the moving image acquisition unit 40 of the data acquisition device 10.
  • step S10 moving image data of a two-dimensional light image is acquired (moving image acquisition step).
  • This two-dimensional light image is an image of a microplate containing light from the sample S containing cells held in the well 21 of the microplate 20.
  • the moving image data is a collection of two-dimensional image data in which two-dimensional image data detected at a predetermined time interval is arranged with time. With this moving image data, it is possible to extract temporal changes in the luminance value of each pixel.
  • a two-dimensional image of the microplate 20 is detected by the imaging device 45 of the moving image acquisition unit 40 to acquire moving image data.
  • the microplate 20 holds a sample S containing cells in a well 21.
  • the moving image data is acquired only for a preset time.
  • the set time is the time from when the luminance value changes to when the luminance value changes from the bottom value to the peak value and then back to the bottom value. That is, the set time may be a time at which a waveform for at least one cycle can be confirmed, and may be, for example, 10 seconds or more. Further, the set time may be set longer than the time when the waveform for one period is confirmed, and may be a time when a plurality of waveforms can be confirmed.
  • the acquired moving image data is input from the data acquisition device 10 to the data analysis device 50.
  • Process S11 is executed by the data analysis device 50.
  • analysis processing is performed on the moving image data acquired by the data acquisition device 10 in step S10 (analysis processing step).
  • Step S11 includes a step of extracting a target pixel to be analyzed (extraction step) and a step of performing analysis processing on the target pixel (data processing step).
  • Process S20 is executed by the extraction unit 52 of the data analysis device 50.
  • step S20 a target pixel that is a target of the analysis region is extracted based on the luminance value data in the pixels of the moving image data acquired in step S10.
  • Step S20 includes luminance value data acquisition step S21, luminance value extraction step S22, and pixel extraction step S23.
  • luminance value data acquisition step S21 luminance value data for each pixel is acquired.
  • the peak value and the bottom value are acquired from the luminance value data of each pixel as an example of the feature of the luminance value data.
  • the target pixel is extracted based on the peak value and the bottom value.
  • Step S21 is executed by the luminance value data acquisition unit 52a.
  • step S21 luminance value data for each pixel is acquired.
  • Step S22 is executed by the luminance value extraction unit 52b.
  • a peak value and a bottom value are extracted from the luminance value data acquired in step S21. At least one peak value is extracted from the change over time of the luminance value data in one pixel. Similarly, at least one bottom value is extracted from the change over time of luminance value data in one pixel.
  • Step S23 is executed by the pixel extraction unit 52c.
  • the target pixel is extracted based on the peak value and the bottom value acquired in step S22.
  • an evaluation value for evaluating the state of change in luminance value is calculated.
  • the evaluation value either the amplitude of the luminance value or the change rate (ratio value) of the luminance value is used.
  • the peak value is the absolute value L of the peak that appears in the luminance value data.
  • the bottom value is the absolute value B of the bottom that appears in the luminance value data.
  • background luminance value data acquired in advance may be used.
  • the amplitude of the luminance value is a difference (LB) between the peak value and the bottom value.
  • the change rate of the luminance value is the ratio (L / B) of the peak value to the bottom value.
  • the evaluation value only the amplitude of the luminance value may be used, or only the change rate of the luminance value may be used. Further, both the amplitude of the luminance value and the change rate of the luminance value may be used as the evaluation value.
  • both the luminance value amplitude and the luminance value change rate are used as evaluation values, after extracting pixels using the luminance value amplitude, further extraction is performed using the luminance value change rate from the extracted pixels. Also good. After extracting a pixel using the change rate of the luminance value, the pixel may be further extracted from the extracted pixel using the amplitude of the luminance value.
  • the peak period is a period when a peak equal to or higher than a threshold is repeated.
  • the number of peaks refers to the number of times that a peak equal to or greater than a threshold appears.
  • the peak time refers to a time from reaching a peak from a predetermined timing such as a timing of medication.
  • the rise time is the time from the bottom value to the peak value.
  • the fall time is the time until the peak value returns to the bottom value.
  • the peak fluctuation range is a time difference between a peak time in one pixel and a peak time in another pixel adjacent to the one pixel.
  • evaluation values can be used in combination with at least one of the amplitude of the luminance value and the change rate of the luminance value. You can select one from peak period, number of peaks, peak time, rise time, fall time, and peak fluctuation range and use it in combination as an evaluation value, or select multiple and use them in combination as an evaluation value Also good.
  • the order in which the evaluation values are applied is not particularly limited, and can be applied in a desired order.
  • Extraction in one embodiment includes a case where a desired cell image is selected from moving image data and a case where different types of cell images included in the moving image data are classified by type.
  • a desired cell image can be selected by using a combination of a plurality of evaluation values.
  • the luminance value data of a desired cell image can be specified by, for example, the amplitude of a predetermined luminance value and a predetermined peak time, a pixel is extracted using these evaluation values, so that a desired image is obtained from the moving image data Cell images can be sorted out.
  • At least one evaluation value can be classified for each type by setting a plurality of threshold values.
  • threshold values of X1 and X2 are set for the amplitude of the luminance value. It is assumed that the threshold value X1 is larger than the threshold value X2. In this case, it can be classified into a group in which the amplitude of the luminance value is X1 or more, a group in which the amplitude of the luminance value is X2 or more and less than X1, and a group in which the amplitude of the luminance value is less than X2.
  • Process S30 is executed by the data processing unit 53.
  • an analysis process is performed on the target pixel constituting the image of the nerve cell extracted in step S20.
  • Step S30 includes a correction step S31, a processing step S32, and an identification step S33.
  • corrected luminance value data obtained by correcting the phase of the luminance value data of the pixel in the analysis region is calculated.
  • process step S32 average brightness value data is calculated based on the corrected brightness value data.
  • an image constituted by the target pixel is identified by comparing the average luminance value data with the sample luminance value data acquired in advance.
  • Step S31 is executed by the phase correction unit 53a.
  • the timing for changing from the bottom value to the peak value is corrected.
  • Changes in luminance values radiated from cells over time may vary in the way the stimulus is transmitted depending on the position of the cells and the dosage, and therefore there may be a shift in the timing at which the reaction appears.
  • the timing at which a reaction appears in a pixel constituting a neuron image located at a position away from the center of the stimulus is later than the timing at which a reaction appears in a pixel constituting a neuron image located at a position close to the center of the stimulus. .
  • step S31 may be omitted.
  • Step S32 is executed by the luminance value data processing unit 53b.
  • luminance value data is averaged based on the corrected luminance value data.
  • average luminance value data is calculated.
  • the average luminance value data is data obtained by averaging the extracted luminance value data of the target pixel for each two-dimensional image data. Thereby, the average luminance of the light emitted from the cells at a specific time can be calculated. Since the average luminance value data at each time is calculated using the corrected luminance value data phase-corrected in step S31, the measurement sensitivity can be improved.
  • average luminance data obtained by averaging the luminance value data of the target pixel may be calculated for each area of the nerve cell formed by the target pixel.
  • Step S33 is executed by the luminance value data identification unit 53c.
  • the type of image constituted by the target pixel is identified using the sample luminance value data.
  • This identification process is executed by comparing the average luminance value data calculated in step S32 with the sample luminance value data acquired in advance and recorded in the sample luminance value data recording unit 55. For example, when the average luminance value data is included in the tolerance range set for the sample luminance value data, the cell image having the average luminance value data is a specific cell represented by the sample luminance value data. Identified.
  • the sample luminance value data may be identified using an evaluation value that can be specified.
  • the light measurement program according to an embodiment is provided by being stored in a recording medium.
  • the recording medium include a recording medium such as a floppy (registered trademark) disk, CD-ROM, DVD, or ROM, or a semiconductor memory.
  • FIG. 6 is a diagram showing a hardware configuration of a computer for executing a program recorded on a recording medium.
  • FIG. 7 is a diagram of a computer for executing a program recorded on a recording medium.
  • the computer includes various data processing devices such as a server device that includes a CPU and performs processing and control by software, and a personal computer.
  • a computer 70 includes a reading device 72 such as a floppy (registered trademark) disk drive device, a CD-ROM drive device, a DVD drive device, and a working memory (RAM) 73 in which an operating system is resident. , A memory 74 for storing a program stored in the recording medium 71, a display device 75 such as a display, a mouse 76 and a keyboard 77 as input devices, a communication device 78 for transmitting and receiving data, and the execution of the program And a CPU 79 for controlling the above.
  • the computer 70 can access the light measurement program stored in the recording medium 71 from the reading device 72, and the light measurement program according to the present embodiment is used by the light measurement program. It becomes possible to operate as 1.
  • the light measurement program may be provided via a network as a computer data signal 79 superimposed on a carrier wave.
  • the computer 70 can store the light measurement program received by the communication device 78 in the memory 74 and execute the light measurement program.
  • a two-dimensional light image of the microplate 20 is detected and two-dimensional moving image data is acquired (S10).
  • This two-dimensional light image includes cells held in the well 21 of the microplate 20.
  • the luminance value data indicating the temporal change of the luminance value in the plurality of pixels constituting the moving image data is acquired (S21).
  • the peak value and the bottom value of the brightness value are acquired from the brightness value data (S22).
  • an image of a neuron from a plurality of pixels is obtained.
  • a target pixel to be configured is extracted (S23). As described above, since the luminance value amplitude and the luminance value change rate based on the luminance value change with time are used, the pixels constituting the image of the nerve cell from which light having the luminance value changing with time is emitted. Can be classified.
  • the evaluation value is defined by the peak period, the number of peaks, the peak time defined by the time from the predetermined timing to the peak, and the rise defined by the time from the bottom value to the peak value.
  • the peak fluctuation range which is the difference between the peak time at one pixel and the peak time at another pixel adjacent to one pixel, and the falling time defined by the time from the peak value to the bottom value, and the peak time at one pixel Contains.
  • the pixel extraction unit 52c extracts the target pixel based on at least one of the peak period, the number of peaks, the peak time, the rising time, the falling time, and the peak fluctuation range.
  • the peak period is used as the evaluation value
  • classification based on the oscillation period of cells that undergo oscillation for example, changes in Ca ions in nerves and muscles
  • classification based on the period change after drug effect are possible.
  • classification based on the number of times of oscillation of the cell and classification based on the number of times of oscillation after the drug effect are possible.
  • classification based on the arrival time (speed) to the peak value is possible as the effect of the medicinal effect response.
  • the fall time is used as the evaluation value, it is possible to classify cells that return poorly due to damage after medicinal effect.
  • the light measurement apparatus 1 includes a phase correction unit 53a that calculates corrected luminance value data by correcting a phase shift between a plurality of luminance value data after the analysis processing unit 51 extracts a target pixel, and a plurality of corrections. And a luminance value data processing unit 53b that calculates the average luminance value data by averaging the luminance value data every time. According to this, the luminance value data of the pixel extracted by the pixel extraction unit 52c is corrected to calculate corrected luminance value data (S31). Then, the average brightness value data is calculated by averaging the plurality of corrected brightness value data (S32). Therefore, analysis processing with improved measurement sensitivity for light emitted from the cells can be performed.
  • a phase correction unit 53a that calculates corrected luminance value data by correcting a phase shift between a plurality of luminance value data after the analysis processing unit 51 extracts a target pixel, and a plurality of corrections.
  • a luminance value data processing unit 53b that calculates the average luminance value data by
  • the light measurement apparatus 1 further includes a luminance value data identification unit 53c in which the analysis processing unit 51 compares the average luminance value data with the sample luminance value data acquired in advance to identify an image constituted by the target pixel. May be included. According to this, the kind of image comprised by a desired cell image can be discriminate
  • FIG. 8A shows the result of executing step S21 (luminance value data acquisition step).
  • Each of the plurality of pixels C1 to C6 has luminance value data shown in the graphs G1 to G6.
  • a process of dividing the pixel C1 having the luminance value data G1 will be described as an example.
  • the number of peaks, the amplitude of the luminance value, the peak time, and the fall time are used.
  • the threshold of the number of peaks is 1 or more and less than 2.
  • the threshold value of the amplitude of the luminance value is not less than a predetermined amplitude threshold value.
  • the peak time threshold is ts or less.
  • the fall time threshold is ds or less.
  • the peak values P1 to P6 and the bottom values B1 to B6 are acquired from the luminance value data G1 to G6 (S22). Subsequently, pixels are extracted by applying the number of peaks as an evaluation value.
  • the threshold used here is '1 or more and less than 2'.
  • the peak number of the luminance value data G1, G3, G5, G6 is “1”
  • the peak number of the luminance value data G2 is “0”
  • the peak number of the luminance value data G4 is '2'.
  • the luminance value data G1, G3, G5, G6 among the luminance value data G1 to G6 satisfying the threshold value “1 or more and less than 2” are the pixel value C1 as shown in FIG. 8B. , C3, C5, C6 are extracted.
  • the pixel is extracted by applying the amplitude of the luminance value as the evaluation value.
  • the amplitude of the luminance value is calculated using the peak values P1, P3, P5, and P6 and the bottom values B1, B3, B5, and B6 of the extracted pixels C1, C3, C5, and C6.
  • the luminance value data G1, G5, and G6 satisfying the threshold among the luminance value amplitudes calculated from the luminance value data G1, G3, G5, and G6 are the luminance value data G1, G5, and G6, as shown in FIG. Pixels C1, C5, and C6 are extracted.
  • pixels are extracted by applying the peak time as an evaluation value.
  • the peak times ⁇ t1, ⁇ t5, ⁇ t6 of the extracted pixels C1, C5, C6 are acquired.
  • the threshold value used here is “below ts”. For this reason, the luminance value data G1, G6 satisfy the threshold value among the luminance value data G1, G5, G6. Therefore, as shown in FIG. 8D, the pixels C1 and C6 are extracted as target pixels.
  • the pixel is extracted by applying the fall time as an evaluation value.
  • the fall times d1 and d2 of the extracted pixels C1 and C6 are acquired.
  • the threshold used here is 'below ds'.
  • the luminance value data G1 satisfies the threshold value among the luminance value data G1 and G6. Accordingly, as shown in FIG. 8E, the pixel C1 is extracted as a pixel constituting an image of a predetermined cell. In this way, a plurality of pixels having the luminance value data G1 are segmented from the moving image data.
  • Example 1 The method of Example 1 described above can be used for, for example, cell oscillation analysis with calcium ions.
  • the luminance value data of all the pixels constituting the image of the well 21 is acquired.
  • pixels having predetermined luminance value data are extracted from the luminance value data.
  • an averaging process is performed on the extracted luminance value data.
  • each well 21 is displayed on the display device 61.
  • Example 1 The method of Example 1 described above can be used for identification of cell images, for example.
  • predetermined cells in the well 21 are stained.
  • the moving image acquisition unit 40 switches the wavelength of light to be observed to acquire moving image data.
  • luminance value data of all the pixels constituting the image of the well 21 is acquired.
  • pixels constituting an image of a cell stained with a predetermined staining reagent are extracted using the method as described in the first embodiment.
  • an averaging process is performed on the luminance value data of the extracted pixels.
  • the luminance value data subjected to the averaging process is identified using the standard luminance value data. Thereby, the cell image can be identified.
  • FIG. 9A shows the result of executing step S21 (luminance value data acquisition step) after executing step S10 (moving image acquisition step).
  • Each of the plurality of pixels C7 to C14 has luminance value data shown in the graphs G7 to G14.
  • a process of classifying a plurality of pixels C7 to C14 for each luminance value data satisfying a predetermined condition will be described.
  • a plurality of pixels are classified into three groups using the amplitude of the luminance value as the evaluation value. Therefore, two amplitude threshold values v0 and v1 are used.
  • the amplitude threshold v1 is larger than the amplitude threshold v0. According to this, a group of pixels whose luminance value amplitude is v1 or more, a group of pixels whose luminance value amplitude is less than v1 and v0 or more, and a group of pixels whose luminance value amplitude is less than v0 are divided. be able to.
  • the peak values P7 to P14 and the bottom values B7 to B14 are obtained from the luminance value data G7 to G14. Then, the amplitude of the luminance value is calculated from the peak values P7 to P14 and the bottom values B7 to B14.
  • pixels C7, C9, and C12 are extracted as pixels whose luminance value amplitude is v1 or more.
  • C8 and C14 are extracted as pixels whose luminance value amplitude is less than v1 and greater than or equal to v0.
  • C11 and C13 are extracted as pixels whose luminance value amplitude is less than v0. In this way, the plurality of pixels C7 to C14 can be divided into three groups.
  • the luminance value data belonging to the same group is subjected to phase correction between the pixels C7, C9 and C12 in step S31 (correction step). Similarly, the phase is corrected between the pixels C8 and C14. Further, the phase is corrected between the pixels C11 and C13. Then, as shown in FIG. 9C, the corrected luminance value data is synthesized in step S32 (data processing step). Thereafter, the corrected luminance value data G7, G9, and G12 are combined to calculate average luminance value data G15. The corrected luminance value data G8 and G14 are combined to calculate average luminance value data G16. The corrected luminance value data G11 and G13 are combined to calculate average luminance value data G17.
  • the synthesized luminance value data G15, G16, and G17 are displayed on the display device 61.
  • the phase correction is performed after the plurality of pixels C7 to C14 are divided into three groups. However, the phase correction may be performed before the division into three groups.
  • the method of classifying a plurality of pixels as in Example 2 described above can be used for functional analysis of nerve cells using calcium ions, for example.
  • the luminance value data is classified using a predetermined classification condition.
  • Subsequently, averaging processing is performed on the luminance value data classified into the same group. And it displays on the display apparatus 61 for every extraction condition.
  • the nerve cell is described as an example of the predetermined cell, but the predetermined cell may be a cell different from the nerve cell.
  • the predetermined cell may be epithelial cells, smooth muscle cells, skeletal muscle cells, vascular endothelial cells, blood cells, osteoblasts, osteoclasts, organ cells, cell lines may be used.
  • the light measurement device in an image including light emitted from a sample including nerve cells or the like, pixels constituting an image of a cell whose luminance value changes with time are classified. be able to.

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Abstract

光測定装置1は、細胞から放出された光を測定する光測定装置1である。光測定装置1は、二次元光像の動画像データを取得する動画像取得部40と、動画像データに対して解析処理を行う解析処理部51と、を備える。解析処理部51は、輝度値データを取得する輝度値データ取得部52aと、輝度値データから輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出部52bと、評価値に基づいて複数の画素から所定の細胞の像を構成する対象画素を抽出する画素抽出部52cと、を含む。画素抽出部52cは、評価値として、ピーク値とボトム値との差分により得られる輝度値の振幅、及びボトム値に対するピーク値の比率により得られる輝度値の変化率のうち少なくとも一つに基づいて対象画素を抽出する。

Description

光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラム
 本発明は、細胞から放出される光を測定する光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムに関する。
 創薬分野では、細胞などの試料に投与した薬品の影響を、細胞から放出された光を測定して評価する場合がある。特許文献1には、動植物の細胞画像を画像処理して細胞を評価する方法が開示されている。この方法は、神経細胞などの細胞本体から外側に突出する突起を画像処理手法によって細胞画像から抽出する。この画像処理手法では、画像を構成する複数の画素から、所定の閾値を超える輝度値を有する画素を解析処理の対象として抽出する。
特開2003‐14737号公報
 一般には、細胞の種類によって光の時間的放出特性が異なることがある。例えば、神経細胞の反応は時間変化に特徴がある。また、染色された細胞等の特定の細胞から放出された光が含まれた画像には、一定の輝度値を有する光を受ける画素と、経時的に変化する輝度値を有する光を受ける画素とが含まれている場合がある。しかし、特許文献1に記載の画像処理手法では、一定の輝度値を有する光が放出されている細胞画像と、経時的に変化する輝度値を有する光が放出されている細胞画像とを区別することができない。また、特許文献1に記載の画像処理手法では、光の時間的放出特性が異なる複数の種類の細胞画像を区別することができない。
 上述した問題点に鑑みて、本発明は、神経細胞等の細胞を含む試料から放出された光を含む画像において、輝度値が経時的に変化する細胞の像を区分けすることが可能な光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムを提供することを目的とする。
 本発明の一側面に係る光測定装置は、細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された細胞から放出された光を測定する光測定装置である。この装置は、試料ケースの保持部の内部に保持された試料から放出された光を含む試料ケースの二次元光像を検出して、二次元光像の動画像データを取得する動画像取得手段と、動画像データに対して解析処理を行う解析処理手段と、を備える。解析処理手段は、動画像データに含まれる保持部に対応する領域から、保持部に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得手段と、輝度値データから輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出手段と、輝度値の経時変化を評価する評価値をピーク値とボトム値とに基づいて計算し、評価値に基づいて複数の画素から所定の細胞の像を構成する対象画素を抽出する画素抽出手段と、を含む。画素抽出手段は、評価値として、ピーク値とボトム値との差分により得られる輝度値の振幅、及びボトム値に対するピーク値の比率により得られる輝度値の変化率のうち少なくとも一つに基づいて対象画素を抽出する。
 本発明の一側面に係る光測定方法は、細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された細胞から放出された光を測定する光測定方法である。この方法は、試料ケースの保持部の内部に保持された試料から放出された光を含む試料ケースの二次元光像を検出して、二次元光像の動画像データを取得する動画像取得ステップと、動画像データに対して解析処理を行う解析処理ステップと、を備える。解析処理ステップは、動画像データに含まれる保持部に対応する領域から、保持部に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得ステップと、輝度値データから輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出ステップと、輝度値の経時変化を評価する評価値をピーク値とボトム値とに基づいて計算し、評価値に基づいて複数の画素から細胞の像を構成する対象画素を抽出する画素抽出ステップと、を含む。画素抽出ステップは、評価値として、ピーク値とボトム値との差分により得られる輝度値の振幅、及びボトム値に対するピーク値の比率により得られる輝度値の変化率のうち少なくとも一つに基づいて対象画素を抽出する。
 本発明の一側面に係る光測定プログラムは、細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された細胞から放出された光を測定する光測定プログラムである。このプログラムは、コンピュータを、動画像取得手段によって取得された、試料ケースの保持部の内部に保持された試料から放出された光を含む試料ケースの二次元光像を検出した動画像データに対し、動画像データに含まれる保持部に対応する領域から、保持部に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得手段、輝度値データから輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出手段、輝度値の経時変化を評価する評価値をピーク値とボトム値とに基づいて計算し、評価値に基づいて複数の画素から所定の細胞の像を構成する対象画素を抽出する画素抽出手段、として機能させる。画素抽出手段は、評価値として、ピーク値とボトム値との差分により得られる輝度値の振幅、及びボトム値に対するピーク値の比率により得られる輝度値の変化率のうち少なくとも一つに基づいて対象画素を抽出する機能を有する。
 光測定装置、光測定方法、或いは光測定プログラムによれば、試料ケースの保持部内に保持された細胞を含む試料から放出された光を含む試料ケースの二次元光像を検出して、二次元の動画像データを取得する。次に、動画像データを構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する。そして、輝度値データから輝度値のピーク値とボトム値とを取得する。ピーク値とボトム値との差分により得られる輝度値の振幅、及びボトム値に対するピーク値の比率により得られる輝度値の変化率の何れか一方に基づいて、複数の画素中から所定の細胞の像を構成する対象画素を抽出する。このように、光測定装置、光測定方法、或いは光測定プログラムは、輝度値データに基づいて対象画素を抽出しているので、経時的に変化する輝度値を有する光が放出されている所定の細胞の像を構成する対象画素を区分けすることができる。
 本発明の一側面に係る光測定装置では、画素抽出手段が、評価値として、ピーク周期、ピーク回数、所定のタイミングからピークに達するまでの時間により規定されるピーク時間、ボトム値からピーク値に達するまでの時間により規定される立ち上がり時間、ピーク値からボトム値に戻るまでの時間により規定される下がり時間、及び一の画素におけるピーク時間と、一の画素と隣接する他の画素におけるピーク時間との差分であるピーク変動幅のうち少なくとも一つに基づいて対象画素をさらに抽出してもよい。これによれば、光測定装置は、対象画素を抽出するためのパラメータとして、ピーク周期、ピーク回数、ピーク時間、立ち上がり時間、下がり時間、及びピーク変動幅を用いている。従って、輝度値の経時変化の特徴を詳細に判別することができるので、所定の細胞の像を構成する対象画素を精度良く区分けすることができる。
 本発明の一側面に係る光測定装置は、解析処理手段が、複数の輝度値データ間における位相のずれを補正して、位相補正された補正輝度値データを算出する補正手段と、複数の補正輝度値データを処理して、複数の補正輝度値データの平均である平均輝度値データを算出する処理手段と、をさらに含んでいてもよい。これによれば、補正手段が、画素抽出部により選択された画素の輝度値データを補正して補正輝度値データを算出する。そして、処理手段が、複数の補正輝度値データを平均化して平均輝度値データを算出する。従って、細胞から放出された光に対する測定感度を向上させた解析処理を行うことができる。
 本発明の一側面に係る光測定装置は、解析処理手段が、平均輝度値データと、予め取得された標本輝度値データとを対比して、対象画素により構成される像を同定する同定手段、をさらに含んでいてもよい。これによれば、所望の細胞画像により構成される像の種類を判別することができる。
 本発明の一側面に係る光測定装置は、細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された細胞から放出された光を測定する光測定装置である。この装置は、試料ケースの保持部の内部に保持された試料から放出された光を含む試料ケースの二次元光像を検出して、二次元光像の動画像データを取得する動画像取得手段と、動画像データに対して解析処理を行う解析処理手段と、を備える。解析処理手段は、動画像データに含まれる保持部に対応する領域から、保持部に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得手段と、輝度値の経時変化を評価する評価値を輝度値データの波形の特徴を示す特徴値に基づいて計算し、評価値に基づいて複数の画素から所定の細胞の像を構成する対象画素を抽出する画素抽出手段と、対象画素における輝度値データに対して所定の処理を行うデータ処理部と、を含む。
 本発明による光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムによれば、神経細胞等を含む試料から放出された光を含む画像において、経時的に輝度値が変化する細胞の像を構成する画素を区分けすることができる。
光測定装置の一実施形態を模式的に示す図である。 マイクロプレートの構成の一例を示す図である。 図2に示したマイクロプレートを側面視した断面構造を示す図である。 データ解析装置の構成の一例を示す図である。 光測定方法の一実施形態を示す図である。 記録媒体に記録されたプログラムを実行するためのコンピュータのハードウェア構成を示す図である。 記録媒体に記録されたプログラムを実行するためのコンピュータを示す図である。 光測定方法の一実施例を説明するための図である。 光測定方法の他の実施例を説明するための図である。 解析結果の表示の一例を示す図である。
 以下、添付図面を参照しながら光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムの実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
 図1は、光測定装置1の一実施形態の構成を模式的に示す図である。図2は、マイクロプレートの構成の一例を示す図である。図3は、図2に示したマイクロプレートを側面視した断面の構造を示す図である。光測定装置1では、試料ケースの一例としてマイクロプレート20を用いてもよい。光測定装置1は、マイクロプレート20によって保持された状態で測定位置Pに配置された試料S(図3参照)からの蛍光を測定する装置である。
 試料Sは所定の細胞を含む。所定の細胞には、例えば神経細胞がある。また、一実施形態に係る光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムは、蛍光測定以外にも、例えば燐光や発光など、試料から放出された光を測定する光測定に一般に適用可能である。以下、光測定装置1の構成について説明する。
 図1に示すように、光測定装置1は、データ取得装置10と、励起光源30と、データ解析装置50とを備えて構成されている。データ取得装置10は、暗箱15と動画像取得部40とを有している。暗箱15は、蛍光測定の対象となる細胞を保持したマイクロプレート20を内部に収容する。動画像取得部40は、暗箱15の内部に設置されて測定位置Pに配置された試料Sからの蛍光を測定する。
 図2及び図3に示すように、マイクロプレート20は、複数のウェル(保持部)21が二次元アレイ状に並設された板状部材である。複数のウェル21のそれぞれは、試料Sを保持可能に構成されている。例えば、図2に示すように、複数のウェル21として、8×12=96個のウェル21が二次元アレイ状に配置されている。ウェル21の形状は円形でも矩形状でもよい。また、マイクロプレート20の底面22は、試料Sに照射される蛍光測定用の励起光と、及び試料Sから放出される蛍光とを透過可能な材質によって形成されている。なお、一般に、光測定装置1が有するマイクロプレート20の底面22は、測定対象となる試料Sから放出された光を透過可能な材質によって形成されていればよい。
 暗箱15には、マイクロプレート20が設置されている。マイクロプレート20は、蛍光観察用の開口を有するマイクロプレートホルダ11に保持されている。また、暗箱15には、マイクロプレート搬送機構12が設置されている。マイクロプレート搬送機構12は、マイクロプレート20を保持したホルダ11を、暗箱15内で所定の方向に搬送する。所定の方向は、図1中においては、右側から左側へと向かう方向である。
 搬入側マイクロプレートストッカー13は、マイクロプレート20の搬送方向に対して搬入側となる暗箱15の一方側15aに設置されている。搬入側マイクロプレートストッカー13は、試料Sが保持された測定前のマイクロプレート20を所定枚数(例えば、25枚)ストックする。また、搬出側マイクロプレートストッカー14は、マイクロプレート20の搬送方向に対して搬出側となる暗箱15の他方側15bに設置されている。搬出側マイクロプレートストッカー14は、測定後のマイクロプレート20をストックする。
 このような構成において、搬入側マイクロプレートストッカー13から暗箱15内へと搬入されたマイクロプレート20は、マイクロプレートホルダ11によって保持されるとともに搬送機構12によって搬送される。そして、マイクロプレート20は測定位置Pで一旦停止させられ、この状態で、マイクロプレート20によって保持された試料Sに対して必要な光測定が行われる。測定完了後、マイクロプレート20は再び搬送機構12によって搬送され、搬出側マイクロプレートストッカー14へと搬出される。なお、図1では、マイクロプレート20を搬入、搬送、及び搬出するための搬送機構12、及びストッカー13、14における具体的な構成の図示を省略している。
 分注装置16は、測定位置Pの上方に設置されている。分注装置16は、マイクロプレート20のウェル21内に試薬等を注入する。測定位置Pは、蛍光測定の実行時にマイクロプレート20、及びそれに保持された試料Sが配置される位置である。動画像取得部40は、測定位置Pの下方に設置されている。動画像取得部40は、ウェル21内に収容された試料Sからマイクロプレート20の底面22を介して放出される蛍光を検出する。
 動画像取得部40は、二次元光像の動画像データを取得する動画像取得手段である。動画像取得部40は、マイクロプレート20の複数のウェル21からの光像を含む二次元光像を検出する。この二次元光像は、マイクロプレート20のウェル21内に保持された試料Sから放出された光を含んでいる。本実施形態では、動画像取得部40は、複数の画素が二次元に配列された二次元画素構造を有し、試料Sから放出される蛍光による二次元の光検出画像である蛍光画像を取得可能な撮像装置45を有している。この撮像装置45には、例えば高感度のCCDカメラやCMOSイメージカメラを用いることができる。また、必要があれば、動画像取得部40は、撮像装置45の前段に配置されるイメージ増倍管、リレーレンズ等を有していてもよい。
 導光光学系41は、マイクロプレート20が配置される測定位置Pと、撮像装置45との間に設置されている。導光光学系41は、マイクロプレート20を底面22側からみた二次元光像を撮像装置45へと導く光学系である。このマイクロプレート20には、複数のウェル21のそれぞれに試料Sが保持されている。導光光学系41は、マイクロプレート20及び撮像装置45の構成等に応じ、必要な機能(例えば集光機能、光像縮小機能等)を実現可能な光学素子によって適宜構成することができる。そのような導光光学系41としては、一細胞あたり一画素以上の分解能を与える光学縮小機能をもつ光学素子であればよく、例えばテーパファイバがある(特開2001-188044号公報参照)。
 光学フィルタ部42は、導光光学系41と撮像装置45との間に設置されている。光学フィルタ部42は、必要に応じて蛍光の導光光路上への光学フィルタの配置、切換等を行う。ただし、このような光学フィルタ部42については、不要であれば設けなくてもよい。
 光測定装置1は、励起光源30を有する。励起光源30は、試料Sに対して蛍光測定用の励起光を供給するための励起光供給手段である。励起光源30は、蛍光測定の対象となる試料Sの種類、試料Sに照射する励起光の波長等に応じて適宜構成することができる。励起光源30は、例えば、光を供給する照明光源と、励起光の波長の選択、切換を行うための光学フィルタ部とによって構成することができる。また、試料Sに対して行われる光測定の種類により、励起光の供給が不要な場合には、光測定装置1は励起光源30を設けない構成としてもよい。
 図1に示すように、励起光源30は、暗箱15の外側に配置され励起光供給用ライトガイド31を介して導光光学系41に接続されている。励起光源30から供給される励起光は、励起光供給用ライトガイド31及び導光光学系41を介して試料Sへと照射される。このような構成では、導光光学系41は、マイクロプレート20及び試料Sからの二次元光像を撮像装置45へと導くとともに、励起光源30からの励起光を試料Sへと導くことが可能な光学系である。このような光学系は、例えば、マイクロプレート20からの蛍光を通過させるとともに、励起光源30からの励起光を反射させるダイクロイックミラー等を用いて構成することができる。なお、図1では、導光光学系41における蛍光及び励起光の光路を、それぞれ実線及び破線によって模式的に示している。
 光測定装置1は、データ解析装置50を有する。データ解析装置50は、動画像取得部40によって取得された光検出画像を含む動画像データに対して解析処理を行う解析処理手段である。データ解析装置50は、データ取得装置10及び励起光源30の各部の動作を制御することによって、光測定装置1における試料Sに対する蛍光測定を制御する。データ解析装置50には、測定結果等を表示する表示装置61と、データの入力や蛍光測定に必要な指示の入力等に用いられる入力装置62とが接続されている。
 以上の構成により、蛍光測定用の励起光が、試料Sに照射される。この励起光は、ライトガイド31及び導光光学系41を介して、励起光源30から供給されている。試料Sは、マイクロプレート20のウェル21内に保持されると共に、暗箱15内で測定位置Pに配置されている。そして、試料Sから放出された蛍光を含む二次元光像は、導光光学系41を介して撮像装置45へと導かれ、撮像装置45によって所定のフレームレートで二次元光像の動画像データが取得される。動画像取得部40によって取得された蛍光画像を含む動画像データは、データ解析装置50へと送られる。そして、データ解析装置50は、入力された動画像データから神経細胞の像を構成する対象画素を抽出し、評価等に必要な解析処理を行う。
 なお、試料ケースは、上述したマイクロプレートに限定されるものではない。複数の試料Sは、試料ケースとしてシャーレのようなディッシュに保持されてもよい。光測定装置1は、顕微鏡を介してシャーレに保持された試料を観察する装置構成であってもよい。
 図4は、一実施形態に係る光測定装置1が備えるデータ解析装置の構成の一例を示す図である。
 データ解析装置50は、動画像データから画素毎の輝度値データを取得し、その輝度値データに基づいて解析対象となる神経細胞の像を構成する対象画素を抽出して、対象画素に対して所定の解析処理を実行するための情報処理装置である。この動画像データは、上述したウェル21内に保持された試料Sから放射される光を含むマイクロプレート20を撮影した画像をデジタルデータに変換したものである。動画像データは、通信ネットワークやCD-ROM、DVD、半導体メモリ等の記録媒体を介してデータ解析装置50に入力されてもよい。
 データ解析装置50は、機能的構成要素として、解析処理部51と、閾値記録部54と、標本輝度値データ記録部55とを備えている。データ解析装置50は、データ取得装置10、表示装置61及び入力装置62に接続されている。
 解析処理部51は、機能的構成要素として、抽出部52と、データ処理部53とを備えている。解析処理部51は、動画像取得部40によって取得された動画像データから解析の対象となる神経細胞などの細胞の像を構成する対象画素を抽出する。解析処理部51は、対象画素が有する輝度値データを解析データとして解析処理を行う。
 抽出部52は、輝度値データ取得部(輝度値データ取得手段)52aと、輝度値抽出部(輝度値抽出手段)52bと、画素抽出部(画素抽出手段)52cとを含んでいる。抽出部52は、ウェル21に対応する測定領域から、実際に解析処理の対象となる神経細胞などの細胞の像を構成する対象画素を抽出する。対象画素は、輝度値データの波形の特徴を示す特徴値に基づいて抽出される。この特徴値には、例えば、輝度値データの波形が有するピーク値、ボトム値、Ratio計算時の変化率、周波数、周期、ピーク値の間隔、立上り速度、立下り速度、積分値等がある。本実施形態では、特徴値をピーク値及びボトム値とした場合について説明する。抽出部52は、データ処理部53に接続されている。また、抽出部52は、閾値記録部54に接続されている。
 閾値記録部54は、対象画素を抽出するときに用いられる各種評価値に関する閾値を記録している。閾値には、例えばピーク値閾値、振幅閾値、及び変化率閾値などがある。閾値記録部54は、抽出部52から参照可能に構成されている。
 輝度値データ取得部52aは、動画像取得部40から入力された動画像データから輝度値データを取得する。即ち、輝度値データ取得部52aは、データ取得装置10から入力された動画像データの測定領域における画素毎に輝度値データを取得する。輝度値データは、画素が有する輝度値の経時変化を示す。輝度値データ取得部52aにおいて取得された輝度値データは、輝度値抽出部52bに出力される。
 輝度値抽出部52bは、輝度値データ取得部52aにより入力された画素の輝度値データからピーク値とボトム値を抽出する。ピーク値とボトム値は、画素抽出部52cに出力される。
 画素抽出部52cは、輝度値抽出部52bから入力されたピーク値とボトム値とに基づいて、神経細胞の像を構成する対象画素を抽出する。対象画素の情報は、データ処理部53に出力される。対象画素を抽出する方法は、後に詳細に説明する。
 データ処理部(データ処理手段)53は、位相補正部(補正手段)53aと、輝度値データ処理部(処理手段)53bと、輝度値データ同定部(同定手段)53cとを含んでいる。データ処理部53は、抽出部52において抽出された対象画素を参照し、対象画素が有する輝度値データを解析データとして、神経細胞の像を構成する対象画素について解析処理を行う。データ処理部53は、抽出部52に接続されている。また、データ処理部53は、標本輝度値データ記録部55に接続されている。
 位相補正部53aは、抽出された対象画素が有する輝度値データにおいて、画素毎の輝度値データの位相をそろえる為に、ボトム値からピーク値に変化するタイミングを補正する。位相補正部53aは、立ち上がり時間やピーク時間などに基づいて、各輝度値データの位相を補正する。位相補正部53aにより補正された輝度値データは、輝度値データ処理部53bに出力される。
 輝度値データ処理部53bは、位相補正部53aにより位相補正された補正輝度値データの平均を算出する。輝度値データ処理部53bにより算出された平均輝度値データは、表示装置61又は輝度値データ同定部53cに出力される。
 輝度値データ同定部53cは、対象画素により構成される像を同定する。この同定は、輝度値データ処理部53bにより算出された平均輝度値データと、標本輝度値データ記録部55に記録された標本輝度値データとを用いて行われる。
 次に、光測定装置1によって実行される光測定方法を説明すると共に、本実施形態の光測定方法について詳細に説明する。ここでは、動画像データから神経細胞の像を構成する対象画素を抽出する工程を説明する。図5は、一実施形態に係る光測定方法の主要なステップを説明するための図である。
 工程S10は、データ取得装置10の動画像取得部40により実行される。工程S10では、二次元光像の動画像データを取得する(動画像取得ステップ)。この二次元光像は、マイクロプレート20のウェル21の内部に保持された細胞を含む試料Sからの光を含むマイクロプレートの像である。ここで、動画像データとは、所定の時間間隔で検出された二次元画像データを経時的に並べた二次元画像データの集まりである。この動画像データにより、各画素の輝度値の時間変化を抽出することが可能となる。
 はじめに、マイクロプレート20の二次元画像を動画像取得部40の撮像装置45で検出して、動画像データを取得する。このマイクロプレート20は、ウェル21内に細胞を含む試料Sを保持している。動画像データは、予め設定された時間の間だけ取得される。設定される時間は、輝度値の変化においてボトム値からピーク値へ変化し、その後ボトム値まで戻るまでの時間である。即ち、設定される時間は、少なくとも一周期分の波形が確認できる時間であればよく、例えば、10秒以上であればよい。また、設定される時間は、一周期分の波形が確認される時間よりも長く設定され、複数の波形が確認できる時間であってもよい。取得された動画像データは、データ取得装置10からデータ解析装置50へ入力される。
 工程S11は、データ解析装置50により実行される。工程S11では、工程S10でデータ取得装置10により取得された動画像データに対して解析処理を行う(解析処理ステップ)。工程S11は、解析の対象となる対象画素を抽出するステップ(抽出ステップ)と、対象画素について解析処理を実施するステップ(データ処理ステップ)とを有する。
 工程S20は、データ解析装置50の抽出部52により実行される。工程S20では、工程S10で取得された動画像データの画素における輝度値データに基づいて、解析領域の対象となる対象画素を抽出する。工程S20は、輝度値データ取得ステップS21と、輝度値抽出ステップS22と、画素抽出ステップS23とを有する。輝度値データ取得ステップS21では、画素毎における輝度値データを取得する。輝度値抽出ステップS22では、輝度値データの特徴の一例として各画素の輝度値データからピーク値とボトム値とを取得する。画素抽出ステップS23では、ピーク値とボトム値とに基づいて対象画素を抽出する。
 工程S21は、輝度値データ取得部52aにより実行される。工程S21では、画素毎の輝度値データを取得する。
 工程S22は、輝度値抽出部52bにより実行される。工程S22では、工程S21において取得された輝度値データからピーク値とボトム値とを抽出する。ピーク値は、一つの画素における輝度値データの経時変化から、少なくとも1つ抽出される。同様に、ボトム値は、一つの画素における輝度値データの経時変化から、少なくとも1つ抽出される。
 工程S23は、画素抽出部52cにより実行される。工程S23では、工程S22において取得されたピーク値とボトム値とに基づいて、対象画素を抽出する。まず、輝度値の変化の状態を評価する評価値を計算する。この評価値には、輝度値の振幅及び輝度値の変化率(レシオ値)のいずれか一方が用いられる。ピーク値とは、輝度値データに現われるピークの絶対値Lである。ボトム値とは、輝度値データに現われるボトムの絶対値Bである。ボトム値は予め取得されたバックグラウンドの輝度値データを用いてもよい。輝度値の振幅とは、ピーク値とボトム値との差分(L-B)である。輝度値の変化率とは、ボトム値に対するピーク値の比率(L/B)である。
 評価値として、輝度値の振幅のみを用いてもよいし、輝度値の変化率のみを用いてもよい。また、評価値として輝度値の振幅と輝度値の変化率との両方を用いてもよい。評価値として輝度値の振幅と輝度値の変化率との両方を用いるときには、輝度値の振幅を用いて画素を抽出した後に、抽出された画素から輝度値の変化率を用いてさらに抽出してもよい。輝度値の変化率を用いて画素を抽出した後に、抽出された画素から輝度値の振幅を用いてさらに抽出してもよい。
 また、上述した輝度値の振幅及び輝度値の変化率の他に、評価値として、ピーク周期、ピーク回数、ピーク時間、立ち上がり時間、下がり時間、及びピーク変動幅を用いることができる。ピーク周期とは、閾値以上のピークが繰り返される場合の周期をいう。ピーク回数とは、閾値以上のピークが出現する回数をいう。ピーク時間とは、例えば投薬したタイミングのような所定のタイミングからピークに到達するまでの時間をいう。立ち上がり時間とは、ボトム値からピーク値に達するまでの時間をいう。下がり時間とは、ピーク値からボトム値に戻るまでの時間をいう。ピーク変動幅とは、一の画素におけるピーク時間と、該一の画素に隣接する他の画素におけるピーク時間との時間差をいう。
 これらの評価値は、輝度値の振幅及び輝度値の変化率の少なくとも何れか一方と組み合わせて用いることができる。ピーク周期、ピーク回数、ピーク時間、立ち上がり時間、下がり時間、及びピーク変動幅から1つを選択して評価値として組み合わせて用いてもよいし、複数個を選択して評価値として組み合わせて用いてもよい。複数の評価値を用いて画素を抽出するときには、評価値を適用する順番には特に制限はなく、所望の順番で適用することができる。
 一実施形態における抽出には、動画像データから所望の細胞画像を選別する場合と、動画像データに含まれた異なる種類の細胞画像を種類ごとに分類する場合とがある。
 動画像データから所望の細胞画像を選別する場合は、例えば複数の評価値を組み合わせて用いることにより所望の細胞画像を選別することができる。所望の細胞画像が有する輝度値データが、例えば所定の輝度値の振幅及び所定のピーク時間により特定できる場合には、これらの評価値を用いて画素を抽出することにより、動画像データから所望の細胞画像を選別することができる。
 動画像データに含まれた異なる種類の細胞画像を種類ごとに分類する場合は、例えば少なくとも1つの評価値について、複数の閾値を設定することにより種類ごとに分類することができる。例えば、輝度値の振幅について、X1、X2の閾値を設定する。閾値X1は閾値X2より大きい値であるとする。この場合には、輝度値の振幅がX1以上であるグループと、輝度値の振幅がX2以上X1未満であるグループと、輝度値の振幅がX2未満であるグループとに分類することができる。
 工程S30は、データ処理部53により実行される。この工程S30では、工程S20において抽出された神経細胞の像を構成する対象画素に対して解析処理を実行する。工程S30は、補正ステップS31と、処理ステップS32と、同定ステップS33とを有する。補正ステップS31では、解析領域における画素の輝度値データの位相を補正した補正輝度値データを算出する。処理ステップS32では、補正輝度値データに基づいて平均輝度値データを算出する。同定ステップS33では、平均輝度値データと予め取得された標本輝度値データとの対比により、対象画素により構成される像を同定する。
 工程S31は、位相補正部53aにより実行される。この工程S31では、ボトム値からピーク値に変化するタイミングを補正する。細胞から放射される輝度値の経時変化は、細胞の位置や投薬により刺激の伝わり方が異なる場合があるため、反応が現われるタイミングにずれが生じる場合がある。例えば、刺激の中心から離れた位置にある神経細胞の像を構成する画素において反応が現われるタイミングは、刺激の中心に近い位置にある神経細胞の像を構成する画素において反応が現われるタイミングよりも遅い。このタイミングのずれは、ボトム値からピーク値に変化するタイミングを複数の画素間で合わせるようにして、位相補正部53aにより補正される。これにより、測定感度を向上させることができる。なお、タイミングのずれが予め設定された時間の範囲内である場合には、工程S31を省略してもよい。
 工程S32は、輝度値データ処理部53bにより実行される。工程S32では、補正輝度値データに基づいて輝度値データの平均化処理が行われる。平均化処理では、平均輝度値データが算出される。平均輝度値データとは、抽出された対象画素の輝度値データを二次元画像データ毎に平均したデータである。これにより、特定の時間における細胞から放出される光の平均輝度を算出することができる。工程S31で位相補正された補正輝度値データを用いて、各時間における平均輝度値データを算出するので、測定感度を向上させることができる。また、ウェル21中に複数の神経細胞がある場合は、対象画素が構成する神経細胞の領域毎に対象画素の輝度値データを平均した平均輝度データを算出してもよい。
 工程S33は、輝度値データ同定部53cにより実行される。この工程S33では、標本輝度値データを用いて対象画素により構成される像の種類を同定する。この同定処理は、工程S32において算出された平均輝度値データと、予め取得され標本輝度値データ記録部55に記録された標本輝度値データとを対比することにより実行される。例えば、平均輝度値データが標本輝度値データに対して設定される許容差の範囲に含まれるとき、平均輝度値データを有する細胞画像は、標本輝度値データで表される特定の細胞であると同定される。また、工程S33では、標本輝度値データを特定可能な評価値を用いて同定してもよい。
 以下、コンピュータをデータ解析装置50として動作させる光測定プログラムについて説明する。
 一実施形態に係る光測定プログラムは、記録媒体に格納されて提供される。記録媒体としては、フロッピー(登録商標)ディスク、CD-ROM、DVD、或いはROM等の記録媒体、或いは半導体メモリ等が例示される。
 図6は、記録媒体に記録されたプログラムを実行するためのコンピュータのハードウェア構成を示す図である。図7は、記録媒体に記録されたプログラムを実行するためのコンピュータの図である。コンピュータは、CPUを具備しソフトウエアによる処理や制御を行うサーバ装置、パーソナルコンピュータ等の各種データ処理装置を含む。
 図6に示すように、コンピュータ70は、フロッピー(登録商標)ディスクドライブ装置、CD-ROMドライブ装置、DVDドライブ装置等の読取装置72と、オペレーティングシステムを常駐させた作業用メモリ(RAM)73と、記録媒体71に記憶されたプログラムを記憶するメモリ74と、ディスプレイといった表示装置75と、入力装置であるマウス76及びキーボード77と、データ等の送受を行うための通信装置78と、プログラムの実行を制御するCPU79とを備えている。コンピュータ70は、記録媒体71が読取装置72に挿入されると、読取装置72から記録媒体71に格納された光測定プログラムにアクセス可能になり、当該光測定プログラムによって、本実施形態の光測定装置1として動作することが可能になる。
 図7に示すように、光測定プログラムは、搬送波に重畳されたコンピュータデータ信号79としてネットワークを介して提供されるものであってもよい。この場合、コンピュータ70は、通信装置78によって受信した光測定プログラムをメモリ74に格納し、当該光測定プログラムを実行することができる。
 光測定装置1、光測定方法、及び光測定プログラムによれば、マイクロプレート20の二次元光像を検出して、二次元の動画像データを取得する(S10)。
この二次元光像は、マイクロプレート20のウェル21内に保持された細胞を含んでいる。次に、動画像データを構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する(S21)。続いて、輝度値データから輝度値のピーク値とボトム値とを取得する(S22)。ピーク値とボトム値との差分により得られる輝度値の振幅、及びボトム値に対するピーク値の比率により得られる輝度値の変化率の何れか一方に基づいて、複数の画素中から神経細胞の像を構成する対象画素を抽出する(S23)。このように、輝度値の経時変化に基づく輝度値の振幅及び輝度値の変化率を用いているので、経時的に変化する輝度値を有する光が放出されている神経細胞の像を構成する画素を区分けすることができる。
 また、光測定装置1では、評価値が、ピーク周期、ピーク回数、所定のタイミングからピークに達するまでの時間により規定されるピーク時間、ボトム値からピーク値に達するまでの時間により規定される立ち上がり時間、ピーク値からボトム値に戻るまでの時間により規定される下がり時間、及び一の画素におけるピーク時間と、一の画素と隣接する他の画素におけるピーク時間との差分であるピーク変動幅をさらに含んでいる。画素抽出部52cは、ピーク周期、ピーク回数、ピーク時間、立ち上がり時間、下がり時間、及びピーク変動幅のうち少なくとも一つに基づいて対象画素を抽出する。これによれば、輝度値の経時変化を表す評価値としてピーク周期、ピーク回数、ピーク時間、立ち上がり時間、下がり時間、及びピーク変動幅を、神経細胞の像を構成する対象画素を抽出するためのパラメータとして用いて、対象画素を抽出している(S23)。従って、輝度値の経時変化の特徴を詳細に判別することができるので、神経細胞の像を構成する対象画素を精度良く区分けすることができる。
 評価値としてピーク周期を用いた場合は、オシレーション(例えば、神経や筋肉のCaイオン変化)する細胞のオシレーション周期に基づく分類や、薬効後の周期変化に基づく分類が可能となる。また、評価値としてピーク回数を用いた場合は、細胞のオシレーション回数に基づく分類や、薬効後のオシレーション回数に基づく分類が可能となる。また、評価値として立ち上がり時間を用いた場合は、薬効レスポンスの効果として、ピーク値までの到達時間(速度)に基づく分類が可能となる。また、評価値として下がり時間を用いた場合は、薬効後のダメージで戻りが悪い細胞を分類することが可能となる。
 光測定装置1は、解析処理部51が、対象画素を抽出した後に、複数の輝度値データ間における位相のずれを補正することにより補正輝度値データを算出する位相補正部53aと、複数の補正輝度値データを時間毎に平均化して平均輝度値データを算出する輝度値データ処理部53bと、をさらに含んでいてもよい。これによれば、画素抽出部52cにより抽出された画素の輝度値データを補正して補正輝度値データを算出する(S31)。そして、複数の補正輝度値データを平均化して平均輝度値データを算出する(S32)。従って、細胞から放出された光に対する測定感度を向上させた解析処理を行うことができる。
 光測定装置1は、解析処理部51が、平均輝度値データと、予め取得された標本輝度値データとを対比して、対象画素により構成される像を同定する輝度値データ同定部53cをさらに含んでいてもよい。これによれば、所望の細胞画像により構成される像の種類を判別することができる。
<実施例1>
 動画像データを構成する複数の画素から、所定の輝度値データを有する画素を選別する工程を具体的に説明する。図8(a)は、工程S21(輝度値データ取得ステップ)を実行した結果を示す。複数の画素C1~C6のそれぞれは、グラフG1~G6に示された輝度値データを有する。本実施例1では、輝度値データG1を有する画素C1を区分けする過程を例に説明する。
 画素C1を区分けするための評価値には、ピーク回数と、輝度値の振幅と、ピーク時間と、下がり時間とを用いる。ピーク回数の閾値は、1以上2未満である。輝度値の振幅の閾値は、所定の振幅閾値以上である。ピーク時間の閾値は、ts以下である。下がり時間の閾値は、ds以下である。
 次に、各輝度値データG1~G6からピーク値P1~P6とボトム値B1~B6とを取得する(S22)。続いて、ピーク回数を評価値として適用して画素を抽出する。ここで用いられる閾値は‘1以上2未満’である。輝度値データG1~G6において、輝度値データG1,G3,G5,G6のピーク回数は‘1’であり、輝度値データG2のピーク回数は‘0’であり、輝度値データG4のピーク回数は‘2’である。このため、輝度値データG1~G6のうち、閾値‘1以上2未満’を満たすものは、輝度値データG1,G3,G5,G6であるので、図8(b)に示すように、画素C1、C3、C5、C6が抽出される。
 続いて、輝度値の振幅を評価値として適用して画素を抽出する。抽出された画素C1、C3、C5、C6が有するピーク値P1、P3、P5、P6とボトム値B1,B3,B5,B6とを用いて輝度値の振幅を計算する。各輝度値データG1,G3,G5,G6から計算された輝度値の振幅のうち、閾値を満たすものは輝度値データG1,G5,G6であるとすると、図8(c)に示すように、画素C1、C5、C6が抽出される。
 続いて、ピーク時間を評価値として適用して画素を抽出する。まず、抽出された画素C1,C5,C6が有するピーク時間Δt1,Δt5,Δt6を取得する。ここで用いられる閾値は‘ts以下’である。このため、輝度値データG1,G5,G6のうち、閾値を満たすものは、輝度値データG1,G6である。従って、図8(d)に示すように、画素C1、C6が対象画素として抽出される。
 そして、下がり時間を評価値として適用して画素を抽出する。まず、抽出された画素C1、C6が有する下がり時間d1、d2を取得する。ここで用いられる閾値は‘ds以下’である。このため、輝度値データG1,G6のうち、閾値を満たすものは、輝度値データG1である。従って、図8(e)に示すように、画素C1が所定の細胞の像を構成する画素として抽出される。このようにして動画像データから、輝度値データG1を有する複数の画素が区分けされる。
 上述した実施例1の方法は、例えば、カルシウムイオンによる細胞のオシレーション解析に用いることができる。まず、ウェル21の像を構成する全ての画素の輝度値データを取得する。次に、輝度値データから、所定の輝度値データを有する画素を抽出する。続いて、抽出された輝度値データについて平均化処理を行う。そして、ウェル21毎に表示装置61に表示する。例えば、図10に示すように、画面を二次元に配列された複数の表示領域(図10では8×12=96個の表示領域)に区分し、そのそれぞれに対応するウェル21での平均輝度値データを表示する。
 上述した実施例1の方法は、例えば、細胞画像の同定に用いることができる。まず、ウェル21内における所定の細胞を染色させる。次に、動画像取得部40において観察する光の波長を切り替えて、動画像データを取得する。続いて、ウェル21の像を構成する全ての画素の輝度値データを取得する。次に、上述した実施例1のような方法を用いて所定の染色試薬により染色された細胞の像を構成する画素を抽出する。さらに、抽出された画素の輝度値データについて平均化処理を行う。そして、標準輝度値データを用いて、平均化処理された輝度値データの同定を行う。これより、細胞画像の同定を行うことができる。
<実施例2>
 動画像データを構成する複数の画素を所定の分類条件により区分けし、分類した輝度値データを表示させる工程を具体的に説明する。図9(a)は、工程S10(動画像取得ステップ)を実行した後に、工程S21(輝度値データ取得ステップ)を実行した結果を示す。複数の画素C7~C14のそれぞれは、グラフG7~G14に示された輝度値データを有する。本実施例2では、所定条件を満たす輝度値データごとに複数の画素C7~C14を分類する過程を説明する。ここでは、評価値として輝度値の振幅を用いて複数の画素を3つのグループに分類する。そのため、2つの振幅閾値v0,v1が用いられる。振幅閾値v1は振幅閾値v0よりも大きいとする。これによれば、輝度値の振幅がv1以上である画素のグループと、輝度値の振幅がv1未満v0以上である画素のグループと、輝度値の振幅がv0未満である画素のグループに区分けすることができる。
 はじめに各輝度値データG7~G14からピーク値P7~P14及びボトム値B7~B14を取得する。そして、ピーク値P7~P14及びボトム値B7~B14から輝度値の振幅を計算する。
 次に、計算された輝度値の振幅と二つの振幅閾値を用いて複数の画素を分類する。そうすると、図9(b)に示すように、輝度値の振幅がv1以上である画素として、画素C7,C9,C12が抽出される。また、輝度値の振幅がv1未満v0以上である画素としてC8,C14が抽出される。さらに、輝度値の振幅がv0未満である画素としてC11,C13が抽出される。このように、複数の画素C7~C14を3つのグループに区分けすることができる。
 続いて、同じグループに属する輝度値データは、工程S31(補正ステップ)において、画素C7,C9及びC12の間で位相の補正がなされる。同様に、画素C8及びC14間で位相の補正がなされる。さらに、画素C11及びC13の間で位相の補正がなされる。そして、図9(c)に示すように、工程S32(データ処理ステップ)において、補正された輝度値データが合成される。その後、補正された輝度値データG7,G9,G12が合成され、平均輝度値データG15が算出される。補正された輝度値データG8,G14が合成され、平均輝度値データG16が算出される。補正された輝度値データG11,G13が合成され、平均輝度値データG17が算出される。そして、合成された輝度値データG15,G16,G17が、表示装置61に表示される。なお、上述の実施例2では、複数の画素C7~C14を3つのグループに区分けした後に位相補正を行ったが、位相補正は3つのグループに区分けする前に実施してもよい。
 上述した実施例2のように、複数の画素を分類する方法は、例えば、カルシウムイオンを用いた神経細胞等の機能解析に用いることができる。まず、ウェル21の像を構成する全ての画素の輝度値データを取得する。次に、所定の分類条件を用いて輝度値データを分類する。続いて、同じグループに分類された輝度値データについて平均化処理を行う。そして、抽出条件ごとに表示装置61に表示する。
 以上、光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムの一実施形態について説明したが、光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムは、上記実施形態に限定されるものではない。例えば、上述した実施形態では所定の細胞として神経細胞を例に説明したが、所定の細胞は神経細胞とは異なる細胞であってもよい。例えば、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、血球細胞、骨芽細胞、破骨細胞、臓器細胞、株化細胞であってもよい。
 光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムによれば、神経細胞等を含む試料から放出された光を含む画像において、経時的に輝度値が変化する細胞の像を構成する画素を区分けすることができる。
1…光測定装置、20…マイクロプレート、21…ウェル、40…動画像取得部、50…データ処理装置、51…解析処理部、52a…輝度値データ取得部、52b…輝度値抽出部、52c…画素抽出部、S…試料。

Claims (7)

  1.  細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された前記細胞から放出された光を測定する光測定装置であって、
     前記試料ケースの前記保持部の内部に保持された前記試料から放出された光を含む前記試料ケースの二次元光像を検出して、前記二次元光像の動画像データを取得する動画像取得手段と、
     前記動画像データに対して解析処理を行う解析処理手段と、
    を備え、
     前記解析処理手段は、
     前記動画像データに含まれる前記保持部に対応する領域から、前記保持部に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得手段と、
     前記輝度値データから前記輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出手段と、
     前記輝度値の経時変化を評価する評価値を前記ピーク値と前記ボトム値とに基づいて計算し、前記評価値に基づいて前記複数の画素から所定の前記細胞の像を構成する対象画素を抽出する画素抽出手段と、
    を含み、
     前記画素抽出手段は、前記評価値として、前記ピーク値と前記ボトム値との差分により得られる輝度値の振幅、及び前記ボトム値に対する前記ピーク値の比率により得られる輝度値の変化率のうち少なくとも一つに基づいて前記対象画素を抽出する光測定装置。
  2.  前記画素抽出手段は、前記評価値として、ピーク周期、ピーク回数、所定のタイミングからピークに達するまでの時間により規定されるピーク時間、前記ボトム値から前記ピーク値に達するまでの時間により規定される立ち上がり時間、前記ピーク値から前記ボトム値に戻るまでの時間により規定される下がり時間、及び一の画素における前記ピーク時間と前記一の画素と隣接する他の画素における前記ピーク時間との差分であるピーク変動幅、のうち少なくとも一つに基づいて前記対象画素をさらに抽出する請求項1に記載の光測定装置。
  3.  前記解析処理手段は、
     複数の前記輝度値データ間における位相のずれを補正して、位相補正された補正輝度値データを算出する補正手段と、
     複数の前記補正輝度値データを処理して、複数の前記補正輝度値データの平均である平均輝度値データを算出する処理手段と、をさらに含む請求項1又は請求項2に記載の光測定装置。
  4.  前記解析処理手段は、
     前記平均輝度値データと、予め取得された標本輝度値データとを対比して、前記対象画素により構成される像を同定する同定手段、をさらに含む請求項3に記載の光測定装置。
  5.  細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された前記細胞から放出された光を測定する光測定方法であって、
     前記試料ケースの前記保持部の内部に保持された前記試料から放出された光を含む前記試料ケースの二次元光像を検出して、前記二次元光像の動画像データを取得する動画像取得ステップと、
     前記動画像データに対して解析処理を行う解析処理ステップと、
    を備え、
     前記解析処理ステップは、
     前記動画像データに含まれる前記保持部に対応する領域から、前記保持部に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得ステップと、
     前記輝度値データから前記輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出ステップと、
     前記輝度値の経時変化を評価する評価値を前記ピーク値と前記ボトム値とに基づいて計算し、前記評価値に基づいて前記複数の画素から所定の前記細胞の像を構成する対象画素を抽出する画素抽出ステップと、
    を含み、
     前記画素抽出ステップは、前記評価値として、前記ピーク値と前記ボトム値との差分により得られる輝度値の振幅、及び前記ボトム値に対する前記ピーク値の比率により得られる輝度値の変化率のうち少なくとも一つに基づいて前記対象画素を抽出する光測定方法。
  6.  細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された前記細胞から放出された光を測定する光測定プログラムであって、
     コンピュータを、
     動画像取得手段によって取得された、前記試料ケースの前記保持部の内部に保持された前記試料から放出された光を含む前記試料ケースの二次元光像を検出した動画像データに対し、前記動画像データに含まれる前記保持部に対応する領域から、前記保持部に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得手段、
     前記輝度値データから前記輝度値のピーク値とボトム値とを抽出する輝度値抽出手段、
     前記輝度値の経時変化を評価する評価値を前記ピーク値と前記ボトム値とに基づいて計算し、前記評価値に基づいて前記複数の画素から所定の前記細胞の像を構成する対象画素を抽出する画素抽出手段、
     として機能させ、
     前記画素抽出手段は、前記評価値として、前記ピーク値と前記ボトム値との差分により得られる輝度値の振幅、及び前記ボトム値に対する前記ピーク値の比率により得られる輝度値の変化率のうち少なくとも一つに基づいて前記対象画素を抽出する機能を有する光測定プログラム。
  7.  細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された前記細胞から放出された光を測定する光測定装置であって、
     前記試料ケースの前記保持部の内部に保持された前記試料から放出された光を含む前記試料ケースの二次元光像を検出して、前記二次元光像の動画像データを取得する動画像取得手段と、
     前記動画像データに対して解析処理を行う解析処理手段と、
    を備え、
     前記解析処理手段は、
     前記動画像データに含まれる前記保持部に対応する領域から、前記保持部に対応する領域を構成する複数の画素における輝度値の経時変化を示す輝度値データを取得する輝度値データ取得手段と、
     前記輝度値の経時変化を評価する評価値を前記輝度値データの波形の特徴を示す特徴値に基づいて計算し、前記評価値に基づいて前記複数の画素から所定の前記細胞の像を構成する対象画素を抽出する画素抽出手段と、
     前記対象画素における前記輝度値データに対して所定の処理を行うデータ処理部と、を含む光測定装置。
     
     
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