JP2006275771A - 細胞画像解析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞画像を使って行う化合物スクリーニングにおいて、自動化された処理により、細胞に有効な作用を与える化合物を探索し、また、化合物探索を既存の方法より効果的に行う。
【解決手段】撮影条件の異なる複数の細胞画像を取得する撮影手段（５５）と、前記複数の細胞の画像に基づいて、細胞の位置と、少なくとも１つの特徴量を抽出し、前記抽出された特徴量をパラメタとして統計的に解析する解析手段（８０）と、を具備する
【選択図】 図１

Description

本発明は、動植物の細胞画像を画像処理することにより所定のデータ抽出を行う細胞画像解析装置に関する。

バイオテクノロジーや医薬品開発の分野では動植物細胞や微生物などに対する様々な薬品や薬などの物質の効果や影響、またはこれらの物質に対する動植物細胞や微生物等の反応を確認する作業が行われる。

特に、複数の薬品候補から、もっとも細胞に効果のあるものを探す作業は、細胞ベースのスクリーニング、或いは、単純に「細胞スクリーニング」と呼ばれる。この細胞スクリーニングは、通常目視により行われる。例えば、薬剤を投与した細胞と投与していない細胞を顕微鏡で実験者が観察し、視野中の細胞の数をカウントする。これら細胞の総数や、一視野辺りの平均細胞数を計算し、薬剤の細胞を殺す効果を測定することができる。

また、細胞の解析を自動で行う装置としてはフローサイトメーターが知られている。フローサイトメーターは、細胞を浮遊液中に流すことで単離させ各細胞の生死、大きさ、形状などを測定する装置である。フローサイトメーターを使うことで細胞スクリーニングを自動で行うことも可能である。

さらに、簡単な画像解析ソフトを備えた細胞解析装置も存在する。この装置では、目視と同じ手続きで細胞の画像を顕微鏡で取得し、この画像を解析し、自動で薬剤の効果を測定している。

画像解析ソフトを使った装置は、実験者の行う前処理が目視観測を行う場合と同じなので、実験者の負担が少ないという利点がある。一方現在の装置は、画像解析の精度が必ずしも高いとは言えず、また解析対象とするパラメタも、細胞の生死数であるとか、細胞の大よその大きさであるとか、突起の位置であるとか、簡単な単一パラメタとその平均を使った解析を行う程度である。

細胞を使ったスクリーニングは、細胞を観察し、細胞位置を認識し、さらに各細胞の特徴量を抽出し、最後にこれらの特徴量を解析することによって、例えば薬効を予測するなどの作業を行う。細胞の特徴量は、細胞の大きさ、最大半径、突起などの形態的なものや、各細胞の生死なども含む。

画像解析を用いた細胞ベースのスクリーニング技術は、特にフローサイトメーターなど画像を使わない細胞解析と比較して以下の点で優れた特徴をもつ。
（１） 細胞の形態情報を取得することができ、例えば突起伸張効果など形態情報を使って効果を予測するスクリーニングを行うことができる。
（２） 解析を行う前処理として実験者が行わなくてはならない作業、つまり、細胞を単離などの作業を行う必要がなくなり負担を減らすことができる。
（３） 細胞の位置関係がわかるので、例えば細胞周辺の局所的な細胞密度が与える化合物の作用への影響などの、細胞間の相互作用を間接的に考慮に入れた解析を行うことができる。

そこで、細胞スクリーニングを効率よく行い、実験者の負担を軽くするためには、細胞解析を自動化しなければならない。スクリーニング作業の自動化のためには、まず、細胞認識を自動化することが必要とされる。

スクリーニングを効率よく行うには、自動化に伴って、細胞の特徴量パラメタを効率よく選択しなくてはならない。例えば、細胞のサイズを変える効果のある薬品のスクリーニングを、細胞数変化を指標に行っても有効な薬品を見つけることができない。しかしながら既存の細胞解析装置では、細胞の特徴量パラメタはあらかじめ固定されたものを使っているのが普通である。

また、それぞれのパラメタの測定に関して、典型的な例と供にその測定精度が公表され、精度に対する信頼度があらかじめ設定されている。しかしながら、実際の実験においては、各系によって、実験条件や、細胞の状態、撮影条件など様々な要素が異なるので、精度も各実験により異なると考えられる。精度が充分高くないことが判明した場合には、測定の精度を上げるために実験条件の変更などが必要になってくる。例えば、撮影前の細胞に行う前処理を変更するなどがあげられるが、複雑な前処理が必要な系は効率的なスクリーニングには不向きである。従って、各実験、各条件に沿って測定に最適なパラメタを見つけることは、正確な細胞スクリーニングの実現のための重要な要素である。

さらに、フローサイトメーターなどの細胞解析方法と比較して著しく異なるのは、細胞の顕微鏡画像をそのまま解析対象にしている点である。このように、顕微鏡画像を使うことによって、実験手続きが実験者の直接の目視による観察方法に近く、独自の手順を必要としないという実験上の利点があり、さらに、目視と同じ像を使って解析を行うため直感的に結果の解釈ができるという利点がある。

また、細胞スクリーニングは、分子間などの化合物のみの反応を見るいわゆる試験管内での実験in vivoな系と比べて生体内に近いという特徴を持つ。
すなわち、細胞スクリーニングにおいては、細胞を単離する必要がなく、複数の細胞がお互い作用しあっていると思われる状態を観察できるので、より生体内に近い情報を得ることができる。逆にこのことから、詳細なスクリーニング結果を出すには、細胞の相互の位置情報を使った解析をする必要があると思われる。

上記のように、細胞スクリーニング技術においては以下のような課題がある。
（１）スクリーニングを効率よく行うために、スクリーニングで行う各処理を自動化しなくてはならない。特に解析部分では、細胞の画像を正しく解析し、細胞の位置を正確に認識しなければいけない。
（２）計測する細胞のパラメタを効率よく選択しなくてはならない。有効なスクリーニング結果を出すには適切な細胞パラメタの選択が必要である。
（３）スクリーニングのための薬効評価を正しく行うためにパラメタの検証を充分行わなくてはならない。

本発明は、効率の良いスクリーニングを行うことができ、正確な薬剤の効果測定を行うことが可能な細胞画像解析装置を提供することを目的とする。

本発明の一局面に係る細胞画像解析装置は、撮影条件の異なる複数の細胞画像を取得する撮影手段と、前記複数の細胞の画像に基づいて、細胞の位置と、少なくとも１つの特徴量を抽出し、前記抽出された特徴量をパラメタとして統計的に解析する解析手段と、を具備することを特徴とする。

本発明によれば、細胞集団の解析を詳細に行うことができる。特徴量変化の相関を調べることで、例えば特定の化合物で引き起こされる細胞変化を定量的に測定、特徴付けを行うことが可能になり、複数の化合物の効果の比較を効率的に行うことができる。
さらに、画像上での細胞の位置を解析することにより、これら変化に与える細胞間相互の影響を予測することが可能になり、各細胞の位置関係を考慮に入れない解析と比較することにより詳細な化合物解析を行うことができる。

図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。図１を用いて、本発明を実施するための基本的な構成を説明する。図１は本発明の一実施の形態に係る細胞画像解析装置の概略構成を示すブロック図であり、本実施の形態に係る細胞画像解析装置の基本構成として走査型共焦点光学顕微鏡を例示している。

光源２０として、例えば波長４８８ｎｍのアルゴンレーザを用いる。光源２０から出射されたレーザ光はコリメートレンズ２２によりビーム直径が拡大されて、平行光束に変換されてダイクロイックミラー２５に導かれる。ダイクロイックミラー２５に導かれたレーザ光は、ダイクロイックミラー２５で反射されて、ＸＹスキャナ３０に入射し、ＸＹスキャナ３０でＸＹ軸方向に走査される。ＸＹスキャナ３０を通ったレーザ光は、対物レンズ３５に入射し、測定対象である溶液状の試料４２に集光される。なお、ダイクロイックミラー２５は光源２０からのレーザ光の波長の光を反射し、光源２０からのレーザ光の波長より長い波長の光を透過させる。また、ＸＹスキャナ３０として１対のガルバノミラーを互いに向かい合わせたものが通常用いられる。

試料４２は、蛍光物質で標識されて、詳細は後述する顕微鏡の試料ステージ４０上に載置されたマイクロプレート４１上に置かれている。蛍光物質として、例えば、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）が用いられる。試料４２から発せられる蛍光は、対物レンズ３５を再び通過し、ＸＹスキャナ３０を通ってダイクロイックミラー２５を通過し、ミラー５０で反射されてレンズ５１に到達する。レンズ５１で蛍光は集光されて、ピンホール５２の開口部でフォーカスされた後に、光検出器５５で受光される。光検出器５５で受光された蛍光信号は光電流信号に変換され、画像処理部８０に入力され、詳細は後述する信号処理、画像解析等の演算が行われてモニタ上に試料の蛍光画像が抽出される。なお、光検出器５５として通常、光電子増倍管（ＰＭＴ：Photo Multiplier Tube）が用いられる。或いはアバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）のような高感度半導体検出器を用いても良い。

また、図１では、試料を走査して、試料の画像を抽出する方法について記述しているが、これに限らず、試料に一様な光を照射し、試料から発せられる蛍光をＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラやＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサ等を用いて試料の画像を取得しても良い。この場合は、試料を光走査する機構は必要ない。

試料４２を収容する容器として、例えば底面が透明に施された９６穴のマイクロプレート４１が用いられる。対物レンズ３５の先端とマイクロプレート４１の間は、液浸水で満たされている。マイクロプレート４１は、試料ステージ４０の上に保持される。試料ステージ４０には、試料ステージ４０が直交する２方向に移動可能なように、２個のステッピングモータ（図示しない）が取り付けられており、それぞれのステッピングモータは試料ステージコントローラ４５に接続されている。試料ステージコントローラ４５はコンピュータ１０に接続されており、試料ステージ４０を保持し、コンピュータ１０からの指令により、ステッピングモータを駆動することによって試料ステージ４０をＸ方向とＹ方向に移動させて、試料４２面を適切な位置に配置する、
また、対物レンズ３５をＺ方向に移動させることにより、レーザ光のフォーカス位置をＺ軸方向に沿って上下に移動させることができる。

なお、蛍光物質については、ローダミン・グリーンに限ることなく、光源の波長を対応させることができれば、例えば、ＴＭＲ（Tetrame-hylrhodamine）、サイファイヴ（Ｃｙ５）、ＦＩＴＣ（Fluorescein-isothiocyanate）、ＴＯＴＯ１、Ａｃｒｉｄｉｎｅ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄなどを用いても良い。

検出器５５からの出力画像は画像処理部８０に入力して、種々の画像処理が行われる。画像処理部８０は、細胞中心抽出処理部８１と、中心点吟味処理部８２、細胞境界抽出処理部８３と、細胞の特徴量抽出処理部８４と、細胞の統計処理部８５とを備えている。まず、カメラ５５からの出力画像に基づいて、細胞中心抽出処理部８１は、各画像の個々の細胞の中心となる点を検出し抽出する。中心点吟味処理部８２、は複数の画像に対して細胞中心抽出処理部８１で抽出された点を比較することにより、細胞の中心として不適切な検出結果（すなわち、誤検出と思われるもの）を除いた細胞中心を抽出する。細胞境界抽出処理部８３は、中心点吟味処理部８２で抽出された細胞中心点を囲むもっとも適切な境界を抽出する。細胞の特徴量抽出処理部８４は、細胞境界抽出処理部８３の結果に基づいて、個々の細胞の形態的特徴量を抽出する。細胞の統計処理部８５は、細胞の特徴量抽出処理部８４で抽出された特徴量を解析して画像に含まれる細胞の個数を抽出する。

なお、画像処理部８０を構成するハードウェアとしては、例えば汎用コンピュータ或いはパーソナルコンピュータ等のようにコンピュータプログラムによって作動する汎用的な処理装置を用いることができる。また、画像処理部８０は、コンピュータ１０の一部であっても良い。このような場合には、上記のような処理装置に、画像処理部８０として機能させるためのコンピュータプログラム、すなわち細胞中心抽出処理部８１、中心点吟味処理部８２、細胞境界抽出処理部８３、細胞の特徴量抽出処理部８４、細胞の統計処理部８５のそれぞれの機能を実現させるためのプログラムをインストールして細胞画像の処理装置を構成している。

上記のように構成された本発明の一実施の形態に係る細胞画像解析装置の動作を、図２を参照して説明する。図２は本発明の一実施の形態に係る画像処理の流れを示すフロー図である。以下、処理の流れに従って、説明する。

細胞画像の撮影は、一般に、細胞内のたんぱく質や、細胞内の核の染色、または、蛍光たんぱく質の使用（このような染色等を「サンプル操作」と称する）により発色した光を、顕微鏡などで拡大することにより行われることが多い。この撮影は、以下のような手順で、複数枚の画像を撮影することにより行われる（ステップＳ１）。
（１）細胞試料の準備において、観察の対象となる各種条件下での細胞を準備する。
（２）準備した細胞試料に対してのサンプル操作を行う。ここで、複数種類の細胞が混在している試料においては、染色方法によって特定の種類の細胞のみ発光するように操作することができる。この性質を使い、観察したい細胞に対して、当該細胞に応じた特徴的な染色方法あるいは発光の操作を行う。
（３）サンプル操作後の試料４２を細胞画像解析装置のステージ４０に載置し、その位置を固定する。
（４）ステージ４０に載置した試料４２の画像（すなわち、「細胞画像」）をコンピュータ１０のモニタ上に抽出する。この場合、試料の位置を固定したまま、必要な回数だけフィルターの変更を行う等の撮影条件の変更を行い、撮影条件の変更のつど撮影を行う。
（５）マイクロプレート４１を使って細胞の位置を変更し、（４）と同様に、撮影条件を変更しながら複数の細胞画像を撮影する。

上記のようにして細胞画像を撮影したら、各画像について画像上の細胞を認識し、その中心を細胞中心抽出処理部８１で抽出する。この細胞の認識は、例えば、適当な輝度値で画像の二値化を行い、二値化された画像の境界から細胞を含む領域を推定する。これにより、細胞を認識して、各細胞の位置を特定し、その中心を抽出する（ステップＳ２）。

ステップＳ２で抽出された細胞中心が誤検出の可能性があるので、同じ位置で撮影した複数の細胞画像を比較することにより、当該細胞中心が正しいと判定されたものを、中心点吟味処理部８２で抽出する（ステップＳ３）。

ステップＳ３で抽出された細胞中心に対応する細胞の境界を細胞境界抽出処理部８３で抽出する（ステップＳ４）。本ステップにおいて、境界の抽出は、例えば、ステップＳ２と同様に、画像データを二値化して、ステップＳ３で抽出された細胞中心を含むように境界を抽出すればよい。なお、本ステップにより、細胞が高精度で認識できる。

細胞の認識（各細胞の識別）が終了したら、細胞の特徴量抽出処理部８４による特徴量の抽出や細胞の統計処理部８５による細胞の総数の抽出を行って、特徴量や総数を出力する（ステップＳ５）。ここで、細胞の特徴量として、細胞境界抽出処理部８３で抽出された細胞の境界情報をもとに、例えば、細胞の大きさ、最大半径位置、周囲長、あるいは細胞の明るさ、細胞の明るさの偏り具合、などの複数の細胞の特徴量を抽出することが考えられる。

この特徴量を抽出して、比較試験を行うことにより、薬効の評価を行うことができる。例えば、化合物を投与した細胞と、投与していない細胞とに分け、一定の条件でこれら細胞を培養し、これらを比較することにより薬効の評価を行うことができる。具体的には、
（１）細胞を２つの細胞群に分け、１つの細胞群に化合物を投与する。もう一方の細胞群には何も投与しない。
（２）２つの細胞群を一定期間培養する。
（３）細胞の数をパラメタとして、細胞群を上記方法で撮影し、解析を行い、２つの群の細胞数を比較する。

上記のような、評価試験において、例えば培養期間を長くとると、かなりの細胞は死滅することが考えられる。しかし、化合物を投与した細胞群の生存している細胞の数が、明らかに、化合物を投与していない細胞群の数よりも多ければ、当該化合物が細胞を守るなんらかの効果があるということが言及できる。

例えば、各細胞の突起の長さをパラメタとしたような場合には、化合物投与後の突起の長さを計測し、細胞1個あたりの突起の伸びを比較する。このとき、突起の伸びが化合物を投与した細胞群で有為に大きい場合、当該化合物は細胞の突起を伸張させる効果があると結論付けることができる。

このように、本実施形態では、様々な解析により、細胞の特徴量を抽出したり、薬効の評価を行ったりすることができる。以下、具体的に、本実施形態において、特徴量などを抽出するための、統計的な解析方法について説明する。

細胞サイズの分布を取った場合を例に取ると、理想的な統計分布は、正規分布やポアソン分布、或いは２項分布などで与えられる。この場合における分布の特徴は、平均値、分散などのいくつかの統計量で表現することができる。

ところが、細胞を使った化合物スクリーニングの場合は、単一のパラメタの分布も上記のような良く知られた分布を取るとは限らない。このため、本発明の実施形態では、上記のような統計量や、更にそれに加えてピークの位置の検出などにより、より詳細な細胞パラメタの統計解析を行うようにしている。

特に、ピーク位置を検出し、その特徴から化合物の効果を予測する方法を例として以下にあげる。

図３のように、横にパラメタの値、縦に頻度を取った分布図を作成する。なお、図３において、分布の頻度は規格化されているものとする。また、（ａ）は化合物を投与していない場合、（ｂ）は化合物を投与した場合の分布を示すものとする。この場合において、パラメタを細胞のサイズとすれば、その平均値は、サイズの小さい方のピーク位置付近にあり、平均値のみでは、その違いを十分表現することができない。すなわち、単純平均のみでは（ａ）と（ｂ）との分布の特徴を充分に識別することができない。また、特に、（ａ）においては、平均値のみでは、２つのピークを表現できていない。

しかしながら、図３の分布図から明らかなように、（ｂ）では、サイズの小さい方に大きいピークがあるので、化合物が細胞のサイズが小さい値になるような比率を高くする効果を持っていることが分かる。つまり、化合物が、サイズの大きい細胞に作用して縮ませるなどの解釈ができ、さまざまな特徴量に対するパラメタ（以下、「特徴量パラメタ」と称する。単に「パラメタ」と称する場合も特に断らない限り、この特徴量パラメタを示すものとする）を設定することで、それぞれの化合物の特性にあった解釈をすることができる。

次に、特徴量パラメタを複数設定した場合において、複数の特徴量パラメタの相関を検証することにより、化合物の有効性を評価する方法について説明する。なお、複数の特徴量パラメタの相関を検証することにより次のようなことが分かる。つまり、各パラメタの測定精度の検証や、実験系にもっとも適したパラメタの選択が可能になり、この結果、細胞評価にもっとも適したパラメタを選択あるいは設計を行うことができる。

パラメタの相関には、通常、正の相関と負の相関があることが知られている。正の相関は、例えば、詳細は後述する図４において、サイズが大きくなるにつれて半径が大きくなるような関係を有する場合を正の相関を有するといい、逆に、サイズが大きくなるにつれて半径が小さくなるような関係を有する場合を負の相関を有するという。

図４を参照して、相関について更に詳しく説明する。図４は、相関を説明するための散布図である。図４において、縦軸をパラメタｘ１、横軸をパラメタｘ２としている。パラメタとしては、例えば、半径やサイズが考えられるが、それらに限らず、細胞の特徴量を示すものと考えられるものであれば、どのような指標をパラメタとして設定しても構わない。

図４において、まず、図４（ａ）、図４（ｂ）の２つの図を比較した場合、一般に、図４（ａ）は相関が強いと判断され、図４（ｂ）は弱いと判断される。図４（ｂ）の相関が弱いと判断される分布においては、パラメタｘ１のばらつきは少なく、はほぼ一定の値周辺に分布している。一方、パラメタｘ２は、特定の値の周りに分布しているのではなく、ほぼランダムに分布している。従って、図４（ｂ）では、パラメタｘ１に対して、パラメタｘ２は関係のない分布をしていると考えられるので、これら２つのパラメタは相関をもたないと判断される。図４（ａ）では、パラメタｘ１及びパラメタｘ２の２つのパラメタは、一定の値（例えば、平均値）の周辺に分布しているため、この場合は、例えば正の相関を持っていると考えられる。

なお、図４（ｃ）のような負の相関を有する分布も想定でき、このような分布も相関が強いと判断される。図４（ｃ）に示すように、パラメタｘ１が小さくなるにつれて、パラメタｘ２が大きくなっている。

上記の例から、相関の強さは、例えば、次のようにして与えられる。相関が強い場合、横軸の値を固定した場合、縦軸の分布は小さくなる。つまり、縦軸はその値での平均値周辺に多く分布するという特徴が見られる。

例えば、図４において、パラメタｘ１とｘ２が離散的な値（ｉ＜１，２・・・）を取るとする。この場合、まずパラメタｘ２を固定し、パラメタｘ２の値に対応するパラメタｘ１の分布を調べて、その平均を取り、この平均からの差を取る。そして、同様の操作をパラメタｘ２の値を変えて行うことにより、２つのパラメタの相関を見積もることができる。

なお、相関は、式（１）で与えられる。
(1/N0)Sum_{i<N}(1/Misum_{j<Mi}|y(i,j)・avr(y(i)|) 式（１）
ここで、Ｎ０：全体のデータ数
ｉ：横軸の値
ｊ：縦軸の値
ｙ（ｉ、ｊ）：固定された各ｉ上に分布している値
ａｖｒ（ｙ（ｉ））：各ｉの平均値
上記のような方法により２つのパラメタ間の相関を定量化することができる。なお、パラメタが２つを越えるような複数のパラメタ群の場合には、２つずつ相関量を定量することにより、全体のパラメタの相関を計算することができる。

次に、パラメタの絞り込みについて、説明する。
パラメタは、一般に、細胞の特徴量をさす。細胞の特徴量とは、上述したサイズや半径や、更には細胞境界の周囲長等があげられるが、これら特徴量の値を使って、実験等の系（以下、単に「実験系」と称する）の評価が行われる。

例えば、何らかの刺激から細胞を保護する作用のある薬剤を評価する場合を考える。このときの実験系は、細胞及び一定期間培養する装置と細胞に与える刺激等によって構成されている。この系を使った薬剤の評価は、例えば、薬剤投与後、刺激を与えて一定期間が経過した後における、一定範囲内に存在する細胞の平均存在数などによって行われる。

本実施形態では、細胞の特徴量として、細胞数のみを選択しており、その他の特徴量である、各細胞のサイズ等は直接評価対象として扱わないが、このように、特徴量による評価は、多くのパラメタを選択して行うのではなく、少数のパラメタを選択して（すなわち、絞って）行われることが多い。

このように、パラメタを絞って評価を行う１つの理由として、特徴量パラメタの正確な測定や、見積もり自体が難しい場合が多いこと、また、複数のパラメタを取り扱うことは一般的に面倒なこと、などがあげられる。

このため、本発明の実施形態では、複数のパラメタから代表的なパラメタを絞り込んで選択し、選択したパラメタを実験系に合わせて設計を行うことを特徴としている。この場合、パラメタの有効性を考慮することが重要である。パラメタの有効性は、パラメタの結果と薬効との相関が強いことを意味している。例えば、上記の例のように、薬の細胞保護作用と細胞数との間の相関を考慮すると、一般に強い相関があると考えられる。すなわち、細胞が刺激を受けた後、薬剤を投与しない場合よりも多く生き残っているなら、投与した薬剤は有効であると判断できる。従って、薬効を細胞数で判断できると考えられるので、細胞数をパラメタとすることが有効であるといえる。なお、パラメタの有効性は、上記の「薬の細胞保護作用と細胞数の関係」のような特定の知識によってのみ判断されるものではない。例えば、数式の形で与えられた評価関数なども有効なパラメタになりうる。また、相関値を比較するパラメタは、他の測定パラメタのことである。

このことをデータ空間上で考える。細胞の特徴量がｎ種類（すなわち、パラメタがｎ個）であるものとし、各パラメタの値をｘ１、ｘ２、・・・、ｘｎとする。このとき、パラメタはｎ次元データ空間上の点である（ｘ１，ｘ２，・・・，ｘｎ）で表現される。

ここで、例えば、ｘ１は細胞の平均生存数であり、×２は細胞の平均サイズ等である。なお、薬効が、ａ１＝１００、ａ２＝７０等と数値化されているものとする。

薬効を表現する「設計されたパラメタ」は、ｎ次元データ空間上で定義された関数として、Ｆ（ｘ１、ｘ２、・・・、ｘｎ）のように書くことができる。

この関数と薬効の相関は、例えば、
(1/N)sum_{i<N}|ai - Fn(di)|(di=(x1(i)、x2(i)、・・・、xn(i))) 式（２）
のように定義される。ここで、ａｉは正解となる薬効の測定値（あらかじめ測定された参考データ）、Ｆｎ（ｄｉ）は、ｉ番目のデータｄｉを代入した関数Ｆｎの結果である。なお、式（２）では、薬効の測定値と計算した予測値の差の平均を取っているので、相関が高い場合、この値は、小さくなる。

次に、関数を複数個Ｆ１、Ｆ２、・・・、Ｆｍのようにとっていった場合を考える。ここで、Ｆｉ（ｉ＝１、２、・・・、ｍ）は、それぞれ異なる定義を有する関数であって、例えば、Ｆ１＝ｘ１、Ｆ２＝ｘ２のように、単一の変数で表現することもできるし、Ｆ３＝ｘ２−ｘ３等のように任意の式で表現することもできる。関数Ｆｉに対して上記の相関を算出することによって、関数値（誤差値）が最も低いもの（相関が高いもの）を最も「有効な関数」として決定する。本明細書では、この「最も有効な関数」を「最も有効なパラメタ」として定義する。例えば、Ｆ１＝ｘ１、Ｆ２＝ｘ２等のように関数を１パラメタで表現した場合を考えれば、この表現（有効なパラメタ）は適切な表現であることがわかる。

特に、実際の計算においては、変数の数は少ない方が好ましい。これは、測定、計算が短時間で済むためである。更に、変数と薬効の関係が単純で直感的に理解しやすいという利点もある。

以上のように、本発明の実施形態では、パラメタの相関を取り、更に実験系に沿ってパラメタを絞り込み、或いは、最適なパラメタを使って関数によりモデル化を行っている。そして、特にパラメタの有効性を式（２）のように、「結果に対して最も誤差の小さい値を出す関数」と定義した。なお、関数の具体的な与え方としては、（１）パラメタの測定精度や信頼性の評価、（２）変化の表現などによって、最適なパラメタを与えるようにしている。

パラメタとその相関を使った解析の例として、測定精度の評価（検証）について説明する。単純な例として、細胞サイズと細胞の周囲長をパラメタの相関を調べ細胞サイズが正しく測定されているかを検証する方法を説明する。

細胞境界の最大幅として与えられる細胞サイズと細胞の周囲長は、細胞の形態が球状あるいは、楕円状などの場合には、単純な関係式で与えられることが分かっている。よって、例えば細胞とその境界を正しく検出している場合には、２つのパラメタは、この関係式に沿った単純な関係を持つことが予想される。

図４のような分布図において、細胞サイズと細胞の周囲長との関係は、比例関係に近い分布、すなわち散布図上では直線的な分布になることが予想される。

しかしながら、例えば、画像中に本来の検出対象以外のものが含まれている場合には、例えば、図５（ａ）のような形状のもの以外に、図５（ｂ）のような形態のものを検出することも考えられる。この場合、サイズと周囲長の関係は本来予想されるような単純な関係式から大きく外れる。

ここで、周囲長を縦軸、半径を横軸にとった場合、このパラメタに関する分布は図６のようになると予想される。しかしながら、図５（ｂ）に示すような特異な形態を持つ細胞は、例えば、図６中の黒い星印等の位置に現れる。

縦軸及び横軸の平均値とそのばらつきの平均値を計算すると、例えば、このような特異な形態は、平均から大きくずれた点として検出することができる。このばらつきは、式（１）と同様の式で定量化することができる。このようにあらかじめ相関が明確に予想できるようなパラメタの組の場合には、実際のパラメタ相関を取ることにより、実験系や測定方法が評価できることがわかる。

このように、各パラメタの測定値に対する相関を検証することにより、測定自体の精度を予測することができる。また、このように、例えば、細胞のサイズと細胞の周囲長の相関を検証すれば、正しくない細胞検出のデータを除くことができるので、全体の測定結果を正しく補正することができる。すなわち、図６の例では、黒い星印の測定点を平均からのばらつき値で除くことができる。

なお、上記では、測定自体の精度について説明したが、条件による変化についても同様であって、各パラメタの相関を検証することにより、実験系の条件等による変化を最も有効に表現するようなパラメタを選択することが可能になる。

一般的に細胞画像の解析は、高い精度にあるとはいえない。特に実験系や実験条件が異なると、誤差が非常に大きくなる。そこで一つの評価系に対しても複数の評価パラメタを設定する必要がある。この場合において、化合物の薬効評価を行う場合に、例えば、突起伸張の効果を評価する系を考える。ここで、突起の検出は完全であるとは限らないので、各細胞の最大径、周囲長、面積など複数のパラメタの検出を行う。

この突起伸張の評価の場合、細胞を正しく認識し、細胞の境界を正しく認識し、細胞の突起位置を正しく認識し、この突起の長さを正しく認識しなくてはならない。しかし、一般的に、この全ての過程をソフトで自動認識することは難しい。

そこで、上記の本発明の実施形態のように、検出された複数種類のデータと、検出された突起の伸張との相関をとり、その相関に応じて重み付けを与えるようにすれば良い。あるいは、最も相関の高いパラメタを参考パラメタとして取り、参考パラメタの変化も合わせて基本データとしても良い。

以上のような解析により、細胞の薬効評価にもっとも適したパラメタを選択する、あるいは重み付けを変えるなどの、パラメタ設計が可能になるので、細胞解析を効率よく行うことができる。

細胞の位置情報を使った解析例を説明する。細胞を長期間生き残らせる効果のある化合物を探索するという目的で実験を行う場合を例に取ると、細胞の数をカウントすることで化合物の効果を測定することになる。

ここで、例えば細胞が高密度な領域の方が、あるいは複数の細胞が接している状態の方が細胞数の比率が多いという場合、細胞間でなんらかの作用が働き、化合物と作用し、結果細胞がより生き残るという条件を生み出したと解釈することも可能である。

あるいは逆に、細胞間での相互作用の影響を受けていない反応を調べたいと仮定する。この場合、細胞が接していないもののみを、あるいは最近接細胞が一定以上の距離である細胞の特徴量のみを取り、その結果を評価するという方法を取ることもできる。

このような解析方法は、例えば細胞を１００％単離させる手間よりは、５０％単離させる手間のほうが圧倒的に少ない場合などに特に有効な評価系を作ることができる。

上記のように本発明の実施形態によれば、処理が自動化されるため、効率の良いスクリーニングを行うことができる。また、パラメタの選択が効率的になるためスクリーニング結果がより有効になることが期待される。さらに、正確な薬剤の効果測定を行うことが可能になる。

本発明は、上記各実施の形態に限ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。さらに、上記各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。

また、例えば各実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。

本発明の一実施の形態に係る細胞画像解析装置の概略構成を示すブロック図。 本発明の一実施の形態に係る画像処理の流れを示すフロー図。 複数のパラメタを設定する必要性を説明するための図。 パラメタ間の相関関係を説明するための散布図。 細胞の形状の一例を示す図。 特異な形状を有するような細胞の特徴量における相関関係を示す図。

符号の説明

１０…コンピュータ
２０…光源
２２…コリメートレンズ
２５…ダイクロイックミラー
３０…ＸＹスキャナ
３５…対物レンズ
４０…試料ステージ
４１…マイクロプレート
４２…試料
４５…試料ステージコントローラ
５０…ミラー
５１…レンズ
５２…ピンホール
５５…光検出器
８０…画像処理部
８１…細胞中心抽出処理部
８２…中心点吟味処理部
８３…細胞境界抽出処理部
８４…特徴量抽出処理部
８５…統計処理部

Claims (8)

1. 撮影条件の異なる複数の細胞画像を取得する撮影手段と、
   前記複数の細胞の画像に基づいて、細胞の位置と、少なくとも１つの特徴量を抽出し、前記抽出された特徴量をパラメタとして統計的に解析する解析手段と、を具備することを特徴とする細胞画像解析装置。
2. 請求項１に記載の細胞画像解析装置において、前記解析手段は、複数の前記特徴量の相関関係に基づいてパラメタ設計をし、これらのパラメタを用いて化合物の有効性を評価することを特徴とする細胞画像解析装置。
3. 請求項２に記載の細胞画像解析装置において、前記解析手段は、前記相関関係に基づいて、前記パラメタの重み付けを変更することを特徴とする細胞画像解析装置。
4. 請求項２又は請求項３に記載の細胞画像解析装置において、前記解析手段は、前記相関関係と前記測定結果に基づいて、パラメタの測定精度あるいは測定の信頼性を評価することを特徴とする細胞画像解析装置。
5. 請求項４に記載の細胞画像解析装置において、前記解析手段は、前記パラメタの測定精度あるいは測定の信頼性の評価に基づいて、測定系の条件による変化を最も有効に表現するパラメタを選択することを特徴とする細胞画像解析装置。
6. 請求項５に記載の細胞画像解析装置において、前記解析手段は、前記選択されたパラメタに基づいて、細胞評価に最も有効な指標となるパラメタを選択することを特徴とする細胞画像解析装置。
7. 請求項２に記載の細胞画像解析装置において、前記解析手段は、各細胞の位置情報を用いて細胞の特徴量を解析することを特徴とする細胞画像解析装置。
8. 請求項７に記載の細胞画像解析装置において、前記位置情報は、局所的な細胞密度、最近接細胞までの距離、細胞同士が接しているか否かの情報を含むことを特徴とする細胞画像解析装置。

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