JP2005345339A

JP2005345339A - 測定ビーズ、色ビーズ判別装置及び色ビーズ判別方法

Info

Publication number: JP2005345339A
Application number: JP2004166848A
Authority: JP
Inventors: Toru Aoki; 青木　　透; Yasushi Ueda; 泰志上田; Makoto Okazaki; 誠岡崎; Nobuaki Noguchi; 展明野口
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2004-06-04
Filing date: 2004-06-04
Publication date: 2005-12-15

Abstract

【課題】ビーズ表面に塗布する半導体ナノ粒子の配合割合に加え、ビーズ自体の色を検出することによって、多種類のビーズを判別することが可能なビーズ判別方法を提供する。
【解決手段】励起光を照射することにより、粒径によって異なる色を発光する半導体ナノ粒子を光の透過率の高い色ビーズの表面に塗布する。この色ビーズ自体の色及びビーズに塗布された半導体ナノ粒子の色を解析することにより、半導体ナノ粒子の製造精度、ビーズ表面に塗布する半導体ナノ粒子の配合精度及び装置の精度が同程度でも、より多くの種類のビーズを判別することが可能となる。
【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子発現解析等のための測定ビーズ、色ビーズ判別装置及び色ビーズ判別方法に関する。

従来、遺伝子の解析では、蛍光色素を用いて検査対象物を染色し、フローサイトメータ等を用いていた。しかし、蛍光色素の蛍光強度は光依存性が有り、太陽光が当たっても減衰するので、測定するためにレーザー光を照射すると蛍光強度が減衰するという課題をもっていた。

この課題を解決するために、光を照射しても蛍光強度が減衰しない半導体ナノ粒子を用いて遺伝子の解析を行う技術が知られている。半導体ナノ粒子は、励起光を照射すると粒の大きさに応じて異なる色の蛍光を発する為、大きさの違う半導体ナノ粒子の配合割合を変えてビーズの表面に塗ることによって色々な色に発光する複数種類のビーズを作成することができる。それぞれのビーズに異なる遺伝子を結合させて、遺伝子の検出及びビーズの種類を判断することによって、遺伝子の解析を行うことが出来る（例えば、特許文献１参照。）。
特開２００２−３１１０２７号公報（第３−４頁、第３図）

しかしながら前記従来の構成では、ビーズ１種類に対して遺伝子を１種類対応付けて遺伝子の検出を行っている為、同時に多くの種類の遺伝子を検出するには、ビーズの種類を増やさなければならない。従って、特許文献１の技術では、製造するビーズの種類が多くなると、種類の異なるビーズ間の色の違いがより小さくなり、色による遺伝子判別が困難になる。これは、半導体ナノ粒子の製造精度が悪くても、ビーズ表面に塗布する半導体ナノ粒子の配合精度が悪くなっても起こる。

これを解決するためには、より小さな色の違いを検出できるようにフローサイトメータの検出精度を上げるか、半導体ナノ粒子の製造精度やビーズ表面に塗布する半導体ナノ粒子の配合精度を上げることによって種類の異なるビーズ間の色の違いを大きくしていた。しかし、フローサイトメータの検出精度や半導体ナノ粒子の製造精度やビーズ表面に塗布する半導体ナノ粒子の配合精度を上げることにより、遺伝子を検出する為のコストが上昇するという問題があった。

本発明は、前記課題を解決するもので、フローサイトメータの検出精度や半導体ナノ粒子の製造精度およびビーズ表面に塗布する半導体ナノ粒子の配合精度を上げなくても、より多くの種類のビーズを判別することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明の測定ビーズ、色ビーズ判別装置及び色ビーズ判別方法は、粒径に応じて異なる色を発光する半導体ナノ粒子を略球状のビーズ粒子の表面に付着させ、このビーズ粒子を複数個集めて構成された測定ビーズにおいて、前記ビーズ粒子は、光透過率が異なる材料から成り、前記光透過率は所定の範囲に区分されていることを特徴とする。

さらに本発明の測定ビーズ、色ビーズ判別装置及び色ビーズ判別方法は、粒径に応じて異なる色を発光する半導体ナノ粒子を略球状のビーズ粒子の表面に付着させ、このビーズ粒子を複数個集めて構成された測定ビーズにおいて、前記ビーズ粒子は、光の波長別に光透過率が異なる材料から成り、前記光透過率は所定の範囲に区分されていることを特徴とする。

さらに本発明の測定ビーズ、色ビーズ判別装置及び色ビーズ判別方法は、請求項１に記載の測定ビーズに測定すべき試料を混合した被測定物に透過光を照射し透過画像を得るための透過光照射手段と、前記被測定物に励起光を照射し蛍光画像を得るための励起光照射手段と、特定の波長域の光を通す複数のフィルタ手段と、前記被測定物の透過画像及び蛍光画像を撮影する撮影手段と、撮影した画像を記憶する記憶手段と、前記透過画像における前記ビーズ粒子の階調を検出する透過画像検出手段と、前記蛍光画像から前記測定ビーズ毎の蛍光波長別の階調を検出する蛍光画像検出手段と、ビーズの種類を判別する制御手段とを備えることを特徴とする。

さらに本発明の測定ビーズ、色ビーズ判別装置及び色ビーズ判別方法は、前記制御手段は、前記透過画像検出手段で検出した前記測定ビーズ毎の階調と、前記蛍光画像検出手段で検出された前記測定ビーズ毎の蛍光波長成分の分析結果から前記測定ビーズを区別することを特徴とする。

さらに本発明の測定ビーズ、色ビーズ判別装置及び色ビーズ判別方法は、請求項１に記載の測定ビーズを配合した測定サンプルに透過光を照射し透過光画像を得るための透過光検出ステップと、前記透過光画像において、前記測定ビーズを光の透過率の違いから区別するビーズ区別ステップと、前記測定サンプルに励起光を照射し特定の波長域の光を通す複数のフィルタを切り替えながら複数の蛍光画像を得るための蛍光検出ステップと、前記ビーズ区別ステップによって、区別された光の透過率の異なる前記測定ビーズごとに前記蛍光検出ステップによって得た複数の蛍光画像を検出して前記測定ビーズの種類の判別を行うビーズ判別ステップと、からなることを特徴とする。

さらに本発明の測定ビーズ、色ビーズ判別装置及び色ビーズ判別方法は、前記ビーズ区別ステップは、前記透過光画像に対して所定の輝度を基準に２値化処理を行う２値化処理ステップと、前記透過光画像から前記測定ビーズ以外のごみを測定対象から取り除くノイズ除去ステップと、前記透過光画像において重なっている前記測定ビーズを測定対象から取り除く対象外ビーズ除去ステップと、２値化後の前記透過光画像における前記測定ビーズの中心部が明るいかどうかを判別する中心輝度判別ステップと、前記測定ビーズにおいて、光透過率が３種類以上に区分されている場合は、２値化の基準となる輝度を所定の値に変更して２値化処理ステップおよび中心輝度判別ステップを所定の回数繰り返し、中心輝度判別ステップの結果から光の透過率の違いを判別することを特徴とする。

さらに本発明の測定ビーズ、色ビーズ判別装置及び色ビーズ判別方法は、請求項２に記載の測定ビーズに測定すべき試料を混合した被測定物に透過光を照射し透過画像を得るための透過光照射手段と、前記被測定物に励起光を照射し蛍光画像を得るための励起光照射手段と、特定の波長域の光を通す複数のフィルタ手段と、前記被測定物の透過画像及び蛍光画像を撮影する撮影手段と、撮影した画像を記憶する記憶手段と、前記透過画像の前記ビーズ粒子の光の波長別の階調を検出する透過画像検出手段と、前記蛍光画像から前記測定ビーズ毎の蛍光波長別の階調を検出する蛍光画像検出手段と、ビーズの種類を判別する制御手段と、を備えることを特徴とする。

さらに本発明の測定ビーズ、色ビーズ判別装置及び色ビーズ判別方法は、前記制御手段は、前記透過画像検出手段で検出された前記測定ビーズ毎の光の波長別の階調と、前記蛍光画像検出手段で検出された前記測定ビーズ毎の蛍光波長成分の分析結果から前記測定ビーズを区別することを特徴とする。

さらに本発明の測定ビーズ、色ビーズ判別装置及び色ビーズ判別方法は、請求項２に記載の測定ビーズを配合した測定サンプルに透過光を照射し、特定の波長域の光を通す複数のフィルタを切り替えながら複数の透過光画像を得るための透過光検出ステップと、複数の前記透過光画像から前記測定ビーズ毎の光の波長別の階調を検出して、前記測定ビーズの区別を行うビーズ区別ステップと、前記測定サンプルに励起光を照射し、特定の波長域の光を通す複数のフィルタを切り替えながら複数の蛍光画像を得るための蛍光検出ステップと、それぞれの前記透過画像において前記測定ビーズ毎の階調を検出する透過画像処理ステップと、前記ビーズ区別ステップによって、区別された光の波長別の階調の異なる前記測定ビーズごとに、前記蛍光検出ステップによって得た複数の蛍光画像から階調を検出して前記測定ビーズの種類の判別を行うビーズ判別ステップと、からなることを特徴とする。

さらに本発明の測定ビーズ、色ビーズ判別装置及び色ビーズ判別方法は、前記ビーズ区別ステップは、それぞれの前記透過光画像に対して所定の輝度を基準に２値化処理を行う２値化処理ステップと、前記透過光画像から前記測定ビーズ以外のごみを測定対象から取り除くノイズ除去ステップと、前記透過光画像において重なっている前記測定ビーズを測定対象から取り除く対象外ビーズ除去ステップと、２値化後の前記透過光画像における前記測定ビーズの中心部が明るいかどうかを判別する中心輝度判別ステップと、中心輝度判別ステップの結果から光の波長別の階調の違いを判別することを特徴とする。

本発明の色ビーズ判別装置及び判別方法によれば、ビーズの表面に塗布した粒径の異なる半導体ナノ粒子の配合割合と、ビーズ自体の光の透過率や色をビーズの種類の判別に用いることにより、半導体ナノ粒子の製造精度、ビーズ表面に塗布する半導体ナノ粒子の配合精度及び装置の精度が同程度でも、より多くの種類のビーズを判別することが可能となる。

以下に、本発明の色ビーズ判別装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。

図１は本発明の第１の実施例における色ビーズ判別装置のブロック図、図２は、本発明の実施例におけるビーズに半導体ナノ粒子を塗布した塗布済みビーズの模式図を示す。表１は、赤色、緑色、青色に発光する３種類の半導体ナノ粒子の配合割合を色ごとに３段階に分けた場合に製造可能な色ビーズの種類を示す。

図２において２０１，２１１は青色に発光する半導体ナノ粒子、２０２，２１２は緑色に発光する半導体ナノ粒子、２０３，２１３は赤色に発光する半導体ナノ粒子である。図２ａには、塗布済み黒ビーズ２１０を示す。この黒ビーズは、特定のｍＲＮＡを補足でき、かつ、黒い（６６０ｎｍの波長の光の透過率が０％）粒径１０μｍのビーズである。この黒ビーズに青色、緑色、赤色の半導体ナノ粒子を所定の配合割合で塗布し、塗布済み黒ビーズ２１０が出来る。図２ｂには、塗布済み透明ビーズ２００を示す。この透明ビーズは、黒ビーズとは異なるｍＲＮＡを補足でき、かつ６６０ｎｍの波長の光の透過率が７０％以上の粒径１０μｍのビーズである。この透明ビーズに、赤色、緑色、青色に発光する半導体ナノ粒子を所定の割合で塗布し、塗布済み透明ビーズ２００が出来る。

次に半導体ナノ粒子の配合割合を説明する。半導体ナノ粒子は、３色あり、おのおのの色ごとに混ぜる割合は３段階あるので、合計２７とおりの組み合わせがある。しかし青色：緑色：赤色の輝度比が（０：０：１）と（０：０：２）の場合は、どちらも赤色の半導体ナノ粒子のみを塗布することになるので、両者は同一のビーズとなる。同様に、青色：緑色：赤色の輝度比が（１：１：１）と（２：２：２）の時も、どちらも青色、緑色、赤色の半導体ナノ粒子を（１：１：１）で塗布することになるので、両者は同一のビーズとなる。従って、この同一のビーズとなる組み合わせを取り除くと２０種類のビーズを作成できる。表１にビーズの種類を示す。

ここで、表１に示す配合割合で半導体ナノ粒子を配合しビーズ表面に塗布することにより、塗布済み透明ビーズ２００及び塗布済み黒ビーズ２１０を作成する。ビーズ自体の光の透過率が異なるので、塗布済み透明ビーズ２００と塗布済み黒ビーズ２１０の区別は、光の透過率を利用すれば容易に行える。従って、光透過率の異なる二種類のビーズを用いることで、システムが判別可能なビーズの種類を２０種類から４０種類に増やすことができる。

図１、図２を用いて、色ビーズ読み取り装置が塗布済み透明ビーズ２００及び塗布済み黒ビーズ２１０の種類を判別する際の動作について説明する。図１において、ウエルプレート１０１は、観察対象（図示せず。ｍＲＮＡやタンパク質を、半導体ナノ粒子やビーズと結合させたもの）を注入する複数個のウエル１０２から構成され、ウエルプレート駆動手段１０３により２次元平面ＸＹ方向に移動できるものとする。ＣＰＵ１０４は装置全体を制御する。まずＣＰＵ１０４は、ウエルプレート駆動手段１０３を制御して、観察対象が注入されたウエル１０２が対物レンズ１０５の真上に位置するように、ウエルプレート１０１を移動させるとともに、光学フィルタ１０８が実装されていない箇所が、対物レンズ１０５の真上に位置するように、フィルタホイール駆動手段１１５を制御してフィルタホイール１１４を回転させる。

次にＣＰＵ１０４は、ＬＥＤ１０６を点灯し、ウエル１０２にＬＥＤ光を照射する。ＬＥＤ光による、ウエル１０２内の観察対象の透過画像は、対物レンズ１０５により拡大され、ダイクロイックミラー１０７及びフィルタホイール１１４の光学フィルタ１０８未実装部分を通過し、さらに、結像レンズ１０９によって集光されて、ＣＣＤカメラ１１０に到達する。対物レンズ１０５は、ウエル１０２内の観察対象の画像を拡大するためのレンズであり、ダイクロイックミラー１０７は、所定の波長未満の光を反射し、所定の波長以上の光を通過するミラーである。

光学フィルタ１０８は、所定の波長域のみを通過するバンドパスフィルタである。本実施例では、青色、緑色、赤色用のバンドパスフィルタを装着し、透過画像撮影時には、光学フィルタ１０８は使用しないものとする。結像レンズ１０９は、光を集光するためのレンズである。ＣＣＤカメラ１１０は、結像レンズ１０９によって集光された光を二次元画像データに変換して出力する画像検出手段である。ＣＰＵ１０４は、ＣＣＤカメラ制御手段１１１に指令を与え、ＣＣＤカメラ１１０によって観察対象の透過画像を撮影する。

ＣＰＵ１０４の自動焦点調整プログラム（図示せず）は、前記透過画像から画像のコントラスト値を計算し、このコントラスト値が最大になる位置を見つけ出すことによって、対物レンズ１０５の焦点を合わせる。ＣＰＵ１０４の自動焦点調整プログラムは、対物レンズ１０５を、２次元平面ＸＹと垂直となる方向（Ｚ軸方向）へ、Ｚ軸駆動手段１１２によって移動させながら、前記コントラスト値が最大となる対物レンズ１０５の位置を見つけ出す。ＣＰＵ１０４は、対物レンズ１０５の焦点が合った状態で撮影した観察対象の透過画像を、ＢＦＩ（ＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄＩｍａｇｅ）として、書き込み手段１２０を通して記憶手段１３０へ格納する。

透過画像検出手段１５０は、読み出し手段１４０を通して記憶手段１３０よりＢＦＩを読み出し、全画素に対して２値化処理を行ない、２値化後のデータを記憶手段１３０に格納する。ゴミによる誤検出を防ぐために、透過画像検出手段１５０は、２値化後の画像から対象物の輪郭を抽出し、対象物の面積及び縦横比を求め、一定の大きさの範囲に入っていないものは検査対象から除外する。また、観察対象物の測定結果が周辺の観察対象物の影響を受けないように、一定の距離以上離れていないものの除外を行い、最終的に検査対象となる塗布済み黒ビーズ２１０と塗布済み透明ビーズ２００の位置情報をビーズ種別記憶手段１８０に記憶する。

ビーズ種類判別手段１７０は、ビーズ種別記憶手段１８０に記憶された塗布済み透明ビーズ２００と塗布済み黒ビーズ２１０の位置情報を取り出し、取り出した位置情報に基づいて記憶手段１３０に格納されている２値化後のＢＦＩイメージから、各ビーズのデータを読み出す。２値化後のＢＦＩイメージを図４に示す。塗布済み透明ビーズ２００は、ビーズ自体がレンズの役目を果し、集光する為、中心部が明るく周辺部が暗くなる。また、塗布済み黒ビーズ２１０は光を通さないため、全体が暗くなる。ビーズ種類判別手段１７０は、ビーズの中心部の画素データが明るければ塗布済み透明ビーズ２００と判断し、ビーズの中心部の画素データが暗ければ塗布済み黒ビーズ２１０と判断して、それぞれのビーズを区別した新たな位置情報ｘを作成し、ビーズ種別記憶手段１８０に格納する。

次に、ＣＰＵ１０４は、光学フィルタ１０８が実装されている箇所が、対物レンズ１０５の真上に位置するように、フィルタホイール駆動手段１１５を制御してフィルタホイール１１４を回転させるとともに、ＬＥＤ１０６を消灯し、励起光源１１３から励起光を照射する。励起光は、青色レーザー光のような短波長の光であり、ダイクロイックミラー１０７に当たると、ダイクロイックミラー１０７が所定の波長以下の光を反射するという性質によって、対物レンズ１０５の方向へ励起光を反射する。

対物レンズ１０５はダイクロイックミラー１０７からの光をウエル１０２内の観察対象に集光させる。ウエル１０２内の観察対象に付着した半導体ナノ粒子は、対物レンズ１０５から照射された光によって励起され、ダイクロイックミラー１０７を通過できる所定の波長以上の光を発光する。観察対象に付着した半導体ナノ粒子が発光した光は、前記観察対象の透過光と同様に、対物レンズ１０５、ダイクロイックミラー１０７、光学フィルタ１０８を通過し、さらに、結像レンズ１０９によって集光されて、ＣＣＤカメラ１１０に到達する。

このとき、光学フィルタ１０８は、特定の波長域のみを通過させる性質を持つため、観察対象に付着した半導体ナノ粒子が発光した光の特定の波長域のみが、ＣＣＤカメラ１１０に到達する。この状態で、ＣＰＵ１０４は、ＣＣＤカメラ制御手段１１１に指令を与え、ＣＣＤカメラ１１０によって観察対象に付着した半導体ナノ粒子が発光した光のうち、光学フィルタ１０８を通過した特定の波長域のみの光の二次元画像データをＣＣＤカメラ制御手段１１１及び書き込み手段１２０を通して記憶手段１３０へ格納する。

光学フィルタ１０８は、通過波長域の異なるものが複数あり、フィルタホイール１１４に取り付けられている。フィルタホイール１１４は、フィルタホイール駆動手段１１５によって回転し、光学フィルタ１０８を切り替えることができる。ＣＰＵ１０４は、光学フィルタ１０８を切り替えながら、上記の方法によって観察対象に付着した半導体ナノ粒子が発光した光の種々の波長域の画像を撮影し、同様の処理を繰り返す。

蛍光画像検出手段１６０は、このようにして撮影された複数枚の蛍光画像データを記憶手段１３０から、読み出し手段１４０を介して読み出して、塗布済み黒ビーズ２１０及び塗布済み透明ビーズ２００ビーズがそれぞれ発する蛍光の波長成分を分析する。ＣＰＵ１０４は、ビーズ種別記憶手段１８０に格納されている位置情報ｘを参照して、塗布済み透明ビーズ２００の蛍光画像と、塗布済み黒ビーズ２１０の蛍光画像とを区分けする。ＣＰＵ１０４は、塗布済み透明ビーズ２００の蛍光画像における蛍光波長成分の分析結果から、表１に示されているビーズの種類（各半導体ナノ粒子の配合の割合）を判別する。次にＣＰＵ１０４は、塗布済み黒ビーズ２１０の蛍光画像における蛍光波長成分の分析結果から、表１に示されているビーズの種類を判別する。このような処理を行うことによって、表1に示されている種類の２倍のビーズを判別することが可能となる。

なお、本実施例では、２種類の透過率の異なるビーズを例としているが、２種類以上の光の透過率の異なるビーズを用いることにより、より多くの種類のビーズを判別することができる。

また、本実施例では、半導体ナノ粒子を３種類、光学フィルタ１０８を３種類の構成の実施例を示しているが、半導体ナノ粒子及び光学フィルタ１０８の種類は３種類よりも多くても、少なくてもよい。

本発明の実施例１は光の透過率が異なるビーズを用いることによって、検出できるビーズの種類を増やすのに対し実施例２では、光の透過率が高い色付の素材で製造されたビーズまたは、ビーズ表面を光の透過率が高い塗料で着色したビーズを用いることによってビーズの種類を増やすところが異なる。よって、実施例２では、装置の構成自体は実施例１とまったく同じで、装置の動作を変えることにより、ビーズの判別を行う。

図３において３０１、３１１、３２１は青色に発光する半導体ナノ粒子、３０２、３１２、３２２は緑色に発光する半導体ナノ粒子、３０３、３１３、３２３は赤色に発光する半導体ナノ粒子である。

図３ａは、塗布済み赤ビーズ３００を示す。これは、光の透過率５０％以上の粒径１０μｍの赤色のビーズに、赤色、緑色、青色に発光する半導体ナノ粒子を所定の割合で塗布したものである。図３ｂは、塗布済み緑ビーズ３１０を示す。これは、光の透過率５０％以上の粒径１０μｍの緑色のビーズに、赤色、緑色、青色に発光する半導体ナノ粒子を所定の割合で塗布したものである。図３ｃは、塗布済み青ビーズ３２０を示す。これは、光の透過率５０％以上の粒径１０μｍの青色のビーズに、赤色、緑色、青色に発光する半導体ナノ粒子を所定の割合で塗布したものである。

実施例１の表１と同様に、青色、緑色、赤色に発光する３種類の半導体ナノ粒子の配合割合を色ごとに３段階に分けた場合は、塗布済み赤ビーズ３００、塗布済み緑ビーズ３１０及び塗布済み青ビーズ３２０をそれぞれ２０種類ずつ製造することができる。塗布済み赤ビーズ３００、塗布済み緑ビーズ３１０及び塗布済み青ビーズ３２０は、ビーズ自体に着色された色の違いで容易に判別できる。従って、これら各３種類の塗布済みビーズを用いることによってシステムが判別可能なビーズの種類を２０種類から６０種類に増やすことができる。

図１、図３を用いて、色ビーズ読み取り装置が塗布済み赤ビーズ３００、塗布済み緑ビーズ３１０及び塗布済み青ビーズ３２０の種類を判別する際の動作について説明する。図１において、ウエルプレート１０１は、観察対象（図示せず。ｍＲＮＡやタンパク質を、半導体ナノ粒子やビーズと結合させたもの）を注入する複数個のウエル１０２から構成され、ウエルプレート駆動手段１０３により２次元平面ＸＹ方向に移動できるものとする。

ＣＰＵ１０４は装置全体を制御する。まずＣＰＵ１０４は、ウエルプレート駆動手段１０３を制御して、観察対象が注入されたウエル１０２が対物レンズ１０５の真上に位置するように、ウエルプレート１０１を移動させるとともに、赤色の光をとおす光学フィルタ１０８が実装されている箇所が、対物レンズ１０５の真上に位置するように、フィルタホイール駆動手段１１５を制御してフィルタホイール１１４を回転させる。

次に、ＣＰＵ１０４は、ＬＥＤ１０６を点灯し、ウエル１０２にＬＥＤ光を照射する。ＬＥＤ光による、ウエル１０２内の観察対象の透過画像は、対物レンズ１０５により拡大され、ダイクロイックミラー１０７及びフィルタホイール１１４の光学フィルタ１０８を通過し、さらに、結像レンズ１０９によって集光されて、ＣＣＤカメラ１１０に到達する。対物レンズ１０５は、ウエル１０２内の観察対象の画像を拡大するためのレンズであり、ダイクロイックミラー１０７は、所定の波長未満の光を反射し、所定の波長以上の光を通過するミラーである。

光学フィルタ１０８は、所定の波長域のみを通過するバンドパスフィルタであり、本実施例では、青色、緑色、赤色用の３種類を装着してある。結像レンズ１０９は、光を集光するためのレンズである。ＣＣＤカメラ１１０は、結像レンズ１０９によって集光された光を二次元画像データに変換して出力する画像検出手段である。ＣＰＵ１０４は、ＣＣＤカメラ制御手段１１１に指令を与え、ＣＣＤカメラ１１０によって観察対象の透過画像を撮影する。

ＣＰＵ１０４の自動焦点調整プログラム（図示せず）は、前記透過画像から画像のコントラスト値を計算し、このコントラスト値が最大になる位置を見つけ出すことによって、対物レンズ１０５の焦点を合わせる。ＣＰＵ１０４の自動焦点調整プログラムは、対物レンズ１０５を、２次元平面ＸＹと垂直となる方向（Ｚ軸方向）へ、Ｚ軸駆動手段１１２によって移動させながら、前記コントラスト値が最大となる対物レンズ１０５の位置を見つけ出す。ＣＰＵ１０４は、対物レンズ１０５の焦点が合った状態で撮影した観察対象の透過画像を、ＲＢＦＩ（ＲｅｄＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄＩｍａｇｅ）として、書き込み手段１２０を通して記憶手段１３０へ格納する。

透過画像検出手段１５０は、読み出し手段１４０を通して記憶手段１３０よりＲＢＦＩを読み出し、全画素に対して２値化処理を行ない、２値化後のデータを記憶手段１３０に格納する。ゴミによる誤検出を防ぐために、透過画像検出手段１５０は、２値化後の画像から対象物の輪郭を抽出し、対象物の面積及び縦横比を求め、一定の大きさの範囲に入っていないものは検査対象から除外する。また、観察対象物の測定結果が周辺の観察対象物の影響を受けないように、一定の距離以上離れていないものを除外し、最終的に検査対象となる塗布済み赤ビーズ３００、塗布済み緑ビーズ３１０及び塗布済み青ビーズ３２０の位置情報をビーズ種別記憶手段１８０に記憶する。続いてＣＰＵ１０４は、緑色の光をとおす光学フィルタ１０８が実装されている箇所が、対物レンズ１０５の真上に位置するように、フィルタホイール駆動手段１１５を制御してフィルタホイール１１４を回転させる。ＣＰＵ１０４は、ＧＢＦＩ（ＧｒｅｅｎＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄＩｍａｇｅ）を撮影する。透過画像検出手段１５０は、読み出し手段１４０を通して記憶手段１３０よりＧＢＦＩを読み出し、全画素に対して２値化処理を行ない、２値化後のデータを記憶手段１３０に格納する。同様にＣＰＵ１０４は、青色の光をとおす光学フィルタ１０８が実装されている箇所が対物レンズ１０５の真上に位置するようにフィルタホイール駆動手段１１５を制御後、ＢＢＦＩ（ＢｌｕｅＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄＩｍａｇｅ）を撮影する。透過画像検出手段１５０は、読み出し手段１４０を通して記憶手段１３０よりＢＢＦＩを読み出し、全画素に対して２値化処理を行ない、２値化後のデータを記憶手段１３０に格納する。

ビーズ種類判別手段１７０は、ビーズ種別記憶手段１８０に記憶された塗布済み赤ビーズ３００、塗布済み緑ビーズ３１０及び塗布済み青ビーズ３２０の位置情報を取り出し、取り出した位置情報に基づいて記憶手段１３０に格納されている２値化後のＲＢＦＩイメージから、各ビーズのデータを読み出す。２値化後のＲＢＦＩイメージを図５に示す。塗布済み赤ビーズ３００は、赤色の光に対してビーズ自体がレンズの役目を果し、集光する為、中心部が明るく周辺部が暗くなる。また、塗布済み緑ビーズ３１０及び塗布済み青ビーズ３２０は赤色の光を通さないため、全体が暗くなる。ビーズ種類判別手段１７０は、各ビーズの中心部の画素データが、明るければ塗布済み赤ビーズ３００と判断して、塗布済み赤ビーズ３００を区別した新たな位置情報Ｒｘを作成し、ビーズ種別記憶手段１８０に格納する。

ビーズ種類判別手段１７０は同様にして、ビーズ種別記憶手段１８０に記憶された塗布済み赤ビーズ３００、塗布済み緑ビーズ３１０及び塗布済み青ビーズ３２０の位置情報を取り出し、取り出した位置情報に基づいて記憶手段１３０に格納されている２値化後のＧＢＦＩイメージ及びＢＢＦＩイメージから、塗布済み緑ビーズ３１０を区別した新たな位置情報Ｇｘ及び塗布済み青ビーズ３２０を区別した新たな位置情報Ｂｘを作成し、ビーズ種別記憶手段１８０に格納する。

次に、ＣＰＵ１０４は、赤色の光をとおす光学フィルタ１０８が実装されている箇所が、対物レンズ１０５の真上に位置するように、フィルタホイール駆動手段１１５を制御してフィルタホイール１１４を回転させるとともに、ＬＥＤ１０６を消灯し、励起光源１１３から励起光を照射する。励起光は、青色レーザー光のような短波長の光であり、ダイクロイックミラー１０７に当たると、ダイクロイックミラー１０７が所定の波長以下の光を反射するという性質によって、対物レンズ１０５の方向へ反射する。

対物レンズ１０５はダイクロイックミラー１０７からの光をウエル１０２内の観察対象に集光させる。ウエル１０２内の観察対象に付着した半導体ナノ粒子は、対物レンズ１０５から照射された光によって、励起されダイクロイックミラー１０７を通過できる所定の波長以上の光を発光する。観察対象に付着した半導体ナノ粒子が発光した光は、前記観察対象の透過光と同様に、対物レンズ１０５、ダイクロイックミラー１０７、光学フィルタ１０８を通過し、さらに、結像レンズ１０９によって集光されて、ＣＣＤカメラ１１０に到達する。

同様にＣＰＵ１０４は、緑色、青色の光をとおす光学フィルタ１０８を切り替えながら、上記の方法によって観察対象に付着した半導体ナノ粒子が発光した光のそれぞれの波長域の画像を撮影し、同様の処理を繰り返す。蛍光画像検出手段１６０は、このようにして撮影された複数枚の蛍光画像データを記憶手段１３０から、読み出し手段１４０を介して読み出して、塗布済み赤ビーズ３００、塗布済み緑ビーズ３１０及び塗布済み青ビーズ３２０がそれぞれ発する蛍光の波長成分を分析する。ＣＰＵ１０４は、ビーズ種別記憶手段１８０に格納されている位置情報Ｒｘ、Ｇｘ、Ｂｘを参照して、塗布済み赤ビーズ３００、塗布済み緑ビーズ３１０及び塗布済み青ビーズ３２０の蛍光画像をそれぞれ区分けする。ＣＰＵ１０４は、塗布済み赤ビーズ３００、塗布済み緑ビーズ３１０及び塗布済み青ビーズ３２０の蛍光画像における蛍光波長成分の分析結果から、表１に示されているビーズの種類（各半導体ナノ粒子の配合割合）を判別する。このような処理を行うことによって、表1に示されている種類の３倍のビーズを判別することが可能となる。

なお、本実施例では、３種類の透過率５０％以上の色ビーズを例としているが、３種類以上の色の異なるビーズを用いることにより、より多くの種類のビーズを判別することができる。

また、本実施例では、光の透過率５０％以上の色ビーズを用いているが、装置の検出精度によって、光の透過率が５０％より小さくても実現可能である。

また、本実施例では、半導体ナノ粒子を三種類、光学フィルタ１０８を三種類の構成の実施例を示しているが、半導体ナノ粒子及び光学フィルタ１０８の種類は三種類よりも多くても、少なくてもよい。

本発明にかかる色ビーズ判別装置は、ビーズ自体の光の透過率または色をビーズの判別の情報に用いることにより、より多くの種類のビーズを判別することができる為、多くの種類の遺伝子を一度に解析を行う、遺伝子解析装置等として有用である。

本発明の実施例１及び２における色ビーズ判別装置のブロック図本発明の実施例１における色ビーズ及び基準ビーズの構造図本発明の実施例２における色ビーズ及び基準ビーズの構造図本発明の実施例１における透過画像のイメージ図本発明の実施例２における透過画像のイメージ図

符号の説明

１０１ウエルプレート
１０２ウエル
１０３ウエルプレート駆動手段
１０４ＣＰＵ
１０５対物レンズ
１０６ＬＥＤ
１０７ダイクロイックミラー
１０８光学フィルタ
１０９結像レンズ
１１０ＣＣＤカメラ
１１１ＣＣＤカメラ制御手段
１１２Ｚ軸駆動手段
１１３励起光源
１１４フィルタホイール
１１５フィルタホイール駆動手段
１２０書き込み手段
１３０記憶手段
１４０読み出し手段
１５０透過画像検出手段
１６０蛍光画像検出手段
１７０ビーズ種類判別手段
１８０ビーズ種別記憶手段
２００塗布済み透明ビーズ
２０１、２１１青色に発光する半導体ナノ粒子
２０２、２１２緑色に発光する半導体ナノ粒子
２０３、２１３赤色に発光する半導体ナノ粒子
２１０塗布済み黒ビーズ
３００塗布済み赤ビーズ
３０１、３１１、３２１青色に発光する半導体ナノ粒子
３０２、３１２、３２２緑色に発光する半導体ナノ粒子
３０３、３１３、３２３赤色に発光する半導体ナノ粒子
３１０塗布済み緑ビーズ
３２０塗布済み青ビーズ

Claims

粒径に応じて異なる色を発光する半導体ナノ粒子を略球状のビーズ粒子の表面に付着させ、このビーズ粒子を複数個集めて構成された測定ビーズにおいて、前記ビーズ粒子は、光透過率が異なる材料から成り、前記光透過率は所定の範囲に区分されていることを特徴とする測定ビーズ。
粒径に応じて異なる色を発光する半導体ナノ粒子を略球状のビーズ粒子の表面に付着させ、このビーズ粒子を複数個集めて構成された測定ビーズにおいて、前記ビーズ粒子は、光の波長別に光透過率が異なる材料から成り、前記光透過率は所定の範囲に区分されていることを特徴とする測定ビーズ。
請求項１に記載の測定ビーズに測定すべき試料を混合した被測定物に透過光を照射し透過画像を得るための透過光照射手段と、
前記被測定物に励起光を照射し蛍光画像を得るための励起光照射手段と、
特定の波長域の光を通す複数のフィルタ手段と、
前記被測定物の透過画像及び蛍光画像を撮影する撮影手段と、
撮影した画像を記憶する記憶手段と、
前記透過画像における前記ビーズ粒子の階調を検出する透過画像検出手段と、
前記蛍光画像から前記測定ビーズ毎の蛍光波長別の階調を検出する蛍光画像検出手段と、
ビーズの種類を判別する制御手段と、を備えることを特徴とする色ビーズ判別装置。
前記制御手段は、前記透過画像検出手段で検出した前記測定ビーズ毎の階調と、前記蛍光画像検出手段で検出された前記測定ビーズ毎の蛍光波長成分の分析結果から前記測定ビーズを区別することを特徴とする請求項３に記載の色ビーズ判別装置。
請求項１に記載の測定ビーズを配合した測定サンプルに透過光を照射し透過光画像を得るための透過光検出ステップと、
前記透過光画像において、前記測定ビーズを光の透過率の違いから区別するビーズ区別ステップと、
前記測定サンプルに励起光を照射し特定の波長域の光を通す複数のフィルタを切り替えながら複数の蛍光画像を得るための蛍光検出ステップと、
前記ビーズ区別ステップによって、区別された光の透過率の異なる前記測定ビーズごとに前記蛍光検出ステップによって得た複数の蛍光画像を検出して前記測定ビーズの種類の判別を行うビーズ判別ステップと、からなることを特徴とする色ビーズ判別方法。
前記ビーズ区別ステップは、前記透過光画像に対して所定の輝度を基準に２値化処理を行う２値化処理ステップと、
前記透過光画像から前記測定ビーズ以外のごみを測定対象から取り除くノイズ除去ステップと、
前記透過光画像において重なっている前記測定ビーズを測定対象から取り除く対象外ビーズ除去ステップと、
２値化後の前記透過光画像における前記測定ビーズの中心部が明るいかどうかを判別する中心輝度判別ステップと、
前記測定ビーズにおいて、光透過率が３種類以上に区分されている場合は、２値化の基準となる輝度を所定の値に変更して２値化処理ステップおよび中心輝度判別ステップを所定の回数繰り返し、中心輝度判別ステップの結果から光の透過率の違いを判別することを特徴とする請求項５に記載の色ビーズ判別方法。
請求項２に記載の測定ビーズに測定すべき試料を混合した被測定物に透過光を照射し透過画像を得るための透過光照射手段と、
前記被測定物に励起光を照射し蛍光画像を得るための励起光照射手段と、
特定の波長域の光を通す複数のフィルタ手段と、
前記被測定物の透過画像及び蛍光画像を撮影する撮影手段と、
撮影した画像を記憶する記憶手段と、
前記透過画像の前記ビーズ粒子の光の波長別の階調を検出する透過画像検出手段と、
前記蛍光画像から前記測定ビーズ毎の蛍光波長別の階調を検出する蛍光画像検出手段と、
ビーズの種類を判別する制御手段と、を備えることを特徴とする色ビーズ判別装置。
前記制御手段は、前記透過画像検出手段で検出された前記測定ビーズ毎の光の波長別の階調と、前記蛍光画像検出手段で検出された前記測定ビーズ毎の蛍光波長成分の分析結果から前記測定ビーズを区別することを特徴とする請求項７に記載の色ビーズ判別装置。
請求項２に記載の測定ビーズを配合した測定サンプルに透過光を照射し、特定の波長域の光を通す複数のフィルタを切り替えながら複数の透過光画像を得るための透過光検出ステップと、
複数の前記透過光画像から前記測定ビーズ毎の光の波長別の階調を検出して、前記測定ビーズの区別を行うビーズ区別ステップと、
前記測定サンプルに励起光を照射し、特定の波長域の光を通す複数のフィルタを切り替えながら複数の蛍光画像を得るための蛍光検出ステップと、
それぞれの前記透過画像において前記測定ビーズ毎の階調を検出する透過画像処理ステップと、
前記ビーズ区別ステップによって、区別された光の波長別の階調の異なる前記測定ビーズごとに、前記蛍光検出ステップによって得た複数の蛍光画像から階調を検出して前記測定ビーズの種類の判別を行うビーズ判別ステップと、からなることを特徴とする色ビーズ判別方法。
前記ビーズ区別ステップは、それぞれの前記透過光画像に対して所定の輝度を基準に２値化処理を行う２値化処理ステップと、
前記透過光画像から前記測定ビーズ以外のごみを測定対象から取り除くノイズ除去ステップと、
前記透過光画像において重なっている前記測定ビーズを測定対象から取り除く対象外ビーズ除去ステップと、
２値化後の前記透過光画像における前記測定ビーズの中心部が明るいかどうかを判別する中心輝度判別ステップと、
中心輝度判別ステップの結果から光の波長別の階調の違いを判別することを特徴とする請求項９に記載の色ビーズ判別方法。