JP2019215314A - ナノ粒子の判別方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本実施形態で判別対象となるナノ粒子は、暗視野観察下で輝点として観察可能な粒子である。暗視野観察下で輝点として観察可能であれば、本実施形態に適用されるナノ粒子は特に制限されず、例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、金ナノロッド、金ナノアーチン、金ナノ粒子凝集体などの同種粒子の凝集体、銀ナノ粒子−金ナノアーチンダイマーなどの異種粒子の凝集体および量子ドットなどが例示できる。
本実施形態における暗視野観察は、試料に斜めから光を当て、試料からの散乱光および反射光等のみを観察する、従来公知の暗視野観察手法であればよい。照明法も透過型、および落射型のどちらでもよく、利用者が適宜選択すればよい。
次に、取得した観察画像を用いた輝点の解析手法について説明する。図1は、以下に説明する輝点の解析手法の一態様におけるスキームを示した図である。
本実施形態における判別方法では、暗視野観察により得られたカラーの観察画像を複数の色成分に色分解して、各色成分の情報を含む輝点の色情報を取得し、当該色情報に基づき解析を行う。以下では、暗視野観察により得られたカラーの観察画像をRGBに色分解し、各輝点のRGB値に基づき解析を行う場合を例に説明する。
色情報に基づき輝点を判別するための一態様として、得られた輝点の色情報を、RGB値の3変量データとして3次元プロットする。3次元プロットすることにより、帰属が異なることによる輝点の相違を、視覚的に認識できるようになる。なお、本明細書において帰属とは、輝点がナノ粒子、ナノ粒子凝集体および不純物の何れに由来するものであるか、またナノ粒子の種類が複数ある場合に、どのナノ粒子に由来するものであるかを示すものである。
同じ種類のナノ粒子であっても、各ナノ粒子の輝点のRGB値にはバラツキがある。また、異なる種類のナノ粒子または不純物であっても、目的とするナノ粒子と輝点の色が近い場合がある。そのため、精度よく判別を行うには、人の視覚による判別では限界がある。そのため、帰属の判別にあたっては、上述の判別情報として、RGB値を入力データとして、帰属の判定結果を出力するソフトウェア(コンピュータプログラム)を用いることが好ましい。特に、機械学習結果に基づいて帰属を自動で判別するソフトウェア(分類モデル)を上述の判別情報として用いることが、判定精度の観点から望ましい。判別に利用可能なソフトウェア(アルゴリズム)は、特に限定されないが、例えば、教師あり学習済みのニューラルネットワーク、あるいは教師あり学習済みのサポートベクターマシン等を利用することもできる。
AND environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria.ISBN 3−900051−07−0, URL http://www.R−project.org.)が挙げられる。
スライドガラス(松浪ガラス社製、S1111)を超純水および70%エタノールで洗浄し、乾燥させた。次に1%APTES((3−Aminopropyl)triethoxysilane、超純水希釈)をスライドガラスに塗布し、室温で30分静置した後、超純水で洗浄した。これを乾燥させアミノ基導入スライドガラスを得た。
(1)金ナノ粒子モノマーの撮影
40nmの金ナノ粒子(BBI社製、150pM)を超純水で5pMに希釈し、試料を調製した。試料3.5μLを実施例1で作製したアミノ基導入スライドガラスに滴下し、その上からカバーガラスを被せ、カバーガラスの四辺にトップコートを塗ることで密閉し、プレパラートを作製した。
40nmの金ナノ粒子(BBI社製、150pM)を超純水で10pMに希釈した。これに同量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え10分間静置したものを試料として用いたこと以外は、上記(1)に記載の方法を用いてプレパラートを作製し、観察像撮影を行った。
試料としてフィルター(MILLEX−GV 0.22μm Filter Unit、Merck Millipore社製)で処理した土壌サンプルまたは血清(100倍希釈、未フィルター)を用いたこと以外は、上記(1)に記載の方法でプレパラートを観察し、観察像撮影を行った。
画像解析ソフトImageJ(Biophotonics International, vol11,issue7,pp.36−42,2004)を用いて、以下の方法で画像処理を行った。
対象画像をグレースケールに変換し、輝点解析および輝点の領域情報(ROI)の取得を行った。輝点解析のパラメーターは閾値30−255、サイズ30−10000、真円度0.3−1.0で行った。
RGBで構成されている対象の画像を、R成分の画像、G成分の画像およびB成分の画像の3つの画像に分割した。各画像について上記(1)で取得したROIで輝点解析を行い、R、GおよびBの各画像におけるROIの強度を取得した。取得した各ROIの強度を、各輝点のR、GおよびBそれぞれの強度とした。これを、以降の解析データとして用いた。
実施例3で得た解析データの処理は、統計分析フリーソフトのR(R DEVELOPMENT CORE TEAM (2005). R: A LANGUAGE AND
environment for statistical computing.
R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria.ISBN 3−900051−07−0, URL http://www.R−project.org.)を用いて行った。
観察対象の輝点がどのナノ粒子または不純物に対応するか決定するための基準を設けることにより、帰属の判別が容易となる。しかしながら、図2の3次元プロットに示されるような、各輝点のプロットが線形分離できない場合には、人の手で基準を規定することが困難である。そこで、機械学習を利用した輝点の帰属の判別方法を採用した。
測定間のRGB値のズレおよびバラつきが機械学習による帰属結果に与える影響を評価するため、同一試料について複数回測定し、測定による誤差を確認した。
浮遊した金ナノ粒子の観察を行うため、増粘剤としてカルボキシメチルセルロース(CMC)を用いて、金ナノ粒子の運動を抑えて速いシャッタースピードで撮影を行った。
40nmの金ナノ粒子(BBI社製、150pM)を超純水により10pMに希釈し、そこに同量の1.0%CMCを添加し、試料を調製した。試料3.5μLをスライドガラス(松浪ガラス社製、S1111、アミノ基未導入)に滴下し、その上からカバーガラスを被せ、カバーガラスの四辺にトップコートを塗ることで密閉し、モノマー試料のプレパラートを作製した。
40nmの金ナノ粒子(BBI社製、150pM)を超純水により20pMに希釈し、これに同量のPBSを加え10分静置した。その後、1:1の容量で1.0%CMCを添加することで試料を調製した。試料3.5μLをスライドガラス(松浪ガラス社製、S1111、アミノ基未導入)に滴下し、その上からカバーガラスを被せ、カバーガラスの四辺にトップコートを塗ることで密閉し、凝集体試料のプレパラートを作製した。
土壌サンプル(フィルター済)を1:1の容量で1.0%CMCと混合することで試料を調製した。試料3.5μLをスライドガラス(松浪ガラス社製、S1111、アミノ基未導入)に滴下し、その上からカバーガラスを被せ、カバーガラスの四辺にトップコートを塗ることで密閉し、不純物試料のプレパラートを作製した。
上記(1)〜(3)の撮影で得られた画像を実施例3および実施例4に記載の方法を用いてデータ処理を行い、RGB値の3次元プロットを行った。ImageJによる輝点解析のパラメーターは、閾値30−255、サイズ5−200、真円度0.3−1.0で行った。また可視化したRGB値の3次元プロットを異なる角度から観察した結果を図3の(a)〜(c)に示す。図3においては、実施例4と同様の異なる濃淡のプロットとして、金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体および不純物を区別して示している。図3の(a)〜(c)から明らかなように、金ナノ粒子の固定化を行わずに撮影を行った場合にも、固定化を行った場合と同様に、金ナノ粒子モノマー、金ナノ粒子凝集体および不純物の輝点は、RGB値の3次元プロットにおいてそれぞれ異なる分布を示すことが確認された。
銀ナノ粒子、金ナノアーチン、および銀ナノ粒子−金ナノアーチンダイマーを以下の方法で作製し、その判別を行った。
40nmの銀ナノ粒子(BBI社製)50μLと0.125mg/mLに調整したスタンダードBSA(Thermo Fisher社製)1μLとを混合し、室温で30分間静置した。この混合液に抗BSAウサギポリクローナル抗体(Molecular Probes社製 20μg/mL、50μL)を添加し、室温でさらに2時間静置した。その後1%BSA溶液(100μL)および超純水(800μL)を添加し、混合した。8000rpmで10分の遠心操作を行うことで上清とナノ粒子とを分離し、回収したナノ粒子を0.1×PBS緩衝液50μLに分散することで、抗BSA抗体修飾銀ナノ粒子溶液を得た。
抗ウサギポリクローナル抗体(R&D system社製)2μLを50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)18μLで希釈し、80nm金ナノアーチン(Cytodiagnostics社製)200μLに添加して室温で30分間静置した。その後、1%BSA溶液80μLを添加して撹拌し、15分静置した。この混合液を遠心操作(8000rpmで10分)して上清とナノアーチンとを分離し、抗ウサギ抗体修飾金ナノアーチンを得た。回収した修飾金ナノアーチンを500μLの超純水に分散し、同様の遠心操作を2回行うことで、過剰の抗ウサギポリクローナル抗体を除去した。得られたナノアーチンを200μLの超純水に分散することで、抗ウサギ抗体修飾金ナノアーチン溶液を得た。
上記(1)および(2)で作製した修飾ナノ粒子について、動的光散乱法(DLS)を利用した粒径分布測定により評価を行い、目的タンパクの修飾を確認した。結果を図4に示す。図4の(A)ではBSA修飾銀ナノ粒子に抗BSAウサギポリクローナル抗体を修飾する前後、図4の(B)では金ナノアーチンに抗ウサギポリクローナル抗体を修飾する前後の結果を示す。どちらの場合も抗体の修飾により粒径分布が正の方向にシフトしたことから、目的タンパクが修飾されたことが示唆された。
上記(1)および(2)で作製した修飾ナノ粒子、ならびにその混合試料を暗視野下で観察した。混合試料としては、(1)の溶液5μLと(2)の溶液5μLとを混合し、3時間静置したものを用いた。観察用プレパラートの作製は実施例2に記載の方法で行った。作製したプレパラートを暗視野下で油浸観察した。観察装置には顕微鏡(BX53、OLYMPUS社製)、CCDカメラ(カラー、DP73、OLYMPUS社製)、および対物レンズ(UplanFLN60×、OLYMPUS社製)を用い、観察条件は露光時間10sec、ISO100、および4800×3600ピクセルシフトで撮影した。混合試料において、銀ナノ粒子および金ナノアーチンのいずれとも異なる色(ピンク〜紫色)の輝点が観察された。
上記(1)および(2)で作製した修飾ナノ粒子をそれぞれ暗視野観察し、観察されたそれぞれ10個の輝点を30×30pixelで抽出した。次いで(1)の修飾ナノ粒子の輝点と、(2)の修飾ナノ粒子との輝点を重ね合わせたcalculated dimer像を得た。詳細には、(1)の修飾ナノ粒子の10個の各輝点と、(2)の修飾ナノ粒子の10個の各輝点との全ての組み合わせ(10×10)について重ね合わせを行い、計100個のcalculated dimer像を得た。calculated dimerは、(1)の修飾ナノ粒子と(2)の修飾ナノ粒子とでダイマーを形成した際に観察されると推測される像を意図したものである。抽出した各10個の輝点と、calculated dimer像をRGB値の3次元プロットにより可視化した(図5)。結果、図5の(a)に示されるように、銀ナノ粒子のクラスター、金ナノアーチンのクラスターおよびcalculated dimer像のクラスターの3つのクラスターに分かれることが確認された。また、ダイマーとして観察される輝点のRGB値の3次元プロットは図5の(a)〜(c)に示す位置であることが推測された。
上記(4)で観察した各暗視野像を実施例3および4に示した方法で処理し、上記(5)のcalculated dimerも含めてRGB3次元プロットした結果を図6に示す。図6の(a)〜(c)に示されるように、銀ナノ粒子および金ナノアーチン由来のプロットとは明らかに異なるプロットが混合試料中に確認され、そのプロットはcalculated dimerのプロットと十分近い位置であった。以上の結果から混合試料中に銀ナノ粒子と金ナノアーチンとのダイマーが存在することが示唆された。また、図6の(a)〜(c)に示すように、色分解によって、銀ナノ粒子、金ナノアーチンおよび銀ナノ粒子−金ナノアーチンダイマーを判別可能であることが確認された。なお、図6に示すプロット中、銀ナノ粒子のクラスターには、混合試料中にモノマーとして存在する修飾銀ナノ粒子の輝点も含まれている。同様に、図6に示すプロット中、金ナノアーチンのクラスターには、混合試料中にモノマーとして存在する修飾金ナノアーチンの輝点も含まれている。
Claims (9)
- 暗視野観察下で輝点として観察可能なナノ粒子の判別方法であって、
ナノ粒子を含む試料を暗視野観察下で観察し、カラーの観察画像を得る工程、
上記観察画像を色分解して、各色成分の情報を含む輝点の色情報を取得する工程、および
上記色情報から、上記観察画像中の輝点がナノ粒子の輝点であるか否かを判別する工程を含むことを特徴とするナノ粒子の判別方法。 - 上記試料は、生じる輝点の色が互いに異なる2種類以上の上記ナノ粒子を含んでいることを特徴とする請求項1に記載のナノ粒子の判別方法。
- 上記観察画像を得る工程では、上記試料中の上記ナノ粒子を基板に固定化して観察を行うことを特徴とする請求項1または2に記載のナノ粒子の判別方法。
- 上記観察画像を得る工程では、上記試料中の上記ナノ粒子を基板に固定化せずに観察を行うことを特徴とする請求項1または2に記載のナノ粒子の判別方法。
- 上記試料には、上記ナノ粒子として金ナノ粒子モノマーが含まれていることを特徴とする請求項1〜4の何れか1項に記載のナノ粒子の判別方法。
- 上記判別する工程では、上記観察画像中の上記輝点が上記ナノ粒子、上記ナノ粒子の凝集体および不純物のいずれであるかを判別することを特徴とする請求項1〜5の何れか1項に記載のナノ粒子の判別方法。
- 上記観察画像の色分解は、上記観察画像をRGBに色分解することを特徴とする請求項1〜6の何れか1項に記載のナノ粒子の判別方法。
- 上記判別する工程では、予め取得した判別情報に基づき、上記観察画像中の輝点がナノ粒子の輝点であるか否かを判別することを特徴とする請求項1〜7の何れか1項に記載のナノ粒子の判別方法。
- 上記判別情報は、上記色情報と上記輝点の帰属との相関関係を機械学習した、上記輝点の分類モデルであることを特徴とする請求項8に記載のナノ粒子の判別方法。
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