ES2307306T3 - Proceso y sistema integrado para la ampliacion y deteccion de ac. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO Y DE UN DISPOSITIVO, CON EL QUE SE POSIBILITA UNA AMPLIACION Y DETECCION INTEGRAL DE ACIDOS NUCLEICOS.
Description
Proceso y sistema integrado para la
amplificación y detección de ácidos nucleicos.
La presente invención se refiere a un proceso y
a un dispositivo que permiten la amplificación y detección
integradas de ácidos nucleicos.
Los procedimientos heterogéneos de detección de
ácidos nucleicos incluyen el paso de la inmovilización del ácido
nucleico a detectar. Esto se realiza por ejemplo directamente por
unión covalente del ácido nucleico con la fase sólida o por unión
del ácido nucleico con un reactivo del par de afinidad y fijación
del otro reactivo del par de afinidad sobre la fase sólida. Otra
posibilidad de unión consiste también en la inmovilización del
ácido nucleico a detectar por hibridación con una sonda llamada de
captura o hibridación, unida a la fase sólida, que es por lo menos
parcialmente complementaria del ácido nucleico a detectar. Esta
sonda de captura puede estar unida a la fase sólida de cualquier
modo que se desee.
Los ejemplos de procedimientos, en los que se
inmovilizan los ácidos nucleicos mediante sondas de captura, se han
descrito en EP-A-0 079 139 para el
caso de la unión directa y en EP-A-0
192 168 para el caso de unión a través de un par de afinidad. Según
las descripciones del procedimiento facilitadas, se hibrida el ácido
nucleico a detectar con una sonda de detección, que también puede
estar hibridada con el ácido nucleico a detectar, y se detecta el
híbrido formado después de la eliminación del exceso de sonda de
detección sobre la fase sólida mediante un grupo marcador existente
en la sonda de detección.
Para detectar ácidos nucleicos que raramente
aparecen en una muestra se recurre habitualmente a una amplificación
específica de la diana. Tal procedimiento, en el que se integra por
ejemplo un grupo marcador digoxigenina en el ácido nucleico
amplificado, se ha descrito en WO 92/06216.
En los procedimientos hasta ahora corriente de
diagnóstico de ácidos nucleicos, tanto la amplificación como la
detección de ácidos nucleicos se realizan en sistemas separados, de
modo que los productos resultantes de la amplificación entran en
contacto con su entorno antes de la detección. De este modo se corre
un gran riesgo de contaminaciones cruzadas y resultados positivos
falsos. Tienen que realizarse además varios pasos de pipeteo y por
lo menos un paso de transferencia.
Por el documento
US-A-5 210 015 se conoce un
procedimiento combinado de amplificación y detección en sistema
cerrado, en el que el paso de la amplificación se realiza en
presencia de la sonda de detección. En las condiciones de
amplificación, esta sonda de detección se une al DNA diana y
contiene un grupo informante (reporter) y un grupo represor
(quencher). Con la actividad de nucleasa de la polimerasa, este
grupo informante puede disgregarse de la sonda, con lo cual se
produce una señal detectable. Sin embargo, este procedimiento tiene
el inconveniente de una baja sensibilidad. Además, la sonda tiene
que elegirse con mucho cuidado en lo referente a su secuencia y
punto de fusión.
En el artículo de Findlay y col. (Clin. Chem.
39, 1927-1933, 1993) se describe un proceso
automatizado de amplificación y detección de ácidos nucleicos, en
el que se emplea un solo recipiente de reacción, que tiene varias
secciones separadas, con lo cual la mezcla de productos generada en
una primera sección tiene que trasvasarse a una segunda sección
separada para efectuar la detección. Un inconveniente de este
procedimiento consiste en que se tienen que emplear recipientes de
reacción de estructura compleja y/o técnicas de transferencia muy
laboriosas.
En el documento WO 93/10267 se describe un
procedimiento para la amplificación y detección de ácidos nucleicos,
en el que durante la reacción está presente una sonda de detección
que, por lo menos en su extremo 3', lleva un grupo marcador
electroluminiscente, de modo que no puede utilizarse como cebador
para la amplificación. Un inconveniente de este procedimiento
estriba en que requiere una construcción costosa de las sondas de
detección. Por otro lado no se descarta que la sonda de detección
añadida pueda interferir en la reacción de amplificación.
En el documento
EP-A-0 628 568 se publica un
procedimiento de amplificación y posterior inmovilización o
detección de ácidos nucleicos por hibridación del ácido nucleico
con una sonda de captura, en dicho procedimiento se protege la
sonda de captura contra la prolongación enzimática y/o la
degradación enzimática del híbrido que se forma. La sonda de
captura puede estar también presente durante la reacción de
amplificación. Este procedimiento adolece también de inconvenientes
porque la preparación de las sondas de captura protegidas es costosa
y porque no puede descartarse que la sonda de captura interfiera en
la reacción de amplificación.
En el documento WO 97/07235 se describe un
procedimiento de detección de una secuencia de ácido nucleico. La
amplificación y la detección de los productos de amplificación se
realizan con cebadores y sondas, por este motivo la temperatura de
fusión de los cebadores tiene que ser más elevada que la de las
sondas.
En la patente US-5 585 242 se
describe un procedimiento para la detección de un ácido nucleico
amplificado por reflexión interna total (TIR).
Un cometido de la presente invención es, pues,
desarrollar un procedimiento de amplificación y detección de ácidos
nucleicos, que permita superar los inconvenientes del estado de la
técnica. En especial, la amplificación y la detección del ácido
nucleico tienen que efectuarse en un solo dispositivo, que durante
el procedimiento no tiene que abrirse. Además, el procedimiento
tiene que ser rápido, fácil de manipular, automatizable y de costes
bajos.
Este cometido se alcanza con un procedimiento de
detección de ácidos nucleicos que consiste en:
(a) proporcionar una muestra, en la que tiene
que detectarse un ácido nucleico,
(b) amplificar el ácido nucleico en un
dispositivo en presencia por lo menos de un cebador específico del
ácido nucleico a detectar y diversas sondas de captura específicas
del ácido nucleico a detectar, para lo cual las sondas de captura
se inmovilizarán en cada caso en posiciones diferentes en la
superficie interior del dispositivo y se elegirán de tal manera que
un híbrido de ácido nucleico y sonda de captura tenga una
temperatura de fusión más baja que un híbrido de ácido nucleico y
cebador, y en el que la amplificación se realiza en condiciones
tales que un híbrido de ácido nucleico y cebador sea estable,
mientras que un híbrido de ácido nucleico y sonda de captura sea
inestable y
(c) detectar el ácido nucleico por fijación de
los productos de amplificación sobre sondas de captura inmovilizadas
a través de la fluorescencia inducida por evanescencia, y en el que
la detección se realiza aplicando condiciones de hibridación
diferencial entre el ácido nucleico a detectar y la sonda de
captura; en el que la amplificación y la detección tiene lugar en
un solo dispositivo, que no se abre mientras dura la reacción y en
el que los marcadores fluorescentes están integrados dentro del
producto de la amplificación.
Con el proceso de la invención, gracias a la
elección de una sonda de captura, que no se hibrida en las
condiciones de amplificación con el cebador ni con el ácido
nucleico a detectar, se consigue una mejor sensibilidad con
respecto a los procedimientos ya conocidos. Además, gracias al uso
de un recipiente integrado cerrado para la amplificación y
detección, se corre un riesgo mínimo de contaminación. Por otro
lado, el procedimiento puede llevarse a la práctica de forma simple
y no requiere ningún paso de lavado. El procedimiento de la
invención permite además realizar una amplificación de tipo
multiplex, p.ej. empleando diversos cebadores marcadores y también
una detección de tipo multiplex, p.ej. empleando diversas sondas de
captura ubicadas en diversas posiciones de la superficie.
El paso (a) del procedimiento de la invención
comprende la preparación de una muestra, que contiene el ácido
nucleico a detectar. La muestra puede ser una muestra natural, p.ej.
un líquido corporal del tipo sangre, suero, plasma, orina o líquido
cerebroespinal, una muestra de tejido o una muestra de cultivo, o
incluso una muestra preparada a partir de una muestra natural
mediante pasos de un proceso. En una forma preferida de ejecución,
la muestra es una muestra natural de origen biológico, que sirve
para detectar un ácido nucleico de origen natural en los
diagnósticos de ácidos nucleicos.
El paso (b) del procedimiento de la invención
abarca la amplificación del ácido nucleico en un dispositivo idóneo
para ello. La amplificación del ácido nucleico a detectar puede
efectuarse por cualquiera de los métodos ya conocidos. La
amplificación se realiza con preferencia empleando uno o varios
cebadores de ácido nucleico, que sean lo suficientemente
complementarios del ácido nucleico a detectar, de modo que en las
condiciones de amplificación se pueda formar un híbrido estable del
cebador con el ácido nucleico a detectar. Estos cebadores se
prolongan con preferencia con una enzima, que también está presente
dentro de la mezcla reaccionante, p.ej. una
DNA-polimerasa. Los ejemplos de procesos de
amplificación idóneos son la reacción en cadena de ligasa (LCR) y
en especial la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Es preferido
además realizar la amplificación con una enzima termoestable en
forma de reacción efectuada de manera termocíclica, en varios
ciclos, p.ej. de 20 a 30 ciclos.
El cebador de ácido nucleico presente en el
procedimiento de la invención es un oligonucleótido o un
oligonucleótido modificado, que por su extremo 3' es accesible a
una extensión enzimática. La longitud del cebador de ácido nucleico
puede variar dentro de amplios márgenes según las exigencias y se
sitúa con preferencia entre 15 y 50 nucleótidos. Las sondas de
captura, también presentes durante la amplificación, pueden ser
también un oligonucleótido o un oligonucleótido modificado, p.ej.
un ácido nucleico peptídico. Se emplean con preferencia sondas de
captura que no presentan ningún extremo 3' accesible para la
extensión enzimática. Las sondas de captura están inmovilizadas en
una superficie interior del dispositivo integrado de amplificación y
detección. La inmovilización puede efectuarse por cualquier método
conocido, p.ej. por unión covalente o por interacciones biológicas
de alta afinidad.
Un ejemplo de procedimiento idóneo de
inmovilización de ácidos nucleicos consiste en que, aplicando la
técnica de Langmuir-Blodgett, se transfieren
monocapas de éter de cinamoilbutilo/celulosa a una superficie
interior del dispositivo de detección. Después de la transferencia
de la película, las monocapas se estabilizan por fotopolimerización
de los dobles enlaces olefínicos. Los dobles enlaces que quedan en
la película pueden convertirse en grupos aldehído por tratamiento
con OsO_{4} y NaIO_{4}, estos aldehídos sirven después para la
unión covalente con estreptavidina u otras sustancias, que son
capaces de inmovilizar los reactivos de unión gracias a
interacciones biológicas de alta afinidad, p.ej. los anticuerpos o
las lectinas. A continuación se pone en contacto la película con la
sustancia que tiene que unirse a ella mediante enlace covalente, en
las condiciones adecuadas, p.ej. con una solución acuosa de
estreptavidina (10 \mug/ml). Eventualmente puede realizarse un
paso de bloqueo con una sustancia inerte, p.ej. albúmina de
suero
bovino.
bovino.
En esta superficie pueden inmovilizarse sondas
de captura, que contienen el reactivo complementario de unión para
la interacción biológica de alta afinidad, p.ej. la biotina. Esta
inmovilización puede realizarse por puesta en contacto de la
superficie con una solución que contenga las sondas de captura
(concentración p.ej. = 200 nmoles/l) a 37ºC durante 1 h. La
ejecución exacta de los pasos para la preparación de una superficie
recubierta con una sonda de captura se describe por ejemplo en Furch
y col. (SPIE 2928, 220-226, 1996).
Para el procedimiento de la invención es
esencial que la extensión del cebador se realice a una temperatura
superior a la temperatura de fusión de un híbrido entre la sonda de
captura inmovilizada y el ácido nucleico a detectar mediante el
procedimiento. De esta manera se consigue una mejora significativa
de la especificidad y de la sensibilidad del ensayo.
La amplificación se realiza con preferencia
especial a una temperatura que es superior por lo menos en 2ºC, en
especial por lo menos en 5ºC y de forma muy especial por lo menos en
8ºC al punto de fusión de un híbrido formado por la sonda de
captura y el ácido nucleico a detectar. La elección de las
secuencias apropiadas de sonda de captura puede realizarse sin más
tomando en consideración las tablas ya conocidas de estabilidad de
híbridos de ácidos nucleicos, p.ej. híbridos de ácido nucleico con
ácido nucleico o híbridos entre ácidos nucleicos y ácidos nucleicos
peptídicos.
Otra ventaja del procedimiento de la invención
consiste en que puede efectuarse una amplificación de tipo
multiplex. En dicha amplificación multiplex pueden emplearse por
ejemplo diversos cebadores diferentes, provistos en cada caso de
diversos grupos marcadores diferentes, detectables por separado. De
este modo pueden utilizarse por ejemplo cebadores competidores
entre sí para una amplificación específica de alelos del ácido
nucleico a detectar, por ejemplo tal como se describe en Lee y Hall
(Annals of the Entomological Society of America 89,
20-27, 1996).
El paso (c) del procedimiento de la invención
consiste en la detección del producto de amplificación generado en
el paso (b) mediante la unión del mismo a las sondas de captura
inmovilizadas. El paso de la detección se realiza de modo
conveniente a una temperatura inferior a la del paso de
amplificación, es decir, a una temperatura en la que se forme un
híbrido estable entre el ácido nucleico a detectar y la sonda de
captura.
Según la invención se realiza la detección de la
unión de un ácido nucleico a las sondas de captura inmovilizadas
por fluorescencia inducida por evanescencia. Para ello se
inmovilizan las sondas de captura en una superficie interior
ópticamente transparente, p.ej. el hoyo de una placa de
microvaloración. Durante la amplificación se integran los
nucleótidos marcados con fluorescencia en el producto de
amplificación. Esto puede realizarse ya sea con el uso de cebadores
marcados con fluorescencia, ya sea con
didesoxinucleótido-trifosfatos monómeros marcados
con fluorescencia. La detección de la fluorescencia inducida por
evanescencia puede realizarse con un microscopio, p.ej. de
resolución local por microscopía confocal, con un escáner o con una
cámara CCD. Es posible realizar mediciones resueltas en el tiempo o
mediciones en tiempo real.
La detección se realiza en el procedimiento de
la invención en forma de detección multiplex. Para ello se emplean
diversas sondas de captura diferentes, que están inmovilizadas en
cada caso en diversas posiciones de la superficie del dispositivo
integrado de amplificación y detección. La detección se realiza
aplicando condiciones diferenciales de hibridación entre el ácido
nucleico a detectar y las sondas de captura, p.ej. por aumento
controlado de la temperatura. De este modo puede realizarse por
ejemplo un análisis mutacional del ácido nucleico a detectar.
Son ejemplos de materiales ópticamente
transparente, sobre los que pueden inmovilizarse las sondas de
captura, los materiales orgánicos o inorgánicos ópticamente
transparente, por ejemplo el vidrio, el cuarzo, la silicona, los
plásticos, tales como el policarbonato, los polímeros acrílicos o el
poliestireno. La inmovilización de las sondas de captura en la
superficie del dispositivo de reacción es una "inmovilización"
termoestable, de modo que en las temperaturas que se aplican
durante la reacción de amplificación no tiene lugar ningún despegue
significativo de las sondas de captura. Por un lado, las sondas
pueden fijarse sobre la fase sólida mediante técnicas de
inmovilización covalente. Por otro lado y con preferencia, la
inmovilización puede tener lugar por acción de un par de unión de
alta afinidad, p.ej. estreptavidina/biotina.
La detección de ácidos nucleicos por
fluorescencia inducida por evanescencia ya se conocida (véase p.ej.
EP-A-0 245 206; WO 96/09532). Sin
embargo, ahora se ha constatado de modo sorprendente que con el
procedimiento de la invención, que comprende una combinación de una
reacción de amplificación en presencia de sondas de captura
inmovilizadas y no interferentes y la detección del producto de
amplificación por fluorescencia inducida por evanescencia, pueden
obtenerse resultados muy sensibles y fiables.
El procedimiento de la invención puede llevarse
a la práctica con el uso de un kit de reactivos para la detección
de ácidos nucleicos, que consta de:
(a) un dispositivo para la amplificación y
detección de ácidos nucleicos, por lo menos con una sonda de captura
inmovilizada por lo menos sobre una superficie interior,
(b) por lo menos un cebador de ácido
nucleico,
(c) eventualmente desoxirribonucleótidos y
(d) eventualmente una enzima apropiada para la
extensión del ácido nucleico/cebador,
\newpage
para ello se elige la sonda de
captura de tal manera que el híbrido del ácido nucleico a detectar y
la sonda de captura tenga una temperatura de fusión menor que el
híbrido formado por el ácido nucleico a detectar y el
cebador.
El dispositivo constituye un sistema cerrado,
que permite una amplificación y detección integradas de un ácido
nucleico existente en una muestra. Los ejemplos de dispositivos de
amplificación y detección apropiados son los recipientes de
reacción, p.ej. recipientes de microrreacción con un volumen igual o
inferior a 100 \mul, p.ej. las placas de microvaloración. Es
obvio que pueden utilizarse también otros dispositivos, por ejemplo
biosensores, p.ej. chips. Las sondas de captura se inmovilizan con
preferencia en una superficie ópticamente transparente del
dispositivo. El kit contiene con preferencia un marcador
fluorescente, por ejemplo un ácido nucleico/cebador marcado y/o un
desoxirribonucleótido marcado. La enzima que lleva el kit es con
preferencia una DNA-polimerasa termoestable, p.ej.
una Taq-polimerasa.
Otro kit de reactivos que puede utilizarse
contiene:
(a) un dispositivo para la amplificación y
detección de ácidos nucleicos por lo menos con una sonda de captura
inmovilizada sobre una superficie interior transparente del
mismo,
(b) por lo menos un cebador de ácido
nucleico,
(c) eventualmente un desoxirribonucleótido,
(d) eventualmente una enzima apropiada para la
extensión del cebador de ácido nucleico,
(e) un marcador de fluorescencia y
(f) eventualmente medios para la detección de
los productos de amplificación por fluorescencia inducida por
evanescencia.
Claims (5)
1. Procedimiento para la detección de un ácido
nucleico que consiste en:
(a) proporcionar una muestra, en la que tiene
que detectarse un ácido nucleico,
(b) amplificar el ácido nucleico en un
dispositivo en presencia por lo menos de un cebador específico del
ácido nucleico a detectar y diversas sondas de captura específicas
del ácido nucleico a detectar, para lo cual las sondas de captura
se inmovilizarán en cada caso en posiciones diferentes en la
superficie interior del dispositivo y se elegirán de tal manera que
un híbrido de ácido nucleico y sonda de captura tenga una
temperatura de fusión más baja que un híbrido de ácido nucleico y
cebador, y en el que la amplificación se realiza en condiciones
tales que el híbrido de ácido nucleico y cebador sea estable,
mientras que el híbrido de ácido nucleico y sonda de captura sea
inestable y
(c) detectar el ácido nucleico por fijación de
los productos de amplificación sobre sondas de captura inmovilizadas
a través de la fluorescencia inducida por evanescencia, y en el que
la detección se realiza aplicando condiciones de hibridación
diferencial entre el ácido nucleico a detectar y la sonda de
captura;
en el que la amplificación y la
detección tiene lugar en un solo dispositivo, que no se abre
mientras dura la reacción y en el que los marcadores fluorescentes
están integrados dentro del producto de la
amplificación.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se realiza la reacción en un hoyo de
placa de microvaloración.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque las sondas de
captura se inmovilizan sobre una superficie interior ópticamente
transparente del dispositivo.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado porque se emplea una
sonda de captura inmovilizada, elegida entre ácidos nucleicos y
ácidos nucleicos peptídicos.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado porque la aplicación
de condiciones de hibridación diferencial se realiza mediante un
aumento controlado de la temperatura.
Applications Claiming Priority (2)
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