CN116377096A - 幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒的等位特异性引物，包括针对幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因设计的引物，其中，幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因选自幽门螺旋杆菌23S，检测位点为A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变位点，A2143G，A2142C，A2142G位点为克拉霉素耐药型，无基因突变为克拉霉素敏感型；还公开了用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒和耐药性诊断的诊断试剂盒，与分析试剂盒配套的荧光定量PCR反应体系，幽门螺旋菌克拉霉素耐药性检测方法，检测方法在非疾病诊断和治疗为目的的方法以及在药物的研发和/或筛选的应用，能告知病人是否同时有克拉霉素敏感型和耐药型幽门螺旋杆菌两种菌株双重感染，提供准确临床用药信息。

Description

幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及医学和生物技术领域，尤其涉及一种应用等位特异性引物检测幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori，H.pylori)生存于人体胃部，是最常见的细菌病原体之一，世界有多半人口受到过幽门螺旋杆菌的感染。幽门螺旋杆菌感染可能引起慢性胃炎、消化性溃疡，严重者则发展为胃癌、胃黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤。随着抗生素的广泛使用，幽门螺旋杆菌耐药菌株也在日益增多，幽门螺旋杆菌对抗生素产生耐药已经成为其根除率下降的最主要原因，这不但给临床治疗带来困难，也增加了患者的经济负担，导致医疗资源极大浪费。耐药性检测是实施个体化治疗的前提，可以避免重复使用已经产生耐药性的抗生素、并根据药敏实验选择有效抗生素。目前，已有多种检测幽门螺旋杆菌抗生素耐药性的方法，传统方法检测幽门螺旋杆菌抗生素耐药性主要局限于药敏试验，但E-test耗材昂贵，纸片扩散法缺乏有效的判断标准，琼脂稀释法对操作技术要求较高；而且药敏试验不能鉴定H.pylori菌株基因突变的位点。另外，幽门螺旋杆菌对培养要求苛刻，微需氧条件下生长缓慢，不适合临床常规开展。如：①分离培养鉴定：幽门螺旋杆菌培养成菌落后，经生化反应鉴定。由于幽门螺旋杆菌培养需要微需氧条件，对营养条件要求苛刻，所以极易造成假阴性，其灵敏度仅有40％-70％，检出率低。且幽门螺旋杆菌培养需要一定时间，不利于快速诊断。②UBT：根据标志物不同可分为13C-UBT和14C-UBT，临床应用广泛，技术要求低。缺点是费用高，易受抑酸剂和抑菌药物影响，敏感度低。③免疫学检查：检测粪便中幽门螺旋杆菌的抗原或血清中幽门螺旋杆菌抗体。优点是快速、无损伤，缺点是不能判断现症感染还是既往感染。④组织病理切片染色法：该法是把患者胃镜检查活检组织切片,染色后观察组织中的幽门螺旋杆菌。优点是可同时进行胃黏膜的病理学诊断，且特异性和敏感性均较高。但该方法受幽门螺旋杆菌载量影响明显，且操作繁琐、费时，不适于大通量样本的检测。随着分子生物学技术的发展，PCR、荧光原位杂交、基因芯片、DNA测序等技术已被用于幽门螺旋杆菌抗生素耐药性的检测，包括：普通PCR、寡核苷酸探针杂交、基因芯片、测序等。以上所有检查方法各有特点，但均不能在一份样本中同时检测出耐药性菌株和敏感性菌株的双重感染。我们采用本公司设计的这项等位基因特异性荧光PCR技术，已发现患者同时感染幽门螺旋杆菌耐药性菌株和敏感性菌株的现象很常见（见图2中样本22和26）。

在幽门螺旋杆菌感染中，尤其在儿童幽门螺旋杆菌感染的治疗中，克拉霉素是重要的首选药物之一。然而，当前克拉霉素耐药性菌株的感染几乎占了所有幽门螺旋杆菌病人的三分之一，给临床治疗带来很大的困难，造成病情久治不愈。通过研究发现，克拉霉素的药用靶位点是幽门螺旋杆菌核糖体23S，而出现耐药性则是幽门螺旋杆菌23S基因的2142核苷酸位点上发生A to G或A to C突变，或者2143核苷酸位点上发生A to G突变。2143位点A to G突变最为常见而2142位点A to C突变引起的耐药性最强。

目前某些公司和研发机构检测上述与克拉霉素耐药相关的基因突变主是应用基因测序和TaqMan探针法技术。基因测序能精确地得知突变基因位点，但步骤相对较多，时间长；TaqMan探针法能测出探针覆盖区域（约10个左右核苷酸）有无基因突变，但无法得知具体的突变点和突变核苷酸。倘若病人同时感染了克拉霉素敏感型和耐药型幽门螺旋杆菌，基因测序和TaqMan探针技术均不能明确地告知。

在PCR中，扩增方向是从引物的5’端向3’端进行，引物3’端的第一个核苷酸是否与被扩增模板完全契合是PCR是否能开始顺畅运行的关键之一。当引物3’端的第一个核苷酸的模板结合位点正好位于基因上的核苷酸突变点（等位点），如果完美结合（T=A，C=G），在适当的温度条件下，则PCR能顺利地进行；倘若不完美结合（T=C，T=G，A=C，A=G），则PCR运行会大受影响。应用引物3‘端与基因检测位点的完美或不完美结合对PCR运行的影响设计出的PCR检测，称为基因等位特异性PCR。

目前检测幽门螺旋杆菌抗生素耐药的分子生物学技术还存在费用高、临床难普及等缺点，因此，亟需开发一种快速、准确、便捷、经济的多重基因检测的方法，同步完成幽门螺旋杆菌鉴定、多位点耐药性分析，从而探索一种新的基于耐药性分析的幽门螺旋杆菌检测及个体化幽门螺旋杆菌根除模式，更好地指导临床合理应用抗生素，降低耐药菌株的出现，减少患者经济负担。现有技术还未有基于基因等位特异性PCR技术同时检测克拉霉素耐药性和幽门螺旋杆菌感染的方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了如下技术方案，一种幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法，应用等位特异性PCR的特点，设计了分别针对克拉霉素耐药型菌株A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变（克拉霉素敏感型）4组引物，在同样的实验条件下，通过简单的荧光定量PCR，可准确地检测出病人样本中幽门螺旋杆菌是否克拉霉素耐药性菌株、确切的基因突变位点和突变核苷酸，并能告知病人是否同时有克拉霉素敏感型和耐药型幽门螺旋杆菌双重感染，对临床用药提供准确信息。并且本发明设计的等位特异性引物同时具有PCR扩增及耐药特异性位点检测作用，不需要额外设计探针。

本发明一方面提供了一种用于应用等位特异性引物检测幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒，包括：引物，所述引物包括针对幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因设计的引物，其中，所述幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因选自幽门螺旋杆菌23S，检测位点为A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变位点，A2143G，A2142C，A2142G位点为克拉霉素耐药型，无基因突变为克拉霉素敏感型。

作为优选的实施方式，用于检测克拉霉素耐药型菌株A2143G的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

用于检测克拉霉素耐药型菌株A2142C的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

用于检测克拉霉素耐药型菌株A2142G的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示；

用于检测无基因突变的引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:7和SEQ IDNO:8所示;

引物和探针序列参见表1：

作为优选的实施方式，正向引物为通用引物，反向引物3’末端碱基对位于模板上的基因突变碱基或等位点；所述正向通用Tag序列为：5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’，针对克拉霉素相关基因设计的引物包括4条反向引物；分别针对1个野生型基因和3个突变型基因设计。

本发明的第二方面提供包含所述引物的用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂或用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒。

作为优选的实施方式，所述试剂盒还可以包括如下试剂中的任意一种或几种：缓冲液、DNA聚合酶、荧光标记物、dNTPs、DNA聚合酶激活剂。

作为优选的实施方式，还包括如下试剂中的任意一种或几种：qPCR缓冲液、UDGase，Taq DNA聚合酶、荧光染料、dNTP、引物。

本发明的第三方面提供一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性诊断的诊断试剂盒，包括核酸提取试剂盒和如第二方面所述的分析试剂盒。

本发明的第四方面用于提供与所述分析试剂盒配套的荧光定量PCR反应体系，所述反应体系如下：

所述荧光定量PCR扩增体系为：

以上试剂来自Yeasen公司的Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)试剂盒。配制好的qPCR扩增体系混合均匀，短暂低速离心后，置于博日荧光定量pcr仪中，按照如下条件进行扩增：

本发明的第五方面提供幽门螺旋菌克拉霉素耐药性检测方法，包括以下步骤：

提取幽门螺旋杆菌核酸；

采用以上任一所述的分析试剂盒对所提取的核酸中的克拉霉素耐药性相关基因进行荧光定量PCR扩增；

其中，所述荧光定量PCR扩增反应过程中，同时使用所述试剂盒中针对克拉霉素耐药基因设计的引物；

其中，所述荧光定量PCR扩增反应过程包括：

25℃降解含UAT模板5min;

95℃变性5min；

95℃变性10s，56℃退火10s，60℃延伸20min；该步骤进行45次循环；

熔解曲线显示；

反应结束。

本发明所述基于多基因的幽门螺旋杆菌抗生素耐药性检测方法，优选为非疾病诊断和治疗为目的的方法，其中所述耐药性针对基因23S中3个点突变导致；所述3个点突变为A2143G点突变，A2142C点突变，A2142G点突变。

本发明的第六方面提供一种电子设备，包括处理器和存储器，所述存储器存储有多条指令，所述处理器用于读取所述指令并执行如第五方面所述的方法。

本发明的第七方面提供一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质存储有多条指令，所述多条指令可被处理器读取并执行如第五方面所述的方法。

本发明的第八方面提供所述基于多基因的幽门螺旋杆菌抗生素耐药性检测方法，可以应用于药物的研发和/或筛选，其中所述耐药性针对基因23S中3个点突变导致；所述3个点突变为A2143G点突变，A2142C点突变，A2142G点突变。

本发明的有益效果：

本发明的幽门螺旋杆菌核糖体23S上3个与幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关的基因突变点的检测与分析，包含4个独立的等位点特异性荧光PCR，分别针对A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变位点，A2143G，A2142C，A2142G位点为克拉霉素耐药型，无基因突变为克拉霉素敏感型，能够同时实现对幽门螺旋杆菌的克拉霉素耐药菌株感染和克拉霉素敏感菌株感染的快速鉴定及的分析，灵敏度可达到90％以上，准确率也可以达到90％，避免传统培养方法和药敏检测耗时长、阳性率低、费用高等缺点。

附图说明

图1为本发明提供的针对克拉霉素耐药型菌株A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变（克拉霉素敏感型）4组引物不同样本的检测结果示意图；

图2为本发明提供的通过分析4组荧光PCR扩增的熔解曲线和扩增CT值的差异性检测出患者是否有幽门螺旋杆菌感染、是否是克拉霉素耐药性菌株感染、是否体内存在克拉霉素耐药性菌株和克拉霉素敏感性菌株双种菌株感染；并检测出不同克拉霉素耐药性菌株感染的基因-检测结果对照表；

图3为本发明提供的HP敏感菌株感染情形下，针对克拉霉素相关基因设计的引物所包括的4条反向引物（分别针对1个野生型基因Wild和3个突变型基因Alle2142C耐药，Alle2142G耐药以及Alle2143G耐药）的循环数量与荧光强度的关系；

图4为本发明提供的HP耐药菌株感染情形下，针对克拉霉素相关基因设计的引物所包括的4条反向引物（分别针对1个野生型基因Wild和3个突变型基因Alle2142C耐药，Alle2142G耐药以及Alle2143G耐药）的循环数量与荧光强度的关系；

图5为本发明提供的HP耐药敏感菌株混合感染情形下，针对克拉霉素相关基因设计的引物所包括的4条反向引物（分别针对1个野生型基因Wild和3个突变型基因Alle2142C耐药，Alle2142G耐药以及Alle2143G耐药）的循环数量与荧光强度的关系；

图6为本发明提供的非HP感染情形下，针对克拉霉素相关基因设计的引物所包括的4条反向引物（分别针对1个野生型基因Wild和3个突变型基因Alle2142C耐药，Alle2142G耐药以及Alle2143G耐药）的循环数量与荧光强度的关系；

图7为本发明提供的电子设备一种实施例的结构示意图。

具体实施方式

为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案做详细的说明。

本发明提供的方法可以在如下的终端环境中实施，该终端可以包括一个或多个如下部件：处理器、存储器和显示屏。其中，存储器中存储有至少一条指令，所述指令由处理器加载并执行以实现下述实施例所述的方法。

处理器可以包括一个或者多个处理核心。处理器利用各种接口和线路连接整个终端内的各个部分，通过运行或执行存储在存储器内的指令、程序、代码集或指令集，以及调用存储在存储器内的数据，执行终端的各种功能和处理数据。

存储器可以包括随机存储器(Random Access Memory，RAM)，也可以包括只读存储器(Read-Only Memory，ROM)。存储器可用于存储指令、程序、代码、代码集或指令。

显示屏用于显示各个应用程序的用户界面。

除此之外，本领域技术人员可以理解，上述终端的结构并不构成对终端的限定，终端可以包括更多或更少的部件，或者组合某些部件，或者不同的部件布置。比如，终端中还包括射频电路、输入单元、传感器、音频电路、电源等部件，在此不再赘述。

1.材料

1.1.研究对象

克拉霉素耐药型菌株A2143G、两种分离的克拉霉素耐药型菌株A2143G临床菌株。

1.2.材料和试剂

1.3.仪器和设备

2.实验方法

2.1.核酸提取

幽门螺旋杆菌核酸抽提采用力拜生物ExoNA核酸提取试剂盒方法参照说明书进行，具体步骤如下：

1.将组织匀浆转置于清洁不含核糖核酸酶（DNase/RNase free）的1.5毫升离心管（试剂盒提供），室温下5500转/分，离心10-15分钟；

2.汲取组织匀浆300微升，移于另一个（DNase/RNase free）1.5毫升离心管（试剂盒提供）。汲取组织匀浆时注意不要扰动离心沉淀物；

3.加入300微升核酸裂解液和10微升磁珠，上下颠倒充分混合10分钟；

4.离心速度3000转/分，离心5分钟，然后用移液枪移去所有管内残留液；

5.加入500微升清洗液（使用前需加入乙醇），充分悬浮（可短暂震荡数次）沉淀的磁珠并上下颠倒3分钟，充分清洗核酸沉淀物。

6.离心速度1500转/分，离心5分钟，小心地倾去上清液；

7.重复步骤6和步骤7，用移液枪移去所有管内残留液；

8.敞开管盖，覆以清洁滤纸，室温空气干燥沉淀磁珠5分钟；

9.加入50微升核酸洗脱液，充分悬浮{可短暂震荡数次}磁珠，悬浮5分钟后，离心5000转/分，5分钟，将离心后的含核酸上清液5分钟移于另一个（DNase/RNase free）离心管。

2.2.PCR反应

2.2.1.引物设计

针对克拉霉素耐药型菌株2143G，2142C，2142G和无基因突变（克拉霉素敏感型）设计4组引物。分别在正向引物5’端加上正向通用Tag序列：

5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’，反向引物5’端加上反向通用Tag序列5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’。

经过优化后，针对各基因得出的多重PCR引物序列见表1。

表1 多重PCR引物序列

合成相关引物，得到等位点特异性引物，详见表2。

表2 等位点特异性引物

2.2.2.PCR反应

等位点特异性PCR反应体系为20μl，按照下列比例配置：

多重PCR反应条件为：25℃预处理5min——95℃预变性5min——(95℃变性10s，56℃退火10s，60℃延伸20s)共45个循环，然后显示熔解曲线。

反应结束后，4℃保存。

2.2.琼脂糖电泳验证

仪器和试剂：同1.3。

获取琼脂糖电泳验证的临床克拉霉素耐药型菌株A2143G、A2142C，A2142G和无基因突变（克拉霉素敏感型）电泳图。

3.结果

如图1所示为针对克拉霉素耐药型菌株A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变（克拉霉素敏感型）4组等位特异性引物不同样本的检测结果。

参见图1，用基因等位点特异性PCR技术检测克拉霉素耐药菌株的结果，其中，6个PCR扩增片段的大小都一样，与设计一致，且没有非特异性条带，从而说明引物的效率和特异性都很好。条带亮度的深浅不一，显示了等位点引物在PCR扩增与耐药性相关的基因点突变时效率不一，即荧光定量PCR CT值的差异，可以作为判别HP克拉霉素耐药性菌株的理论依据。

通过上述实施例以及附图1可以看出，4组独立的等位点特异性荧光PCR结果，相继在目的片段区域出现相应的目的条带，说明引物设计良好，扩增效率高，特异性良好。本发明试剂盒检测克拉霉素耐药性的灵敏度为94.4％，特异度为92.6％，准确性为93.3％。

参见图2，通过分析4组荧光PCR扩增的熔解曲线和扩增CT值的差异性，能检测出患者是否有幽门螺旋杆菌感染、是否是克拉霉素耐药性菌株感染、是否体内存在克拉霉素耐药性菌株和克拉霉素敏感性菌株双种菌株感染。检测出不同克拉霉素耐药性菌株感染，显示了很好的应用前景。

图3-6分别示意HP敏感菌株感染、HP耐药菌株感染、HP耐药敏感菌株混合感染以及非HP感染的样本，在根据克拉霉素耐药相关基因突变点设计的等位特异性引物（包括的4条反向引物分别针对1个野生型基因Wild和3个突变型基因Alle2142C耐药，Alle2142G耐药以及Alle2143G耐药）引导的PCR扩增效率上的差异其中：

（1）如图3所示，针对HP敏感菌株感染，野生型基因Wild的引物扩增效率最高，与基因本身属于敏感菌株感染表征完全符合；

（2）如图4所示，针对HP耐药菌株感染，Alle2143G耐药基因引物的扩增效率最高，与基因本身属于耐药菌株感染表征完全符合；

（3）如图5所示，针对HP耐药敏感菌株混合感染，野生型基因引物和Alle2143G耐药基因引物的扩增效率相近，远高于Alle2142G和Alle2142C 的扩增效率，与基因分属于敏感和耐药菌株感染表征完全符合。

（4）如图6所示，针对非HP感染，4组等位点特异性引物的扩增效率都同样低下，与实际情况完全符合。

由此可以证明，本发明包括针对幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关的基因突变设计的等位点特异性引物，其中，所述幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因选自幽门螺旋杆菌23S，检测位点为A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变位点，A2143G，A2142C，A2142G位点为克拉霉素耐药型，无基因突变为克拉霉素敏感型（即野生型基因Wild）的理论与试验结果完全符合。

本发明还提供了一种存储器，存储有多条指令，指令用于实现如实施例一的方法。

如图7所示，本发明还提供了一种电子设备，包括处理器301和与处理器301连接的存储器302，存储器302存储有多条指令，指令可被处理器加载并执行，以使处理器能够执行如实施例一的方法。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒，其特征在于，包括：等位特异性引物，所述等位特异性引物包括针对幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因设计的引物，其中，所述幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因选自幽门螺旋杆菌23S，检测位点为A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变位点，A2143G，A2142C，A2142G位点为克拉霉素耐药型，无基因突变为克拉霉素敏感型。

2.根据权利要求1所述的一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒，其特征在于，包括：用于检测克拉霉素耐药型菌株A2143G的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

用于检测克拉霉素耐药型菌株A2142C的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

用于检测克拉霉素耐药型菌株A2142G的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

用于检测无基因突变的引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；

引物和探针序列参见表1：

3.根据权利要求2所述的一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒，其特征在于，正向引物为通用引物，反向引物3’末端碱基对位于模板上的基因突变碱基或等位点；所述正向通用Tag序列为：5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’，针对克拉霉素相关基因设计的引物包括4条反向引物；分别针对1个野生型基因和3个突变型基因设计。

4.一种包含权利要求1-3任一所述引物的用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂或用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒。

5.根据权利要求4所述的分析试剂盒，其特征在于，还包括如下试剂中的任意一种或几种：qPCR缓冲液、UDGase，Taq DNA聚合酶、荧光染料、dNTP、引物。

6.一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性诊断的试剂盒，包括核酸提取试剂盒和如权利要求4-5任一所述的分析试剂盒。

7.一种与如权利要求4-5任一所述的分析试剂盒配套的荧光定量PCR反应体系，所述反应体系如下：

所述荧光定量PCR扩增体系为：

组分 体积(μL) HieffqPCRSYBRGreenMasterMix(NoRox) 10 ForwardPrimer(5μM) 1 ReversePrimer(5μM) 1 UDGase(1U/μL) 0.5 模板DNA 5 无菌超纯水 2.5

以上试剂来自Yeasen公司的

qPCR SYBR Green MasterMix(No Rox)试剂盒；配制好的qPCR扩增体系混合均匀，短暂低速离心后，置于博日荧光定量pcr仪中，按照如下条件进行扩增：

。

8.一种幽门螺旋菌克拉霉素耐药性检测方法，包括以下步骤：

提取幽门螺旋杆菌核酸；

采用权利要求1-3任一所述的分析试剂盒对所提取的核酸中的克拉霉素耐药性相关基因进行荧光定量PCR扩增；

其中，所述荧光定量PCR扩增反应过程中，同时使用所述试剂盒中针对克拉霉素耐药基因设计的引物；

其中，所述荧光定量PCR扩增反应过程包括：

25℃降解含UAT模板5min；

95℃变性5min；

95℃变性10s，56℃退火10s，60℃延伸20s；该步骤进行45次循环；

熔解曲线显示；

反应结束。

9.一种权利要求8所述的基于多基因的幽门螺旋杆菌抗生素耐药性检测方法在非疾病诊断和治疗为目的的方法中的应用，其中所述耐药性针对基因23S中3个点突变导致；所述3个点突变为A2143G点突变，A2142C点突变，A2142G点突变。

10.一种权利要求8所述的基于多基因的幽门螺旋杆菌抗生素耐药性检测方法在药物的研发和/或筛选的应用，其中所述耐药性针对基因23S中3个点突变导致；所述3个点突变为A2143G点突变，A2142C点突变，A2142G点突变。

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