CN118091163A - 一种鉴别尖刺信使蝎的特征多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别尖刺信使蝎的特征多肽及其应用。本发明筛选得到的尖刺信使蝎的特征多肽，具有优异的专属性和稳定性，特异性强，能够有效的鉴别东亚钳蝎药材及相关制剂中是否掺伪有尖刺信使蝎，具有良好的应用前景；本发明提供的特征多肽，其应用有助于保证全蝎药材、饮片以及含全蝎相关药品的质量，打击不法企业违规掺伪行为，保障人民群众用药安全，具有良好的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别尖刺信使蝎的特征多肽及其应用。
背景技术
尖刺信使蝎（Lychas mucronatus），隶属于钳蝎科，是一种展现着别具一格的形态与生理机能的蝎子。其身躯构造独特，由坚固的头胸部与柔韧的腹部紧密相连。尤为引人注目的是，头胸部前端装备有一对强健有力的钳状螯肢，这不仅是捕捉和牢牢固定猎物的得力工具，更内置了毒腺，赋予了它在防御与捕食中的双重优势。尖刺信使蝎的识别标志在于其尾部醒目的双针构造，尾部与钳子显得特别饱满，身躯上未有明显的线条纹理，尾节的色泽随着生长逐渐加深，唇部则保持着统一的色调。这种蝎子主要栖息于中国的海南岛以及东南亚的某些特定地域，这些地方的气候与环境条件恰到好处地满足了其生存需求。在野生状态下，尖刺信使蝎主要以昆虫及其他小型节肢动物为食，凭借灵敏的螯肢与尾部的毒刺，它能够高效地捕获并消化猎物。
尖刺信使蝎往往被不法商贩或个别人员作为正品东亚钳蝎的替代品，悄然流入全蝎药材市场。这主要归因于它们在外观和形态上与正品存在着一定的相似性，使得掺杂使假的行为在利益的诱惑下难以根除。更为严峻的是，由于许多中成药在生产过程中全蝎药材已经失去了原有的外观特征，这进一步加剧了掺伪掺假的隐蔽性，使得检测工作更加困难重重。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鉴别尖刺信使蝎的特征多肽。
本发明的另一目的为提供了一种上述特征多肽在鉴别东亚钳蝎药材及其制剂是否掺伪中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种鉴别尖刺信使蝎的特征多肽，所述特征多肽的序列为：
。
本发明还提供了一种上述特征多肽在鉴别东亚钳蝎药材及其制剂是否掺伪尖刺信使蝎中的应用，包括以下步骤：
（1）待检测样品预处理：将待检测样品粉碎得粉末，称取粉末，加入变性缓冲液，摇匀，升温处理，处理结束后取出放冷至室温，离心；取上清液，将上清液进行脱盐和酶解，酶解结束后取出放冷至室温，离心取上清液，得待检测溶液；
（2）使用HPLC-三重四级杆质谱法进行检测，分析对比待检测溶液中的质谱结果，若待检测溶液中在肽段1、肽段2、肽段3、肽段4的出峰处出峰，则认为样品中含有尖刺信使蝎。
进一步的，步骤（1）中，待检测样品预处理的具体步骤为：将待检测样品粉碎得粉末，称取粉末50mg，加入10mL变性缓冲液摇匀，置90℃处理4小时，取出放冷至室温，离心；取上清液500μL，将上清液进行脱盐和酶解，酶解结束后取出放冷至室温，离心取上清液，得待检测溶液。
上述变性缓冲液为6M盐酸胍，1M Tris，2.5mM乙二胺四乙酸，加浓盐酸调pH至8.0。
进一步的，所述脱盐和酶解为将上清液加入到分子量为3kDa的超滤离心管，12000转/分钟离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000转/分钟离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000转/分钟离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL质量浓度为1%的NH4HCO3溶液和10μL浓度为10mg/mL的牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解1小时，取出放冷至室温，于100℃终止酶解反应。
进一步的，步骤（2）中，所述HPLC的参数为: 色谱柱为 C18：2.1 mm × 100 mm，1.7 μm，柱温 43℃，流速0.3mL/分钟，流动相：A为含0.1%甲酸的水溶液，B为乙腈，梯度洗脱，进样体积5μL，溶剂延迟为0-4分钟和26-30分钟。
上述梯度洗脱的具体程序为：0–12分钟，10% B→20% B；12–21分钟，20% B→97%B；21–25分钟，97% B；25–25.5分钟，97% B→10% B；25.5–30分钟，10% B。
进一步的，步骤（2）中，所述三重四级杆质谱法的参数为：质谱检测器，电喷雾电离，正离子模式用于多反应监测，鞘气流量46L/h，辅助气体流量850L/h，喷雾电压3.5kV，离子源温度150℃，辅助气体温度400℃，锥孔电压50V，碰撞电压35V。
本发明提供的特征多肽中，所述肽段1、肽段2、肽段3、肽段4的检测离子对为：
。
本发明的有益效果为：
（1）本发明筛选得到的尖刺信使蝎的特征多肽，具有优异的专属性和稳定性，特异性强，能够有效的鉴别东亚钳蝎药材及相关制剂中是否掺伪有尖刺信使蝎，具有良好的应用前景；
（2）本发明提供的特征多肽，其应用有助于保证全蝎药材、饮片以及含全蝎相关药品的质量，打击不法企业违规掺伪行为，保障人民群众用药安全，具有良好的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为肽段1的质谱氨基酸序列解析图；
图2为肽段2的质谱氨基酸序列解析图；
图3为肽段3的质谱氨基酸序列解析图；
图4为肽段4的质谱氨基酸序列解析图；
图5 为肽段1的尖刺信使蝎样品的三重四极杆MRM质谱图；
图6为肽段1的东亚钳蝎样品的三重四极杆MRM质谱图；
图7 为肽段2的尖刺信使蝎样品的三重四极杆MRM质谱图；
图8 为肽段2的东亚钳蝎样品的三重四极杆MRM质谱图；
图9 为肽段3的尖刺信使蝎样品的三重四极杆MRM质谱图；
图10 为肽段3的东亚钳蝎样品的三重四极杆MRM质谱图；
图11 为肽段4的尖刺信使蝎样品的三重四极杆MRM质谱图；
图12 为肽段4的东亚钳蝎样品的三重四极杆MRM质谱图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1
1.1 样品处理方法
分别将东亚钳蝎、尖刺信使蝎和条斑钳蝎样品粉碎，分别称取粉末50mg，加入10mL变性缓冲液（6M盐酸胍，1M Tris，2.5mM乙二胺四乙酸，加浓盐酸调pH至8.0），摇匀，置90℃处理4小时，取出放冷至室温，离心（12000转/分钟，10分钟）。量取上清液500μL，使用分子量3kDa的超滤离心管对样品进行脱盐和酶解（12000转/分钟离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000转/分钟离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000转/分钟离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL 1% NH4HCO3溶液和10μL牛胰蛋白酶溶液（10mg/mL），37℃酶解1小时，取出放冷至室温，于100℃终止酶解反应，离心，取上清液），即得。
1.2 纳升液相-高分辨质谱方法
使用纳升液相色谱仪（EASY-nLC 1000，Thermo Scientific，San Jose，CA，USA）结合高分辨率质谱仪（Orbitrap-Fusion，Thermo Scientific，San Jose，CA，USA）对制备的样品进行分析条件如下：使用 Thermo Acclaim PepMap C18 色谱柱（75 μm × 2 cm、3 μm，Thermo Scientific，San Jose，CA，USA）进行脱盐和富集，使用 Thermo Acclaim PepMapC18 色谱柱（75 μm × 15 cm， 3 μm，Thermo Scientific，San Jose，CA，USA），流速为 300nL/分钟；流动相A为含2%乙腈的0.1%甲酸水溶液，流动相B为含98%乙腈的0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱（0–1 分钟，1%B→6%B；1–96分钟，6%B→22%B；96–113分钟，22%B→30%B；113–117分钟，30%B→95%B；117–120分钟，95%B)；进样量为1μL。
高分辨率质谱分析的条件如下：离子源为Nanospray Flex；分析采用正离子模式，喷雾电压为1800 V；离子传输毛细管温度为275℃； S-Lens传输效率设置为60%。 初级质谱在分辨率为 60000，采集范围为 350-1550 (m/z) 的 Orbitrap 质量分析仪上进行，二次质谱在采用快速扫描模式进行扫描的 Orbitrap 质量分析仪上进行，顶部用于母离子选择的速度数据依赖模式、用于碎片的 HCD 模式以及碎片能量 NCE 设置为 40。
1.3 使用PEAKS 8.5处理三种样品质谱数据，进行序列的预测，寻找仅尖刺信使蝎所特有的特征多肽，具体如表1所示。
表1
肽段1、肽段2、肽段3和肽段4的质谱氨基酸序列解析如图1-图4所示。
1.4 专属性的验证
分别使用东亚钳蝎、尖刺信使蝎样品按照1.1的方法处理后进三重四极杆液相色谱质谱联用仪，验证所找到的序列专属性，结果如表2所示。
表2
东亚钳蝎样品中肽段1-4未出峰，尖刺信使蝎样品中出现肽段1-4的特征峰，具体如图5-图12所示。
实施例2
2.1 方法的建立
使用 HPLC-三重四极杆 MS（QTRAP6500 LC/MS，AB SCIEX，Foster City，CA，USA）验证肽生物标志物的特异性并建立 MRM 方法。使用HPLC-三重四极杆MS分析具有最高响应强度的产物离子，并选择作为定量离子和定性离子。
HPLC 参数设置如下：色谱柱为 C18（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm，），柱温 43℃，流速0.3mL/分钟，流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，B为乙腈溶液，梯度洗脱 (0–12 分钟, 10%B→20% B; 12–21 分钟, 20% B→97% B; 21–25 分钟, 97% B; 25–25.5 分钟, 97% B→10% B; 25.5–30 分钟, 10% B) 进样体积5μL，溶剂延迟为0-4分钟和26-30分钟。 质谱参数设置如下：质谱检测器，电喷雾电离（ESI）正离子模式用于多反应监测，鞘气流量46L/h，辅助气体流量850L/h，喷雾电压3.5kV，离子源温度150℃，辅助气体温度400℃，锥孔电压50V，碰撞电压30V。
使用找到的母离子和子离子建立方法，鉴别方法：使用尖刺信使蝎药材作为对照品，按照1.1中方法制备，若样品中多肽1-4在对照药材出峰处出峰，则认为样品中含有尖刺信使蝎。
使用找到的尖刺信使蝎特征多肽序列和离子对信息（母离子和子离子如表3所示）建立方法，鉴别方法：使用尖刺信使蝎药材作为对照品，按照实施例1中1.1方法制备，若样品中多肽1-4在对照药材出峰处出峰，则认为样品中含有尖刺信使蝎。
表3
实施例3
将收集的20批全蝎样品按照实施例1和2提供的方法进行检验，结果有三批检出尖刺信使蝎特征多肽（肽段1-肽段4）；具体结果见表4。
表4
。
Claims (9)
1.一种鉴别尖刺信使蝎的特征多肽，其特征在于，所述特征多肽的序列为：
。
2.一种如权利要求1所述的特征多肽在鉴别东亚钳蝎药材及其制剂是否掺伪尖刺信使蝎中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）待检测样品预处理：将待检测样品粉碎得粉末，称取粉末，加入变性缓冲液，摇匀，升温处理，处理结束后取出放冷至室温，离心；取上清液，将上清液进行脱盐和酶解，酶解结束后取出放冷至室温，离心取上清液，得待检测溶液；
（2）使用HPLC-三重四级杆质谱法进行检测，分析对比待检测溶液中的质谱结果，若待检测溶液中在肽段1、肽段2、肽段3、肽段4的出峰处出峰，则认为样品中含有尖刺信使蝎。
3.根据权利要求2所述的特征多肽在鉴别东亚钳蝎药材及其制剂是否掺伪尖刺信使蝎中的应用，其特征在于，步骤（1）中，待检测样品预处理的具体步骤为：将待检测样品粉碎得粉末，称取粉末50mg，加入10mL变性缓冲液摇匀，置90℃处理4小时，取出放冷至室温，离心；取上清液500μL，将上清液进行脱盐和酶解，酶解结束后取出放冷至室温，离心取上清液，得待检测溶液。
4.根据权利要求3所述的特征多肽在鉴别东亚钳蝎药材及其制剂是否掺伪尖刺信使蝎中的应用，其特征在于，所述变性缓冲液为6M盐酸胍，1M Tris，2.5mM乙二胺四乙酸，加浓盐酸调pH至8.0。
5.根据权利要求3所述的特征多肽在鉴别东亚钳蝎药材及其制剂是否掺伪尖刺信使蝎中的应用，其特征在于，所述脱盐和酶解为将上清液加入到分子量为3kDa的超滤离心管，12000转/分钟离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000转/分钟离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL水，12000转/分钟离心10分钟，弃去下层溶液，加入500μL质量浓度为1%的NH4HCO3溶液和10μL浓度为10mg/mL的牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解1小时，取出放冷至室温，于100℃终止酶解反应。
6.根据权利要求2所述的特征多肽在鉴别东亚钳蝎药材及其制剂是否掺伪尖刺信使蝎中的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述HPLC的参数为: 色谱柱为 C18：2.1 mm × 100mm，1.7 μm，柱温 43℃，流速0.3mL/分钟，流动相：A为含0.1%甲酸的水溶液，B为乙腈，梯度洗脱，进样体积5μL，溶剂延迟为0-4分钟和26-30分钟。
7.根据权利要求6所述的特征多肽在鉴别东亚钳蝎药材及其制剂是否掺伪尖刺信使蝎中的应用，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为：0–12分钟，10% B→20% B；12–21分钟，20% B→97% B；21–25分钟，97% B；25–25.5分钟，97% B→10% B；25.5–30分钟，10% B。
8.根据权利要求2所述的特征多肽在鉴别东亚钳蝎药材及其制剂是否掺伪尖刺信使蝎中的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述三重四级杆质谱法的参数为：质谱检测器，电喷雾电离，正离子模式用于多反应监测，鞘气流量46L/h，辅助气体流量850L/h，喷雾电压3.5kV，离子源温度150℃，辅助气体温度400℃，锥孔电压50V，碰撞电压35V。
9.根据权利要求2-8任一项所述的特征多肽在鉴别东亚钳蝎药材及其制剂是否掺伪尖刺信使蝎中的应用，其特征在于，肽段1、肽段2、肽段3、肽段4的检测离子对为：
。
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