KR101678846B1 - 고려인삼 엽록체 게놈 및 핵 내 rDNA 서열의 완전 해독 기반 품종 및 종 간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고려인삼 엽록체 게놈 및 핵내 rDNA 완전 서열 기반의 SNP 마커 및 InDel 마커를 포함하는 인삼 품종 구별용 SNP 조성물 또는 InDel 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 SNP 마커 또는 InDel 마커, 그리고 상기 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용한 인삼 품종 구별방법은 기존의 방법들보다 저비용, 고효율로 인삼 품종을 식별할 수 있다.

Description

고려인삼 엽록체 게놈 및 핵 내 rDNA 서열의 완전 해독 기반 품종 및 종 간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도{Complete sequencing of Chloroplast genome and nrDNA of Panax ginseng-derived Marker, DNA primer set for discrimination of Panax ginseng cultivars and Panax species and uses thereof}

본 발명은 고려인삼 엽록체 게놈 및 핵 내 rDNA 서열의 완전 해독 기반 품종 및 종 간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함하는 고려인삼 품종 중 선향 품종 구별용 SNP 조성물, SNP 위치 염기를 포함하는 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 포함하는 고려인삼 품종 중 금풍 및 청선 품종 구별용 SNP 조성물, SNP 위치 염기를 포함하는 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 포함하는 고려인삼 품종 중 선향 구별용 SNP 조성물, SNP 위치 염기를 포함하는 서열번호 7 또는 8의 염기서열을 포함하는 고려인삼 품종 중 금풍 및 청선 구별용 SNP 조성물, SNP 위치 염기를 포함하는 서열번호 9 또는 10의 염기서열을 포함하는 고려인삼 품종 중 황숙 품종 구별용 SNP 조성물, InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 11 또는 12의 염기서열을 포함하는 고려인삼 품종 중 금풍 및 청선 품종 구별 및 금풍과 황숙 품종 비교시 황숙 구별용 InDel 조성물, InDel 다형성을 보이는 서열번호 13 내지 18의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기서열을 포함하는, 고려인삼 품종 중 선향 품종 구별용 InDel 조성물, SNP 위치 염기를 포함하는 서열번호 19 내지 22의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기서열을 포함하는, 고려인삼 품종 중 금풍 및 고풍 품종 구별용 SNP 조성물 및 상기 SNP 또는 InDel 다형성 뉴클레오티드 증폭용 프라이머 세트에 관한 것이다.

고려인삼 (Panax ginseng)은 아시아 극동지방에서 자생하는 대표적 약용식물로, 자생지 분포 형태가 우리나라의 삼국시대에 고구려의 영토 및 한반도와 일치하며, 고대의 많은 문헌 기록에서 볼 수 있듯 그 전통이 깊고 역사적으로 명성이 높으며, 전통적으로 국제 인삼 시장에서 고려인삼의 가치와 품질이 고가로 인정되는 바, 한국이 인삼의 종주국이라고 할 수 있다.

인삼의 육종은 채종까지 3년, 생육상과 뿌리의 형질 등을 조사하여 우량개체를 선발하는데 5~6년의 기간이 소요되는 등의 특수성으로 인해 우수 품종의 육성까지 수십 년이 걸리는 어려움이 있다.

이러한 난관 속에서도 한국인삼연초연구원으로부터 순계 분리 육종을 통해 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍, 선운, 선원, 선향, 청선 등 9개 품종이 개발되어 등록되어 있으나, 생육과 증식속도가 느리고 종자의 증식량이 낮은 인삼의 생식 특성으로 인해 종자 생산체계가 제대로 확립되지 못하여 우수 품종이 실제 농가에 보급되는 비율은 미미한 실정이다. 또한 육성된 우수 품종들 간의 식별 방법과 기존의 재래 혼계종과의 식별 방법은 생육 과정 중에 경험적인 형태적 관찰을 통해서만 이루어지고 있기 때문에 보다 체계적이고 과학적인 기술이 요구되는 실정이다.

형태적으로 구분하는 방법에 있어서도, 파종 후 많은 시간이 지나서야 식별이 가능하기 때문에 이를 악용하여 재래 혼계종의 종자를 개발된 품종의 종자로 둔갑하여 비싼 값에 판매하는 행위가 일어나고 있으며, 이로 인한 농가의 피해가 증가하리라 예상되고 있다. 개발된 품종들에 있어서도 품종 간 식별이 어려운 단점 및 증식 과정의 비의도적 오염과 혼입 등에 의해 품종의 균일도가 현저히 낮아 명품 인삼을 생산하는데 장애 요인으로 지적되고 있다. 또한, 6년에 걸쳐 생산한 생산품은 뿌리 부위만 유통이 되기 때문에 우수한 품종의 생산품과 우수하지 않은 품종 및 재래 혼계종의 식별이 생육 단계가 아닌 생산품에서 가능하여야 하는데 이에 대한 기반 기술은 거의 없는 상태이며 이를 위한 최선의 방법은 품종을 DNA 수준에서 식별할 수 있는 마커의 활용이다.

최근 다양한 분자생물학적 기법의 발달과 더불어 생물정보학적 영역의 진보도 빠르게 이루어짐에 따라 인간, 동물뿐 아니라 식물에서도 다양한 마커 시스템이 개발되고, 방대한 유전체 정보가 생산되고 데이터베이스화되어 활용되고 있지만, 인삼에서 이와 같은 영역의 연구는 거의 미비한 실정이다. 약용식물로 널리 알려진 인삼은 약리적 성분이나 효능에 관한 연구는 활발하게 진행되어 왔으나 육종이나 유전학, 유전체학 등과 관련된 부분은 연구가 매우 미흡한데, 그 원인으로는 한 세대의 진전에 소요되는 연한이 3~4년으로 길며, 종자 증식속도 또한 개체 당 40립 정도로 느리고, 환경에 대한 생육의 변이가 크다는 점 등을 들 수 있으며 이러한 문제들로 인해 체계적 관리가 어려운 실정이다.

또한 아시아의 극동지방에서만 자생해 오던 인삼을 재배화하였기 때문에 유전자원이 극히 제한적이며, 약배양이나 영양번식과 같은 육종에 있어 보조적으로 활용할 수 있는 수단의 부재 역시 인삼의 유전 육종적 연구를 어렵게 하는 요인이 되고 있다. 유전학이나 유전체학적 측면에서 이루어진 인삼의 연구 성과에 대해 살펴보면, 인삼에서 주요한 약리적 효능을 내는 성분인 진세노사이드(ginsenoside)의 합성경로와 연관된 유전자에 관한 연구(Jung et al., 2003, Plant Cell Rep. 22:224-230), 종 구분을 위한 DNA 마커 개발(Ha et al., 2002, J Agric Food Chem. 50:1871-1875), BAC(bacterial artificial chromosome) 라이브러리 제작과 그로부터 밝혀진 2,000여개의 BAC end 서열(Hong et al., 2004, Mol Gen Genomics. 271:709-716), EST(expressed sequence tag) 라이브러리 제작으로 밝혀진 6,000여개의 서열(Kim et al.,2006, Plant Cell Rep. 25:599-606) 정도를 들 수 있지만, 이러한 정보들은 약 3,000Mb로 추정되는 인삼 유전체의 1%에도 미치지 못하는 미미한 수준이라 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 인삼의 엽록체와 핵내 rDNA의 완전서열해독을 바탕으로 인삼종내 다양한 분석 및 품종 식별 마커를 개발코자 하였다.

한편, 한국등록특허 제0991219호에는 '인삼과 화기삼의 구별을 위한 마커, 상기 마커를 증폭하기 위한 프라이머, 및 이들의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1426466호에는 '고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트'가 개시되어 있으나, 본 발명의 고려인삼 엽록체 게놈 및 핵 내 rDNA 서열의 완전 해독 기반 품종 및 종 간 구별 마커와 프라이머 세트에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 총 12개의 인삼 품종의 엽록체 게놈 및 핵 내 rDNA 서열을 완전 해독하고, 이들 사이의 변이를 분석하여 종 간 및/또는 종 내 품종간 차이가 발견된 DNA 기반 분자마커 17종을 개발하였다. 상기 분자마커들의 특이적 프라이머를 이용하여 다양한 인삼 품종을 분석한 결과, 본 발명의 분자마커들이 고려인삼 품종간 그리고 미국삼인 외래종과의 판별을 가능케 함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치 염기를 포함하는 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 고려인삼 품종 중 선향 품종 구별용 SNP 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 SNP 위치 염기를 포함하는 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 포함하는 고려인삼 품종 중 금풍 및 청선 품종 구별용 SNP 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 SNP 위치 염기를 포함하는 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 포함하는 고려인삼 품종 중 선향 품종 구별용 SNP 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 SNP 위치 염기를 포함하는 서열번호 7 또는 8의 염기서열을 포함하는 고려인삼 품종 중 금풍 및 청선 품종 구별용 SNP 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 SNP 위치 염기를 포함하는 서열번호 9 또는 10의 염기서열을 포함하는 고려인삼 품종 및 재래종 중 황숙 품종 구별용 SNP 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 11 또는 12의 염기서열을 포함하는, 고려인삼 품종 중 금풍 및 청선 품종 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 11 또는 12의 염기서열을 포함하는, 고려인삼 금풍과 황숙 품종 중에서 황숙 품종 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 InDel 다형성을 보이는 서열번호 13 내지 18의 염기서열 중 어느 하나 이상을 포함하는, 고려인삼 품종 중 선향 품종 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 SNP 위치 염기를 포함하는 서열번호 19 내지 22의 염기서열 중 어느 하나 이상을 포함하는, 고려인삼 품종 중 금풍 및 고풍 품종 구별용 SNP 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 23과 24로 표시된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 고려인삼 금풍과 청선 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 25와 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 27과 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 선향 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 29와 30으로 표시된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 고려인삼 금풍과 고풍 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 SNP(single nucleotide polymorphism) 또는 InDel의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 고려인삼 품종 구별용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고려인삼 품종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 고려인삼 품종을 구별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 분자마커들은 세포내에서 카피수가 수백에서 수천개 존재하면서도 종 내 변이가 매우 드물게 존재하는 지역에서 발굴한 것으로 매우 안정적인 검증이 가능하며, 기존의 방법들보다 저비용, 고효율로 인삼 품종을 식별할 수 있고, 인삼종 내 변이연구에도 그 활용성이 높다. 또한, 인삼 가공제품에서도 원재료 판별이 가능하기 때문에 인삼 가공제품의 가치 향상에 활용될 수 있고, 인삼 품종의 순도유지나 품종 보호, 그리고 종자 분쟁의 해결 등에도 이용될 수 있다.

도 1은 고려인삼 품종 및 미국삼에서 rps16-trnUUG 지역 사이의 종열반복의 유전자 복제 수 변이(copy number variation)을 검증한 것으로, A는 각 품종들의 종열반복 유전자 복제 수 변이를 도식화한 것이며, B는 pgcp097f2*r 프라이머 세트를 이용한 PCR 분석 결과이다. P.ginseng, 고려인삼; P.quinquefolius, 미국삼; ChP, 천풍; YP, 영풍; GU,금풍; GO, 고풍; SO, 선원; SU, 선운; SH, 선향; SP,선풍; CS, 청선; JK, 자경; HS, 황숙; PQ, 미국삼.
도 2는 다양한 SNP 및 InDel 다양성 지역에 대해 인삼 품종간의 차이를 검증한 것으로, A는 rpoC1 유전자 내 SNP에 대해 dCAPS 프라이머를 이용하여 분석한 결과이고, B는 trnUUC-trnGGU 사이의 InDel, C는 ycf1 유전자 내 InDel 지역에 대해 특이 프라이머 세트를 이용한 PCR 분석 결과를 나타낸다. D와 E는 HRM 분석으로 확인한 rpoC2와 5.8S 지역의 SNP로, 금풍과 고풍은 빨간색, 미국삼은 분홍색 그리고 나머지 고려인삼 품종들은 파란색 커브로 나타냈다.
도 3은 천풍 특이적 마커에 대한 프라이머를 이용한 인삼 품종 간의 PCR 결과이다.
도 4는 본 발명의 SNP 및 InDel 마커의 서열정보로, 빨간색 괄호는 SNP 또는 InDel 다형성 염기서열을, 푸른색은 프라이머 위치를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치인 91번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 고려인삼 품종 중 선향 품종 구별용 SNP 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 3 또는 4의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치인 155번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 고려인삼 품종 중 금풍 및 청선 품종 구별용 SNP 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 5 또는 6의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치인 68번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 고려인삼 품종 중 선향 품종 구별용 SNP 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 7 또는 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치인 75번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 고려인삼 품종 중 금풍 및 청선 품종 구별용 SNP 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 9 또는 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치인 82번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 고려인삼 품종 중 황숙 품종 구별용 SNP 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 19 내지 22의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 19 및 20은 91번째, 서열번호 21 및 22는 103번째) 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 고려인삼 품종 중 금풍 및 고풍 품종 구별용 SNP 조성물을 제공한다.

상기 서열번호 1 내지 10 및 19 내지 22는 각각의 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 뉴클레오티드이다. 다형성 서열(polymorphic sequence)이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 다형성 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 조성물에 있어서, 상기 SNP 다형성 염기 정보는 도 4에 나타내었다. 상기 SNP 조성물은 각 SNP를 포함하거나 SNP에 상보적인 프라이머나 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 11 또는 12의 염기서열을 포함하는, 고려인삼 품종 중 금풍 및 청선 품종 구별용 InDel 조성물과 서열번호 13 내지 18의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 고려인삼 선향 품종 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 고려인삼 금풍 품종과 황숙 품중 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 11 또는 12의 염기서열을 포함하는, 고려인삼 금풍과 황숙 품종 중에서 황숙 품종 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

상기 서열번호 11 내지 18은 각각 삽입(insertion) 또는 결실(deletion) 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 뉴클레오티드이다. InDel 다형성이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 일부가 중간에 더해지거나 없어져 품종 혹은 종간에 길이 차이가 생긴 경우를 포함하는 서열을 말한다. 상기 다형성 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 InDel 조성물에 있어서, 상기 InDel 다형성 염기 정보는 도 4에 나타내었다.

본 발명에서 품종간 SNP 및 InDel 정보는 인삼 품종 전체 13개의 완전서열 정보를 이용한 비교이기 때문에 다형성 위치 정보는 천풍 품종(GenBank No. KM088019)의 위치 정보에 준하여 표 2에 표시하였다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 및 InDel 조성물에 있어서, 상기 SNP 및 InDel 위치 염기는 천풍 품종의 엽록체 서열을 기준으로 서열번호 1과 2의 경우 7,159번째, 서열번호 3과 4의 경우 21,344번째, 서열번호 5와 6의 경우 115,594번째, 서열번호 7과 8의 경우 117,376번째, 서열번호 9와 10의 경우 127,069번째, 서열번호 11과 12의 경우 5,473번째, 서열번호 13과 14의 경우 7,189째, 서열번호 15와 16의 경우 32,850번째, 서열번호 17과 18의 경우 105,431~136,936번째, 또한 서열번호 19 내지 22에서 표시된 상기 SNP 위치 염기는 천풍품종의 nrDNA 서열을 기준으로 서열번호 19와 20의 경우 2044번째 및 서열번호 21와 22의 경우 4,165번째 위치이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 및 InDel 조성물에 있어서, 본 발명의 염기서열들은 고려인삼 내 특정 한 개의 품종에만 특이하게 나타나는 경우(서열번호 1 및 2, 서열번호 5 및 6, 서열번호 13 내지 18)와 특정 한 개의 품종이 아닌 소수 품종에서 동시에 차이를 나타내는 경우(서열번호 3 및 4, 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 19 내지 22)가 있어, 여러 개의 조합을 통해 고려인삼 내 품종을 식별하는 용도로 활용할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 23과 24로 표시된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 고려인삼 금풍과 청선 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트, 서열번호 25와 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 27과 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고려인삼 선향 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트 및 서열번호 29와 30으로 표시된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 고려인삼 금풍과 고풍 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

상기 서열번호 23 내지 30으로 표시된 4개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 각각 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이루어져 있으며, 서열번호 23, 25, 27 및 29가 정방향 프라이머이며, 서열번호 24, 26, 28 및 30이 역방향 프라이머이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명은 또한, 상기 서열번호 1 내지 10 및 19 내지 22의 염기서열의 SNP 다형성 뉴클레오티드, 서열번호 11 내지 18의 염기서열의 InDel 다형성 뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 고려인삼 내 특정 품종을 다른 품종으로부터 구별하기 위한 고려인삼 품종 구별용 마이크로어레이를 제공한다. 바람직하게는, 상기 다형성 뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 다형성 뉴클레오티드 또는 그의 상보적 다형성 뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고려인삼 품종을 구별하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은

인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 고려인삼 품종을 구별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 인삼 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있으며, 그 방법은 전술한 바와 같다. 상기 분리된 인삼 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법에 있어서, 고려인삼 품종 내 특정 품종을 다른 품종으로부터 구별하기 위한 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

대상 식물 준비 및 NGS(next generation sequencing)

천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선풍, 선원, 선운, 선향, 청선, 자경, 황숙 및 미국삼 (Panax quinquefolius)의 12개 인삼 품종을 서울대학교 인삼 농장(수원 소재)과 한국인삼공사(http://www.kgc.co.kr/)로부터 준비하고, 식물체의 잎으로부터 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법으로 DNA를 추출하였다. 준비된 약 1㎍의 DNA를 추출하여 일루미나사의 Hiseq-2000 장비로 NGS를 실시하였으며, 인삼 전체 게놈의 약 1X의 데이터 양을 생성하였다.

12 개체의 엽록체 게놈과 핵 내 45S rDNA 서열의 조립

dnaLCW(de novo assembly of low-coverage whole genome shotgun sequencing) 방법(출원번호 10-2013-0167982)을 통해 엽록체 유전체 서열 및 핵 내 rDNA 서열을 조립하였으며 조립에서 나타난 갭과 N은 PCR을 통해 확인 및 수정하였다. 조립이 완성된 후 각 개체의 엽록체 유전자 부위를 결정 및 확인하였다.

비교 분석 및 분자마커의 개발

인삼 품종 전체 12 개체의 엽록체 유전체 서열 전부를 상호 비교하여 유전적 다양성을 확인하였다. 유전적 다양성 및 변이는 종열중복(tandem repeat) 지역, 삽입-결실(INDEL), 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, 이하 SNP) 등으로 나타났으며 결과적으로 변이가 확인된 지역에 기반하여 각 개체의 식별 및 근연종과의 판별의 상용화를 위해 분자마커를 Primer 3 프로그램 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을 이용하여 디자인 하였으며 PCR 증폭, 또는 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 실험으로 확인하였다.

실시예 1. 9개의 고려인삼 엽록체 유전체 서열 및 rDNA 서열 완성

9개의 고려인삼 품종(금풍, 고풍, 선풍, 선원, 선운, 선향 및 청선의 7개 고려인삼 품종과 자경 및 황숙의 2개 고려인삼 재래종)의 엽록체 유전체 서열을 완전 조립 및 해독하였다. 전체 인삼 지놈을 대상으로 수행한 NGS 데이터에서 약 0.1-0.3X에 해당하는 임의의 데이터양을 추출하여 시퀀스 조립을 실시하여 엽록체 지놈 서열에 해당하는 컨티그들, 3-5의 컨티그 갯수를 추출하여 완전체를 완성하였다. 9개의 고려인삼 품종의 엽록체 유전체 서열은 156,241bp에서 156,425bp의 서열 길이 차이를 보였다.

9개의 고려인삼 품종에서 45S rDNA 서열을 생산하였으며, 이는 하나의 컨티그로 조립되어 나왔고 그 길이는 품종간 10,095bp에서 11,089bp로 조립되었으며 이에는 뉴클레오타이드 G, C가 특히 많이 분포하는 rDNA의 유전자간 서열에서 하나의 공통적 N이 포함되어 있다(표 1).

실시예 2. 기 발표된 인삼 3종을 포함한 14개 품종 간의 서열 변이 분석

천풍, 연풍을 포함한 9품종, 재래종 2종 및 중국에서 자라는 고려인삼 3종(Damaya, Ermaya 및 Gaolishen)을 포함하여 14개의 본 연구의 대상 품종에서, 고려인삼 품종 내 엽록체 유전체의 유전자의 구성과 순서는 기 발표된 논문과 동일하였다(Kim et al., 2004, DNA Res. 11:247-261).

전체 14개의 고려인삼 엽록체 유전체 서열 내에서 품종 간 서열 비교 결과 SNP 6개와 InDel 6개가 확인되었다. 중국산 고려인삼 3종은 연풍과 동일한 서열로 나타났다. 2개의 SNP가 유전자 간에서 발견되었으며, 4개의 SNP가 유전자 서열에서 나타났다. 유전자 서열에서 나타난 4개의 SNP 중, 3개의 SNP는 아미노산의 변이를 가져왔고, 각각은 rpoC2 유전자에서 글라이신-세린, ccsA 유전자에서 글루타민-알지닌, ycf1 유전자에서 이소루신-아스파라긴으로의 변이를 나타내었다. 또한, 6개의 InDel 중, 3개는 고려인삼 품종 중 선향에서만 특이적으로 나타난 것으로, 1bp에서 59bp 길이의 단순 삽입과 삭제에 기인한 것으로 확인되었고, 또 다른 3개는 7bp에서 57bp의 연속 반복 인자의 반복 수에 따른 차이로 나타났다(표 2).

실시예 3. 고려인삼 품종 내 45S rDNA 서열의 다양성

고려인삼 품종 내에서 rDNA 서열은 5개의 분명한 SNP를 제외하고는 거의 일치한 서열을 보여 주었다. 서열 변이로 확인된 5개의 SNP 중, 1개의 SNP는 5.8S 유전자, 3개는 유전자 간 사이 그리고 나머지 1개는 26S 유전자 서열 안에서 확인되었다. 이중, 26S 유전자 서열 안에서 확인된 SNP는 금풍과 고풍 품종에서 나타난 것으로, 두가지 뉴클레오타이드(G, C) 서열을 모두 가진 것으로 확인되었다. 5개 중 3개의 SNP는 금풍 및 고풍 품종에서 공통적 변이를 보였고, 1개의 SNP는 선풍 품종에 특이적으로 나타난 것이다(표 2).

실시예 4. 엽록체 유전체와 rDNA 서열 변이에 기반한 고려인삼 품종 내 분자마커

상기에서 확인된 총 17개의 다양성 지역 중 8개에 대해서 서열 변이를 검출할 수 있는 프라이머 세트(표 3)를 제작하여 분자마커로서의 활용성을 검증하였다.

인삼 품종간 다양성을 확인하기 위한 프라이머

Primer ID		서열정보(5'→3') (서열번호)	Product size(bp)	Location
SNP based	pgcpd01a	F: AAATATGACCAACAGTAGTTCGAATCTA (31)	212	rpoC1
		R: AGCTTATCGGCAGAAACGAA (32)
	kpcs03	F: ATGAATCGATTGACAAGTCCAC (23)	220	rpoC2
		R: CGCGCAGACTTGTTGAAGTA (24)
InDel based	pgcp139f*r2	F: TGTGCGACAAACAAATAAGTCA (33)	157	rpl32- trnUAG
		R2: CGAAGCGAGTTCCATTTCAT (34)
	pgycf1	F: GGTATTAGTCTGGATACGGCAAA (35)	729	ycf1
		R: TCGAAAAGAAGGGTCACAAGA (36)
	pgcp097f2*r	F: TGGAAAGGCTGTTGTCACTG (25)	377	rps16- trnUUG
		R: TCAGCAACGGGAGATATTCA (26)
	pgcp137	F: TCCTGAACCACTAGACGATGG (27)	457	trnUUC- trnGGU
		R: TTTCGATAACTTCTTGATCCCTCT (28)
SNP based	pg5.8S	F: GGAATGCGCCAAGGAAATC (29)	190	nrDNA 5.8S region
		R: TTGCGTTCAAAGACTCGATG (30)

그 결과, 도 1의 A와 B에 나타난 선향 특이적 마커는 rps16-trnUUG의 유전자 간에서 확인된 것으로 연속된 반복 서열 13bp, 33bp 두가지 타입의 반복 서열의 반복수의 차이로, pgcp097f2*r 프라이머 세트를 이용하여 PCR 분석한 결과, 고려인삼 품종 내, 그리고 미국삼과의 종 간 차이를 보여준다. rpoC1 유전자에서 발견된 SNP는 천풍 특이 서열로 확인되었고(도 2A), 도 2의 B는 trnUUC-trnGGU 유전자 간에서 확인된 것으로, 고려인삼 품종 내에서 선향 특이적인 차이를 보여주었으며(pgcy137 프라이머 세트 이용), 도 2의 C는 57bp 단위의 반복 서열의 반복 수에 따른 차이로, pgycf1 프라이머 세트를 이용한 분석 결과, 고려인삼 품종 내에서 천풍과 재래종 황숙과 동일하게 나타나 다른 품종과 차이를 보이고 있으며, 이는 동시에 미국삼의 반복 수 차이도 확인되었다. 천풍 특이적인 7bp 반복 수 차이(pgcp139f*r2 프라이머 세트 이용)를 가지는 마커 역시 역시 천풍 식별이 가능한 것으로 나타났다(도 3).

그리고 HRM 기법을 적용한 도 2D에서 확인되는 SNP는 rpoC2 유전자에서 확인된 것으로 금풍과 청선 품종에 특이적인 것으로 확인되었다. 도 2의 E에서 보여진 서열 변이는 HRM 기법으로 확인하였으며 금풍과 고풍의 5.8S rDNA 유전자에서 발견된 SNP를 적용한 것으로 금풍과 고풍을 다른 품종과 구별할 수 있다.

상기와 같은 결과들을 통해, 본 발명의 인삼 품종의 엽록체 및 핵 내 rDNA 염기서열의 완전해독에 기반한 품종 간 다양성지역 17개는 품종식별 분자마커로서의 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Complete sequencing of Chloroplast genome and nrDNA of Panax ginseng-derived Marker, DNA primer set for discrimination of Panax ginseng cultivars and Panax species and uses thereof <130> PN14254 <160> 36 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 110 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 1 atatttcaat atttaaggga ttccatttct ttttcacaaa aatggaaagg ctgttgtcac 60 tgaacgttgt cactaaaata gaacgaaatc taataataaa aatacatata 110 <210> 2 <211> 110 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 2 atatttcaat atttaaggga ttccatttct ttttcacaaa aatggaaagg ctgttgtcac 60 tgaacgttgt cactaaaata gaacgaaatc gaataataaa aatacatata 110 <210> 3 <211> 220 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 3 atgaatcgat tgacaagtcc actaccaata tcttgatttc tggtggcaat acatcgtgga 60 cccagatata tatcatccgc taatacacga ccaattaatg tttggataaa aaccctttcc 120 ggcatcatcc catttcgggg actcacagaa atacttcgga cggtgccaca atcttttcga 180 cgtacaacaa tgtgttgaac tacttcaaca agtctgcgcg 220 <210> 4 <211> 220 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 4 atgaatcgat tgacaagtcc actaccaata tcttgatttc tggtggcaat acatcgtgga 60 cccagatata tatcatccgc taatacacga ccaattaatg tttggataaa aaccctttcc 120 ggcatcatcc catttcgggg actcacagaa atacctcgga cggtgccaca atcttttcga 180 cgtacaacaa tgtgttgaac tacttcaaca agtctgcgcg 220 <210> 5 <211> 117 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 5 cattttcttt ttctagtcat attttatacg attttcatag atctctattt tttttgtttt 60 atgaagataa tattctcttt tatgaagaga atattatcta gagaagaaat agataat 117 <210> 6 <211> 117 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 6 cattttcttt ttctagtcat attttatacg attttcatag atctctattt tttttgtttt 60 atgaagagaa tattctcttt tatgaagaga atattatcta gagaagaaat agataat 117 <210> 7 <211> 141 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 7 aatccaatac atgaatgaaa gaaacaatgt tttaagaact actttttttt ctgctaagaa 60 ttattacagg tcccggttga ttcaacagtt ggattattgg agttatcgtg tcattagtct 120 agggtttatc tttttaacca t 141 <210> 8 <211> 141 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 8 aatccaatac atgaatgaaa gaaacaatgt tttaagaact actttttttt ctgctaagaa 60 ttattacagg tcccagttga ttcaacagtt ggattattgg agttatcgtg tcattagtct 120 agggtttatc tttttaacca t 141 <210> 9 <211> 179 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 9 ccttggtttt gtgcatctga tccaagatct cctcggtctg cgggttcttt ttcttcttga 60 tttcgattct ttaattcaaa attttttttt tcatttgatg gtctaaaaaa attccatttt 120 tgctttccat tgatgttttt attgtcacta acattttcat ttctattcaa atttaaaag 179 <210> 10 <211> 179 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 10 ccttggtttt gtgcatctga tccaagatct cctcggtctg cgggttcttt ttcttcttga 60 tttcgattct ttaattcaaa aatttttttt tcatttgatg gtctaaaaaa attccatttt 120 tgctttccat tgatgttttt attgtcacta acattttcat ttctattcaa atttaaaag 179 <210> 11 <211> 169 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 11 tgcaacgatt cgatagacgg ctcattggga tagatgtaag taaatgaaca agaccccccc 60 ctagaaacgt ataggaagtt ttctcctcgt acggctcgag aaaaaatgat tcgaggtttt 120 gtctatgtat agaattctaa tgaatgacaa aagggttgat aaaatcaat 169 <210> 12 <211> 169 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 12 tgcaacgatt cgatagacgg ctcattggga tagatgtaag taaatgaaca agaccccccc 60 ctagaaacgt ataggaagtt ttctcctcgt acggctcgag aaaaaatgat tcgaggtttt 120 gtctatgtat agaattctaa tgaatgacaa aagggttgat aaaatcaat 169 <210> 13 <211> 391 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 13 tggaaaggct gttgtcactg aacgttgtca ctaaaataga acgaaatcta ataataaaaa 60 tacatatata ttacatatat atattacata ttaagttaaa ctaagcattt cctcatttta 120 tatgtatttt tattttttaa cctggaattt ttatatgtat ttttattttt taacctggaa 180 ttaagtaatc tttctgcaat cttggcataa agtgactaaa atatatgaat taccccgtat 240 caatcgttac atcgatttac aattcttcat tagagccaaa cgcgaaatac ctaaaaaggt 300 caaaaaaaca tcggttacat atgtaacttg attcgttgtt aatgagattc ggacagacac 360 agatatttaa atgaatatct cccgttgctg a 391 <210> 14 <211> 378 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 14 tggaaaggct gttgtcactg aacgttgtca ctaaaataga acgaaatcta ataataaaaa 60 tacatatata ttacatatta agttaaacta agcatttcct cattttatat gtatttttat 120 tttttaacct ggaattttta tatgtatttt tattttttaa cctggaatta agtaatcttt 180 ctgcaatctt ggcataaagt gactaaaata tatgaattac cccgtatcaa tcgttacatc 240 gatttacaat tcttcattag agccaaacgc gaaataccta aaaaggtcaa aaaaacatcg 300 gttacatatg taacttgatt cgttgttaat gagattcgga cagacacaga tatttaaatg 360 aatatctccc gttgctga 378 <210> 15 <211> 516 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 15 tcctgaacca ctagacgatg ggggcatact tacccaatag ccatcatact atgttcatag 60 tatgaacagt tttttgaaat tgtcaatata atggaatgat atgattcgat ccgggggatc 120 tttccgtttt tcatcatttc atatttcata gaatttttga attcatattc atgaatcatt 180 cattagattc gctattgtat ttgtatataa aatacaatag cgaattaata tatcattcta 240 ttatatttta ttttaataaa attcttatta atataattat taattaatat atcattctat 300 tatattttat tttaataaaa ttcttattaa tataattatt aattatatat aaaataatat 360 aaaatataat tatagaataa aaaaatagaa aaaatacggg gaatactttc agggagtggt 420 tggtccgtca gaaaagaaaa agaaaaaggg gctcgcacta agctcggaaa ttcacaaaca 480 aaaaatctga gaagagggat caagaagtta tcgaaa 516 <210> 16 <211> 457 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 16 tcctgaacca ctagacgatg ggggcatact tacccaatag ccatcatact atgttcatag 60 tatgaacagt tttttgaaat tgtcaatata atggaatgat atgattcgat ccgggggatc 120 tttccgtttt tcatcatttc atatttcata gaatttttga attcatattc atgaatcatt 180 cattagattc gctattgtat ttgtatataa aatacaatag cgaattaata tatcattcta 240 ttatatttta ttttaataaa attcttatta atataattat taattatata taaaataata 300 taaaatataa ttatagaata aaaaaataga aaaaatacgg ggaatacttt cagggagtgg 360 ttggtccgtc agaaaagaaa aagaaaaagg ggctcgcact aagctcggaa attcacaaac 420 aaaaaatctg agaagaggga tcaagaagtt atcgaaa 457 <210> 17 <211> 136 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 17 gtcggagaag ggcaatcact cattcttaaa accggcgttc ttaagaccaa agagtcggcg 60 gaaagggggg gggggaagct ctccgttcct ggttctcctg tagctggatc ctccggaacc 120 acaagaatcc ttagtt 136 <210> 18 <211> 135 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 18 gtcggagaag ggcaatcact cattcttaaa accggcgttc ttaagaccaa agagtcggcg 60 gaaagggggg ggggaagctc tccgttcctg gttctcctgt agctggatcc tccggaacca 120 caagaatcct tagtt 135 <210> 19 <211> 191 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 19 ggaatgcgcc aaggaaatca aactgaactg cacgcgtccc ccccgtttgc gggcggcgga 60 agcgtctttc taaaacacaa acgactctcg gcaacggata tctcggctct cgcatcgatg 120 aagaacgtag cgaaatgcga tacttggtgt gaattgcaga atcccgtgaa ccatcgagtc 180 tttgaacgca a 191 <210> 20 <211> 191 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 20 ggaatgcgcc aaggaaatca aactgaactg cacgcgtccc ccccgtttgc gggcggcgga 60 agcgtctttc taaaacacaa acgactctcg acaacggata tctcggctct cgcatcgatg 120 aagaacgtag cgaaatgcga tacttggtgt gaattgcaga atcccgtgaa ccatcgagtc 180 tttgaacgca a 191 <210> 21 <211> 172 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 21 aacgttaggg agtccggaga cgtcggcggg ggccccggaa agagttatct tttctgttta 60 acagcctgcc caccctggaa acggctcagc cggaggtagg gtgccagcgg ctggaagagc 120 accgcacgtc gcgtggtgtc cggtgcgccc ccggcggccc ttgaaaatcc gg 172 <210> 22 <211> 171 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 22 aacgttaggg agtccggaga cgtcggcggg ggccccggaa agagttatct tttctgttta 60 acagcctgcc caccctggaa acggctcagc cggaggtagg gtccagcggc tggaagagca 120 ccgcacgtcg cgtggtgtcc ggtgcgcccc cggcggccct tgaaaatccg g 171 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 atgaatcgat tgacaagtcc ac 22 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cgcgcagact tgttgaagta 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tggaaaggct gttgtcactg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tcagcaacgg gagatattca 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 tcctgaacca ctagacgatg g 21 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tttcgataac ttcttgatcc ctct 24 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ggaatgcgcc aaggaaatc 19 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 ttgcgttcaa agactcgatg 20 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 aaatatgacc aacagtagtt cgaatcta 28 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 agcttatcgg cagaaacgaa 20 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 tgtgcgacaa acaaataagt ca 22 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cgaagcgagt tccatttcat 20 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 ggtattagtc tggatacggc aaa 23 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tcgaaaagaa gggtcacaag a 21

Claims (15)

1. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선풍, 선원, 선운, 선향, 청선, 자경 및 황숙을 포함하는 고려인삼 품종으로부터 선향 품종 구별용 마커 조성물:
   1) 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서,
   각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치인 91번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드;
   2) 서열번호 5 또는 6의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서,
   각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치인 68번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드; 및
   3) 고려인삼 선향 품종과 다른 고려인삼 품종 간에 InDel 다형성을 보이는 서열번호 13 내지 18의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드.
2. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선풍, 선원, 선운, 선향, 청선, 자경 및 황숙을 포함하는 고려인삼 품종으로부터 금풍 및 청선 품종 구별용 마커 조성물:
   1) 서열번호 3 또는 4의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서,
   각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치인 155번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드;
   2) 서열번호 7 또는 8의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서,
   각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치인 75번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드; 및
   3) 고려인삼 금풍 및 청선 품종과 다른 고려인삼 품종 간에 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 11 또는 12의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드.
3. 삭제
4. 삭제
5. 서열번호 9 또는 10의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드에 있어서,
   각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치인 82번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선풍, 선원, 선운, 선향, 청선, 자경 및 황숙을 포함하는 고려인삼 품종으로부터 황숙 품종 구별용 SNP 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 서열번호 19 내지 22의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 19 및 20은 91번째, 서열번호 21 및 22는 103번째) 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 뉴클레오티드를 포함하는, 천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선풍, 선원, 선운, 선향, 청선, 자경 및 황숙을 포함하는 고려인삼 품종으로부터 금풍 및 고풍 품종 구별용 SNP 조성물.
10. 서열번호 23과 24로 표시된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선풍, 선원, 선운, 선향, 청선, 자경 및 황숙을 포함하는 고려인삼 품종으로부터 금풍과 청선 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트.
11. 서열번호 25와 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 27과 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선풍, 선원, 선운, 선향, 청선, 자경 및 황숙을 포함하는 고려인삼 품종으로부터 선향 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트.
12. 서열번호 29와 30으로 표시된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선풍, 선원, 선운, 선향, 청선, 자경 및 황숙을 포함하는 고려인삼 품종으로부터 금풍과 고풍 품종을 구별하기 위한 프라이머 세트.
13. 제1항, 제2항, 제5항, 제9항 중 어느 한 항에 기재된 SNP(single nucleotide polymorphism) 또는 InDel의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선풍, 선원, 선운, 선향, 청선, 자경 및 황숙을 포함하는 고려인삼 품종 구별용 마이크로어레이.
14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선풍, 선원, 선운, 선향, 청선, 자경 및 황숙을 포함하는 고려인삼 품종을 구별하기 위한 키트.
15. 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계;및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 천풍, 연풍, 금풍, 고풍, 선풍, 선원, 선운, 선향, 청선, 자경 및 황숙을 포함하는 고려인삼 품종을 구별하기 위한 방법.

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