JP2006246838A - トバモウイルスに対するl抵抗性遺伝子型の識別方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 カプシクム属植物ゲノムを鋳型とし、特定の配列を有するオリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドからなる一対のプライマーを用いて増幅できる増幅DNA断片の一部又は全部を含むマーカーDNA断片を増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、マーカーDNA断片を増幅する工程と、得られたマーカーDNA断片を制限酵素で処理する工程と、制限酵素処理によって得られたDNA断片を検出する工程とを含む、カプシクム属植物のL抵抗性遺伝子型識別方法。
【選択図】 なし
Description
(1)カプシクム属植物ゲノムを鋳型とし、配列番号1で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号2で表されるオリゴヌクレオチドからなる一対のプライマーを用いて増幅できる増幅DNA断片の一部又は全部を含むマーカーDNA断片を増幅するように設計されたプライマーセット
本発明に係るカプシクム属植物のL抵抗性遺伝子型識別方法は、従来の識別方法では不可能であったヘテロ接合体を含むL抵抗性遺伝子型を判定できるものであり、座乗するL抵抗性遺伝子の近傍領域(マーカーDNA断片)に基づいてL抵抗性遺伝子型の識別を行う方法である。ここで、「マーカーDNA断片」とは、L抵抗性遺伝子型の違いに関わらず抵抗性品種全般で増幅されるDNA領域のことを指し、トバモウイルスに対する抵抗性遺伝子型を識別できる共優性マーカーのことをいう。トバモウイルス属に属するウイルスとしては、例えば、トウガラシマイルドモットルウイルス(PMMoV)、タバコモザイクウイルス(TMV)、トマトモザイクウイルス (ToMV)、パプリカマイルドモットルウイルス (PaMMV)を挙げることができる。
(1)トバモウイルスに対する抵抗性カプシクム属植物からのゲノムDNA抽出
L3遺伝子をホモにもつC. chinense PI 159236の約1gの本葉をTOMY社のビーズ式細胞破砕装置(MS-100)で破砕し、Amersham Biosciences社のNucleon PhytoPureを用いてゲノムDNAを抽出した。
抽出したゲノムDNAをBamHI、EcoRI、HindIIIで別々に制限酵素処理(BamHI:30℃で16時間、EcoRI、HindII:37℃で16時間)し、フェノール処理とアルコール沈殿を行って精製した後、Takara社のDNA Ligation Kit ver.2.1を用いてセルフライゲーション(16℃で16時間)を行った。これを鋳型とし、配列番号3と4で示されるプライマーを用いてInverse PCRを行った。PCRは、MJ Research社のPeltier thermal cycler PTC-225を用い、反応条件として、94℃で4分間の反応の後、94℃で10秒間、55℃で10秒間、72℃で10分間の反応を35回繰り返し、最後に72℃で7分間の反応を実行した。PCRの後、1%のアガロースゲルで電気泳動を行い、ゲルのエチジウムブロマイド染色を行ってPCR増幅断片を検出した。PCR増幅断片をPromega社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いてアガロースゲルから抽出した後、Invitrogen社のTOPO TA Cloning KitでPCR増幅断片のクローニングを行った。QIAGEN社のQIAprep Spin Miniprep Kitを用いてPCR増幅断片が挿入されたプラスミドDNAの抽出と精製を行い、これを鋳型とし、Applied Biosystems社の遺伝子解析キット(BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit)と解析システム(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer)を用いてPCR増幅断片の塩基配列を決定した。最終的に、既知のトバモウイルス抵抗性識別SCARマーカーと隣接する、長さ13.796 kbpの塩基配列を決定することができた。
実施例1で決定した近傍領域の塩基配列からプライマーを設計し、抵抗性品種(C. chinense PI 159236)と感受性品種(C. annuum cv. Shoosuke)から抽出したゲノムDNAを鋳型にしてPCRを行った。PCRは、94℃で4分間の反応の後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間の反応を35回、最後に72℃で7分間の反応、という反応条件で行った。PCR増幅産物が抵抗性品種にだけ検出された場合は、このPCR増幅産物を直ちに新規なトバモウイルス抵抗性識別マーカーとした。また、PCR増幅産物が感受性個体でも検出された場合は、そのPCR増幅産物の塩基配列を決定した後、抵抗性個体の塩基配列と比較し、改めてトバモウイルス抵抗性識別マーカー用のプライマーを設計した。
本発明のL抵抗性遺伝子型を識別できるCAPSマーカーの汎用性を検証するために、すでにL抵抗性遺伝子型が明らかとなっているカプシクム属植物(表1)を用いて、L抵抗性遺伝子型と制限酵素断片長多型との対応を検証した。
Claims (10)
- カプシクム属植物ゲノムを鋳型とし、配列番号1で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号2で表されるオリゴヌクレオチドからなる一対のプライマーを用いて増幅できる増幅DNA断片の一部又は全部を含むマーカーDNA断片を増幅するように設計されたプライマーセット。
- 配列番号1で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号2で表されるオリゴヌクレオチドからなる、請求項1記載のプライマーセット。
- 上記増幅DNA断片は、配列番号5乃至14のうちいずれか1で表される塩基配列を含むものであることを特徴とする請求項1記載のプライマーセット。
- カプシクム属植物ゲノムを鋳型とし、配列番号1で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号2で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて増幅できる増幅DNA断片の一部又は全部を含むマーカーDNA断片。
- 上記増幅DNA断片は、配列番号5乃至14のうちいずれか1で表される塩基配列を含むものであることを特徴とする請求項4記載のマーカーDNA断片。
- カプシクム属植物ゲノムを鋳型とし、請求項1乃至3いずれか一項記載のプライマーセットを用いて、マーカーDNA断片を増幅する工程と、
得られたマーカーDNA断片を制限酵素で処理する工程と、
制限酵素処理によって得られたDNA断片を検出する工程と
を含む、カプシクム属植物のL抵抗性遺伝子型識別方法。 - 上記制限酵素処理はGTACを認識配列とする制限酵素を使用することを特徴とする請求項6記載のカプシクム属植物のL抵抗性遺伝子型識別方法。
- 上記制限酵素処理はGTACを認識配列とする制限酵素及びATTAATを認識配列とする制限酵素を使用することを特徴とする請求項6記載のカプシクム属植物のL抵抗性遺伝子型識別方法。
- 上記DNA断片を検出する工程では、制限酵素処理によって得られたDNA断片を電気泳動によって分離することを特徴とする請求項6記載のL抵抗性遺伝子型識別方法。
- 上記DNA断片を検出する工程で行った電気泳動の結果として得られた泳動パターンからL抵抗性遺伝子型を特定する工程を更に含むことを特徴とする請求項9記載のL抵抗性遺伝子型識別方法。
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2005
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