KR102159023B1

KR102159023B1 - Its2 영역을 시퀀싱 하기 위한 증폭용 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102159023B1
Application number: KR1020190131684A
Authority: KR
Inventors: 서보윤; 박홍현; 박부용; 조점래; 정진교
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2020-09-23

Abstract

본 발명은 유전자를 시퀀싱 하기 위한 유전자 증폭용 프라이머 세트에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 ITS2 영역을 시퀀싱 하기 위한 증폭용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 ITS2의 염기서열을 시퀀싱 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 종래에 알려진 ITS 영역 증폭용 프라이머를 사용한 경우 벌목 (Hymenoptera)에 대해서는 증폭 효과가 좋지 못함을 발견하고 벌목을 포함한 다양한 곤충 목에 대해 범용적으로 사용 가능한 ITS 영역 증폭용 프라이머를 예의 연구한 결과, 벌목 (Hymenoptera)의 다양한 종뿐만 아니라 다양한 곤충 목에서도 ITS2 영역 염기서열 확보가 가능하여 ITS2 영역을 활용한 계통분류 연구 및 종 동정 기술 개발에 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

Description

ITS2 영역을 시퀀싱 하기 위한 증폭용 프라이머 세트 및 이의 용도{Set of Primer amplifying and sequencing for ITS2 region and its use}

본 발명은 유전자를 시퀀싱 하기 위한 유전자 증폭용 프라이머 세트에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 ITS2 영역을 시퀀싱 하기 위한 증폭용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 ITS2의 염기서열을 시퀀싱 하는 방법에 관한 것이다.

ITS (internal　transcribed　spacer)는　염색체의　작은 서브유닛 리보솜 RNA (small subunit　ribosomal　RNA, SSU　rRNA)와 큰 서브유닛 리보솜 RNA (large-subunit　rRNA, LSU　rRNA)　유전자　사이에 위치한　DNA 영역을 말한다.

보다 구체적으로, 균류 (Fungi),　원생생물 (Protists) 등의 미생물을 포함하는　진핵생물의　리보솜 RNA (rRNA)는　작은 서브유닛 리보솜 RNA인 18S, 큰 서브유닛 리보솜 RNA인 28S (종에 따라 25S) 및 5.8S　리보솜 RNA로 구성되어 있는데, 진핵생물의 18S와 28S　리보솜 RNA는 원핵 생물의 16S,　23S　리보좀 RNA에 각각 대응되나, 원핵 생물과 달리 진핵 생물의　ITS　영역은 5.8S　리보솜 RNA를 기준으로　ITS1과　ITS2 영역으로 나뉜다. 원핵 생물의　리보솜 RNA 오페론 개수가 종에 따라 1개 또는 최대로 15개 정도에 그치는 반면, 진핵 생물의 경우 1개 내지 2개에서 최대 수천 개의　리보솜 RNA 유전자가 특정 염색체의 한 부분에 연속적으로 모여서 위치한다 (tandem　repeats). 비록 28S　리보솜 RNA가 일부의 진핵 미생물에서 여러 조각으로 절편화된 경우가 있지만, 18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S로 이어지는 유전자 배열은 전체 진핵 생물에 걸쳐 매우 보존적이어서, 일부 원핵 생물의 경우와 같이 ITS　영역이 없는 예는 아직 보고되지 않았다.

한편, ITS 영역은 다음과 같은 이유로 인해 다른 유전자에 비해 손쉽게 서열 정보를 얻을 수 있어 분자계통분류를 위한 지표 (marker)로 널리 이용되고 있다.

첫째, ITS 영역은 거의 모든 생물 종에 존재하고, 둘째, ITS를 감싸고 있는 16S 리보솜 RNA (진핵 생물의 경우 18S), 23S 리보솜 RNA (25S 또는 28S)의 끝부분은 종간 서열이 매우 보존적이어서 중합효소연쇄반응 프라이머 (PCR primers)의 제작이 용이하며, 셋째, 유전체 내 여러 복사본 (copies)를 갖고 있어, 적은 양의 DNA에서 ITS 영역의 증폭 (PCR)이 용이하다.

전술한 ITS 영역의 특성에 기초하여 임의의 균주를 ITS 서열로 특정하는 연구는 진행되었으나 (한국공개특허공보 제10-2000-0075178호), 벌목 (Hymenoptera)을 포함한 다양한 곤충 목 (order)에 적용할 수 있는 범용성이 있으며, ITS2 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머에 관한 연구는 미진한 실정이다.

본 발명자들은 종래에 알려진 ITS 증폭용 프라이머를 사용한 경우 벌목 (Hymenoptera)에 대해서는 증폭 효과가 좋지 못함을 발견하고 벌목을 포함한 다양한 곤충 목에 대해 범용적으로 사용 가능한 ITS 증폭용 프라이머를 예의 연구한 결과, 신규의 ITS2 증폭용 프라이머를 사용하면 다양한 곤충 목에 대하여 ITS2 영역의 염기서열을 증폭할 수 있음을 최초로 규명하여 상기 ITS2 영역의 시퀀싱에 적용하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는, ITS2 (Internal transcribed spacer 2) 영역의 시퀀싱 (sequencing)을 하기 위한 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 유전자 시퀀싱용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 유전자 시퀀싱용 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는, 증폭용 프라이머 세트를 사용하여 검체 유래의 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는, ITS2 (Internal transcribed spacer 2)의 시퀀싱 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는, ITS2 (Internal transcribed spacer 2) 영역을 시퀀싱 (sequencing) 하기 위한 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예로, 상기 프라이머 세트는 벌목 (Hymenoptera), 파리목 (Diptera), 총채벌레목 (Thysanoptera) 및 딱정벌레목 (Coleoptera)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 사용 가능한 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 유전자 시퀀싱용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 유전자 시퀀싱용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는, 증폭용 프라이머 세트를 사용하여 검체 유래의 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는, ITS2 (Internal transcribed spacer 2) 영역의 시퀀싱 방법을 제공한다.

본 발명자들은 종래에 알려진 ITS 증폭용 프라이머를 사용한 경우 벌목 (Hymenoptera)에 대해서는 증폭 효과가 좋지 못함을 발견하고 벌목을 포함한 다양한 곤충 목에 대해 범용적으로 사용 가능한 ITS 증폭용 프라이머를 예의 연구한 결과, 벌목 (Hymenoptera)의 다양한 종뿐만 아니라 파리목, 총채벌레목, 딱정벌레목에서도 ITS2 영역 염기서열 확보가 가능하여 ITS2 영역을 활용한 계통분류 연구 및 종 동정 기술 개발에 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 ITS2 전체 영역이 포함된, 18S 리보솜 RNA 영역과 28S 리보솜 RNA 영역 사이에 대하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 황온좀벌의 5.8S 리보솜RNA 부분 영역과 ITS2 전체 영역 및 28S 리보솜 RNA 부분 영역을 시퀀싱 한 결과를 나타낸 것이다 (파란색: 5.8S 리보솜 DNA, 빨간색: ITS2, 초록색: 28S 리보솜 DNA 영역을 나타냄).
도 3은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 예쁜가는배고치벌의 5.8S 리보솜RNA 부분 영역과 ITS2 전체 영역 및 28S 리보솜 RNA 부분 영역을 시퀀싱 한 결과를 나타낸 것이다 (파란색: 5.8S 리보솜 DNA, 빨간색: ITS2, 초록색: 28S 리보솜 DNA 영역을 나타냄).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이에, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는, ITS2 (Internal transcribed spacer 2) 영역의 시퀀싱(sequencing)을 하기 위한 유전자 증폭용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는, 유전자 시퀀싱용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는, 유전자 시퀀싱용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 프라이머 세트 중 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머는 28S 리보솜 RNA 영역을 참고하여 제작된 벌목 등의 ITS2 영역 염기서열의 시퀀싱을 위한 역방향의 신규 프라이머이고, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머는 18S 리보솜 RNA 영역의 시퀀싱을 위한 정방향의 범용 종래 프라이머이다 (Hills and Dixon, 1991). 이때, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "프라이머 (primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건 (4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 말한다.

본 발명에 따른 프라이머 세트는 벌목 (Hymenoptera), 파리목 (Diptera), 총채벌레목 (Thysanoptera) 및 딱정벌레목 (Coleoptera)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 사용 가능한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 실시예를 통해 본 발명에 따른 프라이머 세트를 사용하여 벌목을 포함한 다양한 곤충 목의 ITS2를 증폭하고, 상기 증폭 산물에 기초하여 시퀀싱이 가능하다는 것을 규명하였다.

본 발명의 일 실시예에서 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는, ITS2 (Internal transcribed spacer 2) 영역의 시퀀싱 (sequencing)을 위한 유전자 증폭용 프라이머 세트를 사용하여 다양한 곤충 목에 대하여 증폭 산물이 생성되는지 여부를 확인한 결과, 벌목 (Hymenoptera), 파리목 (Diptera), 총채벌레목 (Thysanoptera) 및 딱정벌레목 (Coleoptera)에서 증폭 산물이 생성됨을 확인하였다 (실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서 황온좀벌 및 예쁜가는배고치벌의 유전자를 이용하여 PCR 증폭 산물을 얻었고 상기 증폭 산물에 기초하여 ITS2의 생어 염기서열 분석 (Sanger sequencing)을 수행한 결과, 황온좀벌의 5.8S RNA 부분 영역과 ITS2 전체 영역, 그리고 28S RNA 부분 영역을 시퀀싱 할 수 있고, 예쁜가는배고치벌의 5.8S RNA 부분 영역과 ITS2 전체 영역, 그리고 28S RNA 부분 영역을 시퀀싱 할 수 있음을 확인하였다 (실시예 3 참조).

상기 실시예의 결과들은 본 발명에 따른 프라이머 세트가 벌목을 포함한 다양한 곤충 목 (order)에서 범용적으로 ITS2 유전자 영역을 증폭할 수 있으며 상기 증폭 산물을 이용하여 ITS2 유전자 염기서열의 시퀀싱이 가능함을 시사한다.

이에, 본 발명은 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는, 증폭용 프라이머 세트를 사용하여 검체 유래의 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는, 유전자 시퀀싱 (sequencing) 방법을 제공한다. 여기서, 상기 유전자는 ITS2 (Internal transcribed spacer 2) 인 것일 수 있고, 벌목 (Hymenoptera), 파리목 (Diptera), 총채벌레목 (Thysanoptera) 및 딱정벌레목 (Coleoptera)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 사용 가능한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에 따른 상기 방법은 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR), 리가아제 연쇄 반응 (ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응 (repair chain reaction), 전사-중재 증폭 (transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭 (selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소연쇄반응 (multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응 (nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응 (single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcriptase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응 (realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 및 실시간 중합효소연 쇄반응 정량검사 (Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는, 벌목, 파리목, 총채벌레목 및 딱정벌레목으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상 목의 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는, 벌목을 포함한 다양한 곤충 목 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 벌목을 포함한 다양한 곤충 목의 동정용 키트 및 상기 프라이머 세트를 사용하여 검체 유래의 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는, 벌목을 포함한 다양한 곤충 목의 동정 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법

1-1. ITS2 서열 증폭용 프라이머의 제작

벌목의 28S 리보솜 RNA 영역을 참고하여 벌목의 ITS2 영역의 시퀀싱을 위한 역방향의 증폭용 신규 프라이머 제작하였고, 상기 프라이머와 함께 18s 리보솜 RNA 영역에서는 정방향의 범용 프라이머 18e (5’-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3’) (Hills and Dixon, 1991)를 준비하였다. 하기의 표 1은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 나타낸다.

프라이머 명	서열번호	정방향(F) / 역방향(R)	Primer sequence (5'-3')
ITS-28Hym-R	1	역방향 (R)	TA CCA CCC ACT TAG AGC TGC
18e	2	정방향 (F)	CTGGTTGATCCTGCCAGT

1-2. 검체의 Genomic DNA 추출

본 실험을 위해 먼저, 검체의 Genomic DNA는 CTAB extraction solution과 2-mercaptoethanol을 이용하여 추출하였다. 보다 구체적으로, CTAB extraction solution 10 ㎖에 2-mercaptoethanol 73 ㎕을 섞어 CTAB 추출 용액을 만들어 1.5 ㎖ tube에 200 ㎕를 넣고 한 개체를 마쇄하였다.

그 다음으로, 65 ℃에서 1시간 동안 가열 시킨 후 chloroform/IAA 200 ㎕을 넣고 vortex하고 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 새로운 1.5 ㎖ tube로 옮기고 isopropyl alcohol 100 ㎕와 잘 섞어 침전이 일어나도록 상온에서 20분간 보관 후 4 ℃조건에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리를 하였다.

마지막으로, 70 % EtOH을 이용하여 세척한 후 멸균된 3차증류수 20 ㎕에 녹이고 RNase A 1 ㎕를 넣어 30분간 상온에 놓아 둔 후 NanoDrop 2000을 이용하여 추출된 Genomic DNA 양을 측정하였다.

1-3. PCR 실험 조건

PCR 반응은 하기 표 2의 성분으로 구성된 PCR 반응액을 제조하여 수행되었다. PCR 반응액은 PCR tube (200 ㎕)에 2ｘReaction Mix (반응버퍼) 10 ㎕, PCR 프라이머 쌍 [18e (10pM) : ITS-28Hym-R (10pM)] 2.5 ㎕, DNA 중합효소 1 ㎕, 멸균된 3차 증류수 7 ㎕를 넣고 잘 섞은 다음 1 ㎕의 Genomic DNA를 마지막으로 추가하여 최종 반응액이 20 ㎕가 되도록 하여 제조하였다. 음성대조군의 PCR 반응액에는 동일한 양의 멸균된 3차 증류수로 채워 넣어 20 ㎕의 최종 반응액으로 만들었다. PCR의 반응온도와 반응시간은 하기의 표 3에 나타낸 바와 같으며, 상기 조건으로 30 내지 35 사이클을 진행하였다. PCR 결과는 1 % 아가로스 겔에 로딩한 후 전기영동을 통해 확인하였다.

성분		부피 (㎕)
반응버퍼 (2X)		10.0
프라이머	18e (10pM)	1.0
	ITS-28Hym-R (10pM)	1.0
3차 증류수		7.0
Genomic DNA		1.0
최종 반응액		20.0

반복수	반응순서	반응온도	반응시간
30-35	1	98 ℃	10초
	2	60 ℃	15초
	3	68 ℃	1분

실시예 2. 벌목, 파리목, 나비목, 노린재목, 총채벌레목 및 딱정벌레목의 ITS2 서열의 증폭여부 확인

상기 1-2 및 1-3의 실험방법을 사용하여 검체인 벌목 6종, 파리목 1종, 나비목 1종, 노린재목 3종, 총채벌레목 2종, 딱정벌레목 1종의 Genomic DNA를 추출하고 ITS2 전체 영역이 포함된 18S 리보솜 RNA 영역에서 28S 리보솜 RNA 영역 사이의 특이 증폭 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이 벌목 6종에서 모두 3 내지 5kbp의 단일한 PCR 증폭 산물이 확인되었고, 나비목과 노린재목을 제외한 나머지 파리목 1종, 총채벌레목 2종, 딱정벌레목 1종은 비슷한 크기의 단일 PCR 증폭 산물이　확인되었다. 도 1의 영문 약자의 의미는 다음과 같다 (Hym.: 벌목, Dip.: 파리목, Lep.: 나비목, Hem.: 노린재목, Thy.: 총채벌레목, Col.: 딱정벌레목).

실시예 3. 본 발명에 따른 프라이머 세트를 사용하여 증폭시킨 벌목 검체의 ITS2 시퀀싱의 확인

황온좀벌 및 예쁜가는배고치벌의 유전자 및 상기 1-2 및 1-3의 실험방법을 사용하여, PCR 증폭 산물을 얻었고 상기 증폭 산물을 기초로 ITS2의 생어 염기서열 분석 (Sanger sequencing)을 수행하였다.

그 결과, 도 2 및 도 3에서 나타낸 바와 같이 해독된 염기서열에서 ITS2 영역을 확인하였다. 보다 구체적으로, 도 2는 본 발명에 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 황온좀벌의 5.8S RNA 부분 영역과 ITS2 전체 영역, 그리고 28S RNA 부분 영역을 시퀀싱한 결과를 나타낸 것이고, 도 3은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 예쁜가는배고치벌의 5.8S 리보솜-ITS2-28S 리보솜의 유전자를 시퀀예쁜가는배고치벌의 5.8S RNA 부분 영역과 ITS2 전체 영역, 그리고 28S RNA 부분 영역을 시퀀싱한 나타낸 것이다 (파란색: 5.8s 리보솜 DNA, 빨간색: ITS2, 초록색: 28s 리보솜 DNA을 나타냄).

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Set of Primer amplifying and sequencing for ITS2 region and its use <130> PD19-143 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS-28Hym-R (R) <400> 1 taccacccac ttagagctgc 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18e (F) <400> 2 ctggttgatc ctgccagt 18

Claims

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는, ITS2 (Internal transcribed spacer 2) 영역을 시퀀싱 (sequencing) 하기 위한 유전자 증폭용 프라이머 세트.
제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 벌목 (Hymenoptera), 파리목 (Diptera), 총채벌레목 (Thysanoptera) 및 딱정벌레목 (Coleoptera)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 사용 가능한 것을 특징으로 하는, 유전자 증폭용 프라이머 세트.
제1항의 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는, 유전자 시퀀싱 (sequencing)용 조성물.
제3항의 조성물을 포함하는, 유전자 시퀀싱 (sequencing)용 키트.
서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는, 증폭용 프라이머 세트를 사용하여 검체 유래의 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는, ITS2 (Internal transcribed spacer 2) 영역의 시퀀싱 (sequencing) 방법.
제5항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 벌목 (Hymenoptera), 파리목 (Diptera), 총채벌레목 (Thysanoptera) 및 딱정벌레목 (Coleoptera)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 사용 가능한 것을 특징으로 하는 ITS2 (Internal transcribed spacer 2) 영역의 시퀀싱 (sequencing) 방법.