RU2584035C1

RU2584035C1 - Способ диагностики онихомикоза

Info

Publication number: RU2584035C1
Application number: RU2015104841/15A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Михайлович Лавникевич; Наталья Всеволодовна Васильева; Галина Анастасьевна Чилина; Татьяна Владимировна Медведева; Екатерина Валерьевна Крылова; Анастасия Евгеньевна Тараскина
Priority date: 2015-02-12
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2016-05-20

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной генетики и микологии и предназначено для диагностики онихомикоза. Осуществляют выделение ДНК из биологического материала ногтей, проведение ПЦР и детекцию полученных результатов с помощью электрофореза в агарозном геле. Анализируют следующий спектр грибов: Trichophyton spp., Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis и микромицетов любой родовой принадлежности, используя мультиплексное решение для ПЦР с применением праймеров в двух реакциях, причем для определения грибов родов Aspergillus и Fusarium используют общий обратный праймер. В I реакции при детекции полосы, соответствующей 168 п.н., диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Scopulariopsis brevicaulis, 120 п.н. - Candida spp., 600-650 п.н. - онихомикоз вызван любым микромицетом. Во II реакции при детекции полосы, соответствующей 302 п.н., диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Trichophyton spp., 221 п.н. - Fusarium spp., 193 п.н. - Aspergillus spp. Изобретение обеспечивает эффективный способ одновременной идентификации всех этиологических агентов, клинически значимых для онихомикоза России. 1 ил., 4 пр.

Description

Изобретение относится к области молекулярной генетики и микологии и может быть использовано в клинической микологии для диагностики онихомикоза.

Онихомикоз - это грибковое поражение ногтей, вызываемое, как правило, грибами-дерматомицетами рода Trichophyton. Однако условно-патогенные микромицеты - дрожжевые (Candida spp.) и нитчатые недерматомицеты (Aspergillus spp., Fusarium spp. и Scopulariopsis brevicaulis) также могут играть важную роль в возникновении этого заболевания. Для успешного лечения онихомикоза имеет большое значение точная и быстрая диагностика. В случаях, когда диагноз основывался только на клинических симптомах, приблизительно у половины пациентов он оказывался неверным [1].

До настоящего времени основным способом диагностики онихомикоза являлся прямой микроскопический анализ и культуральное исследование (выращивание этиологического агента на дифференциальных питательных средах из биологического материала) [1, 2, 3, 4, 5].

Световая микроскопия препарата, приготовленного в гидроксиде калия (КОН-микроскопия) на сегодняшний день является «золотым стандартом» лабораторной диагностики онихомикоза [2].

Следует отметить, что выделение культуры гриба имеет низкую чувствительность, так как в 30-50% микроскопически выявленных случаев онихомикоза патоген не вырастает, и, следовательно, микромицет не может быть идентифицирован на родовом и/или видовом уровне. Также к значительным недостаткам данного способа относят низкую специфичность микроскопии и большие временные затраты, необходимые для роста грибковой культуры (4-6 недель) [1, 3, 4, 5].

Применяемые культуральные и гистологические методы недостаточно чувствительны, а кроме того, трудоемки и занимают продолжительное время.

С внедрением методов молекулярной диагностики в микробиологическую практику стали разрабатываться способы диагностики онихомикоза для точной (даже на уровне вида) и быстрой (в течение 48 часов) на основе ПЦР.

На российском коммерческом рынке наиболее доступен способ диагностики онихомикоза с использованием тест-системы «ТрифАм» ООО НПФ «Гентех» (Москва, Россия). Недостатки способа: диагностика только двух представителей дерматофитов: Trichophyton rubrum и Trichophyton interdigitale, а также низкая специфичность.

Существует способ диагностики онихомикоза с помощью мультиплексной ПЦР, позволяющий определять все дерматофиты (использование универсальных пандерматофитных праймеров) и Trichophyton rubrum, наиболее частого этиологического агента онихомикоза, в одной реакции. Способ независимо описан в двух работах с применением различных систем праймеров: Brillowska-Dabrowska с соавторами [3] и в работе Kondori с соавторами (использование коммерчески доступной ПЦР тест-системы Statens Serum Institut, Copenhagen, Denmark) [4]. Недостаток способа - идентификация только дерматофитов, упускаются из виду важные этиологические агенты онихомикоза, такие как дрожжевые грибы и нитчатые недерматомицеты, и, как следствие, недостаточно высокая специфичность.

В работе Graser Y. с соавторами «Диагностика ПЦР дерматофитов - обзор» [1] авторами проведен анализ способов диагностики онихомикозов с помощью тест-систем, представленных на коммерческом рынке. Основным недостатком представленных ПЦР тест-систем является недостаточно высокая специфичность, идентификация только грибов дерматофитов.

Таким образом, на сегодняшний день практически отсутствуют способы диагностики онихомикоза, позволяющие выявлять весь спектр патогенных грибов-возбудителей онихомикоза. Применяемые культуральные и гистологические методы недостаточно чувствительны, а кроме того, трудоемки и занимают продолжительное время.

Наиболее близкий аналогичный способ диагностики онихомикоза (прототип) заключается в выделении ДНК из биологического материала ногтей коммерческим набором QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany) с последующим проведением ПЦР в двух мультиплексных реакциях с коммерческой ПЦР тест-системой Mentype Mycoderm PCR Amplification Kit (Biotype Diagnostic) и детекцией полученных результатов с помощью агарозного гель-электрофореза [5]. Представляемый способ позволяет выявлять в ходе I ПЦР реакции следующие микромицеты: Aspergillus spp., Microsporum canis, Candida spp., Epidermophyton floccosum, Trichosporon cutaneum, Scopulariopsis brevicaulis, Microsporum gypseum; в ходе II ПЦР реакции - Trichophyton interdigitale, Trichophyton rubrum, Trichophyton spp.

К недостаткам данного способа диагностики онихомикоза можно отнести высокую стоимость, сложность закупки из Германии коммерческого набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany), длительную процедуру выделения грибковой ДНК (лизис в течение 12 часов), большое количество намножаемых в ходе I реакции близких по длине фрагментов (226, 383, 421, 497, 557, 649 и 761 п.н.), что затрудняет интерпретацию результатов методом агарозного гель-электрофореза, и перечень идентифицируемых микромицетов: перечисленные грибы - характерные этиологические агенты онихомикоза в Западной Европе, в России микромицеты Microsporum spp., Trichosporon cutaneum и Epidermophyton floccosum практически не встречаются как этиологические агенты данного заболевания, когда как для грибов рода Fusarium показано клиническое значение в патогенезе онихомикоза России, а они не диагностируются представленным способом.

Задачей изобретения является упрощение и сокращение времени диагностики онихомикоза, снижение стоимости, доступность для рутинной клинической практики в России.

Техническим результатом изобретения является возможность одновременной идентификации всех этиологических агентов, клинически значимых для онихомикоза России: Trichophyton spp., Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis и микромицетов любой родовой принадлежности.

Технический результат изобретения достигается тем, что при выделении ДНК лизис клеток осуществляют буфером следующего состава: 50 мМ ТрисНСl при рН 9.5, 250 мМ KCl, 60 мМ NaHCO₃ [3], при температуре 90-95°С в течение 5-10 мин, с последующей депротеинизацией смесью хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 24:1 и осаждением ДНК двойным объемом этилового спирта с 3М ацетатом натрия, при этом анализируют следующий спектр грибов, этиологических агентов онихомикоза: Trichophyton spp., Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis и микромицетов любой родовой принадлежности, используя мультиплексное решение для ПЦР с применением при этом следующих праймеров в двух реакциях.

Для определения грибов рода Candida:

C-spp-F: 5'-TGCCTTGATTGACGGTCATTGTGAAAT-3'

C-spp-R: 5'-TGCATGGTTTTGGTTATCAGATTTACCATCACC-3'

Для определения Scopulariopsis brevicaulis:

ScB-F: 5'-CGTCGGATCAACCGTCGCTT-3'

ScB-R: 5'-ACGCCAGCATCCTTGCATAC-3'

Для определения грибов рода Fusarium:

Fus-F: 5'-TGACCAGACTTGGGCTTGG -3'

Fus-R: 5'-GTCCGTGTTTCAAGACGGG-3'

Для определения грибов рода Aspergillus:

ASP-F: 5'-GCATTCGTGCCGGTGTACTT-3',

Для определения грибов рода Trichophyton:

Trich-R: 5'-TTGCTAAACGCTCAGACTGACAGC-3'

Trich-F: 5'-CGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCC-3',

универсальные пангрибковые праймеры:

FUP-F: 5'-AAGCATATCAATAAGCGGAGG-3'

FUP-R: 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'.

Для определения грибов родов Aspergillus и Fusarium используют общий обратный праймер. Параметры режима I ПЦР: денатурация при температуре 94-96°С в течение 5-10 мин, затем 35-40 циклов с денатурацией при температуре 94-96°С в течение 30-40 с, отжигом праймеров при температуре 53°С в течение 30-40 с и последующей элонгацией при температуре 70-72°С в течение 25-35 с; заключительный этап реакции - досинтез 8-15 мин при температуре 70-72°С. Параметры режима II ПЦР: денатурация при температуре 94-96°С в течение 5-10 мин, затем 35-40 циклов с денатурацией при температуре 94-96°С в течение 30-40 с, отжигом праймеров при температуре 61°С в течение 30-40 с и последующей элонгацией при температуре 70-72°С в течение 25-35 с. Заключительный этап реакции - досинтез 8-15 мин при температуре 70-72°С. В I реакции при детекции полосы, соответствующей 168 п. н., диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Scopulariopsis brevicaulis, соответствующей 120 п. н. - онихомикоз, вызванный микромицетом Candida spp., соответствующей 600-650 п. н. - вызванный любым микромицетом. Во II реакции при детекции полосы, соответствующей 302 п.н., диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Trichophyton spp., соответствующей 221 п.н. - онихомикоз, вызванный микромицетом Fusarium spp., а соответствующей 193 п.н. - онихомикоз, вызванный микромицетом Aspergillus spp.

Способ диагностики онихомикоза осуществляют в три лабораторных этапа:

1. выделение ДНК из биологического материала ногтей, при выделении ДНК - лизис клеток, депротеинизация, осаждение ДНК;

2. проведение ПЦР;

3. детекция полученных результатов с помощью электрофореза в агарозном геле.

1. Выделение ДНК из биологического материала ногтей

Необходимое оборудование и расходные материалы:

- Твердотельный термостат, поддерживающий температуру +98°С.

- Микроцентрифуга, развивающая ускорение 1200 об/мин, для пробирок вместимостью 1,5 мл.

- Микроцентрифуга-вортекс.

- Пипетки-дозаторы переменного объема.

- Одноразовые наконечники (объем 200 мкл и 1000 мкл).

- Одноразовые перчатки.

- 95% и 75% этанол.

- 3М sodium acetate рН 5.2.

- Смесь хлороформ-изоамиловый спирт (24:1).

В 1.5 мл пробирку с 100 мкл лизирующего буфера (50 мМ ТрисНСl рН 9.5, 250 мМ KCl, 60 мМ NaHCO₃) вносят ногтевые чешуйки и инкубируют при температуре 90-95°С 5-10 мин. К лизату добавляют равный объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), после чего всю смесь перемешивают и центрифугируют 10 мин при 9000g. Верхнюю фазу отбирают и добавляют 0.1 объема 3М ацетата натрия и 2 объема этилового спирта. После этого пробирку инкубируют в течение 2 часов при температуре -20°С. Далее центрифугируют 10 минут при 20000g на холоде, осадок ДНК отмывают от солей 0.5 мл 70% этилового спирта при комнатной температуре в течение 10 мин. Осажденную ДНК растворяют в 30 мкл ddH₂O.

2. Проведение ПЦР (этап амплификации)

- ПЦР-бокс с УФ-лампой.

- Программируемый термостат (амплификатор).

- Микроцентрифуга-вортекс.

- Морозильная камера для хранения исходных реагентов.

- Пипетки-дозаторы переменного объема.

- Штативы для пробирок 0,5 мл (или 0,2 мл) «рабочее место».

- Штативы для наконечников.

- Емкость для сброса использованных наконечников.

- Одноразовые наконечники с фильтром (аэрозольным барьером) (объем 200 мкл).

- Одноразовые перчатки.

Способ осуществляют с использованием программируемого термоциклера «терцик» (фирма «ДНК-Технология», Россия) в ходе двух мультиплексных реакций.

Для I реакции оптимальный режим амплификации: х1: 94-96° - 5-10 мин; х 35-40: 94-96°С - 30 -40 с, 53°С - 30 с, 70-72°С - 25-35 с; х1: 70-72°С-8-15 мин.

Состав ПЦР-смеси: в объеме 25 мкл содержится 1,5 мМ MgCl2, 60 mM Tris-HCl (рН 8,8), 20 mM KCl, 0,1% тритона Х-100, 0,2 mM dNTP, 1 U Taq ДНК-полимеразы (Синтол, Москва), 20 нг ДНК, выделенной из биологического материала ногтей, три прямых и три обратных праймера следующего состава и концентраций:

FUP-F: 5'-AAGCATATCAATAAGCGGAGG -3'

FUP-R: 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3', по 1.6 мкМ

C-spp-F: 5'-TGCCTTGATTGACGGTCATTGTGAAAT-3'

C-spp-R: 5'-TGCATGGTTTTGGTTATCAGATTTACCATCACC-3', по 0.8 мкМ

ScB-F: 5'-CGTCGGATCAACCGTCGCTT-3'

ScB-R: 5'-ACGCCAGCATCCTTGCATAC-3', no 0.8 мкМ.

Для II реакции оптимальный режим амплификации: х1: 94-96°С - 5 -10 мин; х 35-40: 94-96°С - 30-40 с, 61°С - 30-40 с, 70-72°С - 25-35 с с; х1: 70-72°С - 8-15 мин.

Состав ПЦР-смеси: в объеме 25 мкл содержится 1,5 мМ MgCl2, 60 mM Tris-HCl (рН 8,8), 20 mM KCl, 0,1% тритона Х-100, 0,2 mM dNTP, 1 U Taq ДНК-полимеразы (Синтол, Москва), 20 нг ДНК, выделенной из биологического материала ногтей, три прямых и два обратных праймера в концентрации 0,4 мкМ следующего состава:

ASP-F: 5'-GCATTCGTGCCGGTGTACTT-3'

Fus-F: 5'-TGACCAGACTTGGGCTTGG -3'

Fus-R: 5'-GTCCGTGTTTCAAGACGGG-3'

Trich-R: 5'-TTGCTAAACGCTCAGACTGACAGC-3'

Trich-F: 5'-CGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCC-3'

3. Детекция продуктов амплификации

- Камера для горизонтального электрофореза.

- Источник постоянного тока с напряжением не менее 150 В.

- УФ-трансиллюминатор.

- СВЧ-печь для плавления агарозы.

- Технические весы для взвешивания агарозы.

- Аквадистиллятор.

- Видеосистема для документирования гель-электрофореграмм.

- Пипетки-дозаторы переменного объема (5-50 мкл, 100-1000 мкл).

- Штатив для пробирок 0,5 мл (или 0,2 мл) «рабочее место».

- Пластиковая емкость большого объема для дезактивации буфера и гелей.

- Одноразовые перчатки.

- Агароза, раствор бромистого этидия, 50×ТАЕ буфер для приготовления геля и проведения электрофореза.

Детекцию полученных продуктов амплификации осуществляют следующим методом гель-электрофореза в 2% агарозном геле, приготовленном на 1-кратном ТАЕ-буфере следующего состава: 0,04 М трис-ацетат, 0,02 М ЭДТА (рН 8,0), 0,5 мкг/мл бромистого этидия.

Используют буфер для нанесения - водный раствор, содержащий 0,25% бромфенолового синего и 40% (объем) глицерина, разведенный при нанесении с ПЦР-продуктом в 6 раз. Горизонтальный форез проводят при напряжении электрического тока 10 В/см в течение 60 мин в камере «Mini-Sub Cell GT» (Bio-Rad, США) с применением источника постоянного тока «Эльф-4» (ДНК-технология, Россия). Фоторегистрацию результата электрофореза проводят на УФ-трансиллюминаторе «ТСР-20.МС» (312/254 нм) (Vilber Lourmat, Франция), с помощью фотодокументирующей системы «Gel lmager-2» (Helicon, Россия).

При интерпретации результатов необходимо руководствоваться следующим.

В I реакции при детекции полосы, соответствующей 168 п.н., диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Scopulariopsis brevicaulis. При детекции полосы, соответствующей 120 п.н. - онихомикоз, вызванный микромицетом Candida spp., соответствующей 600-650 п.н. - вызванный любым микромицетом.

Во II реакции при детекции полосы, соответствующей 302 п. н., диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Trichophyton spp. При детекции полосы, соответствующей 221 п.н. - диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Fusarium spp., а соответствующей 193 п.н. - диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Aspergillus spp.

Отличительные существенные признаки и причинно-следственная связь между ними и полученным результатом.

- Комбинация подходов при выделении ДНК (лизис клеток по Brillowska-Dabrowska A. et al., 2007, депротинизация по СТАВ-методу, используемому для растительных клеток, и осаждение ДНК по методу фенол-хролоформной экстракции) - использование такой комбинации методов позволяет эффективно выделять ДНК и существенно сократить временные затраты (лизис клеток в заявляемом нами способе диагностики занимает 5 мин, в отличие от 12 часов способа прототипа).

- Спектр идентифицируемых микромицетов: Trichophyton spp., Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis, наличие грибковой инфекции в общем (применение универсальных пангрибковых праймеров) - спектр микромицетов, определяемый предлагаемым способом диагностики, является оптимальным, что упрощает и ускоряет проведение исследования, при этом он включает все этиологические агенты, клинически значимые для онихомикоза России: Trichophyton spp., Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis и микромицеты любой родовой принадлежности. В случае, если заболевание будет вызвано редким видом микромицета, не включенным в диагностируемый профиль, то грибковая инфекция будет подтверждена с помощью универсальных пангрибковых праймеров.

- Мультиплексное решение для ПЦР с использованием при этом следующих праймеров в двух реакциях.

Для определения грибов рода Candida:

C-spp-F: 5'-TGCCTTGATTGACGGTCATTGTGAAAT-3'

C-spp-R: 5'-TGCATGGTTTTGGTTATCAGATTTACCATCACC-3'

Для определения Scopulariopsis brevicaulis:

ScB-F: 5'-CGTCGGATCAACCGTCGCTT-3'

ScB-R: 5'-ACGCCAGCATCCTTGCATAC-3'

Для определения грибов рода Aspergillus:

ASP-F: 5'-GCATTCGTGCCGGTGTACTT-3'

Для определения грибов рода Fusarium:

Fus-F: 5'-TGACCAGACTTGGGCTTGG -3'

Fus-R: 5-GTCCGTGTTTCAAGACGGG-3'

Для определения грибов рода Trichophyton:

Trich-R: 5'-TTGCTAAACGCTCAGACTGACAGC-3'

Trich-F: 5'-CGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCC-3',

универсальные пангрибковые праймеры:

FUP-F: 5'-AAGCATATCAATAAGCGGAGG-3'

FUP-R: 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'

Предлагаемые праймеры никогда не использовались вместе в мультиплексных реакциях. Основной задачей при подборе комплекса праймеров было нахождение возможности одновременной идентификации всех этиологических агентов онихомикоза, значимых для России путем проведения нескольких независимых ПЦР в одной пробирке. Решение данной задачи позволяет уменьшить в лаборатории затраты труда и времени на проведение анализа и повысить экономическую эффективность метода.

- Для определения грибов родов Aspergillus и Fusarium используют общий обратный праймер - использование единого общего праймера, с одной стороны, так как праймеры работают в едином консервативном участке 18S-5.8S-28S рДНК, позволяет избежать взаимокомплементарности и повысить эффективность работы мультиплексной системы, с другой - снизить стоимость предлагаемого способа диагностики, сокращается количество синтезируемых олигонуклеотидных затравок.

- Параметры режима I ПЦР: денатурация при температуре 94-96°С в течение 5-10 мин, затем 35-40 циклов с денатурацией при температуре 94-96°С в течение 30-40 с, отжигом праймеров при температуре 53°С в течение 30-40 с и последующей элонгацией при температуре 70-72°С в течение 25-35 с; заключительный этап реакции - досинтез 8-15 минут при температуре 70-72°С, чтобы обеспечить амплификацию фрагмента соответствующего грибам Candida spp. размером 120 п.н., фрагмента соответствующего Scopulariopsis brevicaulis размером 168 п. н. и универсального фрагмента для всех микромицетов размером 600-650 п. н.

- Параметры режима II ПЦР: денатурация при температуре 94-96°С в течение 5-10 мин, затем 35-40 циклов с денатурацией при температуре 94-96°С в течение 30-40 с, отжигом праймеров при температуре 61°С в течение 30-40 с и последующей элонгацией при температуре 70-72°С в течение 25 -35 с; заключительный этап реакции - досинтез 8-15 минут при температуре 70-72°С мин, чтобы обеспечить амплификацию фрагмента соответствующего грибам Trichophyton spp. размером 302 п. н., фрагмента соответствующего Aspergillus spp. размером 193 п. н. и фрагмента соответствующего Fusarium spp. размером 221 п.н.

Представляемые температурные и временные режимы являются оптимальными (соотношение специфичности и чувствительности проводимой реакции) для проведения сразу трех независимых ПЦР в одной пробирке, что приносит экономические и временные выгоды, снижает трудозатраты.

Намножаемые фрагменты ДНК хорошо разделяются и визуализируются в 2% агарозном геле, что позволяет давать точные результаты и возможность использования данного способа диагностики онихомикоза в рутинной клинической практике.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Оценка аналитической эффективности способа диагоностики онихомикоза

Аналитическая эффективность была оценена на культурах микромицетов из Российской коллекции патогенных грибов (НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина), было протестировано 46 штаммов клинических изолятов микромицетов следующих видов: Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus versicolor, Fusarium spp., Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Trichophyton interdigitale, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida albicans.

В двух параллельных мультиплексных реакциях ПЦР мы могли обнаружить или все патогенные микромицеты вместе с грибами рода Candida и Scopulariopsis brevicaulis, или мицелиальные грибы трех родов одновременно. Мы наблюдали специфическую воспроизводимую амплификацию соответствующих фрагментов ДНК для каждой пары праймеров отдельно, а также в условиях мультиплексной реакции ПЦР. Идентификацию до вида анализируемых штаммов клинических изолятов грибов проводили путем прямой микроскопии и культивирования, с последующим подтверждением родовой принадлежности секвенированием D1/D2 и ITS рибосомных фрагментов ДНК микромицетов.

Пример 2. Пациентка Р1 (КН) №3047-48, 65 лет.

11.04.2014 пациентка обратилась за амбулаторной помощью в консультативно-диагностическое отделение НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СЗГМУ им. И.И. Мечникова с поражением (подозрение на грибковую инфекцию) ногтевых пластин кистей рук. Был взят клинический материал пораженного ногтя. Апробирован заявляемый способ диагностики онихомикоза. При микроскопии детектирован дрожжевой мицелий, при посеве получен рост Candida spp. Получен положительный результат на микромицеты в целом и Candida spp.

Пример 3. Пациент Р2 (Ж) №119, 38 лет.

10.11.2013 пациент обратился за амбулаторной помощью в консультативно-диагностическое отделение НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СЗГМУ им. И.И. Мечникова с белым поверхностным поражением (подозрение на грибковую инфекцию) ногтевых пластин стоп. Был взят клинический материал пораженного ногтя. Апробирован заявляемый способ диагностики онихомикоза. При микроскопии детектировано обилие мицелия, при посеве получен рост Scopulariopsis brevicaulis. Видовая идентификация подтверждена секвенированием ITS рибосомных фрагментов ДНК. Получен положительный результат на микромицеты в целом и Scopulariopsis brevicaulis.

Пример 4. Пациент РЗ (СЦЦ) №134, 52 года.

25.11.2013 пациент обратился за амбулаторной помощью в консультативно-диагностическое отделение НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СЗГМУ им. И.И. Мечникова с белым поверхностным поражением (подозрение на грибковую инфекцию) ногтевых пластин кистей рук. Был взят клинический материал пораженного ногтя. Апробирован заявляемый способ диагностики онихомикоза. При микроскопии детектирован септированный мицелий, роста грибов при посеве не наблюдали. Получен положительный результат на микромицеты в целом и Trichophyton spp.

На данный момент протестирован 221 образец биологического материала ногтей от пациентов с диагнозом «онихомикоз кистей и стоп» и диагнозом «ониходистрофия». В исследовании использовался материал от больных, обратившихся в микологическую клинику НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина в период с мая 2012 года по настоящее время.

По предварительной оценке клиническая чувствительность ПЦР-теста по отношению к КОН-микроскопии с посевом составила 80%, а специфичность - 83%. Во всех образцах с ониходистрофией ПЦР-тест дал отрицательный результат.

Приложение 1 иллюстрирует электрофореграмму разделения продуктов амплификации в 2% агарозном геле по заявляемому способу у пациентов с онихомикозами и в контрольной группе. Обозначения: М - маркер молекулярного веса (100-1000 п. н. с интервалом 100 п.н.).

К+ - положительный контроль - смесь ДНК культур Trichophyton spp., Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis.

N - пациент контрольной группы (ДНК из нормального биологического материала ногтей).

Р - пациент с онихомикозом (ДНК из биологического материала пораженных ногтей).

Представленная электрофореграмма демонстрирует возможность одновременной идентификации всех этиологических агентов, клинически значимых для онихомикоза России: Trichophyton spp., Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis и микромицетов любой родовой принадлежности.

Лизис клеток в заявляемом способе диагностики онихомикоза занимает 5 мин, в отличие от 12 часов способа прототипа.

Заявляемый способ значительно дешевле способа прототипа, так, по сравнению со способом прототипом, исследование 100 образцов биологического материала по заявляемому способу дешевле импортного аналога, в настоящий момент, на 50 тысяч рублей.

Таким образом, в результате апробации предложенного способа диагностики онихомикоза получен обеспечиваемый заявленным образом технический результат, а именно, показана возможность одновременной идентификации всех этиологических агентов, клинически значимых для онихомикоза России: Trichophyton spp., Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis и микромицетов любой родовой принадлежности.

Убедительно продемонстрировано, что для проведения диагностики онихомикоза в рутинной клинической практике в России наиболее доступным, дешевым, быстрым и простым в исполнении является предложенный способ диагностики онихомикоза.

Список литературы:

1. Graser Y., Czaika V., Ohst Т. Diagnostic PCR of dermatophytes - an overview. JDDG 2012. 10: 721-725.

2. ESCMID, Clinical Microbiology and Infection. 2014, 20 supple 3.

3. Brillowska-Dabrowska A., Saunte D.M., Arendrup M.C. Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of Trichophyton rubrum. J of Clinical Microbiology. 2007. 45(4): 1200-1204.

4. Kondori N., Abrahamsson A. - L., Ataollahy N., Wenneras C. Comparison of a new commercial test, Dermatophyte-PCR kit, with conventional methods for rapid detection and identification of Trichophyton rubrum in nail specimens. Medical Mycology. 2010. 48: 1005-1008.

5. Mehlig L, Garve C, Ritschel A., Zeiler A., Brabetz W., Weber C, Bauer A. Clinical evaluation of a novel commercial multiplex-based PCR diagnostic test for differential diagnosis of dermatomycoses. Mycoses. 2014. 57: 27-34.

Claims

Способ диагностики онихомикоза, заключающийся в выделении ДНК из биологического материала ногтей с последующим проведением ПЦР и детекцией полученных результатов с помощью электрофореза в агарозном геле, отличающийся тем, что при выделении ДНК лизис клеток осуществляют буфером следующего состава: 50 мМ ТрисHСl при рН 9.5, 250 мМ KCl, 60 мМ NaHCO₃, при температуре 90-95°С в течение 5-10 минут, с последующей депротеинизацией смесью хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 24:1 и осаждением ДНК двойным объемом этилового спирта с 3М ацетатом натрия, при этом анализируют следующий спектр грибов, этиологических агентов онихомикоза: Trichophyton spp., Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis и микромицетов любой родовой принадлежности, используя мультиплексное решение для ПЦР с применением при этом следующих праймеров в двух реакциях:
для определения грибов рода Candida:
C-spp-F: 5′-TGCCTTGATTGACGGTCATTGTGAAAT-3′
C-spp-R: 5′-TGCATGGTTTTGGTTATCAGATTTACCATCACC-3′,
для определения грибов рода Scopulariopsis brevicaulis:
ScB-F: 5′-CGTCGGATCAACCGTCGCTT-3′
ScB-R: 5′-ACGCCAGCATCCTTGCATAC-3′,
для определения грибов рода Fusarium:
Fus-F: 5′-TGACCAGACTTGGGCTTGG-3′
Fus-R: 5′-GTCCGTGTTTCAAGACGGG-3′,
для определения грибов рода Aspergillus:
ASP-F: 5′-GCATTCGTGCCGGTGTACTT-3′,
для определения грибов рода Trichophyton:
Trich-R: 5′-TTGCTAAACGCTCAGACTGACAGC-3′
Trich-F: 5′-CGGAAGGATCATTAACGCGCAGGCC-3′,
универсальные пангрибковые праймеры:
FUP-F: 5′-AAGCATATCAATAAGCGGAGG-3′
FUP-R: 5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′,
причем для определения грибов родов Aspergillus и Fusarium используют общий обратный праймер; параметры режима I ПЦР: денатурация при температуре 94-96°С в течение 5-10 мин, затем 35-40 циклов с денатурацией при температуре 94-96°С в течение 30-40 с, отжигом праймеров при температуре 53°С в течение 30-40 с и последующей элонгацией при температуре 70-72°С в течение 25-35 с; заключительный этап реакции - досинтез 8-15 мин при температуре 70-72°С; параметры режима II ПЦР: денатурация при температуре 94-96°С в течение 5-10 мин, затем 35-40 циклов с денатурацией при температуре 94-96°С в течение 30-40 с, отжигом праймеров при температуре 61°С в течение 30-40 с и последующей элонгацией при температуре 70-72°С в течение 25-35 с; заключительный этап реакции - досинтез 8-15 мин при температуре 70-72°С; в I реакции при детекции полосы, соответствующей 168 п.н., диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Scopulariopsis brevicaulis, соответствующей 120 п.н. - онихомикоз, вызванный микромицетом Candida spp., соответствующей 600-650 п.н. - вызванный любым микромицетом; во II реакции при детекции полосы, соответствующей 302 п.н., диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Trichophyton spp., соответствующей 221 п.н. - диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Fusarium spp., а соответствующей 193 п.н. - диагностируют онихомикоз, вызванный микромицетом Aspergillus spp.