JPH06504427A

JPH06504427A - 多重核酸配列の存在または不存在の検出による識別および父性決定

Info

Publication number: JPH06504427A
Application number: JP3518077A
Authority: JP
Inventors: ラヴ，ジャック
Original assignee: ジェン・トラック・インコーポレーテッド
Priority date: 1990-10-17
Filing date: 1991-10-17
Publication date: 1994-05-26
Also published as: WO1992007093A1; EP0553258A1; AU8868091A; US5645990A; EP0553258A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】多重核酸配列の存在または不存在の検出による識別および父性決定技術分野本発明は、ＤＮＡフィンガープリント法に関する。

発明の背景本発明は、ヒト、他の動物または植物個体を同定し且つ区別するのに用いることができる模範的なハイブリダイゼーション結果を生じる方法に関する。伝統的には、核酸バンドパターンの独特性がヒトの指紋と概念的に似ているので、この種類の識別を「核酸（Ｄ　Ｎ　Ａ　）フィンガープリント法」またはｒＤＮＡプロフィリング（Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）　Ｊと称する。ＤＮＡフィンガープリント法の現行の方法は、サザンブロッティングを用いる必要がある。本発明による方法は、実施するのに簡単であり、説明を必要としないし、そして計算機蓄積および検索用の簡単なバーコードに変換される結果を提供する。

サザンプロット核酸ハイブリダイゼーションは２５年以上の間一般的な方法論として用いられてきた。ＤＮＡフィンガープリント法の現行の方法は、サザンブロッテイング１として知られる最新の分子生物学ハイブリダイゼーション技術を用いている。サザンプロットは、１９７５年のその発明以来、分子生物学者にとって主要な支えであった。サザンプロット法においては、最初にＤＮＡ分子を各種抽出方法の一つによって他の細胞性成分から単離する必要がある。抽出後、ある程度純粋なりＮＡを１種類またはそれ以上の制限酵素によって切断して特定のＤＮＡ断片セットを生成する。ＤＮＡの切断に続いて、断片のＤＮＡをアガロースゲル中の電気泳動によって分離する。この標準技法はＤＮＡ断片をそれらの寸法（分子量）に基づいて分析し、そして他のサイジング法よりも識別能力が大きい。大型の分子は電界力の下では小型の分子はど容易にマトリックスを通過することができない。

したがって、大型の分子はより遅く移動する。ゲルはＤＮＡ断片を独特の寸法の区域またはバンドに分離する。

しかしながら、アガロースゲルは次のハイブリダイゼーション反応に対して安定な支持を与えない。その結果、ＤＮＡはゲルから、通常はナイロンまたはニトロセルロースから成る固体支持体膜へと移される。ＤＮＡは毛管作用かまたは真空力によって膜上に移され、そこにおいてその表面に結合する。ＤＮＡを乾燥または紫外線架橋によって膜に永久的に固定させる。

膜を特別な溶液中でプレハイブリッド形成させて任意の非特異的結合部位をブロックする。次に、標識した変性プローブを含む溶液中に膜を入れ且つインキュベートして相補的な標的分子に対してハイブリッド形成させる。多数の因子がハイブリダイセ一シヨン反応の速度、程度および特異性に影響を与える。

ハイブリダイモーションは一本鎖核酸の相補的塩基対合の結果である。この結合は極めて特異的な二本鎖核酸の生成を引き起こす。典型的には、一本鎖の一つを、それを後で測定するかさもなければ新規のＩシブリッドの一部分として検出することができるように標識する。概して、ハイブリッド分子は残りの一本鎖材料から分離されるので、ハイブリッド形成した標識は非ノ＼イブリッド形成標識の不存在下で検出することができる。反応後、過剰のプローブを洗剤および稀塩溶液中の一連の洗浄工程によって洗い落とす。

プローブを３２ｐで放射性標識した場合、オートラジオグラフ法を用いて、プローブが結合している任意のＤＮＡバンドの位置をつきとめることができる。膜を単純に１枚のＸ線フィルムの隣に数分間〜数時装置いた後、フィルムを現像する。

放射性粒子がフィルムに当たったところはいずれも暗色領域が形成され、そして標的ＤＮＡを確認することができる。プローブは非同位体によって標識することもでき、そして適当な検出方法、例えば、蛍光分光光度法、比色分析および化学発光検出を用いて位置決定することができる。　サザンブロツテイングによって、標識プローブを結合した正確な断片の寸法が正確にみきわめられる。サザン法により高分解能ハイブリダイセーソヨン分析が行われて、そして慣用的なフィンガープリント法技術の基礎が形成された。

慣用的ＤＮＡフィンガープリント法フィンガープリントを示すのに用いられた慣用的な方法は、サザンプロット技法によって制限酵素断片長条型（ＲＦＬＰ）　２．３または対立遺伝子変異２−４を示すプローブを用いている。これらの慣用的な多重性プローブは、制限酵素２３で切断された後に邑圭が変化する標的ＤＮＡ断片を有する。これらの多重性プローブは制限断片かまたはミニサテライトである。本発明は、以下、多重存在多重（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｐｒｅｓｅｎｃｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　（ＭＰ　Ｐ）と称する、集団においてその産金が変化する核酸配列において支配されたプローブを用いる。

１９８５年にシェフリーズ（Ｊｅｆｆｒｉｅｓ）　”は、ミニサテライトとしても知られているＤＮＡの単純な縦列反復領域がヒト個体間で極めて大きい断片長条型性を示すことを報告した。シェフリーズは、い（つかの制限酵素セットとの組合わせでこのプローブを用いて、試験された各個体に独特の安定なりＮＡバンドパターンを生じることができるということを提案した。更に、彼は、その独特のパターンをヒトの身元確認および父性決定の問題に適用することができるということを提案した。

サザンブロッティングを用いるＤＮＡフィンガープリント法の現行の方法は、それに関係した下記の問題を有する。

１、時間の浪費−完了するのに１週間またはそれ以上を要する。

２、実施の難しさ一１００種類を越える工程。

３、高度に熟練し且つ精通した技術者を必要とする。

４、非標準化−試験毎および実験室毎に変化しやすい結果。

５、不正確な測定値−結果は、特定の電気泳動条件、緩衝液および環境の温度および用いられたアガロースゲルの種類によって変化するＤＮＡ断片長さの測定値を必要とする。長さの測定は、更に、ＤＮＡバンドの位置の極めて主観的な測定である。

したがって、実施するのに容易であり、比較的速（、有意の専門技術を必要としない、そして主観的な説明を必要としない診断または検出技術に対する一定の要求が存在している。本発明は、日常的な実験室用技術のみを必要とする比較的少ない工程から成ることによって、市場において現在入手可能な機器の修正によって容易１こ自動化しうることによって、そして約１日の内に結果を提供することによってこれらの要求を解決する。更に、結果を標準的な実験室リーダー、例えば、エライザプレートリーダー、分光光度計、蛍光光度計または類似の計測器で測定する。その結果は使用者の説明を全（必要とせず；出力測定値は数字の１（陽性）または０（陰性）に変換される。

発明の概要複数の新規の多重存在多重（ＭＰＰ）プローブを、一連の順序の核酸ハイブリダイゼーション試験において用いる。組合わされた陽性および陰性の結果は一つのパターンを示す。このパターンは個々に特異的であり、したがって、身元確認パターン（Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ＰａｔｔｅｒｎＸＰＩＰ）である。ＭＰＰプローブとして用いられる特定の核酸は、実験下での集団において存在（または不存在）が制限されている遺伝的多重に対して向けられている。

図面の説明図１は、試験中の個々の配列反復の確率である。

図２は、全パターン反復頻度に対する個々の存在多重性の効果である。

図３は、慣用的な微量滴定プレート形状である。

喝発明の詳細な説明多重存在多重によるＤＮＡプロフィリング本発明により、時間の浪費であるし、しかも標準化し且つ制御するのが難しいサザンプロットの使用が避けられる。その方法は、ＤＮＡフィンガープリント法の現行の方法を、実施するのに簡単で且つ速く、説明を必要としないし、そして電子計算機で処理するのに容易な結果を生じる方法で置き換えることができる。

ンによって試験する。ＭＰＰの分析により、生物集団における存在の回数、同一性または父性が１００％未満である核酸配列を決定することができる。

試験システムは現行のサザンプロット法に関係したパターン独自性にまさるものであり、そして父性確定すなわち法医学的に標準化される。更に、ＰＩＦシステムは、一つにはそれが簡単な陽性または陰性結果から成るという理由で、複雑な非標準化サザンブロツティングよりはるかに優れている。更に、バックグラウンドは十分な量の検体に関して有意ではない。

本発明は、多数の核酸ハイブリダイゼーション試験により、ゲル電気泳動およびサザンプロットを用いることなく個体を識別する方法を含む。

その方法は、ａ、個体内の複数のヌクレオチド配列（全遺伝子、遺伝子断片、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド）の存在を、それぞれが独特のヌクレオチド配列に対して向けられている個々の試験のＭＰＰＳに対する複数のプローブを用いて決定し、そしてす１個体から破壊されまたは抽出された検体に対してプローブをｌ＼イブリッド形成（結合）させた後、ハイブリッド形成したプローブおよび標的を非結合プローブから分離する（または非Ｉシブリッド形成標識を別の方法で除去する）ことを含み、そしてＣ３任意の適当な測定システムによってハイブリッドを検出し、そこにおいて、ｄ、陽性シグナルは個体における特定の核酸配列の存在を示し；そして完全で且つ順序付けられた一連のものとして得られた陽性および陰性ハイブリダイセーション結果は、身元確認パターン（Ｐ　Ｉ　Ｆ）と称するその個人に独特のパターン（「指紋」）を提供すること、を含む。

微量滴定プレートなどの特定の形状において各遺伝子の存在を試験した後、その結果は陽性または陰性結果のあるパターンを示す。これらの結果は、１（陽性）またはＯ（陰性）として電子計算機で処理し且つ単純なバーコードに変換することができる。このようにして、分析し且つ比較するのに容易なパターンが得られる。

好ましい核酸配列は、一般的な集団（集団はヒト、ウマ、ネズミ、植物または任意の他の生物でありうる）での存在または不存在に関して多重性を示すものであり、そこにおいて、集団における各「存在」多重性の出現頻度はパターン認識の全頻度に影響を与え、最適の陽性配列頻度は５０％である。下記並びに図１および図２のＭＰＰプローブの説明においてこれを更に説明する。

典型的な血液検体からの検出感度は、標的またはシグナル増幅を用いることなく検出するのに十分である。これは、日常的な父性確定試験にまたは個人の身元確認パターン（Ｐ　Ｉ　Ｆ）を達成するのに理想的である。しかしながら、限られた検体を用いる法的用途に対しては、プローブの周囲の領域を様々な標的増幅方法の一つによって増幅してよい。或いは、シグナルを増幅して、測定可能な水準まで検出を増大させることができる。

多重存在多重性プローブプローブとして用いられる特定の核酸断片は、実験下での個体集団において「存在」　（または不存在）が制限されている遺伝的多重に対して向けられている。

これらを「存在」多重と称し、そしてＰ［’を開発するのにこれらの内のいくつかを用いることを多重存在多重（ＭＰＰ）と称する。これらの核酸プローブは任意の長さ、例えば、全遺伝子、遺伝子断片または短合成りＮＡであってよい。

本発明の好ましい実施態様において、これらの核酸プローブは、約１０〜約３０ヌクレオチド長さの合成りＮＡオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドから成る。当業者は、他の寸法および／または種類のプローブを用いてもよいということを理解するであろう。

候補遺伝子の好ましい種類はＲＦＬＰ由来である。定義により、ＲＦＬＰは、多重性である制限部位を含む。多重性酵素部位の周囲の領域を単離し且つ配列決定することによって、少なくとも１個の塩基対が変化しているプローブが速やかに得られる。８５０種類を越えるこれらのＲＦＬＰは既に確認されており、これらの大部分で集団における変異の頻度を示す予備データが得られた−これらの内の可否種類もが、ＭＰＰに有用であるＲＦＬＰ度数を示す。これらのＲＦＬＰの内、サザンプロットで単一バンドを示すものは、１００％相同と９５％またはそれ未満の相同とを区別するハイブリダイゼーション条件を決定することが一層容易であるので好ましいＭＰＰプローブである。

ＭＰＰプローブを単離することができるもう一つの群の遺伝子は、褐色眼の遺伝子のように優性および劣性の特徴ゆえにヒト集団において高度の変異を示す遺伝子である。青色眼の被験者は褐色眼の遺伝子を完全に欠失している。褐色眼のような概して優性の遺伝子はＭＰＰプローブに良好な候補である。その理由は、特定の表現型の特徴を欠いている被験者においては、通常、これらの遺伝子が完全に不存在であるということである。この種類の多数の優性遺伝子がヒト集団において確認された。同様に、Ｘ染色体上の多数の遺伝子はある人々においてのみそれらの表現型を示し；したがって、これらの遺伝子は、その特徴を欠いている全男性および若干の女性において不存在である。

腫瘍遺伝子ｒａｓ’、’に関して検出されたような後天性疾患突然変異を検出するプローブを避けることは重要である。これらの突然変異が、個人のＰ［’変化を引き起こすと考えられる疾患の進行中に生じる場合にこれらのプローブは変化を検出することがある。一方、出生時に存在している突然変異に基づいている遺伝疾患を検出する遺伝子は可能なＭＰＰプローブである。しかしながら、特定の遺伝疾患の「存在」頻度は、ＭＰＰとして有用であるには低すぎることがある。

集団における個々の配列反復の確率の決定特定のＭＰＰプローブに関係した「存在」多型性の頻度は、核酸ハイブリダイゼーションによって評価される生物集団に関して決定することができる。用いられるハイブリダイゼーション形式は集団における出現頻度に対して重要ではない。

液体、ドツト、スロット、フィルター、捕捉またはサンドイッチ検定などのいずれかのハイブリダイゼーション技術を用いて正確な結果を提供することができる。

その方法は、サザンまたはノザンプロットを用いて行うことができるが、これらは好ましくない。本発明により、ミクロ規模での方法を、完全な細胞の現場でのハイブリダイゼーション試験として行う。　「存在」多型性を検出するプローブはＭＰＰ分析に対して重要である。多数の核酸配列はこれらの部位を検出する可能性を有する。ＭＰＰプローブのハイブリダイセーショと結果は、集団の１００％未満の個体において陽性である。本発明の好ましい実施態様において、ＭＰＰプローブの「存在」頻度は集団の２０％〜８０％であり、最適プローブは５０％の個体において存在する。これを下記並びに図１および図２で説明する。

個々のＭＰＰプローブの「存在」頻度は、統計的に有意の数の異なる個体（例えば、５００〜１，０００）においてそれを試験することによって経験的に決定される。ＭＰＰプローブが試験された１、０００個の無作為の個体から７００回現れたと仮定されたい。経験的存在頻度（ｆ）は０．　７　（７０％）である。この値を用いて、ＰＩＰの比較において任意の２種類の個体間に対合が生じるであろう確率を決定する。確率は式１にしたがって計算される。

式１・ＰＩＦ試験中に繰り返される各プローブ結果の確率（Ｘｎ）を決定する。試験中に繰り返される特定の配列の確率は式１によって定義され、式中、ｆは一般的な集団における特定の配列の経験的に決定された頻度である。

（ｆ）（ｆ）＋（１−ｆ）（１−ｆ）＝Ｘ。

式中、Ｘｎは、この特定の配列に関する一般的な集団での個々の配列反復の確率Ｘ１＝　（０，７）（０，７）＋　（０，３）（０，３）＝０．５８図１は、０〜１の経験的存在頻度の範囲を越えるこれらの確率の計算の結果を示す。明らかであるように、（ｆ）が０または１である場合、反復の確率は１００％である。

理解しつるように、曲線は対称であり、頻度０．５で最小値を有する。したがって、配列が一般的な集団において度数５０％で現れる場合、個々の配列反復の確率は最小値である。

次に、個々の配列反復の確率を用いて、集団におけるパターン反復の全確率を決定する。この確率は式２にしたがって計算される。

集団におけるパターン反復の確率の決定全部のＰＩＦがＭＰＰ分析において統計的に独特であるのが最も好ましい。さもなければ、それらは適当な「フィンガープリント」ではないと考えられる。集団におけるパターン反復の確率は、（１）試験されたプローブの数と、（２）用いられた各ＭＰＰプローブの個々の配列反復の確率との組合わせの関数である。

パターン反復の確率は、十分な数のプローブを用いることによって地球の全集団（約５０億人）よりはるかに少なく計算されることがある。したがって、パターン反復の確率は、関数的に独特であるためにＩＱＩＯ中１未満である必要がある。

本発明により、いずれのプローブ数を用いてもよい。実用的には、十分な数のプローブを用いて、統計的に有意の水準の独自性を達成する。本明細書中で用いられる統計的に有意の数とは、使用者の目的に応じていずれの数でもありうるが、約２０個を上回るプローブであるのが好ましい。用いられるプローブの上限を規定する必要はないが、ＭＰＰ分析の好ましい実施態様が９６ウ工ル微量滴定プレートであるので、９０個のプローブが現行の商業的限界である。したがって、対照用に６ウエルを与え、好ましくは、試験はＭＰＰ分析用に最大９０ウエルまで用いる。好ましい実施態様は２０〜９０個のプローブを含む。９０個のプローブを用いるＭＰＰ分析に関して、図２に示したように、パターン反復の確率は１０２Ｔ中１未満でありうる。これは既知の用途のいずれにもまさる。

図２は、式２を用いるパターン反復の確率の計算の結果を示す。理解しつるように、この曲線も「存在」頻度５０％（０，５）のところにその限界を有する。

この存在頻度では、存在頻度５０％での９０個のプローブを用いるパターン反復の確率はＩＱ−２７未満である。

式２：集団において繰り返される特定のプローブ試験セットの確率を決定する。一般的な集団において繰り返される一定順序のセットの結果（パターン）の確率は、全部の個々の配列反復確率の倍数である。これは式２によって公式化され、式中、Ｘｌ、Ｘ２、Ｘ、〜Ｘｎまでは式１から計算された個々の配列反復確率である。

（ＸＩ）　（Ｘ２）　（Ｘｓ）　・”　（Ｘｎ）　＝＝ｐ式中、Ｐは一般的な集団におけるパターン反復の確率である。

実施例：Ｘが全部０．　５であり且つ９０個の配列が分析される場合。Ｘ全部が０、　５である場合、パターン反復の確率はその最小値である。

（０，５＋）　（０−５２）　（０，５３）　・・・　（０，５”）−（０，５）”＝８ｘｌＯ−” 本発明において言及するキットは、同一性および父性双方を決定するのに用いることができる。キットは、試薬、フィルター、プレートおよび分析を行うのに必要なプローブ全部を含むことができる。全部のプローブを同時に用いるが：微量滴定プレートでのような別個な試験においては、身元確認パターン（ＰＩＦ）　。

と称する陽性および陰性結果の独特のパターンを生じる。　当業者は、本発明がキットを含むことができるということを理解する。キットは「存在」多型性の検出用であり、そして本発明にしたがって処理するための多重存在多型性プローブ、フィルターまたはプレートおよび試薬を含むことができる。試験システムは核酸プローブのセットを含み（用いられるプローブの数が多いほどパターン反復の公算は少ない）、このようなプローブは、被験者核酸の一部分に別個にハイブリッド形成させて、各プローブ試験に関する別個の結果を提供する方式で用いられるので、微量滴定プレート形式の場合のように予め決定された一定順序の配列で試験結果を組合わせることにより、その結果は試験される被験者に独特のパターンであるＰＩＦを形成する。試薬としては、（ａ）処理用材料、例えば、（ａ）フィルターまたはプレート、（ｂ）ハイブリダイゼーション、洗浄および検出用溶液、（ｃ）ＭＰＰに特異的な核酸プローブ並びに（ｄ）陽性および陰性対照のためのＤＮＡおよびプローブがある。

即多数の異なる種類の標識をＭＰＰプローブと一緒に有効に用いる。多数の標識およびそれらに付随する標識方法の十分な説明は、ケラ−（Ｋｅｌｌｅｒ）およびマナク（Ｍａｎａｋ）によるＤ　Ｎ　Ａ　Ｐｒｏｂｅｓ’の中にある。各種標識の例としては、ビオチンまたは任意のその誘導体、発蛍光団、化学発光または生物発光標識、ジゴキシゲニン、酵素、水銀、ハプテン、臭素、ＤＮＡ結合タンパク質、ユウロピウムーソラレン、ランタニド、修飾アミノ、修飾ヌクレオチド、スルホン酸塩、ＡＡＩＦ、ＤＮＰ、放射性同位体または引き続き検出しうる他の分子がある５゜プローブは、制限されないが、ニックトランスレーション、フォトアフィニティーラベリング、ランダムブライミング、直接酵素結合、末端標識、化学修飾、テーリング、転写、直接合成またはコンシュゲージコンを含む技法によって標識される５゜細胞溶解／核酸抽出ＭＰＰの決定は制限酵素消化を必要としないので、検体を高度に精製する必要がない。これは、核酸抽出をしない簡単な細胞および生物の破壊を可能にする。

細胞は、チオシアン酸グアニジニウム、ＳＤＳまたは他の界面活性剤を用いることによって溶解される。

核酸捕捉前記のように調製された粗製溶解物を、捕捉またはサンドイッチ検定を用いるハイブリダイセーソヨン反応において直接用いるかまたは濾過して、ドツト、スポットまたは微量滴定プロット用に核酸試料を捕捉する。ある種の検定では、細胞を直接スポットし、そしてそれらをフィルター上（フィルター現場）で破壊することが可能である。

プロッティングは、ドツトプロットまたはスロットプロットマニホールド、マニホールドなしの簡単なスポットプロット、細胞の直接「フィルター現場」プロッティングまたは他の方法によることができる。これらの操作は各種ラボマニュアルおよび教本１．１０．　１１に記載されている。

ハイブリダイゼーション反応異なる寸法のプローブは異なる結合親和性を示す。更に、プローブおよび標的間の相同％は結合親和性に影響を与える。ＭＰＰに選択されたハイブリダイセーションおよび洗浄条件は、特定のヌクレオチド配列またはプローブに用いられたその配列の一部分の存在または不存在を区別することができる。これらの条件の確立はストリンジエンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を設定する。適当な／Ｓ’ｌ ’プリダイセーンヨン条件は、下記の７ゾブリダイセ一シヨン式に記載した式を用いて算定されるが、最終の最適条件は個々のプローブそれぞれに関して経験的に決定される。

検出／測定ハイブリダイゼーション後に、用いられる検出システムは放射性同位体または非同位体、例えば、比色分析、蛍光分析若しくは発光であってよい。唯一の判定基準はバックグラウンド上での容易な検出である。検出方法はプローブを修飾するのに用いた標識の性質に依る。

ハイブリダイゼーション式式３：長プローブを用いるＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに関する融解温度（Ｔｍ）を決定する。Ｔｍは、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが一本鎖に分離（変性）し始める点である。

Ｔｍ＝８１．５°Ｃ＋１６．６１ｏｇＭ＋０．４１　（Ｇ＋Ｃ％）−０，７（ホルムアミド％）　式中、Ｍ＝　［Ｎａ”］モル／リットルである。

害亘烈・ｌ　Ｍ　−Ｎ　ａ＋および５０％ホルムアミド中、Ｇ＋Ｃを４５％含有する２５０塩基のプローブに関して：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６　ｌｏｇ　（１）　＋０．４１　（４５）　−０，７（５０）　Ｔｍ＝８１．５＋　（０）　＋１８、５−３５＝６５°Ｃ行われるべき温度である。

Ｔ、＝Ｔｍ−２０°Ｃ上記の実施例を用いることにより：Ｔｈ、、＝６５°Ｃ−２０℃＝４５℃ 式５：１４〜４０塩基の短オリゴヌクレオチドプローブのＴｍの決定。短プローブに関する式Ｔｍは経験的に決定されており；それは、プローブおよび標的の相対塩基対含量の関数である。ホルムアミド不含の標準ナトリウムイオン濃度は、用いられる反応条件である。

Ｔｍ＝ＧＣ対当り４°Ｃ＋ＡＴ対当り２°ＣＴｍ＝４８Ｃ（１０）＋２℃（１０）＝６０°Ｃ式６：短オリゴヌクレオチドプローブのＴ。、ｂの決定。

Ｔｈｙｂ＝Ｔｍ−５°Ｃしたがって、上記の２０マーのＴｈｙｂは５５℃であろう。

実施例１゜以下は、マイクロタイタードツトプロット形式においてＤ　Ｎ　Ａ　／　ｚイブリダイセーンヨンを用いる実施例である。実施例１において言及される多数の具体的な工程は、マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら１０などの多数の実験室マニュアルで見出される。

ヒトＤＮＡプロフィリング用検体血液、精液、組織、または核酸を含む任意の検体を用いる。細胞を破壊してその核酸を、それらの分解を防止する媒質中に遊離させる。核酸は、検体または生物の必要性に応じて抽出してよいしまたはしなくてもよい。

核酸抽出：全血液から１、血液検体を抗凝血物質ＥＤＴＡ中に集める。

２、血液を室温において４００Ｘｇで５分間遠心分離して赤血球を白血球から分離する。白血球は赤血球の上部に層を形成する。白血球層をバスツールビベ・ノドで注意深く除去し、そして新しいポリプロピレン試験管に入れる。

３、細胞を再懸濁させ且つ溶解緩衝液（Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ）　（２０ｍＭ　）リス−ＩＴｃＩ、ｐＨ７，５；　２０ｍＭ−ＮａＣ１：　２０ａＭ−ＥＤＴＡ）を加えて全容量を２ｍｌにする。１０％ＳＯ３を０．　ＬＤ１１加えることによって細胞を溶解させる。

４、２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを０．２ｍｌ加える。５０℃で１時間インキュベートしてタンパク質を消化する。

５、等量（２，３ｍ１）のＰＣＩ　（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール：　２５：２４：１）を加え且つ１分間激しくかき回すことによって核酸を抽出する。１０分間遠心分離して２相を分離する。

６　上方の水性層を新しい試験管に移す。等量のＰＣＩで再度抽出する。

７、再度、上方の水性層を新しい試験管に移す。等量のクロロホルム、イソアミルアルコール（２４・１）を加え且つ１分間かき回す。１０分間遠心分離する。

８　水性層を新しい試験管に移す。１／１０容量（０，２ｍ１）の２Ｍ−酢酸Ｎａ、　ｐＨ５，０および２容量の水冷１００％エタノールを加える。−２０℃で少なくとも１時間インキュベートする。ミクロフユージで１０分間遠心分離する。

９　エタノールを試験管から注意深く除去してＤＮＡペレットを残す。冷７０％エタノール２ｍｌを加え且つ静かにかき回すことによってベレットを洗浄する。

ミクロフユーンで１０分間遠心分離する。

１０、エタノールを注意深く除去し、そして試験管をペーパータオル上に倒置するかまたは真空下で乾燥させることによって過剰のエタノールを排除する。ペレットが完全に乾燥しないようにし、さもなければ再溶解するのが難しくなるだけである。

１１、ＤＮＡ／ＲＮＡを１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐｆ１７．５．１ｍＭ　− ＥＤＴＡの０．５ｍｌ中に溶解用途に応じて、ＲＮＡは陽性または陰性の利点を有していてよい。したがって、必要な場合にこの操作を実施してＲＮＡを除去する。ＲＮＡの除去は、ＭＰＰプローブがリポソームＲＮＡまたはバックグラウンドとなった若干の他のＲＮＡに対して交差反応する場合に必要であることがある。

１２、ＲＮアーゼＡを最終濃度１００μｇ／ｍｌまで加え且つ３７℃で３０〜６０分間インキュベートする。

１３、ＳＤＳを最終濃度０．５％までおよびプロテイナーゼＫを最終濃度１００ μｇ／ｍｌまで加える。３７°Ｃで３０〜６０分間インキュベートする。

１４、工程４および５の場合と同様に、溶液をＰＣＩで抽出する。

１５、工程７の場合と同様に、溶液をクロロホルムで抽出する。

１６、工程８〜１１の場合と同様に、ＤＮＡを沈殿させ、洗浄し、そして再溶解させる。

１７、ＤＮＡ溶液を一２０℃で貯蔵する。

膜上の核酸プロッティング被験者のＤＮＡ試料を多数の異なる部分（実施される個々のプローブ試験の数に応じて最大９０種類まで）に分割する。検体をメンブランフィルタ−上にプロットして、多数の異なるプローブを用いるハイブリダイゼーシヨンの用意をする。

ブロッティングを行う好ましい方法は、ナイロン膜がウェルの底部に１寸着したミリポア（Ｍｉ　１ｌｉｐｏｒｅ）微量滴定プレート（または他の製造業者からの同等物）を用いるマイクロタイタードツトプロット（ＭｉｃｒｏｔｉｔｅｒＤｏｔ　Ｂｌｏｔ）形式である。この種類のプレートは、濾過、各ウェル中での種々のプローブとのハイブリッド形成および他のウェルから干渉（交雑混入または滲出）されない試料の洗浄を可能にする。

１８、微量滴定フィルタープレートと一緒に用いるのに適したノ（キューム・プレナム（＋＋ａｃｕｕｍ　Ｐｌｅｎｕｍ）装置を組立てる（商業的に入手可能な９６ウエルの７１キユーム・プレナムのいずれでも十分である）。

１９、微量滴定フィルター（ナイロン）プレートをプレナムに入れる。０５Ｍ− ＮａＯＨを用いて各ウェルに０．２ｍｌ加えることによって膜を湿潤させる。

２０、被験者の核酸溶液の試料を取出し且つＩＱＭ−ＮａＯＨを最終濃度０．５Ｍまで加えることによって変性させる。ＲＮＡが試料中にある場合、直ちに工程２１へと続け、さもなければＲＮ　、Ａが破壊される。

２１、変性核酸溶液２００μｍを試験される各ウェルに加える。

２２、マニホールドに真空を適用して、ウェルの内容物を多孔質膜を介して吸引する。核酸は膜に対して結合する。

ＲＮＡ含有試料の使用に関する選択的工程工程２３２３．１Ｍトリス−１’ｌＣ１、ｐＨ７，０を２００μｍ加え且つ工程２２の場合と同様に濾過する。

２４、試料をウェルから完全に除去した後に装置を取り外し、そして膜を６０° Ｃで３０分間焼くかまたは完全に自然乾燦させる。

標識プローブプローブはＤＮＡかまたはＲＮＡから成る。用いられるプローブ標識方法は、用いられた標識の種類に依る。標識に関する唯一の要件はノ＜・ソクグラウ〉下層での明確な検出能力である。好ましい標識は、標準エライザリーダーで容易に測定しつるフィルター上の変色を生じる。例えば、ビオチニル化プローブはこの種類の検出ノ又テムに適している。オリゴヌクレオチドを標識するには、化学的付着５または光−ビオチニル化５が最良のプローブを生じる。

ハイブリダイゼーション反応引き続き検出される標識を含んでいるオリゴヌクレオチドプローブを、標的（被験者の）核酸を含んでいる媒質に加える。溶液を、塩、ホルムアミド、プローブと標的を結合（ハイブリッド形成）させる温度および時間を含む適当なハイブリダイゼーション条件でインキュベートする。

ナイロン膜を用いて作業するのに好ましいプレハイブリダイゼーション溶液は下記の化学物質を含む。

Ｑ、　１ｍｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ（試薬を除去する濾過が引き続きの工程に用いられない場合、音波処理したニシン精子ＤＮＡで置き換えることができる）０．２％フィコール０２％２％ランアルブミン（またはグリシン）０２％ポリビニルピロリドン６Ｘ　ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム）１％ＳＯ３（ドデシル硫酸ナトリウム）２５、全部のウェルの膜を適当なプレハイブリダイゼーション溶液でプレハイブリッド形成して、プローブの非特異的結合を阻止する。好ましい方法において、プレハイブリダイゼーション溶液は各プローブのハイブリダイゼーションの場合と同一のものである。３７８Ｃで３０〜６０分間プレハイブリッド形成させる。

２６、プレハイブリダイゼーションに続いて、過剰の溶液を真空下で濾過することによってまたは溶液を注ぎ出すことによって除去する。

２７、ウェルを６ＸＳＳＣで１回濯ぎ洗浄し、そして濾過して過剰の試薬を除去する。

マイクロタイタードツトプロット形式において、ハイブリダイゼーシヨンおよび洗浄に用いられる温度は全部のウェルに関して同一であるのが好適である。これは処理を一層容易にさせる。反応の厳格さは所望のプローブ特異性（または相同％）を設定するものであり、塩またはホルムアミド濃度によって制御される。

（適当なハイブリダイゼーション条件を決定する方法を示す詳述された式に関する前記のハイブリダイゼーション式を参照されたい。）　ハイブリダイセーノヨン条件は、９５％またはそれ未満の相同性を示す標的からの標的核酸配列に対して１００％相同の２０塩基対のオリゴヌクレオチド毎に区別することかできる。

２０マーでのこの識別度に近い反応条件を下記の実施例で示す。

ナイロン膜を用いて作業するのに好ましいプレノ＼イブリダイセーノヨン溶液は下記の化学物質を含む。

０、１＋ｎｇ／＋ｎｌの酵母ｔＲＮＡ（試薬を除去する濾過が引き続きの工程て用いられない場合、音波処理したニシン精子Ｄ　Ｎ　、Ａで置き換えることができる）０．２％フィコール０．２％ウン血１ｌｌｆアルブミン（またはグリシン）０２％ポリビニルピロリドン６Ｘ　５ＳＰＥ１％ＳＯＳ　＜ドデシル硫酸ナトリウム）場合によりホルムアミド（１５０％）場合により硫酸デキスラン（５〜１０％）この基本的試薬の変更は多数存在する。これらの試薬の最終濃度は、膜材料（ナイロン、ニトロセルロースまたは紙）、プローブの長さおよびＧＣ含看並びに用いられる標識の種類（例えば、放射性同位体、ヒオチン、発光等）に依る。

２８　各標識プローブ（３０〜９０種類の異なる溶液を調製する）をハイブリダイセーンヨン溶液中に適当な最終１度まで混合する（最終濃度は標識の性質に依る）。ビオチニル化プローブに関しては、ハイブリダイセーソヨン溶液中において０゜１〜０．２二ｇ／ｍｌ用いる。

２９　プローブ溶液１の０．２ｍｌをウェル１に、プローブ溶液２の０．２ｍｌをウェル２に入れ、そして全部のプローブ溶液が加えられるまで続ける。

３０、用いられた特定のプローブ長さおよびノ＼イブリダイセーション溶液に適当な温度でインキュベートする。ホルムアミドまたは硫酸デキストラン不含の前記に記載したハイブリダイゼーション溶液中のＧＣ含量５０％のビオチニル化２０マーに関して、Ｔｈｌ。は約５５℃である（計算に関しては前記の／％イブリダイセーション式を参照されたい）１゜３１５５°Ｃで１６時間ハイブリッド形成させる。

鯖過剰の非結合プローブを、物理的分離によってまたは化学的分解などの別の手段によって除去して非結合プローブを破壊する。残りのプローブはその特異的相補的配列に対してハイブリッド形成するものであり、検出される。

３２、過剰のハイブリダイゼーション溶液を、溶液を注ぎ出すことによって除去する。

３３　各ウェルを室温において洗浄溶液（０、ＩＸ　ＳＳＣＯ，２ｍｌ、１％５ＤＳ）で３回イ１ぎ洗浄して、非結合の過剰プローブを除去する。洗浄溶液濃度は、種々のプローブを同一の洗浄温度で調節するように変更することができる。

３４、最終の極めてストリンジエンシーな洗浄に関して、洗浄溶液０．２ｍｌを各ウェルに加え且つ５５℃で３０分間インキュベートして、誤対合プローブを除去する。

過剰の洗浄溶液を濾過するかまたは注ぎ出す。この洗浄を１回繰り返す。

検出検出方法はプローブを修飾するのに用いられた標識の性質に依る。ビオチニル化プローブシグナルを生じさせる典型的な方法を以下に記載する。これらの工程のいずれの間にも膜を完全に転環させないことが重要である。インキュベーションは全て室温においてである。

３５、各ウェルに対してブロッキング溶液１　（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ中３％ＢＳＡ、ｐｉ１７．４．２０ｍＭ−ＮａＣ１，０，３％トゥイージー２０．０．０１％チメロサール）０．２ｍｌを加え且つ１５分間インキュベートする。

３６　過剰のブロッキング溶液を濾過するかまたは注ぎ出す。各ウェルに対して酵素コンジュゲート（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　（ブロッキング溶液中、アルカリホスファターゼ−ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）コンジュゲートｌ＋ｇ／ｍｌ）　０．２ｍｌを加え且つ１０分間インキュベー１・する。

３７　酵素コンジュゲート溶液を濾過するかまたは注ぎ出す。各ウェルを洗浄溶液２　（５０ｍＭ）リス−１（Ｃ１、Ｉ）Ｈ７，４，２ｈｌｌ−ＮａＣ１，０，３％トウィーンー２０．０．Ｏ１％チメロサール）０．２ｍｌ中においてそれぞれ５分間３回洗浄する。各洗浄毎に洗浄溶液２を濾過するかまたは注ぎ出す。

３８、基質溶液（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）０．２ｍｌを各ウェルに加え且つ暗所において発色するまで１５分間〜２時間インキュベートする。

３９、各ウェルを脱イオン水中で洗浄することによって展開を停止させる。ウェルを濾紙上で乾燥させる。

実施例２゜この技法は、ハイブリダイゼーション溶液６中の塩化ナトリウムの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（または塩化テトラエチルアンモニウム）を代用する。

他の工程は全て実施例１の場合と同一である。この塩の変更により、生成されたハイブリッドの安定性に対する相対匡含量％の影響が避けられる。これはオリゴヌクレオチド配列がハイブリダイゼーション反応を同様に実施するのに同様の闇含量を必要としないので、ＭＰＰプローブを調製するのに有用である。試薬システムはより一層単純である。従来、この変法はヒト結腸直腸癌におけるｒａｓ遺伝子突然変異の分析？４に適用されてきた。

ハイブリダイゼーション反応実施例１の場合と同様に、ビオチニル化オリゴヌクレオチドプローブを、標的（被験者の）核酸を含んでいる媒質に加える。下記のハイブリダイゼーション溶液を含む適当なハイブリダイゼーション条件で溶液をインキュベートする。プローブおよび標的を結合（ハイブリッド形成）させる温度および時間を以下で論理する。

０、１ｍｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ（試薬を除去する濾過が引き続きの工程に用いられない場合、音波処理したニシン精子ＤＮＡで置き換えることができる）０．２％フィコール０．２％ウシ血清アルブミン（またはグリシン）０．２％ポリビニルピロリドン３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム５０ＩＩＩＩＩトリス−１１ＣＩ、　ｐｎｌｌｌ、　０２ｍＭ　ＥＤＴＡ１％ＳＯ３（ドデシル硫酸ナトリウム）２５、全部のウェルの膜を適当なプレハイブリダイゼーション溶液でブレＩ＼イブリッド形成して、プローブの非特異的結合を阻止する。好ましい方法において、プレハイブリダイゼーション溶液は各プローブのハイブリダイモーション中にもちいられるのと同一のものである。５６°Ｃで３０〜６０分間プレハイブリッド形成させる。

２６、プレハイブリダイセージコンに続いて、過剰の溶液を真空下で濾過することによってまたは溶液を注ぎ出すことによって除去する。

ハイブリダイゼーション条件は単一の塩基対誤対合を示す標的からの標的拡散配列に対して１００％相同の２０塩基対のオリゴヌクレオチド毎に区別するまうに決定された。正確な反応条件は経験的に決定されるが、２０マーでのこの識別度に近い反応条件を下記の実施例で示す。

２７、各プローブ（３０〜９０種類の異なる溶液を調製する）をハイブリダイゼーシヨン溶液中に適当な最終濃度まで混合する（最終濃度は標識の性質による）。ビオチニル化プローブに関しては、ハイブリダイゼーション溶液中において０．１〜Ｑ、　２ｎ＋ｇ／ｍｌを用いる。

２８、プローブ溶液１の０．２ｍｌをウェル１に、プローブ溶液２の０．２ｍｌをウェル２１；入れ、そして全体のプローブ溶液が加えられるまで続ける。

２９、用いられた特定のプローブ長およびハイブリダイゼーション溶液に適当な温度でインキュベートする。Ｔｈｆｂは約５６℃である（計算に関しては前記のハイブリダイゼ一シヨン式を参照されたい）。

３０．５０℃で１６時間ハイブリッド形成させる。

紗過剰の非結合プローブを、物理的分離によってまたは化学的分解などの別の手段によって除去して非結合プローブを破壊する。残りのプローブはその特異的相補的配列に対してハイブリッド形成したものであり、検出される。

３１、過剰のハイブリダイゼーション溶液を、溶液を注ぎ出すことによって除去する。

３２、各ウェルを洗浄溶液１（２Ｘ　５ＳＰＥ　０．２吐１％５ＤＳ）を用いて室温において５分間３回濯ぎ洗浄して、非結合の過剰プローブを除去する。洗浄溶液１度は、種々のプローブを同一の洗浄温度で調節するように変更することができる。

３３、最終の極めてストリンジエンシーな洗浄に関して、高塩洗浄溶液（５ｘＳＳＰＥ１．０％５ＤＳ）０．２ｍｌを各ウェルに加え且つ５９℃〜７３℃で（プローブに応じて）５分間インキュベートして誤対合プローブを除去する。過剰の洗浄溶液を濾過するかまたは注ぎ出す。

３４、フィルターを、０．２％フィコール、０．２％ウシ血清アルブミン（またはグリシンＬ０．２％ポリビニルピロリドンまたは酵母ｔＲＮＡ（またはＤＮＡ）不含のハイブリダイゼーション溶液中において５９℃〜６０℃で１時間２回洗浄する。

実施例１または２の結果陽性の結果は、バックグラウンド（陰性対照）上で識別しつるシグナルによって示される。ビオチニル化プローブおよびアルカリホスファターゼコンジュゲートに関するシグナルは紫がかった青色である。

陽性の結果を１と記録し且つ陰性の結果を０と記録する。結果を、他のパターンと比較するための予め決定された形状によるコンピュータープログラムに入れる。典型的な微量滴定プレートパターンを図３に示す。

結果の分析３９個体の識別単一の個体は、特定のプローブセットに関して陽性および陰性結果のある安定なパターンを示す（微量滴定プレートでの実際的な理由で、これは最大９０種類までのＭＰＰプローブである）。この個体はいずれの分析においても同一のパターンを与える。したがって、前の結果との比較は常に、同一の遺伝子断片セットに関して同一のパターンを示す。同一個体の別個の組織から得られた共通の検体は全て同一のパターンを示す。例外は一卵性双生児である。十分な数のＭＰＰプローブを用いて１０Ｉ０中１未満の水準の独自性が達成される場合、２種類の非同 −性個体が同一のパターンを有することはない。存在頻度が０，５のＭＰＰプローブを用いると、式２により、３３種類のプローブのみが必要とされる。「存在」頻度が０．２のプローブを用いると、１０１０中１の水準の独自性に対して６０種類のプローブが必要である。したがって、「存在」頻度が数と組合わされた用いられるプローブがＰＩＦ独自性を決定する。

ＨＬＡ　ＤＱ−α遺伝子座に対するプローブは、殺人容疑者を除外する場合に役立てるのに用いられてきた。場合においては、被害者および犯罪現場からの毛髪などの検体が種々のＨＬＡ　ＤＱ−α対立遺伝子を示す場合に、それらを試験して識別することができる。この遺伝子座の識別しうる形態は６種類存在する。

比較は、容疑者、被害者および攻撃者のＨＬＡ　ＤＱ−α遺伝子地図から行われる。この情報は若干の容疑者を除外するのに用いることができるが、極めて正確に容疑者を確認するのに用いることはできない。ＨＬＡ　ＤＱ−α遺伝子座からの情報を用いる可能性による同一である確率の範囲は１０中１〜１００中１である。ＭＰＰ分析は、最大２５までの大きさの程度までの更に十分な精度を有することがありうるし、そして可能性のある容疑者を除外するのに用いるべきであると考えられる。

更に、被験者の生涯の間にある種の遺伝子を変化させることがある癌細胞の場合のように、突然変異誘発性疾患を検出するＭＰＰプローブを避けるように注意する。この変化は被験者のＰＩＦに対する変化を引き起こすと考えられる。

ＰＩＦに関して、用いられるＭＰＰプローブの数は、各プローブの個々の配列反復の確率および前記の本発明の詳細な説明において記載したように使用者にとって必要なパターン反復の確率の関数である。微量滴定プレート形式を用いる実際的な理由で、用いられるＭＰＰプローブの数は９０個またはそれ未満である。ＰＩＦの一つの重要な使用法は、未知検体と容疑者から得られた検体とを対合させることによって血液、精液または他の組織試料から身元を確認することである。

ｂ、父性確定ＰＩＦと同様に、父性決定に用いられるＭＰＰプローブの数は、各プローブの個々の配列反復の確率、および関係を確立するのに必要なパターン反復の確率の関数である。

母親と子とのパターンの比較は特定の遺伝子の結果において相違を示す。これらの種々の遺伝子の推定による父親との比較は、これらの遺伝子が父親に由来したものかどうかを示す。可能な対合は、母親とは異なる遺伝子全部を父親が寄与している場合に達成される。

場合においては、母親とは異なる子の遺伝子の数が少数しかないことがある。

これは、完全な対合を有することができる可能性のある父親の数を増大させるという影響を与える。したがって、ある対合が唯一であるという確率を決定することが望ましい。推定上の父親が真の父親であるという確率は、母親とは異なる子の遺伝子の頻度の組合わせから決定される。

母親由来の遺伝子変異の数が十分である場合、確率は、推定による父親が真に父親であるということを決定する。必要な排斥頻度はおそら＜１０”中１以下である。存在頻度が５０％のＭＰＰを用いると、式２により、排斥頻度は母親と子との間に１６プローブの相違を必要とする。

参考文献１、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）　、　ＥＭ　（１９７５）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９８：５０３゜２、シェフリーズＤｅｆｆｒｅｙｓ）、＾Ｊ、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、　Ｖ、およびナイン（Ｔ４、シェフリーズ、　ＡＪ、ウィルソン、ｖ１ティン、　ＳＬ、ウエザオールマクミラン・パブリッシャーズ・リミテッド（Ｓｌａｃｌｌｌｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｌｔｄ、　）、英国。

６、メルキオール（Ｍｅｌｃｈｉｏｒ）、　ｆＢおよびフォノ・ヒラペル（Ｙｏｎ　Ｈｉｐｐｅｌ）、　ＰＨ（１９７３）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾７０（２０）　＋２９８〜３０２゜７、ヴアラーンド・ヴリース（Ｖｅｒｌａａｎ−ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ）、　Ｍ、ポガード（Ｂｏｇａａｒｄ）。

ＭＥ、ファン・ジン・エルスト（ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｌｓｔ）　、　Ｈ，ファン・ブーム（ｖａｎ　Ｂｏｏｍ）、ＪＨ，ファン・デア・ニブ（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）、　ＡＪおよびボス（Ｂｏｓ）　、几（１９８６）Ｇｅｎｅ　５０：３１３〜３２０゜８、ボス（Ｂｏｓ）　、几、フィアロン（Ｆｅａｒｏｎ）　、　ＥＲ，ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）　。

ＳＲ，ヴアラーンド・グリース１Ｍ１フアン・ブーム、ＪＨ、ファン・デア・ニブ、ＡＪおよびフォーゲルシュタイン（ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）　、　Ｂ　（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２７：２９３〜２９７゜９、ライラード（Ｗｉｌｌａｒｄ）　、　Ｈ，ら（１９８５）　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ４０　：３６０〜４８９゜１０、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８２）？ニアテイス、Ｔ１フリ、ソシｓ　（Ｆｒｉｔｓｈ）　、　ＥＦおよびサムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　、　Ｊ、監修、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）。

１１　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ヘイムズiＨａｗｅｓ）　、　ＢＤおよびハイジン（Ｈｉｇｉｎｅ）、　ＳＪ、監修、　ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、ワシントン　ＤＣ０浄書（内容に変更なし）集団における経験的頻度（ｆ）浄書（内容に変更なし）集団における１ＥＦ１１の頻度（ｆ）国際調査報告手続補正書彷痴１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ９１１０７６８５平成３年特許願第５１８０７７号２、発明の名称多重核酸配列の存在または不存在の検出による識別および父性決定３、補正をする者事件との関係　特許出願人住所氏　名　ラブ、ジャック４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正命令の日付　平成　５年１２月１４日　侵送日）６、補正の対象

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）複数の独特のヌクレオチド配列を選択し；（ｂ）それぞれの独特の配列を適当なプローブとハイブリッド形成させ；そして（ｃ）陽性のシグナルの種類および数を分析することを含む方法。
２．独特のヌクレオチド配列が、多重存在多型性を有する配列を含む請求項１に記載の方法。
３．独特のヌクレオチド配列が、集団の一部分に存在するヌクレオチド配列を含む請求項２に記載の方法。
４．プローブが少なくとも１０個のヌクレオチドを含む請求項１に記載の方法。
５．約２０〜約９０個のヌクレオチド配列を選択する請求項１に記載の方法。
６．請求項１に記載の工程「ｃ」が、陽性および陰性シグナルの識別しうるパターンを提供する請求項５に記載の方法。
７．プローブ配列が集団の約１０％〜約９０％に存在している請求項３に記載の方法。
８．プローブ配列が集団の約５０％に存在している請求項７に記載の方法。
９．ヌクレオチド配列が制限断片長多型を示す請求項２に記載の方法。
１０．父性を決定する方法であって、（ａ）母性のヌクレオチド配列セットに関して請求項１に記載の方法を実施し（ｂ）子のヌクレオチド配列セットに関して請求項１に記載の方法を実施し；（ｃ）推定上の父性のヌクレオチド配列セットに関して請求項１に記載の方法を実施し；（ｄ）工程「ａ」および「ｂ」の結果の類似点および相違点を分析し；そして（ｅ）工程「ｄ」において見出された相違点と工程「ｃ」の結果とを比較することを含む上記の方法。
１１．それぞれが多重存在多型性を有する複数のヌクレオチド配列；および適当な容器、を含むキット。
１２．下記、すなわち、フィルター；微量滴定プレート；ハイブリッド形成試薬；洗浄試薬；検出または標識試薬；並びに陽性および陰性対照用のヌクレオチド配列の少なくとも一つを更に含む請求項１１に記載のキット。