DE4439896A1 - Verfahren und Mittel zur "inneren Nummerierung" von Produkten sowie von Proben - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Konstruktion von Mitteln, die sich für die "interne" Numerierung von Produkten oder Proben eignen und deren Anwendung.

Stand der Technik

In der Produktion von hochwertigen Gütern gibt es den Bedarf, die produzierten Artikel fälschungssicher zu gestalten. Es besteht die Möglichkeit, den Produkten irreversibel Signalstoffe beizumischen, anhand derer diese gezeichnet werden können. Als signaltragende Substanzen können z. B. anorganische Stoffe, Eiweiße, Nukleinsäuren aber auch Partikel wie Sporen usw. benutzt werden.

Prinzipiell ist die interne Kennzeichnung als Verfahren bekannt. Es gibt den Vorschlag, klinischen Proben anorganische Salze beizumischen (US 3 733 178), organische Signalstoffe zu verwenden (WO 89/07272) und Produkten biologische Strukturen (z. B. Sporen) und Moleküle wie DNA als "inneres Etikett" beizufügen.

Die Möglichkeit der Verwendung von DNA unterschiedlicher Species wird erwähnt.

Diese Verfahrensweise ermöglicht zwar eine nahezu unbegrenzte Informationsvielfalt, sie hat aber lediglich beschreibenden Charakter. Die Beschreibung könnte lauten: Das Produkt "A" enthält DNA der Spezies "XY" bzw. Sporen der Species "U" und "V". Eine systematische Numerierung von Produkt- oder Probenserien in gut handhabbarer Form ist aber z. Z. nicht möglich. Sie ist nur dann zu ermöglichen, wenn dazu spezielle Konstrukte hergestellt werden. Wegen ihrer hohen Informationskapazität bieten sich besonders Nukleinsäuren an. Eine Lösung für ein solches Vorgehen ist nicht bekannt.

Eine innere Kennzeichnung von Proben und Produkten durch Beimischung von Partikeln ist ebenfalls beschrieben. In den bekannten Schriften wird auf die Möglichkeit der Erstellung von Mitteln, die eine systematische Verschlüsselung von Zahlen in ein Informationssystem zur inneren Codierung von Proben und Produkten ermöglichen aber weder hingewiesen, noch wird ein Lösungsweg für die Etablierung solcher Systeme gegeben.

Die Erstellung von Mitteln und Verfahren, welche durch Gebrauch von Makromolekülen oder von Partikeln die Möglichkeit einer systematischen inneren Numerierung eröffnen, stellen eine völlig neue Qualität dar.

Problem

Das Verfahren, einem Produkt oder einer Probe zur Erkennung einen oder mehrere Signalstoffe beizumischen, bezeichnen wir in dieser Schrift als "innere Numerierung, innere Kennzeichnung, innere Etikettierung oder innere Codierung".

Im Gegensatz zur einfachen Kennzeichnung sind viele Aufgaben vorhanden, die ein flexibles und universelles Kennzeichnungssystem wie z. B. die Realisierung von laufenden Nummern, erfordern. Einige solcher Aufgaben sollen genannt sein:

• - Innere Numerierung von Produkten oder Proben einer Serie (z. B. Blutproben, Produkte und Kunstwerke mit limitierter Auflage usw.)
• - Innere Zeichnung von Waren mit einem Produktionsdatum oder Verfallsdatum, um einerseits Verbraucherschutz zu garantieren und um andererseits Gewährleistungsbetrug zu verhindern.
• Innere Numerierung von Produktionschargen, z. B. um unverkäufliche Muster zu kennzeichnen.
• - Innere Kennzeichnung von Produkten mit Nummern von behördlichen Zulassungsbescheiden, steuer- oder zollrechtlich relevanten Genehmigungen bzw. Kennzeichnung von Produkten mit eingeschränkter Verwendungszulassung (z. B. Freibankfleisch), Kennzeichnung von Ernten oder Fischfängen, welche die Einhaltung von Mengenquotierungen usw. überprüfbar machen oder um steuerbefreite Mineralöle und andere Produkte mit Zulassungsnummern kennzeichnen zu können.
• - Innere Kennzeichnung von Farben und ähnlichem zwecks Offenlegung von Rezepten (z. B. Mischungsverhältnis von Komponenten usw.) um eine spätere identische Rekonstruktion oder Reparatur (auch bei fehlenden Unterlagen) gewährleisten zu können.
• - Innere Numerierung von Tankerladungen, um Verursacher von Ölverschmutzungen identifizieren zu können.
• - Innere Kennzeichnung von Abfallprodukten, Abwässer und recyclingpflichtigen Produkten mit Code-Nummern des Produzenten, um unerlaubte Entsorgungspraktiken zu verhindern und/oder um Rücknahmepflicht durch Hersteller regeln zu können.

Es sei darauf verwiesen, daß die Methode der inneren Kennzeichnung nicht nur für flüssige und pastöse Produkte in Frage kommt, sondern daß selbst metallische Produkte (z. B. Maschinen) über die Lackierung mit einer "inneren" Kennzeichnung versehen werden können.

Im folgenden wird auf die Notwendigkeit der Entwicklung von Systemen der inneren Numerierung für die Medizin besonders eingegangen.

In der bisherigen medizinischen und biologischen Analysenpraxis wird das Untersuchungsgut (z. B. Blut, Seren und Urin) am Probengefäß beschriftet. Falsche Beschriftungen und Probe-zu-Probe Kontaminationen können nach dem Stand der Technik nicht, bzw. nur durch Zufall, erkannt werden. Deshalb gibt es z. B. auch keine Möglichkeit, zu beweisen, daß eine Probe nicht verwechselt wurde.

Auch ist eine maschinelle Erkennung von Proben und die automatische Zusammenführung des Analysenergebnisses mit den Stammdaten der Probe z. Z. nur möglich, indem die Daten der äußeren Beschriftung mit dem Ergebnis kombiniert werden. Eine Beifügung einer internen Bearbeitungsnummer, die sich zu einem bestimmten Zeitpunkt maschinenlesbar abrufen läßt und irreversibel mit dem Untersuchungsergebnis verknüpft ist, würde einen höheren Grad der Analysenautomatisierung erlauben und zu einem Höchstmaß an Sicherheit führen.

Für all die genannten Bereiche werden Markierungsmittel benötigt, die die Erstellung einer systematischen Numerierung erlauben und die universell einsetzbar und leicht lesbar sind. Derartiges ist bisher nicht entwickelt worden.

Im folgenden soll die erfindungsgemäße Erstellung von DNA-Systemen zur Verschlüsselung von Zahlen in verschiedenen Varianten beschrieben werden:

Lösungen I. Erstellung von Codes durch Mischung von DNA Klonen mit unterschiedlicher Einzelinformation (Polyklonale Zahlencodierung) I.-1 Erstellung von Strichcodes durch Mischungen von Molekülen mit unterschiedlichem Abstand zwischen Primer-Annealing Positionen

Zur dauerhaften und flexiblen Kenntlichmachung von Produkten und Proben bietet sich die Beimischung von informationstragenden Nukleinsäuren an.

Nukleinsäuren besitzen eine hohe Informationskapazität, sie sind unter geeigneten Bedingungen auch weitgehend inert und es gibt gut entwickelte standardisierte Methoden um die Nukleinsäure- verschlüsselten Informationen zu lesen.

Die Realisierung der Codierung kann ermöglicht werden durch Beimischung eines Sortiments von amplifizierbaren DNA-Molekülen. Dieses Verfahren wird im folgendem "polyklonale Codeverschlüsselung" genannt. Das Ensemble der DNA-Moleküle soll so geartet sein, daß während eines Amplifikationsprozesses mit einem (u. U. auch mit mehreren) Primerpaar(en) ein Ensemble von PCR-Produkten unterschiedlicher Länge entsteht. Die Beimischung der DNA kann direkt durch Verwendung freier Moleküle (bzw. an nicht biologische Träger gebunden) oder via Klonierungsvehikel wie Plasmide und/oder Phagen bzw. von plasmidtragenden Bakterien, Hefen oder völlig anderer Organismen geschehen. Im einfachsten Falle beherbergen die informationstragenden DNA-Moleküle einen natürlich vorkommenden oder einen künstlich erzeugten Längenpolymorphismus.

Bei einer parallelen Amplifikation der Moleküle und der Auftrennung zeigen sich dann in der Elektrophorese in vorgegebenen Bereichen Bandenkombinationen (z. B. Allel-Leitern mit Lücken), die einen Strichcode darstellen. Je nach Sortiment der Moleküle ergibt das System aus vorhandenen Sprossen und Lücken die Darstellung von bestimmten Zahlen, wobei Codierungen in dualen Zahlen, in dekadischen Zahlen oder anderen Zahlensystemen vorgenommen werden können.

In unserem 1. Beispiel funktioniert die Erstellung eines solchen Systems dadurch, daß in Klonierungsvehikel (in unserem Modell werden Plasmide verwandt) jeweils an gleicher Stelle ein natürlich vorkommender oder ein künstlich hergestellter Längenpolymorphismus kloniert wird. Als natürlicher Polymorphismus kann ein Short- Tandem-Repeat-Polymorphismus, z. B. der humane ATGG-Repeat im Myelin-Basic-Protein des Menschen, ein beliebiger anderer STR- oder ein VNTR-Polymorphismus verwendet werden.

I.1-1 Zahlendarstellung durch Verwendung des dualen Systems

Für die Erstellung einer dualen Zahl von 8 Bit werden PCR-Produkte von 8 unterschiedlichen Längen (die Allele eines Polymorphismus darstellen können) kloniert. Sechzehn Bit erfordern dementsprechend die Erstellung von 16 Klonen, die sich jeweils in der Länge der Inserts unterscheiden. Die Mischung der Produkte entscheidet dann über die innewohnende Information. Zur Lesung der internen Numerierung können die informationstragenden DNA-Fragmente mit Primern, die entweder außerhalb der Inserts in der Plasmidsequenz oder an den polymorphismus-flankierenden Stellen im Insert annealen, ampliziert werden. Anhand der Abbildungen wird das Prinzip der Erfindung erläutert.

Fig. 1 und Fig. 2 zeigen, wie die Kennzeichnung in Form eines Strichcodes organisiert werden kann.

Fig. 1 zeigt, daß ein Strichcode erstellt werden kann, indem ein geeignetes Sortiment von Plasmiden hergestellt wird.

In der Fig. 1 bedeutet nR eine Basisanzahl eines repetitiven Elements des Polymorphismus von beispielsweise 4 Basen, das in keinem der Allele unterschritten wird. Die Zahlen nR+1R bis nR+10R symbolisieren 10 Klone, die sich jeweils in der Länge der Inserts unterscheiden. In unserem Beispiel betragen die Differenzen jeweils 4 bp. Diese Serie von DNA Klonen läßt sich verwenden, um ein duales Zeichensystem von 8 Bit (ein Byte) plus einem dualen Prüfzeichensystem von 2 Bit zu etablieren.

Eine zweite Serie von Klonen wird erstellt, indem man einen zweiten ähnlich gearteten Polymorphismus in analoger Weise an gleicher Stelle im gleichen Vektor kloniert. Wichtig ist, daß die PCR-Produkt-Großenspektren (Klassen) sich nicht überlappen. (Das zweite 10-Bit-Feld ließe sich auch dadurch erstellen, daß man an gleicher Stelle denselben Polymorphismus insertiert, dessen Allel aber mit Primern amplifiziert wurden, die durchgehend 48 bp größere Produkte liefern.)

Man erhält dann ein vergleichbares Sortiment von Klonen (Klasse 2), bei dem aber das kürzeste Insert 8 bp länger ist, als das längste Insert der ersten Serie von klonen. Dieses ist in der Fig. 1 als zweite Serie von Klonen dargestellt.

Natürlich ist es auch möglich, die Moleküle unterschiedlicher Länge jeweils aus völlig unterschiedlicher Quelle zu beziehen. Eine geeignete Kombination der Klone ermöglicht dann, ausgehend von dem Gemisch an Molekülen, einen Strichcode zu amplifizieren. Die Pfeile in der Abb. 1 zeigen die Positionen außerhalb des Inserts, an denen das Primer-Annealing stattfinden soll. Die Organisation des Strichcodes ist in Fig. 2 gezeigt. Dort realisieren die elektrophoretisch aufgetrennten Amplifikate aus zwei Serien von Klonen gemäß Fig. 1 je ein Numerierungsfeld (1 und 2) von jeweils 8 dualen Zeichen (1 Byte=2⁸=256) und je ein Prüffeld (3 und 4) mit einem Informationsgehalt von jeweils 2 Bit (2²=4). Die senkrechte Zeile a zeigt schematisch ein Elektropherogramm von Amplifikaten, in dem alle möglichen Positionen des Numerierungs- und Prüffeldkonstrukts durch Banden besetzt sind. die senkrechte Zeile b zeigt schematisch ein Elektropherogramm, in dem durch die Alternativen "Bande vorhanden" (=1) und "Bande nicht vorhanden" (=0) eine Information realisiert ist. Der hier als Beispiel angeführte Strichcode lehnt sich an das Prinzip etablierter elektronischer Informationssysteme an. Mit dem in der Abb. 2 dargestellten Code, der 2 Byte für Numerierungen enthält, kann man 65 536 Proben oder Produkte kennzeichnen.

Wie im hier angeführten Beispiel der Fig. 2 gezeigt, ist es sinnvoll, den acht Zeichen für die Numerierung zusätzliche Zeichen eines Prüffeldes zuzuordnen. In unserem Beispiel wird dazu ein Zwei-Bit-Prüffeld verwendet. Die einfachste der vielen denkbaren Möglichkeiten der Überprüfung kann in folgender Weise funktionieren: In der Prüffeld-Position 1 (untere Bande des 2-Bit- Prüffeldes) muß eine Bande erscheinen, wenn die im Numerierungsfeld dargestellte Zahl eine gerade Zahl oder 0 ist. Die zweite Prüffeldbande (obere Bandenposition im Prüffeldfenster) muß erscheinen, wenn die Anzahl der Banden im Numerierungsfeld eine ungerade Zahl oder 0 ist. Die Verwendung eines Prüffeldes ist nicht nur geeignet, Störungen in der Funktion aufzudecken, sondern es erschwert auch die Fälschung des Systems durch nachträgliche Beimischungen von DNA-Signalen.

Benutzt man, wie in unserem Beispiel, für die Besetzung der 8 Positionen im Numerierungsfenster und 2 Positionen im Prüffeldfenster einen Polymorphismus, in dem die Allele durch Vier-bp-Sprünge unterschieden sind, so wird zur Darstellung eines Numerierungsfeldes mit dem dazugehörenden Prüffeld ein Platzbedarf von 40 bp beansprucht. Demzufolge ist im Abstand von 44 (oder besser 48) bp die Plazierung einer zweiten Stelle (hier als Byte) möglich. Der in der Fig. 2 dargestellte Code zeigt eine solche Organisation.

Es ist darüber hinaus prinzipiell auch möglich, daß sich beide Stellen überlappen oder sogar direkt im gleichen Bereich befinden. Für diesen Fall müssen die Fragmente des einen Systems die Freiräume des anderen nutzen, oder die Fragmente der beiden Systeme müssen unterschiedlich markiert sein.

Anstatt eines natürlich vorkommenden Polymorphismus, der hier zur Verwendung vorgeschlagen wird, kann auch ein künstlich erzeugtes Fragment-Längen-Sortiment erstellt und verwendet werden. Auf die detaillierte Darstellung dieser Möglichkeit wird verzichtet.

I.1-2 Codierung durch Verwendung dekadischer Zahlensysteme

- Besonders übersichtliche Verhältnisse erhält man, wenn man anstatt des 8-Bitfeldes mehrere 4-Bitfelder etabliert und ein pseudodekadisches System konstruiert. Dabei wird für die Darstellung einer Zahl von 1 bis 10 ein Feld mit vier Bandenpositionen (4-Bit-Feld) benötigt. Abgesehen davon, daß die Null als Bandenkombination dargestellt werden sollte (und nicht als Fehlen von Banden) kann die bekannte Umformung von dekadischen in duale Zahlen genutzt werden:

0=L0L0  1=000L  2=00L0  3=00LL  4=0L00
5=0L0L  6=0LL0  7=0LLL  8=L000  9=L00L

Eine Reihung von mehreren 4-Bitfeldern erlaubt dann die Darstellung mehrstelliger dekadischer Zahlen. Die Etablierung einer Zahl von 1 bis 1000 würde nach diesem System die Erstellung von drei 4-Bitfeldern benötigen, zu deren Besetzung 12 DNA-Klone gebraucht werden. Bei Einführung eines Prüfcodes kämen 1 bis 2 Klone hinzu. Damit zeigt sich, daß bei gleichem Informationsvolumen die verbesserte Übersichtlichkeit des Systems mit einem Mehraufwand an Klonen erkauft wird. In der Abb. 3 soll als Beispiel gezeigt werden, wie sich unter Verwendung des natürlich vorkommenden MBP Polymorphismus eine willkürlich ausgewählte Zahl darstellen läßt. Die Zahl lautet hier 502. Der Polymorphismus ist geeignet in zwei Feldern (Polymorphismus A und B) insgesamt 13 Banden darzustellen. Hier werden Bandenpositionen aus beiden Feldern dazu benutzt, die notwendigen drei 4-Bandenfelder zu erstellen.

Eine weitere Erhöhung der Übersichtlichkeit und Vereinfachung der Darstellung läßt sich durch ein echtes dekadisches Zahlensystem erreichen. Dieses ist in Abb. 4 dargestellt. Für die Darstellung einer Zahl von 1 bis 10 wird in der Gelelektrophorese oder in einem anderen Auswertesystem ein Informationsfeld mit jeweils zehn Positionen für Banden (oder Spots) benötigt. Zur Darstellung beispielsweise der Ziffer 5 erfolgt die Belegung der Position 5 durch eine Bande, bei Darstellung einer 0 ist die nullte Position besetzt, und die 2 wird durch Besetzung der Bandenposition 2 erreicht. Die Bandenpositionen für eine dreistellige Zahl können wie folgt verteilt sein (Beispiel):

1. Stelle: 100 bis 140 bp Klasse 1
2. Stelle: 160 bis 200 bp Klasse 2
3. Stelle: 220 bis 260 bp Klasse 3

Auch hier gilt wiederum, daß ein Zuwachs an Übersichtlichkeit einen erhöhten Bedarf an DNA-Klonen erfordert. Pro Stelle einer dekadischen Zahl werden 10 DNA-Klone, zur Darstellung aller Zahlen von 0 bis 10 000 werden 40 Klone benötigt. Vorteilhaft ist, daß zur Darstellung jeder Zahl in der genannten Größenordnung nur 4 Klone tatsächlich eingesetzt werden. Deshalb ist dieses System zu bevorzugen, wenn eine uniklonale Verschlüsselung angewandt werden soll (siehe unten). Die Abb. 4 zeigt wiederum die Verschlüsselung der Zahl 502, verbunden mit einem Prüfcode.

II-2. Codierung von Zahlen innerhalb eines DNA-Moleküls (uniklonale Zahlencodierung)

Die Mischung von DNA Molekülen mit unterschiedlicher Einzelinformation zur Erstellung einer Gesamtinformation (z. B. eine mehrstellige Zahl als Strichcode) wie unter II-1 beschrieben, ist nur dort praktikabel, wo sichergestellt ist, daß das Ensemble der Nukleinsäureklone, welche die gewünschte Information ja nur in ihrer Gesamtheit repräsentieren, vom Zeitpunkt der Mischung bis zur Darstellung der Zahl weder durch Beimischung anderer Informationen noch durch Verlust von Einzelkomponenten verändert werden kann. Solche Probleme würden aber entstehen, wenn z. B. das Auftreten von gezeichneten Produkten im Abwasser überwacht werden sollen, oder wenn die Mischung von unterschiedlich numerierten Produkten gewollt oder ungewollt stattfinden könnte. Zur inneren Codierung solcher Produkte oder Abprodukte muß die gesamte Information in einem Molekül codiert sein. Nur so kann gewährleistet werden, daß alle Ausgangsinformationen wiedergewonnen werden können und nicht durch Beimischung anderer Informationen oder Ausdünnung von Komponenten verfälscht werden.

Nachteilig ist die geringere Flexibilität eines solchen Systems: Während sich bei der polyklonalen Codierung von Zahlen im dualen System durch Mischen der Moleküle aus einem Ensemble von 16 Klonen jede Zahl von 1 bis 65 536 darstellen läßt (im dekadischen System werden für die Darstellung von Zahlen von 0 bis 9999 vierzig Klone benötigt), muß bei der uniklonaren Verschlüsselung einer Zahl für jede gewünschte Zahl ein spezieller Klon konstruiert werden. Polyklonale Zahlen lassen sich bei Bedarf mit relativ geringem technischen Aufwand mischen. Die Verschlüsselung einer mehrstelligen Zahl in einem Molekül erfordert für jede Zahl extra einen gentechnischen Arbeitsprozeß. Dieser Aufwand ist jedoch berechtigt, wenn eine dauerhafte Nummer vergeben werden soll (z. B. einer Lizenznummer von einem Patentinhaber oder von einer Aufsichtsbehörde an den Hersteller eines Produktes, das gezeichnet werden soll; Betriebsnummer eines Tankers usw.)

Die Codierung von DNA-Molekülen mit mehrstelligen Zahlen erfolgt vorteilhaft unter Nutzung des dekadischen Zahlensystems, ist aber auch mit anderen Zahlensystemen möglich.

Einer der möglichen Wege zur Konstruktion eines solchen Codes verläuft in folgenden Schritten:

• 1. DNA Fragmente unterschiedlicher Länge (z. B. Amplifikate der Allele von STRs oder künstliche Produkte) werden durch die entsprechenden Primer einzeln generiert.
  Will man 4-stellige Zahlen etablieren, so muß ein Reservoir von 40 unterschiedlichen Produkten geschaffen werden.
• 2. Die vorhandenen PCR-Produkte werden reamplifiziert mit Primern, die in 5′Richtung um 10 Basen (oder mehr) länger sind. In dem "Überhang" dieser Primer ist jeweils ein Restriktionsort codiert.
• 3. Von den Überhangprimern werden vier Typen synthetisiert, die sich jeweils durch den Schnittort im "Überhang" unterscheiden. Die Schnittsequenzen in unserem Beispiel sind geeignet für Bam HI, Kpn I, Hind III und Bgl II im R-Primer (Enzyme mit gleicher Größe des Erkennungsortes und gleicher Schnittsymmetrie) und Taq I, Msp I, Mae I und Mae II (wiederum Enzyme mit gleicher Größe des Erkennungsortes und gleicher Schnittsymmetrie) im V-Primer.

Von den vorhandenen 40 PCR-Produkten unterschiedlicher Länge werden je zehn Fragmente wie folgt reamplifiziert:

10 Fragmente der Größenklasse 1, die zur Besetzung der 1. Stelle unserer Zahl (0.000 bis 9.000) geeignet sind. Der R-Primer enthält einen Bam HI Ort, der V-Primer enthält einen Taq I-Ort (Zifferfragment I).
10 Fragmente der Größenklasse 2, die zur Besetzung der 2. Stelle unserer Zahl (000 bis 900) geeignet sind. Der R-Primer enthält einen Bgl II-Ort, der V-Primer beherbergt einen Msp I-Ort (Zifferfragment II).
10 Fragmente der Größenklasse 3, die zur Besetzung der 3. Stelle unserer Zahl (00 bis 90) geeignet sind. Der R-Primer enthält einen Hind III Ort, der V-Primer enthält einen Mae I-Ort (Zifferfragment III).
10 Fragmente der Größenklasse 4, die zur Besetzung der 4. Stelle unserer Zahl (0 bis 9) geeignet sind. Der R-Primer enthält einen Kpn I Ort, der V-Primer beherbergt einen Mae II-Ort (Zifferfragment IV).
Alle Ziffernfragmente (ZF) werden mit dem passenden Restriktionsenzym im Doppelverdau geschnitten (Bam HI + Taq I; Bgl II + Msp I; Hind III + Mae I; . , Kpn I + Mae II). Die Mikrofragmente werden abgetrennt und verworfen.

In gleicher Weise werden 5 Joiningfragmente (JF) von ca. 700 bp generiert, die alle im Mittelteil eine übereinstimmende Sequenz besitzen, an den Enden aber komplementäre Schnittsequenzen zu den Serien der Zifferfragmente bzw. zum Klonierungsvektor aufweisen.

Alle Joiningfragmente werden mit den passenden Restriktionsenzymen geschnitten. Die an den Enden abgeschnittenen Mikrofragmente werden abgetrennt und verworfen.

Zur Erstellung einer vierstelligen Zahl werden die passenden vier Zifferfragmente, welche die Stellen der vierstelligen Zahl besetzen, ausgewählt und mit dem jeweils komplementären Joiningfragmenten ligiert.

Folgende Ligationen werden realisiert:

Vector-(JF1)-(ZFI)-(JF2)-(ZFII)-(JF3)-(ZFIII)-(JF4)-(ZFIV)-(JF5)-Vec-tor

Die Reihenfolge der Schnitt- bzw. Ligationsorte ist:

Vector-Eco RI-JF-Taq I-ZF-Bam H I-JF-Msp I-ZF-Bgl II- JF-Mae I-ZF- Hind III-JF-Mae II ZF Kpn I-JF-SmaI-Vector

Zur Bildung einer 4-stelligen Zahl werden die sinnentsprechend ausgewählten ZFs der Klassen 1 bis 4 unter Zuhilfenahme der JFs so ligiert, das in jeder Klasse (Stelle) die gewollte Ziffernposition besetzt wird. Das entstandene Plasmid, mit der Information für eine vierstellige Zahl, wird dann in üblicher Weise in E. coli amplifiziert.

Lesen der Zahl:
Die Darstellung aller Ziffern erfolgt parallel in einem einzigen PCR-Ansatz. Die Primer sind so synthetisiert, daß sie Zf-flankierend in den JFs annealen. Bei Wahl niedriger Extensionszeiten ist die JF- und ZF-überspringende Amplifikation so ineffektiv, daß sie die gewünschte Amplifikation der ZF nicht stört.

Ein Beispiel für eine kodierte Zahl (502) ist im Zusammenhang der Darstellung dekadischer Zahlen gegeben.

III. Auswerttechniken für Nukleinsäurecodes

Das hier beschriebene Codierungssystem eignet sich prinzipiell zur Darstellung eines internen Nukleinsäure-Codes in allen elektrophoretischen Systemen. Besonders effektiv einsetzbar ist es jedoch bei Analysen in Genscannern, in denen fluorescenzprimer- markierte PCR-Produkte analysiert werden. Je nach Fragestellung können die Anwendungen unterschiedlich gestaltet sein. In solchen Systemen, die unterschiedliche Farbmarkierungen auswerten können, kann man z. B. gelb (=Tamra) für die interne Probennumerierung reservieren, während als Fragmentgrößenstandard rot (=Rox) und für die Hauptuntersuchung grün (=Fam) und blau (=Hex) markierte Primer in Frage kommen.

Die Erstellung einer Mischung der geklonten Moleküle, um den Code erfindungsgemäß zu ermöglichen, sollte in einem computergesteuerten Produktionsprozeß erfolgen, da sonst menschliches Versagen zu einer Fehlmischung der Komponenten führen könnte. Dabei ist es empfehlenswert, das erfindungsgemäße Ensemble der Code-realisierenden Moleküle auf teststreifen-analogen Trägern zu applizieren, die dann für die spätere Einführung in das Probengefäß vorgesehen sind oder die auch direkt als Träger für Trockenblutproben in Frage kommen. Verwendet man das hier für die duale Codierung als Beispiel angeführte System mit einem Informationsgehalt von insgesamt 20 Bit, wird die jeweils aktuelle Information in entsprechender Weise durch eine Auswahl aus einem Sortiment von 20 Plasmidsuspensionen ausgewählt und appliziert. Bringt man die einzelnen Lösungen entsprechend der ihnen innewohnenden Information auf dem Streifen in der gleichen Reihenfolge an, wie sie später auch nach Amplifikation und Elektrophorese auftritt (wie in Fig. 2 dargestellt), so stellt sich der zutreffende Strichcode auf dem Streifen dar. Eine Visualisierung durch Beimischung eines unschädlichen Farbstoffes ist problemlos möglich. Dadurch wird der Code auch direkt oder mit handelsüblichen Strichcodescannern lesbar.

IV. Erstellung von Strichcodes oder Dotcodes durch Mischungen von Molekülen unterschiedlicher Sequenz

Neben der Möglichkeit, für die Codierung von Zahlen ein längenvariables DNA-Informationssystem einzusetzen, können Zahlen auch durch sequenzvariable DNA-Informationssysteme dargestellt werden. Kloniert man in einem gleichen Vektor 8 Sequenzen unterschiedlicher Herkunft, so läßt sich wiederum durch geeignete Mischung der Komponenten dieses Systems ein Informationsgehalt (im Sinne des hier angestrebten Numerierungssystems) von 8 Bit sehr einfach verschlüsseln. Die Amplifikation des Systems erfolgt, wie für die längenvariable Codierungssysteme beschrieben, wobei allerdings die Primer so markiert sein müssen, daß die PCR Produkte nach Einsatz zur Hybridisierung durch eine der bekannten nichtradioaktiven Detektierungsmethoden erkannt werden können. Die Detektierung des Strichcodes gelingt für dieses System mit Teststreifen, auf denen für jede der Sequenzen an festgelegter Position eine homologe Sequenz gebunden ist. Die auf dem Teststreifen gebundenen homologen Sequenzen sind linear angeordnet, so daß sich aus positivem Hybridisierungsergebnis (+) und negativem Hybridisierungsergebnis (-) eine duale Zahlenreihe ergibt.

Strichcodes oder Dotcodes durch Mischungen von Molekülen unterschiedlicher Sequenz lassen sich uniklonal und polyklonal erstellen (Vergleiche oben).

V. Applikationsformen

Die Applikation der Lösungen auf dem Trägerstreifen im Strichcode-Modus kann unter Zuhilfenahme von tintenstrahldruckerartigen Geräten erfolgen. Solche Verfahren sind in einem anderen Zusammenhang beschrieben (EP 40 24 545 A1). Nach Applikation der Nukleinsäurecodierung auf dem Träger muß diese versiegelt werden. Es bietet sich dafür eine Proteinase-K-verdaubare Proteinbeschichtung (Gelatine) an. Eine andere Möglichkeit besteht darin, Proberöhrchen für Blutentnahmen etc. von vornherein schon im Produktionsprozeß äußerlich und intern zu numerieren. Für die Anwendung der Kodierungslösungen in anderen Bereichen läßt sich jede andere Art der Konfektionierung vorstellen, z. B. Abfüllung in Tabletten oder Kapseln, Ampullen, Flaschen, Injektionsspritzen usw.

VI. Innere Numerierung durch Einsatz von Partikeln

Eine innere Kennzeichnung von Proben und Produkten durch Beimischung von Partikeln ist bekannt. Für eine innere Numerierung gibt es jedoch bisher kein Verfahren und keine Mittel.

Das hier vorgestellte Verfahren gleicht dem Vorgehen der Numerierung mit polyklonalen Nukleinsäuren:
So wie bei der polyklonalen DNA-Codierung zur Darstellung einer (beispielsweise) 3-stelligen dekadischen Zahl drei Nucleinsäurefragmente hinzugefügt werden, die jeweils innerhalb ihrer Größenklasse eine von 10 möglichen Positionen besetzen und somit in jeder Stelle die Ziffern 0 bis 9 symbolisieren, so gehören bei der Darstellung der Zahlen durch Partikelzufügung analog die Partikel drei Klassen an, in welcher jeweils 10 Positionen (Ziffern) von 0 bis 9 zu besetzen sind.

Numerierung in dieser Weise ist möglich durch Zufügung von künstlich produzierten Strukturen wie Latex-, Styropor-, Nylon-, Polyacrylamidpartikel usw. Es können aber auch natürliche Resourcen wie Sporen und Pollen als Informationsträger genutzt werden. Für ein solches Verfahren soll hier ein Beispiel gegeben werden: Selbstverständlich lassen sich sowohl die Klassen als auch die Species anders auswählen, wodurch eine ungeheure Vielfalt möglich ist. Zusätzlich sind auch hier wiederum andere Zahlensysteme als das dekadische möglich.

In unserem Beispiel wird
die 1 Klasse 000 bis 900 mit Pilzsporen
die 2 Klasse 00 bis 90 mit Pollen
die 3 Klasse 0 bis 9 mit Farn-, Moos- oder Bärlappsporen
etabliert.

Nur für das Beispiel der 1. Klasse ist exemplarisch eine vollständige Besetzung beschrieben, für die 2. und 3. Klasse mag eine verkürzte Darstellung genügen.

In diesem Numerierungssystem kann beispielsweise die Zahl 502 durch die Sporen- und Pollenkombination Reizker-Haselnuß-Nestfarn erstellt werden.

Die Auswertung eines solchen Zahlensystems erfolgt mikroskopisch unter Verwendung von Vergleichspräparaten und Bildtafeln.

Claims (10)

1. Nukleinsäuren, die zur internen Kennzeichnung von medizinischen, biologischen und chemischen Proben sowie von Produkten verschiedenster anderer Art eingesetzt werden können, gekennzeichnet dadurch, daß sie durch die Zusammenstellung eines Emsembles von Molekülen die Information für die Darstellung von Zahlen beinhalten.

2. Nukleinsäurekonstrukte, die zur internen Kennzeichnung von medizinischen, biologischen und chemischen Proben sowie von Produkten verschiedenster anderer Art eingesetzt werden können, gekennzeichnet dadurch, daß innerhalb eines Moleküls multiple Bindungsstellen für ein Primerpaar oder mehrere Primerpaare vorhanden sind, deren Anordnung so organisiert ist, daß sie die Möglichkeit zur Amplifikation eines Ensembles von Molekülen ermöglichen, die dann zur Darstellung von Zahlencodes genutzt werden.

3. Nukleinsäuren nach Anspruch 1 und 2, die als Templates zur Amplifizierung eines Gemisches von Molekülen unterschiedlicher Länge dienen, welches bei Auftrennung in der Elektrophorese einen Strichcode bildet.

4. Nukleinsäuren nach Anspruch 1 bis 2, die als Templates zur Amplifizierung eines Gemisches von Molekülen unterschiedlicher Sequenz dienen, welches bei Hybridisierung auf ein in regelmäßiger Reihenfolge angebrachtes, trägergebundenes Sortiment von DNA Spots einen Zahlencode realisiert.

5. Nukleinsäuren nach Anspruch 1-4, die sowohl als freie Moleküle, als auch als an Träger gebundene Moleküle, oder als in Vektoren wie Plasmide, Phagen, Hefen oder anderer Organismen integrierte Signalstoffe eingesetzt werden können.

6. Teststreifen oder Testblätter als Träger von Nukleinsäuresortimenten gemäß Anspruch 1, welche so gestaltet sind, daß sie entweder einer Probe beigefügt werden können oder daß sie selbst geeignet sind, eine Probe aufzunehmen, wobei erreicht wird, daß die Probe oder ein Produkt mit der inneren Codierung beimpft wird.

7. Innerlich gezeichnete Gefäße und/oder Materialien, die zur Aufnahme von Proben geeignet sind, gekennzeichnet dadurch, daß sie mit Nukleinsäuregemischen oder -Konstrukten gemäß Anspruch 1 markiert sind, in der Art, daß beim Füllen der Gefäße mit dem vorgesehenen Gut die Signalmoleküle in das Füllgut eindringen und diese somit markieren.

8. Verfahren der Kennzeichnung von Waren und Proben durch Zufügung von molekular codierten Nummern.

9. Sortimente von Partikeln natürlicher oder künstlicher Herkunft, die zur internen Kennzeichnung von medizinischen, biologischen und chemischen Proben sowie von Produkten verschiedenster Art eingesetzt werden können, gekennzeichnet dadurch, daß durch die Zusammenstellung des Partikelensembles die Information für die Darstellung von Zahlen gegeben wird.

10. Verfahren der inneren Kennzeichnung von Waren und Proben durch Zufügung von Nummern, die durch die Zusammenstellung eines Ensembles von Partikeln nach Anspruch 9 codiert sind.