CN109082389B - 一种兼具生物肥料与生物农药潜力的土壤链霉菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种兼具生物肥料与生物农药潜力的土壤链霉菌，属于微生物技术领域，链霉菌的分类命名为链霉菌(Stretomyces costaricanus)CP99，其保藏编号为GDMCC No.60404；保藏日为2018年07月03日。链霉菌CP99对植物真菌性病害包括鎌孢菌属(如黄瓜枯萎病菌、西瓜蔓割病菌)、疫霉属(木瓜疫病)腐霉病菌(Pythiumaphanidermatum)立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)有较好的抑制效果，并能够降低根节线虫的卵孵化率及减少作物根节线虫的危害程度。其促进根系生长效果佳，且并非由于IAA的产生造成的，而是因为其含有未知的促进根系生长因子。该菌极具开发为生物农药(包括生长调节剂及生物防治)的潜能。

Description

一种兼具生物肥料与生物农药潜力的土壤链霉菌
技术领域
本发明涉及一种土壤链霉菌，特别涉及一种兼具生物肥料与生物农药潜力的土壤链霉菌，该土壤链霉菌兼具促进植物根系生长、植株长势及防治植物土传真菌病害与线虫病害的效果，属于微生物技术领域。
背景技术
引起植物生病的生物性原因包括四大病原：真菌、细菌、线虫、病毒。其中，真菌性病害的种类最多，当中严重者包括：镰孢菌属(Fusarium spp.)引起的土传性病害如瓜类的枯萎病，根腐病，香蕉黄叶病等；腐霉菌属(Pythium spp.)引起的木瓜疫病；立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等。线虫病害则因其寄主范围广、躲藏于植物体或土壤团块当中等生态特点，造成防治上的困难，过往使用高毒的土壤薫蒸剂或直接灌施化学农药，但仍然造成全球严重的经济损失，并且纳入重要的农产品贸易检疫病害中：如胞囊线虫、黄金线虫、茎腐线虫等。
最近，食品安全与生态保育的意识越来越重，化学农药长期不当使用，往往破坏生态平衡、污染环境及造成病原菌的抗药性，导致农产品农药残留超标等严重后果；进一步的累积在大气、土壤和水源中，造成持续性的恶性循环。
近来年，以微生物资源开发为农业可用的微生物肥料与微生物农药是极具前瞻性的研究目标，最终应以工艺简单、生产快速、成本低廉、健康环保、功效稳定为重要指标。
抗生素在过往滥用的历史中，病原微生物与害虫己发展出抗药性，农产品抗生素过量，影响生态與人体健康等重大问题。国家政策亦逐渐关注抗生素的应用。
因此，以微生物开发为兼具抗生物质(抗生素)、分解酶、促长因子的生物农药是一个具前瞻性的重要方向，药/肥同源的时代己经来临。该生物农药除含有有效成份外，还包含菌体，应用在农业生产中，能够不污染环境，不造成人畜安全疑虑，易于被微生物分解等优点。如全球70％的抗生素由链霉菌属分离开发，包括抗真菌、细菌及杀虫效果。链霉菌属同时兼具产生多种分解酶，並协助增加其防病效果，如几丁质分解酶能增加对真菌与线虫的抑制。
植物根圈土壤是一个复杂而多样的生态体系，此处具有许多不同的益菌与病菌，在此环境体系中，能够获得具有拮抗病原菌能力的微生物，且往往具有高效拮抗能力。微生物的资源并不限制其来自何处，即便是同属的同种菌，但是不同菌株之间，仍可能存在高度的差异性。这些差异包括了各种抗生素、分解酶的产生种类与分泌浓度。
因此，选择适当的材料与筛选方法，是开发微生物农药的关键之一。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种兼具促进植物根系生长、植物长势及防治植物土传真菌病害与线虫病害效果的土壤链霉菌。该菌株对真菌性病原菌包括镰孢菌属 (Fusariumspp.)如黄瓜枯萎病菌、西瓜蔓割病菌、疫霉菌属(Phytophthora spp.)如西红柿晚疫病、马铃薯晚疫病；腐霉菌属(Pythium spp.)引起的木瓜疫病、立枯丝核菌 (R.solani)等多种病原菌具有明显的抑制作用及降低植物寄生性土壤线虫：根节线虫、胞囊线虫、柑橘线虫、根腐线虫等危害严重程度，具开发为生物农药(包括生长调节剂及生物防治)的潜能。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种兼具生物肥料与生物农药潜力的土壤链霉菌，其特征在于：所述链霉菌的分类命名为链霉菌(Stretomyces costaricanus)CP99，其保藏编号为GDMCC No.60404；保藏日为2018年07月03日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州巿先烈中路100号大院59号楼，广东省微生物菌种保藏中心。
本发明的另一目的是提供一种上述土壤链霉菌在抑制真菌性病原菌中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99在抑制真菌性病原菌中的应用。
优选地，所述真菌性病原菌包括镰孢菌属(Fusarium spp.)、腐霉菌属(Pythiumspp.)、立枯丝核菌(R.solani)等。
优选地，所述镰孢菌属(Fusarium spp.)包括黄瓜枯萎病菌和西瓜蔓割病菌。
优选地，所述腐霉菌属为木瓜疫病(P.aphanidermatum)。
本发明的另一目的是提供一种上述土壤链霉菌在降低植物寄生性土壤线虫中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99在降低植物寄生性土壤线虫中的应用。
优选地，所述植物寄生性土壤线虫为根节线虫、胞囊线虫、柑橘线虫或根腐线虫。
本发明的另一目的是提供一种上述土壤链霉菌在促进植株生长与根系生长上应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99在促进植株生长与根系生长上的应用。
优选地，所述应用包括在土壤种植、无土种植与水培种植系统中的应用。
优选地，所述应用中链霉菌CP99能促进植株生长及增加根系生长，但不产生或产生极低量的IAA物质。
本发明的再一目的是提供所述的链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99在制备生物农药中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99在制备生物农药中的应用，所述链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99制备成发酵原液，稀释后即得土壤链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99生物农药。
优选地，所述稀释为100-500倍。
优选地，所述链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99发酵原液和生物肥料与生物刺激素以任意比例混合使用。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：
(1)本发明提供的土壤链霉菌为链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99，分离自广东省线虫病害危害严重的西红柿根系与根圈土壤中，此类菌虽被披露使用在各种农业应用上，但同时兼具防治植物真菌性病害及线虫危害的防治未见报导。
(2)本发明的链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99的发酵原液对多种植物病原真菌具有抑菌活性，对根节线虫孵化率有显着降低的功效。与目前所用的化学杀菌剂及化学杀线虫剂相比，具有安全高效，低毒无残留，无污染和不易产生抗药性的特征。
(3)链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99对镰孢菌属(Fusarium spp.)如黄瓜枯萎病菌、西瓜蔓割病菌、腐霉菌属(木瓜疫病P.aphanidermatum)、立枯丝核菌(R.solani)均具有较好的抑制效果。
(4)链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99易于培养，其发酵产物储存稳定性高，具有促进植物根系生长的效果，活菌存活时间长，因此，被开发为生物防菌制剂，在农业种植的植物病原菌防治与线虫防治方面具有很大潜力。
下面通过附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。应该理解的是，所述的实施例仅仅涉及本发明的优选实施方案，在不脱离本发明的精神和范围情况下，各种成分及含量的变化和改进都是可能的。
附图说明
图1为本发明链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99在无机盐淀粉琼脂培养基上的培养特征。
图2为本发明链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99在光学显微镜下，以物镜40倍，目镜10倍观察到的菌丝和孢子丝的特征。
图3为IAA标准曲线。
具体实施方式
实施例1：链霉菌CP99的分离
一、土壤链霉菌的分离培养
1、生物材料及培养基：从广东省中山巿坦洲区一发病严重的西红柿田中，取样诊断后，发现其根节线虫危害严重，且维管束黄化，经柯赫准则后确定为镰孢菌引起的西红柿萎凋病及根节线虫共同危害，将采集的植物根系与根圈土壤进行菌种分离，获得样品；分离培养基均以马铃薯蔗糖培养基，成分如下：马铃薯：200g，蔗糖：20g，琼脂：17g，过滤水：1000ml；
2、样品处理：取1g样品，放入9mL的无菌水中，剧烈摇动后静置10min，再将样品1:10稀释，取100μL稀释液，均匀涂布于分离培养基平板(马铃薯：200g，蔗糖： 20g，琼脂：17g，过滤水：1000ml)上；20-40℃，培养1-5周，待微生物长出，挑取具有抑菌能力菌落转接纯化，纯化培养的菌株再接种到含分离培养基(马铃薯： 200g，蔗糖：20g，琼脂：17g，过滤水：1000ml)的试管中培养，然后放于4℃冰箱保存备用；
3、放线菌培养：挑取分离培养基上生长的单菌落进行转接纯化，根据菌株的形态特征和培养特征，去除重复的菌株，最后共计分离获得185株拮抗微生物，其中放线菌菌株为38株，对已纯化的菌株，接种马铃薯蔗糖培养基斜面培养基(马铃薯：200g，蔗糖：20g，琼脂：17g，过滤水：1000ml)中，于20-40℃恒温培养箱中培养5～7天后，获得土壤放线菌，置于4℃冰箱保存备用；
二、土壤链霉菌拮抗菌株的筛选
1、指示菌平板的制备
从发病的黄瓜植株、西瓜植株和木瓜果实及小白菜幼苗上分离并保存：黄瓜枯萎病菌、西瓜蔓割病菌、木瓜疫病菌和立枯丝核菌，将保存的上述病菌转接于PSA 培养基(配制方法为：称取新鲜去皮的马铃薯200g，切碎加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤，取滤液定容至1000mL，再加20g蔗糖和17g琼脂，加热充分溶解后，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121℃，高压灭菌20min)平板上，置于28℃的微生物培养箱培养3-5天，利用打孔器制备成直径5mm的菌丝块，放置在马铃薯蔗糖平板培养基的中间,进行对峙培养。
2、具抑制活性菌株的筛选
将步骤一中分离获得的土壤放线菌接种于马铃薯蔗糖培养基(配制方法为：称取新鲜去皮的马铃薯200g，切碎加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤，取滤液定容至1000mL，再加20g蔗糖和17g琼脂)平板上，30℃培养5天后，调整放射线菌接种源，使其浓度为约108cfu/ml，将8mm的纸盘(paper disc)置于接种有指示菌的马铃薯蔗糖平板培养基的两侧边缘，取50μl孢子悬浮液滴在8mm的纸盘(paper disc)中，然后于28-30℃的微生物培养箱培养，48-96小时后，观察周围透明抑菌圈的有无和大小，据此判定放线菌的拮抗活性；具体如下：
链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99对各种真菌的抑菌效果：
(1)、供试菌株及培养基：供试植物病原真菌包括黄瓜枯萎病菌、西瓜蔓割病菌、木瓜疫病菌、立枯丝核菌；用于植物病原真菌培养所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PSA)培养基，其具体配方如实施例1中步骤二中所述；
(2)、供试菌株的活化：将PSA培养基分别加热溶解后，倒入直径为9cm的无菌培养皿中，制备得到培养基平板；用无菌接种针挑取保存于4℃冰箱斜面培养基中的各真菌的菌块，接种于PSA培养基平板上，置于28℃恒温培养箱中培养活化，分别得到活化好的黄瓜枯萎病菌、西瓜蔓割病菌、木瓜疫病菌、立枯丝核菌；
(3)、抑菌活性的测定：取下面实施例2中获得的链霉菌(Streptomycescostaricanus)CP99的发酵液，用移液器吸取50μl发酵液，滴在8mm纸盘(paper disc) 于直径9cm PSA平板培养基；将上述活化好的黄瓜枯萎病菌、西瓜蔓割病菌、木瓜疫病菌、立枯丝核菌，用直径5mm的打孔器打取菌块，置于平板的中央，以无菌水作对照，重复3次，接种后将平板置于28-30℃恒温培养箱培养2-4天，量取抑制圈大小，计算抑制率，菌丝生长抑制率(％)＝[1-(处理菌落直径-菌饼直径)/(对照菌落直径- 菌饼直径)]×100。
试验结果见表1：链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99发酵液对植物病原菌的抑制率，从表1可以看出：链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99发酵液对黄瓜枯萎病菌、西瓜蔓割病菌、木瓜疫病菌、立枯丝核菌4种病原菌的抑制率均在64％以上，效果显着。
表1
植物病原菌 实验组生长直径(mm) 对照组生长直径(mm) 抑制率
黄瓜枯萎病菌 13.35 40.25 67％
西瓜蔓割病菌 14.35 42.8 66％
木瓜疫病菌 9.6 43.5 78％
立枯丝核菌 15.5 43.5 64％
通过以上方法，从分离获得的38株土壤放线菌中筛选出1株对黄瓜枯萎病菌、西瓜蔓割病菌、木瓜疫病)、立枯丝核菌均有较强抑制活性的菌株，将其命名为链霉菌CP99。
链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99分离自广东省线虫病害危害严重的西红柿根系与根圈土壤中，该菌株为第185株菌中的第99号，所以编号为CP99。该菌株的培养特征、形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列和菌种分类结果如下：
1、链霉菌CP99的培养和形态特征：链霉菌CP99在供试的6种培养基上生长情况见表2，所使用的6种培养基上均可生长，除在蔗糖硝酸盐琼脂上无气生菌丝体产生，在其余5种培养基上均有白色、灰褐色的气生菌丝体产生；链霉菌CP99在可生长的6 种培养基上基质菌丝体有黄色、黄褐色、及灰白色，而在6种培养基中均无可溶性色素产生。链霉菌CP99用插片培养法观察，其孢子丝1-3圈紧密螺旋形，孢子呈球形、卵圆形、长圆形；具体见下表2：菌株的培养特征。
表2
培养基 气生菌丝体 基质菌丝体 可溶性色素
甘油天冬素琼脂 白色,灰褐色 黄褐色 无
无机盐淀粉琼脂 白色,灰褐色 黄褐色 无
酵母精麦芽精琼脂 白色,灰褐色 黄色,略带褐色 无
燕麦粉琼脂 灰褐色 灰白色 无
蔗糖硝酸盐培养基 不产气生丝 灰白色 无
葡萄糖天冬素琼脂 白色,灰褐色 黄色,略带褐色 无
2、链霉菌CP99的生理生化特征：链霉菌CP99可使淀粉水解、牛奶凝固胨化和硝酸盐还原，不使明胶液化，不产生H2S和黑色素，具体见下表3：链霉菌CP99的生理生化特性。
表3
生理生化试验 结果 生理生化试验 结果
明胶液化 — H2S —
淀粉水解 + 黑色素的产生 —
牛奶的凝固与胨化 凝固并且胨化 硝酸盐还原 +
其中，如图1所示，为本发明链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99在无机盐淀粉琼脂培养基上的培养特征。
如图2所示，为本发明链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99在光学显微镜下，物镜40倍，目镜10倍下观察到的菌丝和孢子丝的特征。
3、链霉菌CP99的16S rDNA序列：将链霉菌CP99的16S rDNA的序列与美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上进行Blast比对分析发现，所测序列与G e n b a n k中链霉菌属的多个种均具有较高的同源性，其中与Streptomyces costaricanus具有最高同源性，其序列相似性达100％；
链霉菌CP99的16S rDNA序列(如序列表中序列1所示)：
CTCCCACAAGGGGTTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGG TGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGAC TTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTC ACGGTATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGA TGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCTCCCGTGAGTCCCCAGCACC ACAAGGGCCTGCTGGCAACACGGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCA CGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGGGGCACTATCTCTAA TGCTTTCCGGTGTATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCC GCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGG GAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACCGACGACGTGGAATGTCGCCAACACCTAGTTCCCACCGTTT ACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTA ATGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCA GGAATTCCGATCTCCCCTACCACACTCTAGCTAGCCCGTATCGACTGCAGACTCGGGGTTAAGCCC CGAGCTTTCACAATCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACG CTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCG TCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGT CGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCC GTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCC ATTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTGCACCGCCGGAGCTTTACACCATCAA GGATGCCCAAGATGGTCATATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGCAGGGC AGATTGCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCACCCCGAAGGGCTTCA
4、菌种分类结果：根据链霉菌CP99的形态特征、培养特征、生理生化特征及16SrDNA序列，将链霉菌CP99鉴定为Streptomyces costaricanus。
保藏信息：
链霉菌(Stretomyces costaricanus)菌株的分类命名为链霉菌(Stretomycescostaricanus)CP99，其保藏编号为GDMCC No.60404，保藏日为2018年07月03日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州巿先烈中路100号大院 59号楼。
实施例2：链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99发酵液的制备
1、菌株的活化培养：将分离保存的链霉菌CP99移至马铃薯蔗糖平板培养基(马铃薯：200g，蔗糖：20g，琼脂：17g，过滤水：1000ml)上于30℃培养箱培养5天；
2、菌株的发酵培养：取马铃薯蔗糖平板培养基上活化的链霉菌CP99，接种到马铃薯蔗糖液态培养基中(100mL培养基/250mL锥形瓶，配方：马铃薯：200g，蔗糖：20g，过滤水：1000ml)中，30℃下摇床180rpm/min振荡培养5天，得链霉菌 (Streptomycescostaricanus)CP99发酵液。
应用实施例1：链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99发酵液促进水培小白菜与福山莴苣根系生长及增产最佳的稀释倍数
1.将实施例2制备的链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99发酵液，以100、300、500倍稀释，添加至水耕栽培系统中，并添加霍格兰氏(Hoagland’s)营养液配方，其EC值为2.0-2.3、pH在6.2-7.1之间、DO值4.8-5.8、温度22-28℃；栽培28-38 天后，收取称重；结果显示：小白菜在稀释500倍时有最佳的单株重及根系，福山莴苣则在300倍稀释时，有最佳的单株重及根重；过程中仅添加一次；见表4：链霉菌CP99对两种蔬菜之生长影响。
表4
Figure BDA0001743319740000081
应用实施例2：链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99发酵液促进水培日本小松菜与大将莴苣根系生长及增产效果与比较配合叶面肥的使用的效果
1.分别以空白对照组、发酵液500倍稀释以及发酵液500倍+NPK为3-3-3的叶面复合肥200倍处理，观察链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99发酵液促进水培日本小松菜与大将莴苣根系生长及增产效果与比较配合叶面肥的使用的效果，其种植条件与应用实施例1相同，结果如下表5所示：
2.如表5所示：链霉菌CP99发酵液500倍及喷施叶面肥对日本小松及大将莴苣之影响，在添加500倍发酵液的处理组，单株重比空白对照分别增加52％及81％；而添加500倍发酵液再进行NPK为3-3-3的叶面复合肥200倍处理组，其增重比为51％及 74％，与单纯添加500倍发酵液的处理组并无显着的差异；说明，单纯使用链霉菌 (Streptomycescostaricanus)CP99发酵液在水培系统中各营养元素充足的情况下，能够起到促进根系生长及增加营养吸收的效果，且效果不比叶面吸收差。
表5
Figure BDA0001743319740000091
应用实施例3：链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99发酵液对根节线虫的孵化率之影响：
依上述方式制备发酵，将培养液稀释50倍，浸泡根节线虫卵块，以水做为对照组，每处理有八个重复测试，每个重复测试进行五次重复试验，于室温下进行，五天后，将已孵化的二龄幼虫回接至黄瓜植株，每株100只，观察二龄幼虫侵入根系能力是否受到影响。
结果如下表6链霉菌(Streptomyces costaricanus)CP99发酵液对对根节线虫的孵化率及入侵能力之影响所示：
表6：
Figure BDA0001743319740000092
注：Galling index：指根瘤指数，并以以下四个标准分别代表0＝(没有影响)，1＝1-15％，2＝16-30％，3＝31-50％，4＝51-100％；
Disease incidence：病害指数(％)＝【Σ(指根瘤指数*指根瘤数)/(植株总数)*(最大的根瘤指数)】*100％。
从表6可以看出：发酵液处理可降低根节线虫的孵化率，并能降低其二龄幼虫侵黄瓜的能力。
应用实施例4：链霉菌CP99发酵液对各种作物病害的防治效果
利用上述制取发酵液方法，取得发酵液后，稀释50倍-100倍，处理黄瓜枯萎病、西红柿幼苗瘁倒(立枯丝核菌)及木瓜果疫病，黄瓜播种后14天长出真叶后，接种104cfu/ml枯萎病之孢子悬浮液，隔天后，浇灌100倍稀释的链霉菌CP99发酵液，置于温室中，室温为26-30℃，相对湿度为70-90％，每处理20株植物，处理组共进行三次重复试验，西红柿幼苗瘁倒(立枯丝核菌)以72孔穴盘播种，同时接种病原菌及防治菌处理，14天后，计算出土率，木瓜果疫病，以地上部喷施的方式进行，每周一次，共实施五次后，调查果实发病率，结果如下表7所示，以100倍发酵液进行处理可以降低黄瓜枯萎病的发生，增加西红柿幼苗瘁倒(立枯丝核菌)的出土率及降低木瓜果疫病的发生。
表7链霉菌CP99发酵液对不同病害的实际防治效果
黄瓜枯萎病 西红柿幼苗瘁倒 木瓜果疫病
50天后发病率 出土率 发病率
发酵液100倍 20％ 54.2％ 13.0％
水处理 80％ 16.7％ 37.0％
应用实施例5
使用沙尔科夫斯基(Salkowski)试剂对吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA) 反应的专一性测试，此方法所测IAA浓度范围为5-200ppm，操作步骤如下：
1.取链霉菌CP99之孢子悬浮液(浓度为1*108cfu/ml)200μl，接种于含5mM色胺酸的LB液态培养基；
2.无光振荡培养4天后，进行高速离心：10000RPM，10分钟，以0.22μm的小飞碟将菌体及培养液分离，分别得到菌体和不含菌之培养滤液；
3.将不含菌之培养滤液与Salkowski试剂以1:2的体积比例混合，于无光照反应25分钟，得反应液；
4.若产生IAA，则会依浓度呈现深红色至粉红色反应；
5.最后将上述3之反应液以A530nm光电比色计测试其吸收值，对照以IAA标准曲线(IAA：10-100ppm，每10ppm取一间隔，共十标准点)，即可测得链霉菌CP99 的IAA含量。
如图3所示，为IAA标准曲线；10-100ppm，每10ppm取一间隔，共十标准点；区间在0.236-1.501之间。
结果：连续测试链霉菌CP99发酵四天的IAA产生量，均显示其OD值在-0.005 至0.038之间，而所建立的标准曲线区间在0.236-1.501之间，因此，推论链霉菌(Stretomyces costaricanus)CP99是一种不产生或仅产生极少量IAA(吲哚-3-乙酸) 物质，但却能促进植物根系发育与植株生长的放线菌。其促进根系生长效果佳，且并非由于IAA的产生造成的，而是因为其含有未知的促进根系生长因子。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修改，皆应属本发明的涵盖范围。
Figure BDA0001743319740000121
Figure BDA0001743319740000131
Figure BDA0001743319740000141
。
序列表
<110> 广东植物龙生物技术股份有限公司
<120> 一种兼具生物肥料与生物农药潜力的土壤链霉菌
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1371
<212> DNA
<213> 链霉菌CP99(Stretomyces costaricanus)
<400> 1
ctcccacaag gggttgggcc accggcttcg ggtgttaccg actttcgtga cgtgacgggc 60
ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcagcaatg ctgatctgcg attactagcg 120
actccgactt catggggtcg agttgcagac cccaatccga actgagaccg gctttttgag 180
attcgctcca cctcacggta tcgcagctca ttgtaccggc cattgtagca cgtgtgcagc 240
ccaagacata aggggcatga tgacttgacg tcgtccccac cttcctccga gttgaccccg 300
gcggtctccc gtgagtcccc agcaccacaa gggcctgctg gcaacacggg acaagggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccatgcacca 420
cctgtacacc gaccacaagg ggggcactat ctctaatgct ttccggtgta tgtcaagcct 480
tggtaaggtt cttcgcgttg cgtcgaatta agccacatgc tccgccgctt gtgcgggccc 540
ccgtcaattc ctttgagttt tagccttgcg gccgtactcc ccaggcgggg aacttaatgc 600
gttagctgcg gcaccgacga cgtggaatgt cgccaacacc tagttcccac cgtttacggc 660
gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct cagcgtcagt 720
aatggcccag agatccgcct tcgccaccgg tgttcctcct gatatctgcg catttcaccg 780
ctacaccagg aattccgatc tcccctacca cactctagct agcccgtatc gactgcagac 840
tcggggttaa gccccgagct ttcacaatcg acgtgacaag ccgcctacga gctctttacg 900
cccaataatt ccggacaacg cttgcgccct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 960
agccggcgct tcttctgcag gtaccgtcac tttcgcttct tccctgctga aagaggttta 1020
caacccgaag gccgtcatcc ctcacgcggc gtcgctgcat caggctttcg cccattgtgc 1080
aatattcccc actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc 1140
ggtcgccctc tcaggccggc tacccgtcgt cgccttggtg agccattacc tcaccaacaa 1200
gctgataggc cgcgggctca tcctgcaccg ccggagcttt acaccatcaa ggatgcccaa 1260
gatggtcata tccggtatta gaccccgttt ccagggcttg tcccagagtg cagggcagat 1320
tgcccacgtg ttactcaccc gttcgccact aatccacccc gaagggcttc a 1371

Claims (8)

1.一种兼具生物肥料与生物农药潜力的土壤链霉菌，其特征在于：所述链霉菌的分类命名为链霉菌(Stretomyces costaricanus)CP99，其保藏编号为GDMCC No.60404。
2.权利要求1所述链霉菌CP99在抑制真菌性病原菌中的应用；所述真菌性病原菌为镰孢菌、疫霉菌、腐霉病菌或立枯丝核菌。
3.根据权利要求2所述土壤链霉菌在抑制真菌性病原菌中的应用，其特征在于：所述镰孢菌为黄瓜枯萎病菌和西瓜蔓割病菌。
4.根据权利要求2所述土壤链霉菌在抑制真菌性病原菌中的应用，其特征在于：所述疫霉菌为木瓜疫病病原菌。
5.权利要求1所述链霉菌CP99在降低植物寄生性土壤线虫中的应用；所述植物寄生性土壤线虫为根节线虫。
6.权利要求1所述链霉菌CP99在促进作物生长与根系生长上的应用，其特征在于：所述应用中，链霉菌CP99能促进生根及增加根系生长，不产生或产生极低量的IAA物质。
7.根据权利要求6所述链霉菌CP99在促进作物生长与根系生长上的应用，其特征在于：所述应用包括土壤链霉菌CP99在土壤种植、无土种植与水培种植系统中的应用。
8.权利要求1所述链霉菌CP99在制备生物农药中的应用，所述链霉菌CP99制备成发酵原液，稀释后即得土壤链霉菌CP99生物农药，所述稀释为100-500倍；或者，所述链霉菌CP99发酵原液和生物肥料与生物刺激素以任意比例混合使用。
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