CN102206593B - 一株金黄垂直链霉菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株金黄垂直链霉菌及其应用。该金黄垂直链霉菌为金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)HN6，其保藏编号为CCTCC No.M2010293。本发明的链霉菌能拮抗多种真菌和细菌，且对香蕉枯萎病的防治效果好，因此，本发明链霉菌在植物病害的生物防治领域将有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株金黄垂直链霉菌及其应用。
背景技术
植物病害生物防治强调生态系统的良性循环和环境保护，可以有效地避免化学农药所带来的一系列问题，由于其社会效益、生态效益、长远利益显著而愈来愈引起人们的重视。随着人们对生态平衡和绿色健康概念越来越重视，生物防治措施在农业生产中得到了前所未有的关注。进入21世纪以来，各国政府和民众更加重视生物农药的开发和应用，生物农药在整个农药市场的份额正在逐年上升。在环境污染日益严重的今天，生物防治更是农业发展的必由之路。放线菌是最早应用到生产中的生防微生物，其重要经济价值是由于它们所产生的抗生素能有效地防治人类和动物的传染性病害，特别是细菌性的病害以及农作物的某些病害，其在植物病害生物防治中发挥了巨大的作用。目前从微生物中发现的大约8000种生物活性物质中，有近70％是放线菌产生的。利用放线菌的次生代谢产物-抗生素制备的新农药，由于其具有无污染、无残留、可再生、易于产业化、成本低等特点已成为无公害农药的主体和未来农药的发展方向。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株金黄垂直链霉菌。
本发明所提供的金黄垂直链霉菌为金黄垂直链霉菌(Streptomycesaureoverticillatus)HN6，其保藏编号为CCTCC No.M2010293。
本发明的另一个目的是提供一种用于生物防治植物病害的菌剂。
本发明所提供的用于生物防治植物病害的菌剂，其活性成分为金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)HN6CCTCC No.M2010293或发酵金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)HN6CCTCC No.M2010293得到的发酵液。
上述菌剂中，所述植物病害为香蕉枯萎病。
上述任一所述菌剂中，所述香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cubense)引起的；所述尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)具体为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)[即尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)FOC4]。
金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)HN6CCTCC No.M2010293在生物防治植物病害中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述植物病害为香蕉枯萎病。
上述任一所述应用中，所述香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cubense)引起的；所述尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)具体为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)[即尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)FOC4]。
金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)HN6CCTCC No.M2010293在拮抗细菌和/或真菌中的应用也属于本发明的保护范围；所述应用中不包括疾病的治疗方法。
上述应用中，所述细菌为如下中的至少一种：丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora var.carotovora)、苜蓿黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris pv.alfalfae)、马铃薯环腐棒杆菌(Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；
所述真菌为如下中的至少一种：尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)、苜蓿茄镰孢菌(Fusarium solani)、苜蓿尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)、苜蓿匍柄霉(Stemphylium botryosum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰孢菌(Peronospora aestivalis)、半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、苜蓿壳针孢叶斑病菌(Septoria medicaginis)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、瓜类壳二孢(Ascochyta citrullina)、大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)、禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、禾弯孢霉菌(Curvularia lunata)、大斑突脐孢(Exserohilumleonard turcicum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)和粉红聚端孢(Trichothecium roseum)。
上述应用中，所述胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora var.carotovora)为胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora var.carotovora)CGMCC 1.1000，所述马铃薯环腐棒杆菌(Clavibacter michiganensis subsp.Sepedonicus)为马铃薯环腐棒杆菌(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)ACCC 01233，所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC 1.348，所述金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ACCC01336；
上述应用中，所述尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)4号生理小种[即尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)FOC4]，所述燕麦镰孢菌(Fusariumavenaceum)为燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)ACCC 30065，所述立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)ACCC 30332，所述禾谷镰孢菌(Peronospora aestivalis)为禾谷镰孢菌(Peronospora aestivalis)ACCC 30068，所述半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)为半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)ACCC31945，所述瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)为瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)ACCC 36125，所述灰葡萄孢(Botrytis cinerea)为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)ACCC30091，所述瓜类壳二孢(Ascochyta citrullina)为瓜类壳二孢(Ascochyta citrullina)ACCC 36440，所述大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)为大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)ACCC 36109，所述禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)为禾顶囊壳(Gaeumannomycesgraminis)ACCC 30310，所述禾弯孢霉菌(Curvularia lunata)为禾弯孢霉菌(Curvularialunata)ACCC 36580，所述辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)为辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)ACCC 36279，所述核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)ACCC 30096，所述粉红聚端孢(Trichothecium roseum)为粉红聚端孢(Trichothecium roseum)ACCC 36459。
本发明的另一个目的是提供一种细菌和/或真菌的拮抗剂。
本发明所提供的细菌和/或真菌的拮抗剂，其活性成分为金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)HN6CCTCC No.M2010293。
上述拮抗剂中，所述细菌为如下中的至少一种：丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora var.carotovora)、苜蓿黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris pv.alfalfae)、马铃薯环腐棒杆菌(Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；
所述真菌为如下中的至少一种：尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)、苜蓿茄镰孢菌(Fusarium solani)、苜蓿尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)、苜蓿匍柄霉(Stemphylium botryosum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰孢菌(Peronospora aestivalis)、半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、苜蓿壳针孢叶斑病菌(Septoria medicaginis)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、瓜类壳二孢(Ascochyta citrullina)、大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)、禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、禾弯孢霉菌(Curvularia lunata)、大斑突脐孢(Exserohilumleonard turcicum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)和粉红聚端孢(Trichothecium roseum)。
上述拮抗剂中，所述胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora var.carotovora)为胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora var.carotovora)CGMCC 1.1000，所述马铃薯环腐棒杆菌(Clavibacter michiganensis subsp.Sepedonicus)为马铃薯环腐棒杆菌(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)ACCC 01233，所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC 1.348，所述金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ACCC01336；
上述拮抗剂中，所述尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)4号生理小种[即尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)FOC4]，所述燕麦镰孢菌(Fusariumavenaceum)为燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)ACCC 30065，所述立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)ACCC 30332，所述禾谷镰孢菌(Peronospora aestivalis)为禾谷镰孢菌(Peronospora aestivalis)ACCC 30068，所述半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)为半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)ACCC31945，所述瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)为瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)ACCC 36125，所述灰葡萄孢(Botrytis cinerea)为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)ACCC30091，所述瓜类壳二孢(Ascochyta citrullina)为瓜类壳二孢(Ascochyta citrullina)ACCC 36440，所述大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)为大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)ACCC 36109，所述禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)为禾顶囊壳(Gaeumannomycesgraminis)ACCC 30310，所述禾弯孢霉菌(Curvularia lunata)为禾弯孢霉菌(Curvularialunata)ACCC 36580，所述辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)为辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)ACCC 36279，所述核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)ACCC 30096，所述粉红聚端孢(Trichothecium roseum)为粉红聚端孢(Trichothecium roseum)ACCC 36459。
本发明首次从海南省植物园园区土壤样品中分离筛选到一株金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)HN6，实验证明，该菌株对20种病原真菌和6种病原细菌有显著拮抗作用，抗菌谱广，且该菌株对香蕉枯萎病有很好的防治效果，因此，本发明菌株在植物病害的生物防治领域将有广阔的应用前景。
附图说明
图1为菌株HN6气生菌丝及孢子、孢子丝形态图。
图2为HN6菌株系统进化树构建。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、菌的分离和鉴定
一、菌株的分离
高氏一号培养基按照如下方法制备：将可溶性淀粉20g、琼脂20g、KNO31g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g和蒸馏水1000mL混合，得到的混合物即为高氏一号培养基；高氏一号培养基的pH 7.2-7.4。
PDA平板：马铃薯(去皮)200g加入1000mL蒸馏水，煮30min，过滤，滤液用蒸馏水补足至1000mL，加入蔗糖(或葡萄糖)20g、琼脂粉20g，pH自然。
植物病原真菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense FOC4)在文献“麦明晓，黄惠琴，鲍时翔.香蕉镰刀菌枯萎病4号生理小种研究进展[J].中国生物防治，2009，25(增1)：71-75.”中公开过，公众可从海南大学获得。
采用平板稀释法分离放线菌菌株：土样采自海南省植物园，称取土样25g加入到225mL无菌水中，180r/min摇床振荡15min，静置10min后，用无菌水将上清液依次稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。用移液器吸取不同浓度的稀释液均匀涂布接种于高氏一号平板表面，每浓度3次重复，置于28℃的培养箱中培养5-10d，观察菌落生长情况。挑取单菌落稀释划线法纯化培养菌株。纯化后的放线菌在高氏一号培养基上繁殖保存。共获得89株放线菌。
皿内抑菌活性筛选试验：将89株放线菌接种于高氏一号培养平板内，28℃培养5d，待用。植物病原真菌接种于PDA平板，25℃培养5d，待用。
菌株的筛选：采用平板对峙法对供试放线菌进行抑菌活性的初筛：将培养好的放线菌用灭菌打孔器取直径5mm的菌碟置于12cm PDA平板中间，然后将同样大小尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense FOC4)菌饼对峙接于距放线菌4cm处，25℃下培养5d，测量抑(溶)菌圈的直径，筛选抑(溶)菌圈直径≥35cm菌株。最终获得1株目的菌株，将其命名为HN6。
二、菌株的鉴定
1、菌丝形态及培养特征观察
将菌株HN6在高氏一号培养基上28℃培养7d后，用普通显微镜及扫描电镜进行常规的菌丝形态观察、照相。结果如图1所示。结果显示：菌株HN6菌落较小，干燥，气生菌丝茂盛，呈粉白色，基内菌丝橙红色，无可溶性色素。经普通显微镜及扫描电镜进行菌丝形态观察发现，菌株气生菌丝纤细、多分枝，孢子丝直，孢子圆柱形。
在高氏一号、察氏、葡萄糖-天冬素、克氏一号、马铃薯浸汁、葡萄糖酵母膏琼脂及马铃薯块培养基上接种菌株HN6，置于28℃培养，定期观察其菌落特征及菌体颜色，并记载气生菌丝的颜色、基质丝体的颜色和可溶性色素的颜色，作为鉴定种的依据。
HN6在各种培养基上的特征如表1，可见该菌在不同的培养基上的培养性状是不同的，另外该菌只在葡萄糖酵母膏琼脂上会产生可溶性色素外，在其他几种供试培养基上都不产生色素。
表1、菌株HN6的培养特征
2、生理生化特性测定
参照《Bergeys Manual of Sustematic Bacteriology》Vol.II的内容对菌株HN6进行生理生化鉴定。测定内容包括：明胶液化能力测定、牛奶凝固与胨化测定、淀粉水解测定、纤维素水解试验、硫化氢产生试验、碳源利用试验等。
结果如表2和表3所示。
表2、菌株HN6的理化特征
注：“+”表示生化反应为阳性；“-”表示生化反应为阴性。
表3、菌株HN6的碳源利用情况
注：“+”表示利用；“-”表示不能利用；“+-”表示利用较弱。
3、细胞壁化学组分分析
细胞壁化学组分分析按文献“王平.测定放线菌菌体中氨基酸和单糖的快速方法-薄层层析法[J].微生物学通报，1986，13(5)：228-231.”中的薄板层析法(TCL)进行全细胞水解液的氨基酸和糖型分析。
纸层层析法对菌株HN6进行全细胞氨基酸分析，结果如表4：
表4、菌株HN6全细胞氨基酸分析结果
纸层层析法对菌株HN6进行全细胞壁糖分分析，结果如表5：
表5、菌株HN6全细胞壁糖份分析结果
综合表4、表5结果可知：菌株HN6细胞中含有氨基酸的种类为：LL-DAP、甘氨酸等标志性氨基酸，可知该菌株细胞壁属于I型，属于链霉菌属；菌株HN6细胞中除含有葡萄糖外不含有表5中其它糖的种类，该菌株糖型为C型。
4、菌株16S rDNA序列分析
提取菌株HN6的总DNA，采用细菌通用引物(正向Pf：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向Pr：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)进行16S rDNA的PCR扩增。扩增体系如表6所示。PCR反应条件：95℃预变性5min，进入循环：94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环后，72℃延伸10min。将PCR产物交上海英骏生物技术有限公司测序。将测得的16S rDNA序列与GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已有序列进行BLAST分析，获得相关种、属的16S rDNA序列，采用CLUSTAL X 1.8软件进行多序列比对并用Neighbor-Joining法构建系统发育树，以确定该菌株的分类地位。
表6、16SrDNA PCR扩增体系
注：25μL体系
结果测得的序列如SEQ ID NO：1所示。构建的系统发育树如图2所示。结果显示，与菌株HN6相似度较高的均为链霉菌属的菌株，由此可知菌株HN6属于链霉菌属，另外该菌株HN6在系统发育树上与金黄垂直链霉菌(Streptomycesaureoverticillatus)为独立一分支，相似度达99％，结合菌株淀粉水解、纤维素上不生长等生理生化特性可以鉴定该菌株HN6为金黄垂直链霉菌。
本发明的菌株HN6已于2010年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉市武汉大学，邮编430072)，保藏号为CCTCC No.M2010293。该菌株的分类命名为金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)，菌株名称为HN6。
实施例2、菌株的应用
NA培养平板：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g和蒸馏水1000mL混合，pH 7.2，得到混合物为NA，即牛肉膏蛋白胨培养基。
改良高氏1号培养液按照如下方法制备：将葡萄糖5.0g、甘油5.0g、可溶性淀粉5.0g、KH2PO40.5g、CaCO30.5g、NaCl 0.5g、MgSO40.5g、蛋白胨5.0g、酵母膏5.0g和黄豆粉5.0g溶于蒸馏水中，再用蒸馏水定容至1升，得到的混合物即为改良高氏1号培养液；
查氏培养液按照如下方法制备：将NaNO32.0g、KCl 0.5g、FeSO40.01g、KH2PO41.0g、MgSO40.5g和蔗糖30.0g溶于蒸馏水中，再用蒸馏水定容至1升，得到的混合物即为查氏培养液。
四叶期的粉蕉(MusaABB)组培苗在文献“李梅婷，等.香蕉枯萎病菌及其粗毒素对香蕉的致病性比较[J].热带作物学报，2010，31(3)：446-452.”中公开过，公众可从海南大学获得。
一、抗菌谱的测定
制备改良高氏1号培养液，接入菌HN6CCTCC No.M2010293，180r·min-1，28℃振荡培养5d，得到菌HN6CCTCC No.M2010293发酵液。
采用杯碟法对菌HN6CCTCC No.M2010293进行抗菌谱测定：将培养好的靶标菌制成孢子悬浮液或菌悬液，取100μL涂于12cm PDA或NA培养平板上，然后距皿中心3cm处放入灭菌牛津杯，每皿3个，杯中加入200μL菌HN6CCTCC No.M2010293发酵液，分别置25℃培养3d(真菌)、28℃培养1d(细菌)后测定抑菌圈直径。
结果如表7所示。
表7-1、菌株HN6对20种植物病原真菌的抑菌效果
表7-2、菌株HN6对6种细菌的抑菌效果
表7-3各菌株来源
苜蓿黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris pv.alfalfae)在文献“刘爱萍，侯天爵.草地病虫害及防治[M].2005：55-56.”中公开过，公众可从海南大学获得。
苜蓿茄镰孢菌(Fusarium solani)在文献“曹丽霞，赵存虎，白全江，等.内蒙古中部地区苜蓿根腐病病原研究(英文)[J].华北农学报，2008，23(6)：105-107.”中公开过，公众可从海南大学获得。
苜蓿尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)在文献“曹丽霞，赵存虎，白全江，等.内蒙古中部地区苜蓿根腐病病原研究(英文)[J].华北农学报，2008，23(6)：105-107.”中公开过，公众可从海南大学获得。
苜蓿匍柄霉(Stemphylium botryosum)在文献“刘爱萍，侯天爵.草地病虫害及防治[M].2005：55-56.”中公开过，公众可从海南大学获得。
苜蓿壳针孢叶斑病菌(Septoria medicaginis)在文献“刘爱萍，侯天爵.草地病虫害及防治[M].2005：55-56.”中公开过，公众可从海南大学获得。
尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)4号生理小种[即尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)FOC4]在文献“麦明晓，黄惠琴，鲍时翔.香蕉镰刀菌枯萎病4号生理小种研究进展[J].中国生物防治，2009，25(增1)：71-75.”中公开过，公众可从海南大学获得。
胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)在文献“刘正坪，胡俊，高翔，等.枸杞炭疽病菌生物学特性研究[J].北京农学院学报，2005，20(3)：36-39.”中公开过，公众可从海南大学获得。
大斑突脐孢(Exserohilumleonard turcicum)在文献“周洪友，刘正坪，胡俊，等.苏丹草大斑病菌的生物学特性研究[J].华北农学报，2009，24(1)：174-177.”中公开过，公众可从海南大学获得。
丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)在文献在文献“刘爱萍，侯天爵.草地病虫害及防治[M].2005：55-56.”中公开过，公众可从海南大学获得。
菌株HN6对尖孢镰刀菌古巴专化型、苜蓿茄镰孢菌、苜蓿匍柄霉、立枯丝核菌、禾谷镰孢菌、半裸镰刀菌、瓜果腐霉、苜蓿壳针孢、灰葡萄孢、大丽轮枝孢、胶孢炭疽菌、禾弯孢霉菌、大斑突脐孢、辣椒疫霉菌等20种病原真菌及丁香假单胞菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、苜蓿黄单胞杆菌、马铃薯环腐棒杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌6种细菌有明显的拮抗作用。证明菌株HN6的抑菌谱广。
二、菌株HN6对香蕉枯萎病的防病效果
将菌株HN6接入改良高氏1号培养液，180r·min-1，28℃培养7d，得到菌株HN6发酵液；将菌株HN6发酵液稀释至109cfu·mL-1，得到稀释后的菌株HN6发酵液，备用。
将尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense FOC4)接入查氏培养液，180r·min-1，28℃振荡培养7d，得到尖孢镰刀菌古巴专化型发酵液；将尖孢镰刀菌古巴专化型发酵液稀释至107cfu·mL-1，得到稀释后的尖孢镰刀菌古巴专化型发酵液，备用。
菌株HN6盆栽防效实验：从海南大学儋州校区周边非香蕉种植地采集土样，过20目筛，160℃灭菌2h，冷却至常温后分装于灭菌育苗杯，用清水将四叶期的粉蕉(MusaABB)组培苗根部冲洗干净，定植于已灭菌的土壤中，在28℃、2000lx光照、12h光照/12h黑暗的下培养。15d后灌根法接入20mL稀释后的菌株HN6发酵液，在28℃、2000lx光照、12h光照/12h黑暗的下培养。分别以无菌水、改良高氏1号培养液、恶霉灵(北京北农绿享科技发展有限公司)1200倍药液为对照，每处理设1个苗，每处理重复30次。施加稀释后的菌株HN6发酵液5d后，以伤根法接入20mL稀释后的尖孢镰刀菌古巴专化型发酵液，在28℃、2000lx光照、12h光照/12h黑暗的下培养，于接种尖孢镰刀菌古巴专化型后第14d第一次调查各处理的病情指数和防治效果，以后每隔8d调查一次，共调查3次。
香蕉枯萎病的分级标准：
0级：维管束正常，外部无症状；
1级：植株下部叶片边缘变黄，维管束有变色迹象；
2级：植株下部叶片出现枯萎，少于1/4的维管束变色；
3级：1/4-1/2维管束变色；
4级：1/2-3/4维管束变色；
5级：3/4维管束变色；
6级：整个植株枯萎，死亡。
分别在接种尖孢镰刀菌古巴专化型的第14d、22d、30d进行香蕉枯萎病的病情指数和防治效果调查，结果如表8。由表8可知：对照组香蕉苗接种病原菌后均从14d开始发病，至30d到达发病盛期，实验组在接种22d时发病。接种30d时，实验组防治率可达71.32％；恶霉灵1200倍液有一定的防治效果，但不如实验组。
表8、香蕉枯萎病的病情指数及防治效果调查结果
注：无菌水处理为CK1；改良高氏1号培养液为CK2；恶霉灵1200倍液为CK3。
Claims (5)
1.金黄垂直链霉菌（Streptomyces aureoverticillatus）HN6，其保藏编号为CCTCCNo.M2010293。
2.一种用于生物防治植物病害的菌剂，其活性成分为发酵金黄垂直链霉菌（Streptomyces aureoverticillatus）HN6 CCTCC No.M2010293得到的发酵液；
所述植物病害为香蕉枯萎病；
所述香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）引起的。
3.发酵金黄垂直链霉菌（Streptomyces aureoverticillatus）HN6 CCTCC No.M2010293得到的发酵液在生物防治植物病害中的应用；
所述植物病害为香蕉枯萎病；
所述香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）引起的。
4.发酵金黄垂直链霉菌（Streptomyces aureoverticillatus）HN6 CCTCC No.M2010293得到的发酵液在拮抗细菌和/或真菌中的应用；所述应用中不包括疾病的治疗方法；
所述细菌为如下中的至少一种：丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）、胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora var.carotovora）、苜蓿黄单胞杆菌（Xanthomonascampestris pv.alfalfae）、马铃薯环腐棒杆菌（Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）；
所述真菌为如下中的至少一种：尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporumf.sp.cubense）、苜蓿茄镰孢菌（Fusarium solani）、苜蓿尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、燕麦镰孢菌（Fusarium avenaceum）、苜蓿匍柄霉（Stemphylium botryosum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、禾谷镰孢菌（Peronospora aestivalis）、半裸镰刀菌（Fusarium semitectum）、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、苜蓿壳针孢叶斑病菌（Septoria medcaginis）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、瓜类壳二孢（Ascochyta citrullina）、大丽轮枝菌（Verticillium dahlia）、禾顶囊壳（Gaeumannomyces graminis）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、禾弯孢霉菌（Curvularia lunata）、大斑突脐孢（Exserohilumleonard turcicum）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）和粉红聚端孢（Trichothecium roseum）。
5.细菌和/或真菌的拮抗剂，其活性成分为发酵金黄垂直链霉菌（Streptomycesaureoverticillatus）HN6 CCTCC No.M2010293得到的发酵液；
所述细菌为如下中的至少一种：丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）、胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora var.carotovora）、苜蓿黄单胞杆菌（Xanthomonascampestris pv.alfalfae）、马铃薯环腐棒杆菌（Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）；
所述真菌为如下中的至少一种：尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporumf.sp.cubense）、苜蓿茄镰孢菌（Fusarium solani）、苜蓿尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、燕麦镰孢菌（Fusarium avenaceum）、苜蓿匍柄霉（Stemphylium botryosum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、禾谷镰孢菌（Peronospora aestivalis）、半裸镰刀菌（Fusarium semitectum）、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、苜蓿壳针孢叶斑病菌（Septoria medicaginis）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、瓜类壳二孢（Ascochyta citrullina）、大丽轮枝菌（Verticillium dahlia）、禾顶囊壳（Gaeumannomyces graminis）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、禾弯孢霉菌（Curvularia lunata）、大斑突脐孢（Exserohilumleonard turcicum）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）和粉红聚端孢（Trichothecium roseum）。
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