CN105394085B

CN105394085B - 一种金黄垂直链霉菌hn6可湿性粉剂

Info

Publication number: CN105394085B
Application number: CN201510715757.3A
Authority: CN
Inventors: 骆焱平; 王兰英
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2035-10-29
Also published as: CN105394085A

Abstract

本发明公开了一种金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂，其由以下质量百分比的组分制成：金黄垂直链霉菌HN6液体发酵物5%～20%、润湿剂1％～5％、分散剂1％～5％、稳定剂0.5％～2％、填料补足到100%。制备方法包括：按照上述重量投入润湿剂、分散剂、稳定剂、填料到气流粉碎机中粉碎，过325目筛，降温后，加入金黄垂直链霉菌HN6液体发酵物，继续粉碎，水分含量≤5%，活性孢子数为0.1～10亿/克，经检验合格，包装贮存。本发明有益效果：该药剂属于微生物活体制剂，对香蕉枯萎病有显著效果，对其它病害有较好的防治作用，对生态环境无毒副作用，能保障农产品的质量与安全。

Description

一种金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂

技术领域

发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及一种金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂。

背景技术

香蕉枯萎病又名巴拿马病，由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubeme FOC)侵染引起，属国际检疫对象，发病严重时可致蕉园丢荒，严重影响了香蕉种植业的发展。近年来化学农药引起农药残留、破坏生态环境等负面影响日益严重，利用生防微生物防治农作物病害逐渐受到重视。放线菌是生防微生物中极为重要的一类菌群，已经广泛应用于农业生物防治领域。生防放线菌的应用主要有两方面，一方面是利用放线菌产生的次生代谢产物，主要是抗生素类物质；另一方面是利用活体放线菌菌株进行生物防治。由于近年来抗生素在人类环境中也产生不利影响，应用逐渐受到限制。而活体放线菌菌株可以通过在作物根际的繁殖保证防病效果的持久性，甚至有些放线菌还可以通过在作物根际固氮、分泌生长素对作物起到促生、增产作用；或者通过诱导植物抗病性提高防病效果等，因此放线菌活体制剂的研究已成为当今应用研究的主流。已报道防治香蕉枯萎病的活体菌株制剂主要是芽胞杆菌，放线菌较少，因此开展放线菌活体制剂的研究具有重要的意义。

金黄垂直链霉菌HN6(Streptomyces aureoverticillatus)HN6，已于2010年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉市武汉大学，邮编430072)，保藏号为CCTCC No.M2010293。经过研究发现：金黄垂直链霉菌HN6对香蕉枯萎病原菌在内的多种植物病原菌有极强的抑菌活性；金黄垂直链霉菌HN6对尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubeme FOC)侵染引起的香蕉枯萎病有很好的防治作用；金黄垂直链霉菌HN6能明显提高组培香蕉苗苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶的活性；金黄垂直链霉菌HN6可以增加组培香蕉苗株高、茎粗、地上部分鲜重及地下部分鲜重；金黄垂直链霉菌HN6可以提高植株叶片叶绿素、可溶性蛋白质及可溶性糖含量；金黄垂直链霉菌HN6可有效增强组培香蕉苗根系活力。由此申请了“一株金黄垂直链霉菌HN6及其应用ZL201110062146.5”的发明专利和相关论文“王兰英,王琴,骆焱平.金黄垂直链霉菌HN6对香蕉的防病促生作用[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2015,43(05):1-6”。以往该菌株的研究与应用主要采用孢子悬浮液或液体发酵物，但孢子悬浮液与液体发酵物均不耐储存，也不宜运输，必将限制该菌株的大规模应用。因此研制该菌株的活体制剂具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂，该粉剂可以用于防治香蕉枯萎病。

本发明的另一个目的在于提供该金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂的制备方法。

为实现所述目的，本发明采用以下技术方案：

一种金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂，其由以下质量百分比的组分制成：金黄垂直链霉菌HN6液体发酵物5％～20％、润湿剂1％～5％、分散剂1％～5％、稳定剂0.5％～2％、填料补足到100％。

其中，所述的金黄垂直链霉菌HN6液体发酵物通过以下步骤制备：1)活化金黄垂直链霉菌HN6：以划线法将金黄垂直链霉菌HN6接种在高氏一号培养基(培养基的质量百分比组成：可溶性淀粉2％，KNO₃ 0.1％，K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄0.05％、NaCl 0.05％、FeSO₄0.001％，琼脂2％，补水至100％)平板上，28℃恒温培养5天；2)将活化的金黄垂直链霉菌HN6接种于一级种子培养液(一级种子培养液的质量百分比组成：溶性淀粉2％，KNO₃0.1％，K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄ 0.05％、NaCl 0.05％、FeSO₄ 0.001％，补水至100％)中，180r·min^-1，28℃培养72h；3)将制备好的一级种子培养液接种在二级种子培养液(二级种子培养液的质量百分比组成：葡萄糖0.05％、可溶性淀粉0.05％、K₂HPO₄ 0.05％、NaCl0.05％、MgSO₄ 0.05％、蛋白胨0.05％、酵母膏0.05％和黄豆粉0.05％，补水至100％)中，180r·min^-1，28℃培养72h，离心分离，得到金黄垂直链霉菌HN6液体发酵物，低温干燥，水分含量低于5％。

优选的，所述润湿剂选用十二烷基硫酸钠、吐温-80、亚甲基双萘磺酸钠中的一种或几种。

优选的，所述分散剂选用NNO、聚乙二醇、聚天门冬氨酸、CMCC-Na中的一种或几种。

优选的，所述稳定剂选用维生素E、磷酸二氢钾、特丁基对苯二酚中的一种或几种。

优选的，所述填料选用硅藻土、膨润土、白炭黑、轻质碳酸钙、高岭土中的一种或几种。

上述的金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤：

按照上述重量投入润湿剂、分散剂、稳定剂、填料到气流粉碎机中粉碎，过325目筛，降温后，加入金黄垂直链霉菌HN6液体发酵物，继续粉碎，水分含量≤5％，活性孢子数为0.1～10亿/克，经检验合格，包装贮存。

本发明有益效果：该药剂属于微生物活体制剂，对香蕉枯萎病有显著效果，对其它病害有较好的防治作用，对生态环境无毒副作用，能保障农产品的质量与安全。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂的制备方法

(1)菌种活化：

本发明所用菌种为金黄垂直链霉菌HN6(Streptomyces aureoverticillatusHN6)。将菌种以划线法接种在扩大培养基(可溶性淀粉2％，KNO₃ 0.1％，K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄ 0.05％、NaCl 0.05％、FeSO₄ 0.001％，琼脂2％，补水至100％，待药品全部溶解后，调节pH至7.0-7.2，121℃高温高压灭菌20min)固体平板上，28℃恒温培养5天。

(2)一级种子制备：

将活化的金黄垂直链霉菌HN6制成浓度为10⁹cfu g^-1孢子悬浮液，然后按照5％的接种量接种于装有一级种子培养液(溶性淀粉2％，KNO₃ 0.1％，K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄0.05％、NaCl 0.05％、FeSO₄ 0.001％，补水至100％，待药品全部溶解后，调节pH至7.0-7.2，121℃高温高压灭菌20min)的三角瓶中，180r·min-¹，28℃培养72h，制得一级种子，备用。

(3)二级种子制备：

将制备好的一级种子培养液按照5％接种量接种在装有二级种子培养液(葡萄糖0.05％、可溶性淀粉0.05％、K₂HPO₄ 0.05％、NaCl 0.05％、MgSO₄ 0.05％、蛋白胨0.05％、酵母膏0.05％和黄豆粉0.05％，补水至100％，待药品全部溶解后，调节pH至6.8-7.0，121℃高温高压灭菌20min)的三角瓶中，180r·min^-1，28℃培养72h，制得二级种子，离心分离，得到金黄垂直链霉菌HN6液体发酵物。

(4)可湿性粉剂的制备：

黄垂直链霉菌液体发酵物0.1～10亿/克，润湿剂1％～5％，分散剂1％～5％，稳定剂0.5％～2％，填料补足到100％组成。按照上述重量投入到气流粉碎机中粉碎，过325目筛，水分含量≤5％，活性孢子>0.1～10亿/克，经检验合格，包装贮存。

实例1 0.1亿/克金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂的制备方法

由金黄垂直链霉菌液体发酵物5％、十二烷基硫酸钠1％、NNO 5％、磷酸二氢钾2％和硅藻土87％制成。按照上述重量投入到气流粉碎机中粉碎，过325目筛，水分含量≤5％，活性孢子检测为0.1亿/克，经检验合格，包装贮存。

实例2 3亿/克金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂的制备方法

由金黄垂直链霉菌液体发酵物10％、亚甲基双萘磺酸钠5％、NNO 1％、聚天门冬氨酸1％、维生素E 0.5％和膨润土82.5％制成。按照上述重量投入到气流粉碎机中粉碎，过325目筛，水分含量≤5％，活性孢子检测为3亿/克，经检验合格，包装贮存。

实例3 5亿/克金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂的制备方法

由金黄垂直链霉菌液体发酵物15％、十二烷基硫酸钠2％、吐温-80 1％、聚乙二醇2％、聚天门冬氨酸1％、磷酸二氢钾0.5％、特丁基对苯二酚1％、白炭黑30％和高岭土47.5％制成。按照上述重量投入到气流粉碎机中粉碎，过325目筛，水分含量≤5％，活性孢子检测为5亿/克，经检验合格，包装贮存。

实例4 10亿/克金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂的制备方法

由金黄垂直链霉菌液体发酵物20％、十二烷基硫酸钠5％、NNO 4％、CMCC-Na1％、磷酸二氢钾3％、特丁基对苯二酚2％、硅藻土40％和轻质碳酸钙25％制成。按照上述重量投入到气流粉碎机中粉碎，过325目筛，水分含量≤5％，活性孢子检测为10亿/克，经检验合格，包装贮存。

实施例2金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂的制备方法优化过程

首先，固定其它助剂，选用硅藻土、膨润土、白炭黑、轻质碳酸钙、高岭土填料，按照上述方法配制可湿性粉剂，测定其悬浮率(中国人民共和国国家标准GB/T14825-2006)、润湿时间(中国人民共和国国家标准GB/T 5451-2001)和活菌数(采用系列梯度稀释法进行菌落计数)。结果见表1。

表1不同填料对可湿性粉剂的指标影响

由表1可知，硅藻土的悬浮率最好，其次是膨润土，高岭土的效果较差。从润湿时间看，硅藻土和膨润土的润湿时间短，速度快，白炭黑效果较差。从活菌数量看，硅藻土的最好，高岭土最差。为此，我们固定硅藻土，对润湿剂和分散剂进行测试，结果见表2.

表2不同润湿剂、分散剂对可湿性粉剂的指标影响

注：分散性强用“+++”表示，分散性好用“++”表示，分散性一般用“+”表示。

由表2可知，十二烷基硫酸钠、亚甲基双萘磺酸钠的润湿性最好，吐温-80其次，其它润湿性效果较差。NNO分散性最好，其次是聚乙二醇，其它助剂的分散性一般。从活菌数量看，十二烷基硫酸钠最好，其次是聚天门冬氨酸，CMCC-Na较差。

由此，选用硅藻土做填料，十二烷基硫酸钠做润湿剂，NNO做分散剂，优化选择稳定剂，结果见表3。

表3不同稳定剂对可湿性粉剂的指标影响

由表3可知，磷酸二氢钾的效果最好，活菌数量最多，其次是维生素E。

因此，根据优化结果，以硅藻土为填料，十二烷基硫酸钠为润湿剂，NNO为分散剂，磷酸二氢钾为稳定剂，按照实施例一进行配制，得到金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂，活菌数量为6.8×10⁹cfu g^-1。

同时也可以选择二种或者以上的同类助剂，增加可湿性粉剂的综合性能。

实施例3金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂对香蕉枯萎病的盆栽防治效果

将香蕉枯萎病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense FOC4)接种于PDA平板上，25℃恒温培养。5天后用无菌水洗脱平板上孢子，接入查氏培养液(NaNO₃0.2％，KCl0.05％，FeSO₄ 0.001％，KH₂PO₄0.1％g，MgSO₄ 0.05％，蔗糖3％，补水至100％，待药品全部溶解后，121℃高温高压灭菌20min)，150r·min^-1，25℃振荡培养7天，得到香蕉枯萎病原菌液体培养液，用无菌水将该培养液稀释至孢子浓度为10⁷cfu·mL^-1，备用。

采集非香蕉种植地土样，过20目筛，170℃灭菌1.5h，待土冷却，将金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂与灭菌土按照1：200质量比混匀，然后分装于口径为20cm育苗钵中，以25％多菌灵可湿性粉剂(四川国光农化股份有限公司)同样处理为药剂对照，以不施药的处理为空白对照，每处理重复30次。将四叶期的粉蕉(MusaABB)组培苗根部用清水冲洗干净，移栽于育苗钵内，在光照强度为1500-2500lx、温度为25-30℃、12h光暗交替条件下培养7天，以伤根法接入孢子浓度为10⁷cfu·mL^-1香蕉枯萎病原菌。将接完菌的粉蕉组培苗在上述条件下继续培育，每隔14d调查各处理的病情指数，统计最终防效。香蕉枯萎病的病情分级标准如下：

0级：外观无可见症状，解剖假茎维管束组织未变褐；

1级：外观无可见症状，解剖假茎维管束组织变褐；

3级：叶片黄化或倒垂；

5级：假茎基部开裂，但病株尚未枯死；

7级：病株枯死。

金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂对香蕉枯萎病的盆栽防治效果

表4金黄垂直链霉菌HN6WP对香蕉枯萎病的盆栽防治效果

注：同列小写字母表示0.05水平的差异显著性，大写字母表示0.01水平的差异显著性，下表同。

由表4可知：接种香蕉枯萎病原菌14d，空白对照和25％多菌灵处理均出现病症，金黄垂直链霉菌HN6处理未发病；接种42d，空白对照到发病盛期，病情指数达85.12，而金黄垂直链霉菌HN6处理病情指数仅为16.86。依据42d的病情指数计算防效可知，金黄垂直链霉菌HN6防效(80.19％)极显著高于25％多菌灵防效(58.80％)。由此可见，金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂对盆栽香蕉的枯萎病有很好的防治作用。

实施例4金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂对香蕉枯萎病的田间防治效果

试验地点选择在海南大学儋州校区香蕉种植地，该试验地上一年度香蕉枯萎病发病率为70％以上。本试验设金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂、25％多菌灵可湿性粉剂及空白对照三个处理，每处理重复4次，每次重复20株粉蕉。

将金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂与细土按照质量比1:150比例混合均匀制成药土，取2kg药土放入香蕉苗定殖穴内，以25％多菌灵可湿性粉剂(四川国光农化股份有限公司)同样处理为药剂对照，以不做处理的细土为空白对照。将四叶期的粉蕉(MusaABB)组培苗移栽至定植穴内，移栽后每月用金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂10倍稀释液1升灌根一次，以25％多菌灵可湿性粉剂500倍液1L处理药剂对照，以1L自来水处理空白对照。每10天观测一次发病情况，180天后统计各处理发病率、病情指数及防治效果。香蕉枯萎病的病情分级及统计公式同生物测定实施例3。

经调查发现，在香蕉苗定植后30天空白对照区开始出现病征，25％多菌灵处理区40天出现病症，而金黄垂直链霉菌HN6处理130天才有少量植株出现轻微病症。由180天统计结果(表5)可知，按照上述施药方式，金黄垂直链霉菌HN6处理效果最好，发病率仅为20.00％，最终防效可达72.34％，与25％多菌灵药剂照处理(防效50.33％)达极显著差异。由此可见，金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂对大田香蕉的枯萎病也有很好的防治作用。

表5金黄垂直链霉菌HN6WP对香蕉枯萎病的大田防治效果(180天)

田间试验表明，180天后，金黄垂直链霉菌可湿性粉剂的防效可达72.34％，与25％多菌灵药剂照处理(防效50.33％)达极显著差异。由此可见，金黄垂直链霉菌可湿性粉剂对香蕉枯萎病有很好的防治作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂，其特征在于，其由以下质量百分比的组分制成：金黄垂直链霉菌（Streptomyces aureoverticillatus）HN6液体发酵物5%～20%、润湿剂十二烷基硫酸钠1％～5％、分散剂NNO1％～5％、稳定剂磷酸二氢钾0.5％～2％、填料硅藻土补足到100%，所述金黄垂直链霉菌HN6保藏号为CCTCC No.M2010293。

2.权利要求1所述的金黄垂直链霉菌HN6可湿性粉剂用于香蕉枯萎病防治。