CN109452313A - 一种昆虫病原线虫制剂及制备方法和应用 - Google Patents

一种昆虫病原线虫制剂及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种昆虫病原线虫制剂及其制备方法和应用，解决了现有技术中昆虫病原线虫(Entomopathogenic Nematode，EPN)田间使用效果不佳及持效期短的问题。本发明所述的一种昆虫病原线虫制剂，包括昆虫病原线虫异小杆属(Heterorhabditis beicherriana)和硫脲。本发明还公开了该昆虫病原线虫制剂在制备防治植物地下害虫的农药中的应用。本发明首次将传统农业中的肥料增效剂化合物(硫脲Thiourea)与生防制剂(昆虫病原线虫EPN)相结合使用，提高昆虫病原线虫EPN在实际的农业生产中速效性，进而解决EPN田间使用效果不佳及持效期短的问题。

Description

一种昆虫病原线虫制剂及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，尤其涉及一种昆虫病原线虫制剂及制备方法和应用。
背景技术
害虫防治一直是人们提高农作物产量的途径之一，化学农药以其高效、快速的杀虫效果一度成为害虫防治的有效工具，但随着化学农药的大量使用，化学农药一系列潜在的危险性和弊端也逐渐凸显出来，环境污染、害虫抗药性的发展以及害虫的再猖獗成为制约化学农药发展和应用的主要因素。为了满足人类对环境和食品安全等方面的要求的不断提高，生物防治作为一种安全有效的手段，已受到了广泛的关注，对有害生物高效、对非靶标生物及环境安全的生物农药成为研发的热点，昆虫病原线虫(EntomopathogenicNematode，EPN)正是一类重要的害虫生物防治因子，在害虫可持续治理中具有巨大的应用潜力。
17世纪人们就已经发现了被线虫寄生的昆虫，二十世纪30年代人们开始利用线虫防治有害昆虫的研究，昆虫病原线虫(EPN)分布广泛，是昆虫的专化性寄生天敌，包括两个科——斯氏线虫科(Steinernematidae)和异小杆线虫科(Heterorhabditidae)。此两科均属于线虫动物门(Nematoda)，色矛纲(Chromadorea)，小杆目(Rhabditida)。目前，已经描述的斯氏属线虫有61种，异小杆属线虫有14种。昆虫病原线虫(EPN)具有化学杀虫剂无法比拟的优点，作为天敌昆虫兼病原微生物双重特点的生物杀虫剂，田间应用中不易产生害虫抗性，对非靶标生物及环境安全，在害虫可持续治理中应用潜力巨大。目前全球有40多个国家在研制EPN杀虫剂，国外已有数十家公司实现了EPN商品化，昆虫病原线虫制剂成功应用于多种地下害虫和钻蛀性害虫综合防治之中。
虽然EPN作为生物农药的应用前景可观，但是在害虫综合治理应用中，EPN作为生物农药，由于其为生物活体，对外界环境比较敏感，易受到温度、湿度和光照等因素的影响，因此导致制剂的田间使用效果不佳及持效期短等；作为昆虫的病原物，其进入昆虫体内通过携带的共生菌导致昆虫“得病”而死，在实际的农业生产中，其速效性明显低于化学农药。
目前，新型农药的研制开发有向“非杀生性农药(Antibiocidal)”方向发展的趋势，寻求理想的、适合于害虫综合治理要求的、且能够替代目前应用的广谱高效杀虫剂，已成为重要的研究课题。其中，“生物合理设计”是利用靶标生物体生命过程中某个特定的关键生理生化作用机理作为研究型，设计和合成能影响该机理的化合物，从中筛选先导化合物，然后优化结构来开发新药的一条研究开发途径。
对于昆虫来说，就是要研究某一重要生命活动的生化基础，然后“对靶”设计新颖药物。而其中最有希望的生物合理途径是“多酚氧化酶PO抑制剂”，这也一直是学术界的研究热点。尤其是在设计新的高生物活性、低毒、副作用小的多酚氧化酶PO抑制剂方面取得了较大的进展，设计适当的该酶的抑制剂作为杀虫剂具有广阔的应用前景，使昆虫无法完成发育而停留在幼虫期或蛹期进而死亡。硫脲是桑尺蠖多酚氧化酶的非竞争性抑制剂，推测其抑制机制可能是硫脲不直接与酶活性中心的双铜结合，而是通过它的羰基与酶活性中心周围的亲核基团如-SH、-NH2、-OH结合，生成的产物占据酶活性中心周围的空间，形成空间位阻，阻止了底物与酶活性中心的结合，从而抑制了酶的活性。为此，本发明首次提出由硫脲这一“多酚氧化酶PO抑制剂”作为EPN增效剂，帮助抑制昆虫的免疫反应(PO介导的体液免疫)，加速EPN侵染致死昆虫寄主，提高昆虫病原线虫EPN在实际农业生产中的速效性，进而解决EPN田间使用效果不佳及持效期短的问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是：提供一种昆虫病原线虫制剂，解决现有技术中EPN田间使用效果不佳及持效期短的问题。
本发明还提供了该昆虫病原线虫制剂的制备方法。
本发明还进一步提供了该昆虫病原线虫制剂的应用。
本发明采用的技术方案如下：
本发明所述的一种昆虫病原线虫制剂，包括异小杆属昆虫病原线虫(Heterorhabditis)和硫脲。
进一步地，所述异小杆属线虫为Heterorhabditis beicherriana。
进一步地，每1L所述制剂含有昆虫病原线虫数量为5,000,000IJs-15,000,000IJs，硫脲0.5-2mol。
进一步地，每1L所述制剂中含有昆虫病原线虫数量为10,000,000IJs，硫脲1mol。
进一步地，本发明所述昆虫病原线虫制剂中还包括有机硅、十二烷基硫酸钠、土壤调节剂、保湿剂、革兰氏阴性细菌培养基成分和蒸馏水。
进一步地，所述土壤调节剂选自黄腐酸钾和氧化钙的一种或多种；所述保湿剂选择海藻糖和聚丙烯酰胺的一种或多种；所述革兰氏阴性细菌培养基成分包括氯化钠、牛肉膏和蛋白胨。
其中，每1L所述制剂含有有机硅0.2-1g，矿源黄腐酸钾0.2-1g，海藻糖(α,α)1-3g，氯化钠2-8g，蛋白胨1-3g，牛肉膏0.5-2g，蒸馏水1000mL，并调节所述制剂的pH值为7.0-7.5。
进一步地，其中每1L所述制剂中含有昆虫病原线虫数量为10,000,000IJs，硫脲1mol，有机硅0.5g，矿源黄腐酸钾0.4g，海藻糖2g，氯化钠5g，蛋白胨2g，牛肉膏1g，蒸馏水1000mL，并调节所述制剂的pH值为7.2。
本发明中，用柠檬酸和/或氢氧化钾调节所述制剂的pH值。
本发明所述的一种昆虫病原线虫制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.昆虫病原线虫的扩繁培养：
昆虫病原线虫(Heterorhabditis beicherriana)，用大蜡螟(Galleriamellonella)末龄幼虫，或黄粉虫(Tenebrio molitor)老熟幼虫扩繁，昆虫病原线虫的侵染期三龄幼虫(IJs)采用White trap法收集到蒸馏水中，储存于冰箱内一段时间后使用；
步骤2.按比例称取各原料组分：
用静沉法将步骤1收集到的昆虫病原线虫(Heterorhabditis beicherriana)悬浮液浓缩，加入硫脲，室温混匀，调节pH值，冰箱内储存；
或者加入硫脲后再依次加入有机硅、矿源黄腐酸钾、海藻糖、氯化钠、蛋白胨、牛肉膏，室温混匀，调节pH值，冰箱内储存。
进一步地，所述步骤1中，大蜡螟(Galleria mellonella)末龄幼虫的体重约为0.20g/条，黄粉虫(Tenebrio molitor)老熟幼虫的体重约为0.10g/条，储存于2-5℃冰箱内约10-15天后使用；所述步骤2中，将步骤1收集到的昆虫病原线虫(Heterorhabditisbeicherriana)悬浮液浓缩至5,000,000IJs-15,000,000IJs/L，所述冰箱内储存的温度为2-5℃。
本发明所述的昆虫病原线虫制剂在制备防治地下害虫的农药中的应用。
进一步地，所述地下害虫包括花生蛴螬、斜纹夜蛾、小地老虎、玫瑰金龟子、茶天牛、云斑天牛和黄曲跳甲。
本发明所述的昆虫病原线虫异小杆属(Heterorhabditis beicherriana)，发源于中国本土。发明人于2010年3月北京顺义樱桃园采集土样，用大蜡螟诱饵陷阱法(Galleriamellonella L.baiting technique)、分离、纯化、鉴定的异小杆属线虫的新种，并于2012年将分类鉴定、形态描述、生物特性等特征发表在《Zootaxa》国际期刊(ISSN：1175-5326，LiXingyue,Liu Qizhi,NermutJ.,etal.Heterorhabditis beicherriana n.sp.(Nematoda:Heterorhabditidae),a new entomopathogenic nematode from the Shunyi districtof Beijing,China.Zootaxa,2012,3569:25-40.)。
本发明所述的硫脲为硫化氢与石灰浆作用而成，为白色光亮苦味晶体，别名硫代尿素，化学式为CH4N2S，分子量为76.12，溶于水，可用于发芽促进剂、杀菌剂及氮肥增效剂等。
本发明所述的有机硅为乙氧基改性聚三硅氧烷，为惰性的表面活性剂，其优秀的表面活性能使它浸润虫体，从而使昆虫窒息或干扰其生理过程，能降低液体的表面张力，使硫脲Thiourea更易渗透到昆虫的气孔内发挥作用。
本发明所述的矿源黄腐酸钾经过几千万年的土壤微生物转化而形成的，提取自褐煤、风化煤，含有黄腐酸≥50wt％，K2O≥12wt％，锌≥5wt％，水≤0.5wt％，pH＝8-11。矿源黄腐酸钾作为微生物的粮食，含有丰富羟基、羧基、酚羟基、甲氧基等官能团，可以调节土壤的pH值，螯合土壤中微量元素，改善土壤品质，提高作物的抗逆性，促进根发达。
本发明所述的海藻糖(α,α)，分子式为C12H22O11·2H2O，不易水解，性质稳定，在温度胁迫和水胁迫过程中可以稳定生物膜(细胞膜)、酶类及蛋白质结构的稳定，是生物抗逆作用的重要物质，在土壤中起着帮助昆虫病原线虫抗干燥的重要作用。
本发明所述的聚丙烯酰胺是优良的长效土壤保水剂，可以在土壤中作为昆虫病原线虫的保湿剂，提高其土壤存活率，并帮助其更迅速地在土壤中移动找寻寄主，发挥EPN的生防作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明设计科学，首次将“生物合理设计原理”与“生物防治原理”相结合，对于新型农药研发向“非杀生性农药(Antibiocidal)”的发展具有创新指导意义。
(2)本发明首次将“生物杀虫剂”与“生物合理性杀虫剂”复配，组合成为一种高效利用干扰昆虫体生命过程中某个关键生理生化作用，对靶标害虫进行有效防治的实用方法；
(3)本发明首次探索性地开展将“多酚氧化酶-PO抑制剂”作为昆虫病原线虫EPN助剂应用于害虫防治的研究；
(4)首次将传统农业中的肥料增效剂化合物(硫脲Thiourea)与生防制剂(昆虫病原线虫EPN)相结合使用，硫脲这一“多酚氧化酶PO抑制剂”作为EPN助剂，帮助抑制昆虫的免疫反应(PO介导的体液免疫)，加速EPN侵染致死昆虫寄主，提高昆虫病原线虫EPN在实际的农业生产中速效性，进而解决EPN田间使用效果不佳及持效期短的问题。
本发明中，昆虫病原线虫异小杆属(Heterorhabditis beicherriana)作为侵染致死蛴螬的生物杀虫剂，具有天敌昆虫兼病原微生物双重特点的活性生物，不易产生害虫抗性，对非靶标生物及环境安全，并可以在昆虫寄主体内自行繁殖扩张，可以在害虫可持续治理中应用。昆虫病原线虫异小杆属(Heterorhabditis beicherriana)的寄主广谱性，可以应用于花生、马铃薯或萝卜等地下食用类作物的地下害虫防治，地下害虫包括花生蛴螬、斜纹夜蛾、小地老虎、玫瑰金龟子、茶太牛、云斑天牛等。
本发明加入有机硅，促进硫脲抑制昆虫体液免疫功能，提高EPN的杀虫速度和田间活性。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了本发明的昆虫病原线虫制剂的成分含量表及制法，具体见表1。
表1
采用表1中的原料制备本发明的昆虫病原线虫制剂的制法如下：
步骤1.昆虫病原线虫的扩繁培养：
昆虫病原线虫(Heterorhabditis beicherriana)，用大蜡螟(Galleriamellonella)末龄幼虫(体重约为0.20g/条)，或黄粉虫(Tenebrio molitor)老熟幼虫(体重约为0.10g/条)扩繁；昆虫病原线虫的侵染期三龄幼虫(IJs)采用White trap法收集到蒸馏水中，储存于4℃冰箱内约2周后使用；
步骤2.按比例称取各原料组分：
用静沉法将步骤1收集到的昆虫病原线虫(Heterorhabditis beicherriana)悬浮液浓缩，加入硫脲，室温混匀，调节pH值7.0-7.5，4℃冰箱内储存。
实施例2
本实施例提供了本发明的昆虫病原线虫制剂的成分含量表，具体见表2。
表2
采用表2中的原料制备本发明的昆虫病原线虫制剂的制法如下：
步骤1.昆虫病原线虫的扩繁培养：
昆虫病原线虫(Heterorhabditis beicherriana)，用大蜡螟(Galleriamellonella)末龄幼虫(体重约为0.20g/条)，或黄粉虫(Tenebrio molitor)老熟幼虫(体重约为0.10g/条)扩繁；昆虫病原线虫的侵染期三龄幼虫(IJs)采用White trap法收集到蒸馏水中，储存于4℃冰箱内约2周后使用；
步骤2.按比例称取各原料组分：
用静沉法将步骤1收集到的昆虫病原线虫(Heterorhabditis beicherriana)悬浮液浓缩，加入硫脲，室温混匀，调节pH值7.0-7.5，4℃冰箱内储存。
实施例3
本实施例提供了本发明制剂防治花生蛴螬的应用。
具体应用为：
试验于2018年4月至8月在四川省农业科学院经作所花生种植基地(成都市青白江区姚渡镇)和广安市西高镇百里村花生繁育地进行。种植密度8000穴/亩，播种孔宽3cm、深4cm，用打孔器打孔每孔播种两粒。每个小区面积为20m2(2m*10m)，每个小区合计240穴花生苗。试验区共设置1个空白对照，6个实验处理，每个处理3个重复，共计420m2的试验用地。
其中空白对照组为无拌种、不施线虫、不施用任何药剂，仅施入与处理制剂等量清水(10L/亩)；
实验处理1组为无拌种，施用本发明的昆虫病原线虫制剂：采用实施例1表1中编号1所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的昆虫病原线虫制剂A。
实验处理2组为无拌种，施用本发明的昆虫病原线虫制剂：采用实施例2表2中编号1所列举原料配比按照实施例2所述步骤制备的昆虫病原线虫制剂B。
实验处理3组为采用30％辛硫磷微囊悬浮剂拌种；
实验处理4组为无拌种，仅施用硫脲溶液。该硫脲溶液为1moL硫脲溶于蒸馏水1L中，并调节pH值为7.2制成，其用量、用法同实验处理1组一致；
实验处理5组为无拌种，仅施用昆虫病原线虫液；该昆虫病原线虫液与实验处理1组的昆虫病原线虫制剂相比，不含硫脲，其余条件均相同。昆虫病原线虫液的用量、用法同实验处理1组一致；
实验处理6组为无拌种，仅施用有机硅溶液；该有机硅溶液为0.5g有机硅溶于蒸馏水1L中，并调节pH值为7.2制成，其用量、用法同实验处理1组一致；
实验处理7组为无拌种，仅施用昆虫病原线虫和海藻糖液；该昆虫病原线虫和海藻糖液与实验处理2组的昆虫病原线虫制剂相比，不含硫脲、有机硅、矿源黄腐酸钾和培养基成分，其余条件均相同。所制药液的用量、用法同实验处理1组一致。
本实施例中所述的培养基成分为氯化钠、蛋白胨和牛肉膏。
1.本实施例中采用的花生主推品种：1个(水果花生)。
2.本实施例中花生拌种药剂方法为：30％辛硫磷微囊悬浮剂，药种比为1:50，播种前一天常温拌种后阴干。
3.本实施例中实验处理1组的试验处理方法为起垄开沟后，沟穴内施肥后播种。本发明制剂施药方法：花生初花期后用药。
昆虫病原线虫制剂施用前镜检线虫密度10,000条/mL,每穴花生浇施线虫制剂约1.25mL(10L/亩)，保证每穴花生施用线虫12500条线虫，达15万条/m2(1亿IJs/亩),施药后每穴浇水约200mL，确保线虫制剂随水达到花生根系及其周围,并保持湿度。按田间正常种植管理，至秋天花生8月底-9月初收获时，收获时每小区对角线5点取样，每点面积1m2，将花生植株整个根系及其周边约5-10cm的土移至穴外,分别调查记录每穴穴内和根际土壤中以及根系的花生取样总果数、受害果数(籽粒受害70％以上者)、计算被害率(％)和防效(％)。然后并根据小区测产(花生好果晒干称重)统计产量、增产率(％)。
各项内容按下列公式计算:
被害果率(％)＝被害果数/调查总果数×100
防效(％)＝(空白对照区被害果率-药剂处理区被害果率)/空白对照区被害果率×100
增产率(％)＝(药剂处理区产量-空白对照区产量)/空白对照区产量×100
试验结果见表3。
表3
试验结果表明：采用本发明制剂可以有效防治地下害虫，提高农作物产量。
本发明制剂相比于化学药剂拌种的优势在于：
1.长效、高效：只要在花生初花期后一次用药，即可高效地控制花生整个生长期内蛴螬以及其它地下害虫的危害，平均防效达60％以上；达到化学拌种常规药剂的防效；
2.简便、省工：和常规防治相比，用工减少40％以上；
3.无公害：在获得长效、高效的前提下，经法定的检测单位测定：剧毒农药在花生果仁中残留量极低(检测不到)，远远低于无公害农产品的残留指标。
4.对花生安全、保产效果更高：对花生出苗和生长安全；花生产量可提高15％以上，花生品质得到提高。
5.环境安全及长效：对人畜安全,不污染环境,亦不会产生抗性。对土壤生态环境安全，对土壤可持续性无影响。作为活体生物能在死亡的虫尸上繁殖，继续扩散控制整个生长期的蛴螬等地下害虫。
本发明制剂相比于单纯使用线虫防治的优势在于：
1.线虫制剂中添加的硫脲，除了可作为发芽促进剂、杀菌剂及氮肥增效剂，作为昆虫多酚氧化酶抑制剂，抑制了害虫体液免疫反应，提高了线虫侵染致死蛴螬的速率，大幅提高了其对蛴螬的防治效率。
2.线虫制剂中添加的有机硅，作为优秀的惰性表面活性剂，其表面活性能使它浸润虫体，能降低液体的表面张力，使硫脲更易渗透到昆虫的气孔内发挥作用，从而使硫脲更快地干扰昆虫的免疫生理过程，
3.线虫制剂中添加的海藻糖(α,α)，在土壤中起着帮助昆虫病原线虫抗干燥的重要作用，使其在土壤环境中存活时间更久，更持续地发挥生防效果。
4.线虫制剂中添加的聚丙烯酰胺，是优良的土壤保水剂，可以在土壤中作为线虫的长效保湿剂，提高其土壤存活率和运动力，帮助其更迅速地在土壤中移动找寻寄主，加速其发挥蛴螬的生防作用。
5.线虫制剂中添加的矿源黄腐酸钾，可以调节土壤的pH值，螯合土壤中微量元素，改善土壤品质，提高作物的抗逆性，促进根发达。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种昆虫病原线虫制剂，其特征在于，包括异小杆属昆虫病原线虫(Heterorhabditis)和硫脲。
2.根据权利要求1所述的昆虫病原线虫制剂，其特征在于，所述异小杆属线虫为Heterorhabditis beicherriana。
3.根据权利要求1-2任一项所述的昆虫病原线虫制剂，其特征在于，每1L所述制剂含有昆虫病原线虫数量为5,000,000IJs-15,000,000IJs，硫脲0.5-2mol。
4.根据权利要求1-3任一项所述的昆虫病原线虫制剂，其特征在于，每1L所述制剂中含有昆虫病原线虫数量为10,000,000IJs，硫脲1mol。
5.根据权利要求4述的昆虫病原线虫制剂，其特征在于，还包括有机硅、十二烷基硫酸钠、土壤调节剂、保湿剂、革兰氏阴性细菌培养基成分和蒸馏水。
6.根据权利要求5所述的昆虫病原线虫制剂，其特征在于，所述土壤调节剂选自黄腐酸钾和氧化钙的一种或多种；所述保湿剂选自海藻糖和聚丙烯酰胺的一种或多种；所述革兰氏阴性细菌培养基成分包括氯化钠、牛肉膏和蛋白胨。
7.根据权利要求6所述的昆虫病原线虫制剂，其特征在于，其中每1L所述制剂中含有昆虫病原线虫数量为10,000,000IJs，硫脲1mol，有机硅0.5g，矿源黄腐酸钾0.4g，海藻糖2g，氯化钠5g，蛋白胨2g，牛肉膏1g，蒸馏水1000mL，并调节所述制剂的pH值为7.2。
8.如权利要求1-7任意一项所述的一种昆虫病原线虫制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.昆虫病原线虫的扩繁培养：
昆虫病原线虫(Heterorhabditis beicherriana)，用大蜡螟(Galleria mellonella)末龄幼虫，或黄粉虫(Tenebrio molitor)老熟幼虫扩繁，昆虫病原线虫的侵染期三龄幼虫(IJs)采用White trap法收集到蒸馏水中，储存于冰箱内一段时间后使用；
步骤2.按比例称取各原料组分：
用静沉法将步骤1收集到的昆虫病原线虫(Heterorhabditis beicherriana)悬浮液浓缩，加入硫脲，室温混匀，调节pH值，冰箱内储存；
或者加入硫脲后再依次加入有机硅、矿源黄腐酸钾、海藻糖、氯化钠、蛋白胨、牛肉膏，室温混匀，调节pH值，冰箱内储存。
9.如权利要求1-8任意一项所述的昆虫病原线虫制剂在制备防治地下害虫的农药中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述地下害虫包括花生蛴螬、斜纹夜蛾、小地老虎、玫瑰金龟子、茶天牛、云斑天牛和黄曲跳甲。
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