CN110938573A - 一种枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌24‑7菌株发酵液体的制备方法，包括菌种预处理、种子液制备和发酵液制备步骤。本发明提供的枯草芽孢杆菌24‑7菌株发酵液体中包含有活性物质枯草菌素、制霉菌素、短杆菌肽，这些活性物质对黄瓜白粉病、番茄白粉病、烟草白粉病等致病菌有明显的抑制作用；其安全无毒、无残留、且不会污染环境；本发明提供的枯草芽孢杆菌24‑7的发酵生产工艺，可以提高发酵液的芽孢含量，从而提高制剂的生防效果，及对原料进行合理的配比，使利用率最大化，缩短发酵周期，适于批量生产，从而降低人工，设备及水、电、气等运行成本，最终提高经济效益。

Description

一种枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法
技术领域
本发明属于芽孢杆菌发酵液体制备技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，具有促进作物生长，抑制植物病原菌，加快畜禽粪便及日常生活废弃物堆肥的腐熟进程等功能，是用于制备有机废弃物堆肥发酵菌剂或生物有机肥的重要功能菌。枯草芽孢杆菌作为生防菌，其发展前景很广阔，现在已经在农业的生防、畜-牧和养殖、医药及分子生物学研究等方面都有广泛的应用。现今的化学农药防治病虫害对农业生产起了十分重要的作用，但长期连续不合理地使用化学农药，产生了诸多问题，不止污染环境，有些还有直接危害农作物的健康，引致各种急性或慢性生理性病害，甚至危及人和动物的健康。所以利用有益微生物来防治植物病害是具有良好的社会、经济、生态和环境效益。但是现有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)制剂(即枯草芽孢杆菌的发酵液体)的生产工艺复杂、生产发酵周期长，生产成本高，不利于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)制剂的批量生产和扩产。
发明内容
本发明旨在提供一种枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：具体步骤为
A、菌种预处理，汲取原始枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种与接种容器中装有的LB液体培养基接种，并将接种后的接种容器置于35℃、160rpm的恒温摇床中培养72h，最后以50％丙三醇灭菌与菌液按照1:1的比例用离心管保存于-80℃超低温环境中；
B、种子液制备，先将-80℃下离心管保存的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种接种于LB固体培养基平板上，LB固体培养基平板上划线以35℃恒温培养箱培养24h；随后挑选LB固体培养基平板上具有固定形态的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7单菌落于0.05～0.1L的LB液体培养基上培育，32～37℃、150～200rpm/min条件下恒温培养14～20h，得到种子液；
C、发酵液制备，汲取0.1L发酵配方液、0.01～0.02L种子液种于于摇瓶灭菌中，置于35℃，160～190rpm恒温摇床培养24～30h，即得有效活菌数为1.81×1012cfu/L～3.83×1012cfu/L的枯草芽孢杆菌24-7菌株的发酵液体。
本发明的有益效果：本发明提供的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体中包含的活性物质枯草菌素、制霉菌素、短杆菌肽，这些活性物质对黄瓜白粉病、番茄白粉病、烟草白粉病等致病菌有明显的抑制作用；其安全无毒、无残留、且不会污染环境；本发明提供的枯草芽孢杆菌24-7的发酵生产工艺，可以提高发酵液的芽孢含量，从而提高制剂的生防效果，及对原料进行合理的配比，使利用率最大化，缩短发酵周期，适于批量生产，从而降低人工，设备及水、电、气等运行成本，最终提高经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法，包括A、菌种预处理，B、种子液制备，C、发酵液制备，具体步骤为
A、菌种预处理，汲取原始枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种与接种容器中装有的LB液体培养基接种，并将接种后的接种容器置于35℃、160rpm的恒温摇床中培养72h，最后以50％丙三醇灭菌与菌液按照1:1的比例用离心管保存于-80℃超低温环境中；
B、种子液制备，先将-80℃下离心管保存的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种接种于LB固体培养基平板上，LB固体培养基平板上划线以35℃恒温培养箱培养24h；随后挑选LB固体培养基平板上具有固定形态的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7单菌落于0.05～0.1L的LB液体培养基上培育，32～37℃、150～200rpm/min条件下恒温培养14～20h，得到种子液；
C、发酵液制备，汲取0.1L发酵配方液、0.01～0.02L种子液种于于摇瓶灭菌中，置于35℃，160～190rpm恒温摇床培养24～30h，既得枯草芽孢杆菌24-7菌株的发酵液体。
所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7是从中药材三七中提取，并经过常规的液体和固体发酵培养、筛选获得的内生菌，菌落形态为外周边缘光滑，表面是呈褶皱状突起，乳白色，粘稠；该内生菌和Bacillussubtilis(枯草芽孢杆菌)位于同一分支，两者进化关系和距离最近，相似度100％，结合形态特征、培养特征和生理生化特征，鉴定此菌株为枯草芽胞杆菌，命名为枯草芽孢杆菌24-7，其菌株保藏编号为：CGMCCNO.18460，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地为址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2019年09月02日。
所述的步骤A中LB液体培养基、步骤B中LB固体培养基平板、步骤B中LB液体培养基的原料均包括：细菌学蛋白胨9～12g/L，NaCl4～6g/L，酵母提取粉4～6g/L。
所述的步骤C中发酵配方液包括：玉米粉6～10g/L、黄豆粉16～20g/L、鱼粉2～6g/L、蛋白胨1～4g/L、蔗糖4～8g/L、碳酸钙3～7g/L、硫酸锰0.1～0.4g/L、氯化钠0.1～0.5g/L、硫酸镁0.3～0.7g/L、磷酸二氢钾0.1～0.4g/L、磷酸氢二钾0.1～0.4g/L、硫酸胺0.3～0.7g/L、氢氧化钠0.1～0.4g/L。
所述的步骤C中发酵配方液对提高菌株24-7芽孢量起主要作用的原料包括玉米粉6～10g/L、黄豆粉16～20g/L、鱼粉2～6g/L、蛋白胨1～4g/L、碳酸钙3～7g/L、蔗糖4～8g/L。
所述的发酵配方液的pH值为6.0～8.0。
所述的步骤C中枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液中的有效活菌数为1.81×1012cfu/L～3.83×1012cfu/L。
下面结合实施例对本发明作进一步的解释和说明实施例1
本发明所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法的具体步骤为：
A、菌种预处理，汲取原始枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种与接种容器中装有的LB液体培养基接种，并将接种后的接种容器置于35℃、160rpm的恒温摇床中培养72h，最后以50％丙三醇灭菌与菌液按照1:1的比例用离心管保存于-80℃超低温环境中；
B、种子液制备，先将-80℃下离心管保存的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种接种于LB固体培养基平板上，LB固体培养基平板划线以35℃恒温培养箱培养24h；随后挑选LB固体培养基平板上具有固定形态的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7单菌落于0.05～0.1L的LB液体培养基中，32℃、150rpm/min条件下恒温培养14h，得到种子液；
C、发酵液制备，汲取0.1L发酵配方液、0.01～0.02L种子液种于于摇瓶灭菌中，置于35℃，160rpm恒温摇床培养24h，既得枯草芽孢杆菌24-7菌株的发酵液体；该枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液中的有效活菌数为1.81×1012cfu/L～3.83×1012cfu/L。
其中，该实施例步骤A中LB液体培养基、步骤B中LB固体培养基平板、步骤B中LB液体培养基的原料均包括：细菌学蛋白胨9～12g/L，NaCl4～6g/L，酵母提取粉4～6g/L。
该实施例步骤C中的发酵配方液包括：玉米粉6～10g/L、黄豆粉16～20g/L、鱼粉2～6g/L、蛋白胨1～4g/L、蔗糖4～8g/L、碳酸钙3～7g/L、硫酸锰0.1～0.4g/L、氯化钠0.1～0.5g/L、硫酸镁0.3～0.7g/L、磷酸二氢钾0.1～0.4g/L、磷酸氢二钾0.1～0.4g/L、硫酸胺0.3～0.7g/L、氢氧化钠0.1～0.4g/L，发酵配方液的pH值为6.0。
实施例2
本发明所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法的具体步骤为：
A、菌种预处理，汲取原始枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种与接种容器中装有的LB液体培养基接种，并将接种后的接种容器置于35℃、160rpm的恒温摇床中培养72h，最后以50％丙三醇灭菌与菌液按照1:1的比例用离心管保存于-80℃超低温环境中；
B、种子液制备，先将-80℃下离心管保存的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种接种于LB固体培养基平板上，LB固体培养基平板划线以35℃恒温培养箱培养24h；随后挑选LB固体培养基平板上具有固定形态的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7单菌落于0.05～0.1L的LB液体培养基中，35℃、180rpm/min条件下恒温培养17h，得到种子液；
C、发酵液制备，汲取0.1L发酵配方液、0.01～0.02L种子液种于于摇瓶灭菌中，置于35℃，180rpm恒温摇床培养27h，既得枯草芽孢杆菌24-7菌株的发酵液体；该枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液中的有效活菌数为1.81×1012cfu/L～3.83×1012cfu/L。
其中，该实施例步骤A中LB液体培养基、步骤B中LB固体培养基平板、步骤B中LB液体培养基的原料均包括：细菌学蛋白胨9～12g/L，NaCl4～6g/L，酵母提取粉4～6g/L。
该实施例步骤C中的发酵配方液包括：玉米粉6～10g/L、黄豆粉16～20g/L、鱼粉2～6g/L、蛋白胨1～4g/L、蔗糖4～8g/L、碳酸钙3～7g/L、硫酸锰0.1～0.4g/L、氯化钠0.1～0.5g/L、硫酸镁0.3～0.7g/L、磷酸二氢钾0.1～0.4g/L、磷酸氢二钾0.1～0.4g/L、硫酸胺0.3～0.7g/L、氢氧化钠0.1～0.4g/L，发酵配方液的pH值为7.0。
实施例3
本发明所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法的具体步骤为：
A、菌种预处理，汲取原始枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种与接种容器中装有的LB液体培养基接种，并将接种后的接种容器置于35℃、160rpm的恒温摇床中培养72h，最后以50％丙三醇灭菌与菌液按照1:1的比例用离心管保存于-80℃超低温环境中；
B、种子液制备，先将-80℃下离心管保存的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种接种于LB固体培养基平板上，LB固体培养基平板划线以35℃恒温培养箱培养24h；随后挑选LB固体培养基平板上具有固定形态的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7单菌落于0.05～0.1L的LB液体培养基中，37℃、1200rpm/min条件下恒温培养20h，得到种子液；
C、发酵液制备，汲取0.1L发酵配方液、0.01～0.02L种子液种于于摇瓶灭菌中，置于35℃，190rpm恒温摇床培养30h，既得枯草芽孢杆菌24-7菌株的发酵液体；该枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液中的有效活菌数为1.81×1012cfu/L～3.83×1012cfu/L。
其中，该实施例步骤A中LB液体培养基、步骤B中LB固体培养基平板、步骤B中LB液体培养基的原料均包括：细菌学蛋白胨9～12g/L，NaCl4～6g/L，酵母提取粉4～6g/L。
该实施例步骤C中的发酵配方液包括：玉米粉6～10g/L、黄豆粉16～20g/L、鱼粉2～6g/L、蛋白胨1～4g/L、蔗糖4～8g/L、碳酸钙3～7g/L、硫酸锰0.1～0.4g/L、氯化钠0.1～0.5g/L、硫酸镁0.3～0.7g/L、磷酸二氢钾0.1～0.4g/L、磷酸氢二钾0.1～0.4g/L、硫酸胺0.3～0.7g/L、氢氧化钠0.1～0.4g/L，发酵配方液的pH值为8.0。
实施例4
本发明所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法的具体步骤为：
A、菌种预处理，汲取原始枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种与接种容器中装有的LB液体培养基接种，并将接种后的接种容器置于35℃、160rpm的恒温摇床中培养72h，最后以50％丙三醇灭菌与菌液按照1:1的比例用离心管保存于-80℃超低温环境中；
B、种子液制备，先将-80℃下离心管保存的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种接种于LB固体培养基平板上，LB固体培养基平板划线以35℃恒温培养箱培养24h；随后挑选LB固体培养基平板上具有固定形态的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7单菌落于0.05～0.1L的LB液体培养基中，32℃、150rpm/min条件下恒温培养14h，得到种子液；
C、发酵液制备，汲取0.1L发酵配方液、0.01～0.02L种子液种于于摇瓶灭菌中，置于35℃，160rpm恒温摇床培养24h，既得枯草芽孢杆菌24-7菌株的发酵液体；该枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液中的有效活菌数为1.81×1012cfu/L～3.83×1012cfu/L。
其中，该实施例步骤A中LB液体培养基、步骤B中LB固体培养基平板、步骤B中LB液体培养基的原料均包括：细菌学蛋白胨9～12g/L，NaCl4～6g/L，酵母提取粉4～6g/L。
该实施例步骤C中的发酵配方液包括：玉米粉6～10g/L、黄豆粉16～20g/L、鱼粉2～6g/L、蛋白胨1～4g/L、碳酸钙3～7g/L、蔗糖4～8g/L，发酵配方液的pH值为6.0。
实施例5
本发明所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法的具体步骤为：
A、菌种预处理，汲取原始枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种与接种容器中装有的LB液体培养基接种，并将接种后的接种容器置于35℃、160rpm的恒温摇床中培养72h，最后以50％丙三醇灭菌与菌液按照1:1的比例用离心管保存于-80℃超低温环境中；
B、种子液制备，先将-80℃下离心管保存的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种接种于LB固体培养基平板上，LB固体培养基平板划线以35℃恒温培养箱培养24h；随后挑选LB固体培养基平板上具有固定形态的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7单菌落于0.05～0.1L的LB液体培养基中，35℃、180rpm/min条件下恒温培养17h，得到种子液；
C、发酵液制备，汲取0.1L发酵配方液、0.01～0.02L种子液种于于摇瓶灭菌中，置于35℃，180rpm恒温摇床培养27h，既得枯草芽孢杆菌24-7菌株的发酵液体；该枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液中的有效活菌数为1.81×1012cfu/L～3.83×1012cfu/L。
其中，该实施例步骤A中LB液体培养基、步骤B中LB固体培养基平板、步骤B中LB液体培养基的原料均包括：细菌学蛋白胨9～12g/L，NaCl4～6g/L，酵母提取粉4～6g/L。
该实施例步骤C中的发酵配方液包括：玉米粉6～10g/L、黄豆粉16～20g/L、鱼粉2～6g/L、蛋白胨1～4g/L、碳酸钙3～7g/L、蔗糖4～8g/L，发酵配方液的pH值为7.0。
实施例6
本发明所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法的具体步骤为：
A、菌种预处理，汲取原始枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种与接种容器中装有的LB液体培养基接种，并将接种后的接种容器置于35℃、160rpm的恒温摇床中培养72h，最后以50％丙三醇灭菌与菌液按照1:1的比例用离心管保存于-80℃超低温环境中；
B、种子液制备，先将-80℃下离心管保存的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7菌种接种于LB固体培养基平板上，LB固体培养基平板划线以35℃恒温培养箱培养24h；随后挑选LB固体培养基平板上具有固定形态的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)24-7单菌落于0.05～0.1L的LB液体培养基中，37℃、1200rpm/min条件下恒温培养20h，得到种子液；
C、发酵液制备，汲取0.1L发酵配方液、0.01～0.02L种子液种于于摇瓶灭菌中，置于35℃，190rpm恒温摇床培养30h，既得枯草芽孢杆菌24-7菌株的发酵液体；该枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液中的有效活菌数为1.81×1012cfu/L～3.83×1012cfu/L。
其中，该实施例步骤A中LB液体培养基、步骤B中LB固体培养基平板、步骤B中LB液体培养基的原料均包括：细菌学蛋白胨9～12g/L，NaCl4～6g/L，酵母提取粉4～6g/L。
该实施例步骤C中的发酵配方液包括：玉米粉6～10g/L、黄豆粉16～20g/L、鱼粉2～6g/L、蛋白胨1～4g/L、碳酸钙3～7g/L、蔗糖4～8g/L，发酵配方液的pH值为8.0。

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法，包括A、菌种预处理，B、种子液制备，C、发酵液制备，其特征在于：具体步骤为
A、菌种预处理，汲取原始枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)24-7菌种与接种容器中装有的LB液体培养基接种，并将接种后的接种容器置于35℃、160rpm的恒温摇床中培养72h，最后以50％丙三醇灭菌与菌液按照1:1的比例用离心管保存于-80℃超低温环境中；
B、种子液制备，先将-80℃下离心管保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)24-7菌种接种于LB固体培养基平板上，LB固体培养基平板上划线以35℃恒温培养箱培养24h；随后挑选LB固体培养基平板上具有固定形态的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)24-7单菌落于0.05～0.1L的LB液体培养基上培育，32～37℃、150～200rpm/min条件下恒温培养14～20h，得到种子液；
C、发酵液制备，汲取0.1L发酵配方液、0.01～0.02L种子液接种于摇瓶灭菌中，置于35℃，160～190rpm恒温摇床培养24～30h，即得枯草芽孢杆菌24-7菌株的发酵液体。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)24-7是从中药材三七中提取，并经过常规的液体和固体发酵培养、筛选获得的内生菌，菌落形态为外周边缘光滑，表面是呈褶皱状突起，乳白色，粘稠；该内生菌和Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)位于同一分支，两者进化关系和距离最近，相似度100％，结合形态特征、培养特征和生理生化特征，鉴定此菌株为Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)，命名为枯草芽孢杆菌24-7，其菌株保藏编号为：CGMCCNO.18460，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地为址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2019年09月02日。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法，其特征在于：所述的步骤A中LB液体培养基、步骤B中LB固体培养基平板、步骤B中LB液体培养基的原料均包括：细菌学蛋白胨9～12g/L，NaCl4～6g/L，酵母提取粉4～6g/L。
4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法，其特征在于：所述的步骤C中发酵配方液的原料包括：玉米粉6～10g/L、黄豆粉16～20g/L、鱼粉2～6g/L、蛋白胨1～4g/L、蔗糖4～8g/L、碳酸钙3～7g/L、硫酸锰0.1～0.4g/L、氯化钠0.1～0.5g/L、硫酸镁0.3～0.7g/L、磷酸二氢钾0.1～0.4g/L、磷酸氢二钾0.1～0.4g/L、硫酸胺0.3～0.7g/L、氢氧化钠0.1～0.4g/L。
5.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法，其特征在于：所述的步骤C中发酵配方液的原料包括：玉米粉6～10g/L、黄豆粉16～20g/L、鱼粉2～6g/L、蛋白胨1～4g/L、碳酸钙3～7g/L、蔗糖4～8g/L。
6.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法，其特征在于：所述的发酵配方液的pH值为6.0～8.0。
7.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液体的制备方法，其特征在于：所述的步骤C中枯草芽孢杆菌24-7菌株发酵液中的有效活菌数为1.81×1012cfu/L～3.83×1012cfu/L。
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