CN112352792A - 一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂，包括离心菌体、助剂和离心菌体上清液。一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂的制备方法，包括菌体制备、菌液制备和菌液成品步骤。本发明提供的微生物菌剂有较强的选择性，本申请中的功能菌种枯草芽孢杆菌WSWFJ38具有对人畜等靶标以外生物(非靶标生物)安全无害的特点，甚至对天敌昆虫也是安全的，是由自然界中筛选分离得到，未进行基因改造，田间使用不具有风险，可在土壤中自然快速分解，对作物、动物和人体均不产生危害，可实现田间、作物、水源无污染、无残留，与常规杀虫农药相比安全性大大提高，有利于有机农业的发展。

Description

一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于害虫防治技术领域，尤其涉及一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith),又称秋黏虫,属鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae灰翅夜蛾属Spodoptera,是一种原产于美洲热带和亚热带地区的杂食性害虫。我国于2019年1月11日前次于云南江城县发现该虫的为害，且能在我国多数省、市、自治区为害。草地贪夜蛾不仅取食为害玉米，还可取食大麦、水稻、花生、甜菜、大豆、烟草、番茄、马铃薯、白菜、小麦等80余农作物种植物。
草地贪夜蛾生命周期包括卵、幼虫、蛹和成虫4个虫态，取食为害阶段为幼虫期，以6龄幼虫为害最为严重，低龄幼虫(1～3龄)取食玉米叶片形成半透明薄膜“窗孔”，高龄幼虫(4～6龄)取食形成不规则的长形孔洞，高龄幼虫也会取食玉米雄穗和果穗。由于化学药剂和物理防控对于病害的防治效果较差，基于生物产业的快速发展，采用农用微生物菌剂进行枯萎病的防控，既能避免农作物产生抗药性，又能实现绿色环保无残留，所以研制一株高效防草地贪夜蛾的功能菌剂及其制成的防控产品对于农业的健康持续发展尤为重要。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂；第二目的在于提供一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂的制备方法。
本发明的第一目的是这样实现的：具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂，包括以下重量份的组分：离心菌体45～55份、助剂35～40份、离心菌体上清液10～15份；其中,所述离心菌体中的菌体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSWFJ38，保藏号为CGMCCNo.20143。
所述微生物菌株已于2020年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌株名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSWFJ38，保藏号为CGMCC No.20143。
本发明的第二目的是这样实现的：包括菌体制备、菌液制备和菌液成品步骤，具体为
1)菌体制备，先取-80℃下保存的保藏号为CGMCC No.20143的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSWFJ38菌株在LB固体培养基上活化12～16h活化的得菌株；其次，取菌株置于LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm/min条件下培养24h活化得种子液；随后取种子液置于发酵料培养中，中温度为36.5℃～37.5℃条件下，转速为120rpm/min条件下培养25～30h得发酵液；最后以离心机转速6000rpm/min条件下离心15min得到离心菌体；
2)菌液制备，取步骤1)制得的离心菌体、离心菌体上清液，以及由润湿分散剂、醇类抗冻剂、增稠剂和非离子表面活性剂组成的助剂混合搅拌均匀得到菌液，三者的重量百分比为：离心菌体45～55份、离心菌体上清液10～15份、助剂35～40份；
3)菌液成品，取步骤2)制得的菌液加入稀释剂稀释得枯草芽孢杆菌菌悬液成品，即为防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂。
本发明的有益效果是：1、有较强的选择性，本申请中的功能菌种枯草芽孢杆菌WSWFJ38具有对人畜等靶标以外生物(非靶标生物)安全无害的特点，甚至对天敌昆虫也是安全的，是由自然界中筛选分离得到，未进行基因改造，田间使用不具有风险，可在土壤中自然快速分解，对作物、动物和人体均不产生危害，可实现田间、作物、水源无污染、无残留，与常规杀虫农药相比安全性大大提高，有利于有机农业的发展；
2、能散布蔓延，病原体能在虫体内增殖，最后能产生大量具有感染力的繁殖体，杀虫效果好，害虫接触到微微生物菌剂后能在12h-24h之内快速死亡；本发明能对草地贪夜蛾进行有效防控，能够在很大程度上替代化学农药的使用，减少环境污染，提高作物安全性。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对其具体实施方式进行详细的说明。
一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂，包括以下重量份的组分：离心菌体45～55份、助剂35～40份、离心菌体上清液10～15份；其中,所述离心菌体中的菌体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
WSWFJ38，保藏号为CGMCC No.20143。
所述的助剂包括以下重量份的组分：润湿分散剂17～20份、增稠剂3～5份、非离子表面活性剂12～15份。
所述的润湿分散剂以下重量份的组分：羧甲基纤维素钠(EMA)10份、萘磺酸盐(D425)5份、吐温(20)4.8份中的任一种或两种以上的组合。
所述的助剂还包括以下重量份的组分：醇类抗冻剂0.1～1份。
所述的非离子表面活性剂包括以下重量份的组分：三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯8份、烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)4份、聚乙二醇(PEG600)2.2份中的任一种或两种以上的组合。
一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂制备方法，包括菌体制备、菌液制备和菌液成品步骤，具体为
1)菌体制备，先取-80℃下保存的保藏号为CGMCC No.20143的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSWFJ38菌株在LB固体培养基上活化12～16h活化的得菌株；其次，取菌株置于LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm/min条件下培养24h活化得种子液；随后取种子液置于发酵料培养中，中温度为36.5℃～37.5℃条件下，转速为120rpm/min条件下培养25～30h得发酵液；最后以离心机转速6000rpm/min条件下离心15min得到离心菌体；
2)菌液制备，取步骤1)制得的离心菌体、离心菌体上清液，以及由润湿分散剂、醇类抗冻剂、增稠剂和非离子表面活性剂组成的助剂混合搅拌均匀得到菌液，三者的重量百分比为：离心菌体45～55份、离心菌体上清液10～15份、助剂35～40份；
3)菌液成品，取步骤2)制得的菌液加入稀释剂稀释得到有效活菌数不小于2.0×108cfu/mL枯草芽孢杆菌菌悬液成品，即为防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂。
所述步骤1)中：当所述LB培养基为LB液体培养基时，pH＝6.8～7.5，包括以下重量份的组分：细菌学蛋白胨1份、酵母提取粉0.5份、氯化钠1份、水95份；
当所述LB培养基为LB固体培养基时，pH＝6.8～7.5，包括以下重量份的组分：细菌学蛋白胨1份、酵母提取粉0.5份、氯化钠1份、琼脂粉24份、水73.5份。
所述步骤1)中发酵液培养基包括以下重量份的组分：黄豆粉1.0～1.6份、蔗糖0.1～0.5份、蛋白胨0.2～0.6份、玉米粉0.2～0.6份、碳酸钙0.3～0.9份、鱼粉0.1～0.3份、硫酸铵0.01～0.08份、硫酸镁0.02～0.05份、磷酸二氢钾0.01～0.04份、磷酸氢二钾0.02～0.05份、硫酸锰0.01～0.04份、氢氧化钠0.01～0.04份、氯化钠0.02～0.03份、消泡剂0.5～1.5份，用盐酸及氢氧化钠调节pH至6.8～7.5。
所述的步骤3)中的稀释剂为水。
实施例1
一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂，包括以下重量份的组分：离心菌体45份、助剂35份、离心菌体上清液10份；其中,所述微生物菌剂有效活菌数不小于2.0×108cfu/mL；其中，所述的助剂包括以下重量份的组分：润湿分散剂17、增稠剂3、非离子表面活性剂12；所述的润湿分散剂以下重量份的组分：羧甲基纤维素钠(EMA)10份、萘磺酸盐(D425)5份、吐温(20)4.8份中的任一种或两种以上的组合；所述的非离子表面活性剂包括以下重量份的组分：三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯8份、烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)4份、聚乙二醇(PEG600)2.2份中的任一种或两种以上的组合。
实施例2
一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂，包括以下重量份的组分：离心菌体50份、助剂37.5份、离心菌体上清液12.5份；其中,所述微生物菌剂有效活菌数不小于2.0×108cfu/mL；其中，所述的助剂包括以下重量份的组分：润湿分散剂18.5份、增稠剂4份、非离子表面活性剂13.5份；所述的润湿分散剂以下重量份的组分：羧甲基纤维素钠(EMA)10份、萘磺酸盐(D425)5份、吐温(20)4.8份中的任一种或两种以上的组合；所述的非离子表面活性剂包括以下重量份的组分：三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯8份、烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)4份、聚乙二醇(PEG600)2.2份中的任一种或两种以上的组合。
实施例3
一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂，包括以下重量份的组分：离心菌体55份、助剂40份、离心菌体上清液15份；其中,所述微生物菌剂有效活菌数不小于2.0×108cfu/mL；其中，所述的助剂包括以下重量份的组分：润湿分散剂20份、增稠剂5份、非离子表面活性剂15份；所述的润湿分散剂以下重量份的组分：羧甲基纤维素钠(EMA)10份、萘磺酸盐(D425)5份、吐温(20)4.8份中的任一种或两种以上的组合；所述的非离子表面活性剂包括以下重量份的组分：三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯8份、烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)4份、聚乙二醇(PEG600)2.2份中的任一种或两种以上的组合。
实施例4
一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂，包括以下重量份的组分：离心菌体45～55份、助剂35～40份、离心菌体上清液10～15份；其中,所述微生物菌剂有效活菌数不小于2.0×108cfu/mL；其中，所述的助剂包括以下重量份的组分：润湿分散剂17～20份、增稠剂3～5份、非离子表面活性剂12～15份、醇类抗冻剂0.1～1份；所述的润湿分散剂以下重量份的组分：羧甲基纤维素钠(EMA)10份、萘磺酸盐(D425)5份、吐温(20)4.8份中的任一种或两种以上的组合；所述的非离子表面活性剂包括以下重量份的组分：三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯8份、烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)4份、聚乙二醇(PEG600)2.2份中的任一种或两种以上的组合。
实施例5
利用本发明所述的具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂作杀虫剂对玉米草地贪夜蛾的室内防效测定。
1.材料与方法
1.1供试药剂：高效氯氰菊酯水乳剂(重庆树荣作物科学技术有限公司)、微生物菌剂、CK对照(清水)，供试昆虫采集自德宏州植保所试验田块草地贪夜蛾卵块、不同虫龄幼虫测定杀虫活性。
1.2室内防效验证：采用浸卵法测定药剂对草地贪夜蛾的杀卵活性。选取当日初产淡绿色卵块,用毛刷将卵块分散为单个卵粒并均匀地粘在透明胶带上制成卵卡，将卵卡在药液中浸渍10s,用滤纸吸取多余药液后晾干,然后放入50mL离心管中。以清水为对照。每处理30粒卵,3次重复，处理后使用体视解剖镜逐日检查卵孵化数量及未孵化数量,直至无卵孵化，计算孵化抑制率。
利用微生物菌剂的不同稀释倍数对草地贪夜蛾喷雾试验，将大喇叭口期幼嫩玉米叶片剪为5cm叶段置于培养皿(15cm)中；选取F1代发育整齐的2龄、幼虫饥饿4h后放入处理好的叶片上；以清水为对照。每处理幼虫50头，3次重复；处理后12h、24h、36h、48h检查幼虫存活状态，以毛刷轻触幼虫体表，无反应判定为死亡，记录死亡数、存活数，计算死亡率。
2.结果分析
表1，微生物菌剂对草地贪夜蛾室内杀卵活性
Figure BDA0002807448740000071
注：上述均为三次重复试验所取平均值。
药剂处理后5d，高效氯氰菊酯800倍液草地贪夜蛾的杀卵活性最高,其次分别为微生物菌剂100倍、200倍、300倍；表中所示微生物菌剂100倍液菌含量为2×108cfu/g，200倍液为1×108cfu/g，300倍液为0.67×108cfu/g。
表2，微生物菌剂对草地贪夜蛾低龄龄幼虫室内防效测定
Figure BDA0002807448740000072
由表2微生物菌剂不同稀释倍数对草地贪夜蛾的低龄幼虫防治效果可知：高效氯氰菊酯800倍液处理效果最佳，其次为微生物菌剂稀释100倍及200倍，但高效氯氰菊酯稀释与二者防效差异不显著，都达到了95％以上，其次为微生物菌剂稀释300倍处理，防效为86.68％，因此证明微生物菌株对草地贪夜蛾低龄幼虫具有一定的致死效果。
表3，微生物菌剂对草地贪夜蛾高龄幼虫室内防效测定
Figure BDA0002807448740000081
由表3微生物菌剂不同稀释倍数对草地贪夜蛾的高龄幼虫防治效果可知：高效氯氰菊酯800倍液处理效果仍然最佳，死亡率达到92.21％，其次为微生物菌剂稀释100倍，防效为89.74％，其次为微生物菌剂稀释200倍处理，防效为75.32％，清水处理同样有死亡率，是因为在捕捉时有误伤或其活性不强所导致，总体而言，微生物菌剂不同稀释倍数处理草地贪夜蛾在喷施后24h防效达到极致，因此在施用时建议将该生物杀虫剂稀释至100-200倍施用效果较佳。
表4微生物菌剂对草地贪夜蛾田间的防治效果
Figure BDA0002807448740000082
注：清水(对照)；，农药高效氯氰菊酯稀释300倍；f微生物菌剂稀释100倍液；，，微生物菌剂稀释200倍液；…微生物菌剂稀释300倍液。表中所示悬浮剂100倍液菌含量为2.0×108cfu/g,200倍液为1.0×108cfu/g，300倍液为0.67×108cfu/g。同列数据后不同大写字母表示不同的处理间在0.01水平差异显著；小写字母表示不同的处理间在0.05水平差异显著。
由表4微生物菌剂对草地贪夜蛾的防治效果可知：将微生物菌剂稀释到100倍倍施用，与高效氯氰菊酯800倍液防效差异不显著，均达到90％以上，稀释到200倍、300倍防效在88％-90％之间，稀释300倍同样能达到预期防效，原因为在喷施玉米时，由于玉米的特殊性，导致喷施后菌液在玉米心中存在时间较长，菌液不宜挥发，导致杀虫效果相比于室内较好。因此在田间喷施玉米时建议将其稀释至200-300倍施用，同样能达到较好的防治效果。

Claims (10)

1.一种具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂，其特征在于：包括以下重量份的组分：离心菌体45～55份、助剂35～40份、离心菌体上清液10～15份；其中,所述离心菌体中的菌体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSWFJ38，保藏号为CGMCC No.20143。
2.根据权利要求1所述的具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂，其特征在于：所述的助剂包括以下重量份的组分：润湿分散剂17～20份、增稠剂3～5份、非离子表面活性剂12～15份。
3.根据权利要求1所述的具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂，其特征在于：所述的润湿分散剂以下重量份的组分：羧甲基纤维素钠(EMA)10份、萘磺酸盐(D425)5份、吐温(20)4.8份中的任一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求1所述的具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂，其特征在于：所述的非离子表面活性剂包括以下重量份的组分：三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯8份、烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)4份、聚乙二醇(PEG600)2.2份中的任一种或两种以上的组合。
5.一种权利要求1～4任一项所述的具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂制备方法，包括菌体制备、菌液制备和菌液成品步骤，其特征在于：具体步骤为
1)菌体制备，取菌种经LB培养基活化、发酵料培养基发酵、离心分离得到离心菌体；
2)菌液制备，取步骤1)制得的离心菌体、助剂、离心菌体上清液混合搅拌均匀得到菌液；
3)菌液成品，取步骤2)制得的菌液加入稀释剂稀释得到枯草芽孢杆菌菌悬液成品，即为防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂。
6.根据权利要求5所述的具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂制备方法，其特征在于：所述的步骤1)中的菌种活化方式为将-80℃下保存的枯草芽孢杆菌菌株在LB固体培养基上活化12～16h，得活化的菌株。
7.根据权利要求5所述的具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂制备方法，其特征在于：所述的步骤1)中的发酵方式为取活化的菌株接种LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm/min条件下培养24h，得种子液；再把种子液与培养液以体积比为1：120的比例接入到发酵料培养基中，在温度为36.5℃～37.5℃条件下，转速为120rpm/min条件下培养25～30h，得菌料发酵液。
8.根据权利要求5所述的具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤1)中
当所述LB培养基为LB液体培养基时，pH＝6.8～7.5，包括以下重量份的组分：细菌学蛋白胨1份、酵母提取粉0.5份、氯化钠1份、水95份；
当所述LB培养基为LB固体培养基时，pH＝6.8～7.5，包括以下重量份的组分：细菌学蛋白胨1份、酵母提取粉0.5份、氯化钠1份、琼脂粉24份、水73.5份。
9.根据权利要求5所述的具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤1)中发酵液培养基包括以下重量份的组分：黄豆粉1.0～1.6份、蔗糖0.1～0.5份、蛋白胨0.2～0.6份、玉米粉0.2～0.6份、碳酸钙0.3～0.9份、鱼粉0.1～0.3份、硫酸铵0.01～0.08份、硫酸镁0.02～0.05份、磷酸二氢钾0.01～0.04份、磷酸氢二钾0.02～0.05份、硫酸锰0.01～0.04份、氢氧化钠0.01～0.04份、氯化钠0.02～0.03份、消泡剂0.5～1.5份，用盐酸及氢氧化钠调节pH至6.8～7.5。
10.根据权利要求5所述的具有防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂制备方法，其特征在于：所述的步骤3)制得的枯草芽孢杆菌菌悬液成品，即防治草地贪夜蛾功能的微生物菌剂中的有效活菌数不小于2.0×108cfu/mL。
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